Αφηρημένο

χημειοαντίσταση στα κύτταρα πολυανθεκτικής (MDR) πάνω από την έκφραση Ρ-γλυκοπρωτεΐνη ( P-gp) που κωδικοποιείται από το γονίδιο MDR1, είναι ένα μείζον εμπόδιο στην επιτυχή χημειοθεραπεία για καρκίνο του παχέος εντέρου. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι sinomenine μπορούν να ενισχύσουν την απορρόφηση των διαφόρων υποστρωμάτων P-gp. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήσαμε την επίδραση της sinomenine στην χημειοαντίσταση σε καρκινικά κύτταρα κόλου και διερεύνησε τον υποκείμενο μηχανισμό. Αναπτύξαμε κύτταρα πολυανθεκτικά Caco-2 (MDR-Caco-2) με έκθεση των κυττάρων Caco-2 σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις δοξορουβικίνης. Ταυτοποιήσαμε υπερέκφραση της COX-2 και MDR-1 γονίδια, καθώς και ενεργοποίηση της οδού σήματος ΝΡ-κΒ σε κύτταρα MDR-Caco-2. Είναι σημαντικό ότι, βρήκαμε ότι sinomenine ενισχύει την ευαισθησία των MDR κυττάρων-Caco-2 προς δοξορουβικίνη με ρύθμιση προς τα κάτω της έκφρασης MDR-1 και COX-2 με αναστολή του μονοπατιού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ. Αυτά τα ευρήματα παρέχουν νέες δυνατότητες στρατηγική για την αντιστροφή της P-gp-μεσολάβηση αντίσταση αντικαρκινικό φάρμακο

Παράθεση:. Liu Ζ, Duan Z-J, Chang J-Υ, Zhang Ζ-f, Chu R, Li Υ-L, et al. (2014) Sinomenine ευαισθητοποιεί πολυανθεκτική του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα (Caco-2) με δοξορουβικίνη με ρύθμιση προς τα κάτω της MDR-1 έκφρασης. PLoS ONE 9 (6): e98560. doi: 10.1371 /journal.pone.0098560

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 22, Γενάρη 2014? Αποδεκτές: 5 Μάη 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Ιουνίου του 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία χρηματοδότηση ή υποστήριξη στην έκθεση

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθεις όγκους. στο γαστρεντερικό κομμάτι. Τα τελευταία χρόνια, η συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του παχέος εντέρου έχει αυξηθεί σημαντικά στην Κίνα [1]. Η χειρουργική εκτομή είναι η βέλτιστη θεραπεία για αυτό το είδος του καρκίνου, ενώ η χημειοθεραπεία χρησιμεύει ως ένα από τα σημαντικά ανοσοενισχυτικό θεραπείες για τη θεραπεία της. Επί του παρόντος, η ανάπτυξη αντοχής πολυφαρμάκου (MDR), ένα φαινότυπο ότι τα καρκινικά κύτταρα καθίστανται ανθεκτικά σε ένα ευρύ φάσμα των χημειοθεραπευτικών [2], είναι ένα μείζον εμπόδιο στην παχέος χημειοθεραπεία του καρκίνου. Έχει αποδειχθεί ότι η εμφάνιση της MDR σε καρκινικά κύτταρα συσχετίστηκε σημαντικά με την υπερέκφραση των πρωτεϊνών αντλία μεμβράνης, συμπεριλαμβανομένων Ρ-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp) [3].

P-gp, που κωδικοποιείται από το MDR- 1 γονίδιο, είναι ένα μέλος της μεγάλης ΑΤΡ-δέσμευσης πρωτεΐνης κασέτα υπεροικογένειας [4]. P-gp είναι σε θέση να αντλεί ένα μεγάλο ποσό των ενώσεων από ενδοκυτταρικά προς εξω-κυτταρικές θέσεις. Όταν τα καρκινικά κύτταρα αντιμετωπίζουν χημειοθεραπευτικά φάρμακα, λιποδιαλυτές φάρμακα εισέρχονται στα κύτταρα μέσω του αποτελέσματος κλίση συγκέντρωσης. Μετά τη σύνδεση προς Ρ-gp, λιποδιαλυτές φάρμακα συνεχώς αντλούνται έξω από το κύτταρο με μία διεργασία που τροφοδοτείται από υδρόλυση ΑΤΡ, προκαλεί μια συνεχή μείωση των ενδοκυτταρικών επιπέδων του φαρμάκου [5]. Κατά συνέπεια, η τοξικότητα του φαρμάκου σε καρκινικά κύτταρα σταδιακά αποδυναμώνεται, χάνοντας έτσι την αποτελεσματικότητα και, τέλος, δημιουργώντας αντοχή φαρμάκου σε καρκινικά κύτταρα.

Sinomenine (7,8-διδεϋδρο-4-υδροξυ-3,7-διμεθοξυ- 17-methylmorphinae-6-όνη) είναι μία από αρκετές αλκαλοειδών που εξάγεται από το στέλεχος του

Sinomenium acutumRehder

& amp? Wilson (Menispermaceae), το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί παραδοσιακά στην Κίνα και την Ιαπωνία για τη θεραπεία διαφόρων ρευματικών και αρθριτικών παθήσεων [6]. Αξίζει να σημειωθεί ότι sinomenine είναι ικανό να αυξάνει την απορροφητική μεταφορά της διγοξίνης (α πρωτότυπη υπόστρωμα της p-γλυκοπρωτεΐνης) και μειώνοντας εκκριτική μεταφορά της [7]. Μερικές μελέτες δείχνουν ότι sinomenine μπορούν να μπλοκάρουν την ενεργοποίηση του NF-κΒ [8]. Ο υποκείμενος μηχανισμός των φαινομένων αυτών παραμένει ασαφής.

κυκλοοξυγενάσης (COX), ένα ένζυμο που περιορίζει το ρυθμό που καταλύει τη βιοσύνθεση των προσταγλανδινών (PG) από το υπόστρωμα το αραχιδονικό οξύ (ΑΑ) και συμμετέχει σε πολλές φυσιολογικές και παθολογικές εκδηλώσεις . Επί του παρόντος, υπάρχουν δύο ισομορφές του COX: COX-1 και COX-2. Στους περισσότερους ιστούς, η COX-1 εκφράζεται ιδιοσυστατικά, ενώ COX-2 επάγεται από αυξητικούς παράγοντες, κυτοκίνες, και καρκινογόνες ουσίες [9]. COX-2 είναι κοινώς ανιχνευθεί σε πολλούς τύπους ιστών όγκου συμπεριλαμβανομένου του οισοφάγου, του στομάχου, του παχέος εντέρου, του ήπατος, του χοληφόρου συστήματος, του παγκρέατος, του μαστού, του πνεύμονα και της ουροδόχου κύστης καρκίνους [10]. Πρόσφατα ευρήματα έδειξαν ότι η έκφραση COX-2 συσχετίζεται θετικά με την P-gp έκφραση σε ιστό όγκου [11]. Σχετικές μελέτες έχουν αποδείξει ότι οι αναστολείς COX-2 αυξάνουν την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων στις χημειοθεραπευτικές ουσίες με τη ρύθμιση της δραστικότητας της Ρ-gp [12], [13]. Έχει βρεθεί ότι η σελεκοξίμπη, ένα επιλεκτικό αναστολέα COX-2, μπορεί να ρυθμίζουν προς τα κάτω P-gp έκφραση σε καρκινικά κύτταρα καταστέλλοντας την έκφραση των παραγόντων μεταγραφής όπως ΝΡ-κΒ [14], [15]. Αρκετές μελέτες έδειξαν ότι το γονίδιο MDR-1 μπορεί να περιέχουν DNA θέσεις για τη δέσμευση του παράγοντα μεταγραφής ΝΡ-κΒ [16], [17].

Μερικές μελέτες δείχνουν ότι sinomenine αναστέλλει την ωρίμανση των δενδριτικών κυττάρων που προέρχονται από μονοκύτταρα μέσω ενεργοποίησης αποκλεισμού του ΝΡ-κΒ [8]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την υπόθεση ότι sinomenine μπορεί να ενισχύσει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων προς αντικαρκινικών φαρμάκων και ερεύνησε τις δυνητικές μοριακών μηχανισμών αυτού του αποτελέσματος με την άμεση αξιολόγηση της επίδρασης των COX-2 και ΝΡ-κΒ οδών επί της έκφρασης Ρ-gp.

Υλικά και Μέθοδοι

Regents και Αντισώματα

Sinomenine, σελεκοξίμπη, δοξορουβικίνη, 3- (4, 5-διμεθυλο θειαζολ-2-υλ) -2, 5- διφαινυλο βρωμιούχο τετρα-zolium (ΜΤΤ) και διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) αγοράστηκαν από την Sigma Chemical Company (St. Louis, ΜΟ). Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) και ορό εμβρύου μόσχου (FCS) ελήφθησαν από την GIBCO Ζωής Technology (Grand Island, ΝΥ). PGE

2 και PGE

2 kit εκτίμησης αγοράστηκαν από την Cayman Chemical Co., USA. Triton Χ-100 αγοράστηκε από Amresco, ΗΠΑ. Ρ-γλυκοπρωτεΐνη (P-gp) ποντικού αντι-ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα, π-ΙκΒ-α (Ser 32/36) και πολυκλωνικό αντίσωμα ΙκΒ-α κουνελιού αντι-ανθρώπου αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) . ΝΡ-κΒ ρ65 κουνελιού πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-ανθρώπινης ελήφθησαν από Proteintech Group, USA. Τα μονοκλωνικά αντι-βήτα-ακτίνης και πολυκλωνικά κουνελιού αντι-COX-2 ελήφθησαν από την Βιοσύνθεση Biotechnology (Πεκίνο, Κίνα). FITC επισημασμένο κατσίκα αντι-ποντικού IgG και FITC επισημασμένο κατσίκα αντί-κουνελιού IgG αγοράσθηκαν από την Amersham Pharmacia Biotech. (Piscataway, NJ).

Cell Culture

Οι κυτταρικές σειρές Caco-2 που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη είχαν αγοραστεί από την Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών. κύτταρα Caco-2 καλλιεργήθηκαν σε υψηλής γλυκόζης τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM, Gibco, Bethesda, MD, USA) μέσα καλλιέργειας που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου στους 37 ° C με 5% CO

2. κύτταρα MDR-Caco-2 αναπτύχθηκαν από έκθεση των κυττάρων Caco-2 σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις δοξορουβικίνης (από 0,1 μΜ έως 1,6 μΜ σε 7 ημέρες). Στη συνέχεια τα κύτταρα MDR-Caco-2 επωάστηκαν χωρίς δοξορουβικίνη για μια εβδομάδα πριν από τα πειράματα.

Δοκιμασία Χρωματομετρική ΜΤΤ

Η συγκέντρωση εφαρμογή του sinomenine, celecoxib, PGE

2 και την ικανότητα των sinomenine να ευαισθητοποιούν καρκινικά κύτταρα κόλου προς δοξορουβικίνη αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την χρωματομετρική δοκιμασία ΜΤΤ. Caco-2 κύτταρα και MDR-Caco-2 κύτταρα σε λογαριθμική φάση συλλέχθηκαν, επωάστηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων σε συγκέντρωση 2 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες με ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FCS. Μετά την προσκόλληση των κυττάρων στον τοίχο, μέσο DMEM (χωρίς FCS) που περιέχει sinomenine (0, 50, 100, 300, 400, 500, 1000, 2000 μΜ), σελεκοξίμπη (0, 5, 10, 15, 20, 25 , 30, 35 μΜ) και PGE

2 (0, 10

-5, 10

-4, 10

-3, 10

-2, 10

-1, 1, 10 μΜ) συμπληρώθηκαν σε τελικό όγκο 200 μλ /φρεάτιο για 48 h. Μετά τη θεραπεία, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με DMEM. Στη συνέχεια, 200 μΙ ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS και προστέθηκε 10% ΜΤΤ (5 mg /ml). Μετά από επώαση για άλλες 4 ώρες, η μειωμένη ενδοκυτταρική προϊόν φορμαζάνης διαλύθηκε με αντικατάσταση 150 μL DMEM με τον ίδιο όγκο του DMSO. Η τιμή οπτικής πυκνότητας (OD) ανιχνεύθηκε σε μήκος κύματος 490 nm με ένα αναγνώστη μικροπλάκας (Bio-rad680, CA, USA). Τέσσερα αντίγραφα έχουν σχεδιαστεί για κάθε φρεάτιο, και η μέση τιμή υπολογίσθηκε τρεις φορές. Ο ρυθμός αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων υπολογίστηκε από τον ακόλουθο τύπο:. Ρυθμός αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης = (1 -OD αξία στην ομάδα μελέτης αξία /OD στην ομάδα ελέγχου) χ 100%

Η δοκιμή αναστολής της ανάπτυξης διεξήχθη για να αξιολογηθεί η ικανότητα του sinomenine και celecoxib να ευαισθητοποιήσει Caco-2 και MDR-Caco-2 κυττάρων προς δοξορουβικίνη. Μετά την προσκόλληση των κυττάρων στον τοίχο, μέσο DMEM (χωρίς FCS) που περιέχει sinomenine (500 μΜ), σελεκοξίμπη (25 μΜ), sinomenine (500 μΜ) συν PGE

2 (1 μΜ) με ένα διάστημα 2 h . Μετά από επώαση για 48 ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με ϋΜΕΜ (FCS-ελεύθερο) που περιέχει ντοξορουμπικίνη (1.6, 2.0, 2.4, 2.8, 3.2, 3.6, 4.0, 5.0, 6.0 μΜ) για 24 ώρες.

WST -1 κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

κύτταρα Caco-2 και τα κύτταρα MDR-Caco-2 κατά τη λογαριθμική φάση συλλέχθηκαν, επωάστηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων σε συγκέντρωση 2 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες με ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FCS. Μετά την προσκόλληση των κυττάρων στον τοίχο, μέσο DMEM (χωρίς FCS) που περιέχει sinomenine (500 μΜ), σελεκοξίμπη (25 μΜ), sinomenine (500 μΜ) συν PGE

2 (1 μΜ) με ένα διάστημα 2 h . Μετά από επώαση για 48 ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με ϋΜΕΜ (FCS-ελεύθερο) που περιέχει ντοξορουμπικίνη (1.6, 2.0, 2.4, 2.8, 3.2, 3.6, 4.0, 5.0, 6.0 μΜ) για 24 ώρες. 10 μL του WST-1 αντιδραστηρίου προστέθηκε (Roche Applied Science, Vilvoorde, Βέλγιο) και επωάζονται για 2 ώρες στους 37 ° C. Η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε στα 450 nm με αναγνώστη μικροπλάκας Labnet (Celbio, Μιλάνο, Ιταλία). Τα δεδομένα WST-1 παρουσιάζονται ως μέσος όρος (± SD) των τριπλών πειραμάτων.

PGE

2 Εκτίμηση

MDR-Caco-2 και Caco-2 κύτταρα σε πυκνότητα 5 × 10

6 σπάρθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας 90 mm. Αυτά επωάστηκαν με ή χωρίς snomenine (500 μΜ) για 48 ώρες. Στο τέλος της περιόδου αγωγής, το μέσο καλλιέργειας συλλέχθηκε για να προσδιοριστεί η ποσότητα της PGE

2 που εκκρίνεται από αυτά τα κύτταρα και αποθηκεύονται στους) -80 ° C. Η ποσοτική ανάλυση της PGE

2 απελευθερώνεται στο μέσο αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας PGE

2 κιτ ανοσοπροσδιορισμού σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Cayman Chemical Company, USA).

Ανοσοκυτοχημεία

Η κατανομή της Ρ-gp στην κυτταρική μεμβράνη και πυρηνική μετατόπιση του ΝΡ-κΒ ρ65 αναλύθηκε με ανοσοκυτταροχημεία ως τυπικές διαδικασίες. Εν συντομία, Caco-2 και MDR-Caco-2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με sinomenine (500 μΜ) και μέσο ελέγχου (χωρίς sinomenine) για 48 ώρες και μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη. Τα κύτταρα επωάστηκαν με Ρ-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp) αντι-ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (1:200 αραίωση) ή ΝΡ-κΒ αντι-ανθρώπινο αντίσωμα πολυκλωνικό ρ65 κουνελιού (1:200 αραίωση) για 1 ώρα που ακολουθείται από επώαση με FITC επισημασμένο κατσίκα αντι-ποντικού IgG (1:200 αραίωση) ή IgG αντι-κουνελιού σημασμένο με FITC κατσίκας (1:200 αραίωση) για 1 ώρα, αντίστοιχα. Τέλος, τα κύτταρα εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA).

Σε πραγματικό χρόνο σχετική ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Δοκιμασία

Για να διερευνήσουν η επίδραση της sinomenine και celecoxib σε P-gp και έκφραση της COX-2, σε πραγματικό χρόνο σε σχέση ποσοτική PCR εκτελέστηκε. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων με ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FCS για 24 ώρες. Caco-2 και MDR-Caco-2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με sinomenine (500 μΜ) ή σελεκοξίμπη (25 μΜ) για 48 ώρες.

Ολικό RNA απομονώθηκε με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Keygen Biotech Co., Ltd, Nanjing , Κίνα), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το απομονωμένο RNA ποσοτικοποιήθηκε με φασματοφωτομετρία (οπτική denisty 260/280 nm). Το mRNA στη συνέχεια μεταγράφεται αντίστροφα σε cDNA, σύμφωνα με PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time αγοράζονται από την Takara Bio Inc. (Dalian, Κίνα).

Σε πραγματικό χρόνο σε σχέση ποσοτικής PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των Applied Biosystems 7500 ταχύτερη Real-Time PCR System με την SYBR πρόμιγμα Ex Taq (ΤΙΊ ΚΝάσηΗ Plus) Master Mix αγοράζονται από την Takara Bio Inc (Dalian, Κίνα) εις τριπλούν για κάθε δείγμα και κάθε γονίδιο. PCR διεξήχθησαν με τη χρήση των ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών που καταγράφονται στον Πίνακα 1, η οποία περιγράφει το μέγεθος των αναμενόμενων θραυσμάτων. Οι συνθήκες PCR που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: μετουσίωση στους 95 ° C για 30 s, που ακολουθείται από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 5 s και 30 s στους 60 ° C για ανόπτηση και 30 δευτερόλεπτα στους 72 ° C για επιμήκυνση. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως η τιμή αναλογία της τιμής CT για mRNA στόχου με εκείνη του mRNA β-ακτίνης (Ct δείγμα /Ctβ-ακτίνη).

Η

Ανάλυση Western Blot

στυπώματα Western διεξήχθησαν βάσει τυποποιημένων διαδικασιών. Εν συντομία, συλλέχθηκαν κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS (ρΗ 7.4). Πυρηνικά εκχυλίσματα απομονώθηκαν με τη χρήση του /κυτταρόπλασμα Kit κλασματοποίηση των πυρηνικών (Keygen Biotech Co., Ltd, Nanjing, Κίνα), σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Συνολικής πρωτεΐνης εξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή του κιτ δοκιμής από Nanjing keygen Biotech. CO., LTD (Κίνα). Μετά τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης πρωτεΐνης των δειγμάτων με χρήση του προσδιορισμού δικιγχονινικού οξέος (BCA) πρωτεΐνη, ίσες ποσότητες των δειγμάτων πρωτεΐνης (30 μg πρωτεΐνης) διαχωρίστηκαν επάνω σε πηκτές SDS-πολυακρυλαμιδίου (8% για Ρ-gp, 15% για την COX-2, 12% για ΝΡ-κΒ ρ65, ρ-ΙκΒ-α, α-ΙκΒ και βήτα-ακτίνη).

Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF. Μετά τον αποκλεισμό εντός 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris που περιέχει 0.05% Tween-20 (TTBS), η μεμβράνη PVDF επωάστηκε όλη τη νύκτα σε ρυθμιστικό αποκλεισμού με αραιό πρωτογενή αντισώματα: αντι-Ρ-γλυκοπρωτεΐνη (1:500 αραίωση), αντι- ρ-ΙκΒ-α (Ser 32/36) και αντι- ΙκΒ-α (1:300 αραίωση), αντι-ΝΡ-κΒ ρ65 (1:400 αραίωση), αντι-COX-2 (1:500 αραίωση) και αντι -β-ακτίνης (1:1000 αραίωση), στους 4 ° C. Ακολούθως, η μεμβράνη PVDF πλύθηκε τρεις φορές χρησιμοποιώντας TTBS, που ακολουθείται από την έκθεση στο δευτερεύον αντίσωμα: συζευγμένο με υπεροξειδάση AffiniPure αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού και αντι-ποντικού IgG (Βιοσύνθεση Biotechnology, Beijing, Κίνα, 1:2000 αραίωση). Οι ζώνες του προϊόντος φωτογραφήθηκαν, και η πυκνότητα κάθε ζώνης προϊόντος ποσοτικοποιήθηκε με το σύστημα XRS ChemiDoc τεκμηρίωσης (Bio-Rad Laboratories). Η ένταση κάθε σήματος διορθώθηκε χρησιμοποιώντας τις τιμές που λαμβάνονται από την ανοσο-β-ακτίνης.

Στατιστικές Αναλύσεις

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SE. Μια προκαταρκτική ανάλυση ήταν. πραγματοποιείται για να προσδιοριστεί κατά πόσον οι σύνολα δεδομένων που παρέχεται με ένα κανονικό. διανομής, και ένας υπολογισμός της ομοιογένειας της διακύμανσης διεξήχθη χρησιμοποιώντας τεστ Bartlett του. Τα μέσα μεταξύ των ποικίλων δειγμάτων συγκρίθηκαν με ANOVA, και πολλαπλές συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο λιγότερο σημαντική διαφορά (LSD). Εάν οι τιμές F ήταν σημαντικές (Ρ & lt? 0,05), η μέθοδος του Dunnett χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τις ατομικές διαφορές μεταξύ των μέσων, και Ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά με τη χρήση του λογισμικού SPSS 11.5 για windows.

Αποτελέσματα

Επίδραση της Sinomenine, Celecoxib και PGE

2 σε Caco-2 Βιωσιμότητας

Πειράματα που διεξήχθησαν με επώαση των κυττάρων Caco-2 έως 48 ώρες με αυξανόμενες συγκεντρώσεις sinomenine, αποκάλυψε ότι αυτή η ένωση δεν επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων Caco-2 σε συγκεντρώσεις 500 μΜ ή λιγότερο (Εικ. 1Α). Μια συγκέντρωση 500 μΜ επιλέχθηκε ως η συγκέντρωση εφαρμογής.

Οι κυτταροτοξικές επιδράσεις των υποδεικνύεται ενώσεων σε κύτταρα Caco-2 προσδιορίστηκαν με ανάλυση ΜΤΤ. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SE. κύτταρα Όχημα επεξεργασμένα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος κανονικοποίηση. * P & lt? 0.5, ** P & lt?. 0.05

Η

δόσης-απόκρισης και μελέτες χρονικής πορείας έδειξε ότι celecoxib, ένας ειδικός αναστολέας της COX-2 δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των Caco-2 κυττάρων σε δόσεις που κυμαίνονται από 0 έως 25 μΜ (Σχ. 1Β). Προηγούμενες μελέτες υποδεικνύουν ότι σελεκοξίμπη ρυθμίζει την έκφραση MDR1 με αναστολή της δραστικότητας του ενζύμου COX-2 σε μια συγκέντρωση 25 μΜ. Έτσι, επελέγη μία δόση των 25 μΜ για πειράματα μας [18].

Για να αξιολογηθεί το κατά πόσον PGE

2 θα μπορούσε να επηρεάσει τα αποτελέσματα του sinomenine, τα κύτταρα Caco-2 επωάστηκαν με ή χωρίς αυξανόμενες συγκεντρώσεις (0 έως 10 μΜ) της PGE

2, ένα τελικό προϊόν της COX-2, έδειξε ότι αυτή η ένωση δεν επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων Caco-2 σε οποιαδήποτε συγκέντρωση που δοκιμάστηκε (Εικ. 1 C). Μελέτες έχουν δείξει ότι PGE

2 ρυθμίζει την έκφραση MDR1 σε συγκέντρωση 1 μΜ [12], [18], [19], και υπονοείται ότι Akt μπλοκάρεται στο μηχανισμό. Ως εκ τούτου, επιλέξαμε τη δόση του 1 μΜ στα πειράματά μας.

Sinomenine και Σελεκοξίμπη Ενισχυμένη δοξορουβικίνη που προκαλείται Ctotoxicity τόσο σε Caco-2 και MDR-Caco-2 κύτταρα

Για να αξιολογηθεί κατά πόσον sinomenine και celecoxib θα μπορούσε να ευαισθητοποιήσει κύτταρα Caco-2 και MDR-Caco-2 στην κυτταροτοξική δράση της δοξορουβικίνης, Caco-2 και τα κύτταρα MDR-Caco-2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με δοξορουβικίνη (10

-5 έως 10 μΜ) απουσία ή παρουσία του sinomenine (500 μΜ), σελεκοξίμπη (25 μΜ), ή sinomenine (500 μΜ) συν PGE

2 (1 μΜ) για 48 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ (Εικ. 2 Α και Β) και WST-1 προσδιορισμό (Σχ. 2 Γ και Δ). Η δοξορουβικίνη μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα δοσοεξαρτώμενο τόσο σε κύτταρα MDR-Caco-2 Caco-2 και με IC

50 τιμή περίπου 2,41 ± 0,15 μΜ και 4,67 ± 0,12 μΜ (Σχ. 2 Α), αντίστοιχα. Στην ΜΤΤ δοκιμασία, της ταυτόχρονης θεραπείας των κυττάρων Caco-2 με sinomenine, ή σελεκοξίμπη, ευαισθητοποιημένα κύτταρα Caco-2 στην κυτταροτοξική δράση της δοξορουβικίνης με μία μείωση στην IC

50 τιμές από 2,41 ± 0,15 μΜ έως 1,91 ± 0,16 μΜ και 1,85 ± 0.2 μΜ (Σχ. 2 Α), αντίστοιχα. Παρ ‘όλα αυτά, της ταυτόχρονης θεραπείας με sinomenine συν PGE

2 δεν είχε επίδραση επί της ευαισθησίας των Caco-2 κυττάρων προς δοξορουβικίνη.

Caco-2 και MDR-Caco-2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 48 ώρες με δοξορουβικίνη (10

-5 έως 10 μΜ) μόνη ή σε συνδυασμό με sinomenine (500 μΜ), σελεκοξίμπη (25 μΜ), ή sinomenine (500 μΜ) συν PGE

2 (1 μΜ). Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε στη συνέχεια με δοκιμασία ΜΤΤ. ομάδα Ct (Α και C) αναφέρεται σε ομάδα δοξορουβικίνη επεξεργασμένο Caco-2 και ομάδα Ct (Β και D) αναφέρονται σε ομάδα δοξορουβικίνη αγωγή MDR-Caco-2. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. (N = 3) από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν. ** Ρ & lt? 0,01, * Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα δοξορουβικίνη επεξεργασμένο Caco-2. ## Ρ & lt? 0.01, # Ρ & lt?. 0.05, σε σύγκριση με την ομάδα δοξορουβικίνη επεξεργασμένο MDR-Caco-2

Η

Sinomenine και celecoxib ενισχυθεί επίσης η κυτταροτοξική δράση της doxorubicin σε κύτταρα MDR-Caco-2, η οποία μειώθηκε το IC

50 τιμή από 4,67 ± 0,12 μΜ έως 2,45 μ ± 0,14 μΜ και 2,56 μΜ ± 0,11 μΜ (Εικ. 2 Β), αντίστοιχα. Παραδόξως, της ταυτόχρονης θεραπείας με sinomenine συν PGE

2 είχαν αρνητική επίδραση στην ευαισθησία των Caco MDR-2-κυττάρων προς δοξορουβικίνη με αυξημένο IC

50 τιμή από 4,67 ± 0,12 μΜ έως 5,35 μ ± 0,13 μΜ.

WST-1 προσδιορισμό, το IC

50 αξία των κυττάρων Caco-2 μειώθηκε από 2,33 ± 0,14 μΜ έως 1,85 ± 0,13 μΜ και 1,88 ± 0,21 μΜ (Σχ. 2 C). Ωστόσο ταυτόχρονης θεραπείας με sinomenine συν PGE

2 αποδυνάμωσε την ευαισθησία των κυττάρων Caco-2 προς δοξορουβικίνη με μείωση της IC

50 τιμές από 2,33 ± 0,14 μΜ σε 2,55 ± 0,17 μΜ (Εικ. 2 C). Sinomenine και celecoxib ενίσχυσαν επίσης την κυτταροτοξική δράση της doxorubicin σε κύτταρα MDR-Caco-2, η οποία μειώθηκε το IC

50 τιμή από 4,55 ± 0,19 μΜ έως 2,55 μ ± 0,25 μΜ και 2,52 μΜ ± 0,18 μΜ (Σχ. 2 Δ) , αντίστοιχα. Περιέργως, της ταυτόχρονης θεραπείας με sinomenine συν PGE

2 είχαν αρνητική επίδραση στην ευαισθησία των Caco MDR–2 κυττάρων προς δοξορουβικίνη με αυξημένο IC

50 τιμή από 4,55 ± 0,19 μΜ σε 5,15 μ ± 0,14 μΜ (Εικ. 2 D).

Sinomenine Μειώθηκε PGE

2 Release

Για να εξετάσουμε πιο προσεκτικά τη συμμετοχή της COX-2, η PGE

2, ένα τελικό προϊόν COX-2, που κυκλοφόρησε από τις κύτταρα MDR-Caco-2 Caco-2 και προσδιορίσθηκε με την μέθοδο ELISA. Τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς μια σημαντική αύξηση των

2 επίπεδα PGE σε MDR-Caco-2 κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα Caco-2 και μια σημαντική μείωση των επιπέδων της PGE2 σε κύτταρα MDR-Caco-2 υποβάλλεται σε επεξεργασία με sinomenine (Σχ. 3).

MDR-Caco-2 και Caco-2 κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες παρουσία ή απουσία 500 μΜ sinomenine, όπως υποδεικνύεται, και συλλέχθηκαν. Υπερκείμενα στη συνέχεια συλλέγονται για PGE

μέτρησης 2. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. (N = 3) από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν. Σε σύγκριση με τα κύτταρα Caco-2, η PGE

2 επίπεδα σε κύτταρα MDR-Caco-2 αυξήθηκαν σημαντικά (Ρ & lt? 0,01), η οποία μειώθηκε σημαντικά σε κύτταρα κατεργασμένα με sinomenine 2 MDR-Caco-(Ρ & lt? 0,01).

Sinomenine και Σελεκοξίμπη μειωτικά η έκφραση της P-gp /MDR1 σε MDR-Caco-2 κύτταρα

για να κατανοήσουμε το μηχανισμό της αντίστασης που αναπτύχθηκε σε κύτταρα MDR-Caco-2, και ο μηχανισμός που εμπλέκεται στην sinomenine και celecoxib ευαισθητοποίηση κυττάρων MDR-Caco-2 προς δοξορουβικίνη, ανοσοφθορισμό κυτταροχημεία, ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου, και western αποτύπωση πραγματοποιήθηκαν. Τα αποτελέσματα έδειξαν υπερέκφραση του MDR1 mRNA και της πρωτεΐνης μειώθηκαν σημαντικά με την παρουσία του sinomenine και celecoxib (Εικ. 4).

Πολυανθεκτική Caco-2 (MDR-Caco-2) κύτταρα αναπτύχθηκαν με έκθεση του Caco -2 κυττάρων σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις δοξορουβικίνης (από 0,1 μΜ έως 1,6 μΜ σε 7 ημέρες). κύτταρα MDR-Caco-2 επωάστηκαν χωρίς δοξορουβικίνη για μια εβδομάδα πριν από τα πειράματα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα MDR-Caco-2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς sinomenine (500 μΜ) και celecoxib (25 μΜ) για 48 ώρες. (Α) ανοσοκυτταροχημεία στοχεύουν P-gp (πράσινο). (Β) Ανάλυση Western blot των sinomenine και celecoxib μεσολάβηση επίδραση στην έκφραση Ρ-σρ σε κύτταρα Caco-2 και τα κύτταρα MDR-Caco-2. Αντίσωμα προς βήτα-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε για να εξασφαλιστεί η ίση φόρτωση πρωτεϊνών σε κάθε λωρίδα. (Γ) Οι σχετικές τιμές πυκνότητας μπάντα στις λωρίδες έκφραση της P-gp περιγράφεται στο μπαρ chat. (D) σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση της έκφρασης MDR1 σε κύτταρα Caco-2 και τα κύτταρα MDR-Caco-2 υποβάλλεται σε επεξεργασία με ή χωρίς sinomenine. Βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερική αναφορά για την ανίχνευση της έκφρασης MDR1. Όλα τα παραπάνω αποτελέσματα εκφράζονται ως το μέσο ± SE (η = 3) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *, P & lt? 0,05 και **, Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με την ομάδα MDR-Caco-2

Η

Sinomenine μειωτικά την έκφραση της COX-2 σε MDR-Caco-2 κύτταρα

για να κατανοήσουμε τον ρόλο των COX-2 στην ανάπτυξη της αντίστασης, και την επίδραση της sinomenine στην έκφραση της COX-2, Caco-2 και MDR-Caco-2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς sinomenine και σελεκοξίμπη, ένα COX-2 συγκεκριμένο αναστολέα, μέσω ποσοτικής σε πραγματικό χρόνο PCR και κηλίδωση Western. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η COX-2 υπερεκφράζεται σε κύτταρα MDR-Caco-2 και sinomenine κατέστειλε έκφραση COX-2 (Σχ. 5). Πέρα από αυτό, celecoxib δεν έχει καμία επίδραση στην έκφραση. Μπορούμε να συμπεράνουμε ότι celecoxib, ως ειδικός αναστολέας της COX-2, αναστέλλει την λειτουργία του COX-2 και όχι τη ρύθμιση της έκφρασης του.

κύτταρα MDR-Caco-2 επωάστηκαν χωρίς δοξορουβικίνη για μια εβδομάδα πριν από τα πειράματα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα MDR-Caco-2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς sinomenine (500 μΜ) και celecoxib (25 μΜ) για 48 ώρες. (Α) Ανάλυση Western blot των sinomenine και celecoxib μεσολάβηση επίδραση στην έκφραση της COX-2 σε κύτταρα Caco-2 και τα κύτταρα MDR-Caco-2. Αντίσωμα προς βήτα-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε για να εξασφαλιστεί η ίση φόρτωση πρωτεϊνών σε κάθε λωρίδα. (Β) Οι σχετικές τιμές πυκνότητας μπάντα στις λωρίδες έκφραση της COX-2 που περιγράφεται στο μπαρ chat. (C) σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση της έκφρασης COX-2 σε κύτταρα Caco-2 και τα κύτταρα MDR-Caco-2 υποβάλλεται σε επεξεργασία με ή χωρίς sinomenine και celecoxib. Βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερική αναφορά για την ανίχνευση της έκφρασης COX-2. Όλα τα παραπάνω αποτελέσματα εκφράζονται ως το μέσο ± SE (η = 3) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *, P & lt? 0,05 και **, Ρ & lt?. 0.01 σε σύγκριση με την ομάδα MDR-Caco-2

Η

Sinomenine και Σελεκοξίμπη Μειώθηκε NF-κΒ ενεργοποίησης

P-gp έκφρασης έχει σαφώς συσχετίζεται με NF-κ Β ενεργοποίησης [17], [20], [21], η οποία διαμεσολαβείται από την φωσφορυλίωση της ΙκΒ-α. Στη συνέχεια, ενεργοποιείται υπομονάδας ρ65 του ΝΡ-κΒ μετατίθεται στον πυρήνα και συνδέεται στη θέση του DNA, η οποία τελικά ενεργοποιεί την μεταγραφή του MDR-1 [22]. Για να κατανοήσουμε τον μηχανισμό με τον οποίο sinomenine και celecoxib ενισχύουν την ευαισθησία του MDR-Caco-2 κυττάρων προς δοξορουβικίνη, ανοσοφθορισμό κυτταροχημεία, ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου, και κηλίδωση Western διεξήχθησαν για να ανιχνεύσουν υπομονάδα ρ65 σε πυρηνικά και κυτταροπλασματικά ρ-ΙκΒ-α και ΙκΒ-α. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η οδός ΝΡ-κΒ ενεργοποιήθηκε σε κύτταρα MDR-Caco-2, ενώ sinomenine και celecoxib κατέστειλε την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε μονοπάτι MDR-Caco-2 κύτταρα (Εικ. 6).

Στη συνέχεια, τα κύτταρα MDR-Caco-2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς sinomenine (500 μΜ) και celecoxib (25 μΜ) για 48 ώρες. (Α) με στόχο ανοσοκυτταροχημεία Ρ65 (πράσινο). (Β) ανάλυση κηλίδας Western των sinomenine και celecoxib μεσολάβηση επίδραση στην πυρηνική μετατόπιση του Ρ65 σε κύτταρα Caco-2 και τα κύτταρα MDR-Caco-2. Αντίσωμα προς βήτα-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε για να εξασφαλιστεί η ίση φόρτωση πρωτεϊνών σε κάθε λωρίδα. (Γ) Οι σχετικές τιμές πυκνότητας μπάντα στους διαδρόμους της πυρηνικής Ρ65 έκφρασης που περιγράφεται στο μπαρ chat. (Δ) Οι σχετικές τιμές πυκνότητας μπάντα στις κυτταροπλασματικές λωρίδες ρ-ΙκΒ-α που περιγράφεται στο μπαρ chat. Όλα τα παραπάνω αποτελέσματα εκφράζονται ως το μέσο ± SE (η = 3) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *, P & lt? 0,05 και **, Ρ & lt?. 0.01 σε σύγκριση με την ομάδα MDR-Caco-2

Η

Συζήτηση

Η χημειοθεραπεία χρησιμεύει ως ένα από τα σημαντικά θεραπείες για καρκίνο του παχέος εντέρου. Μακροχρόνια χημειοθεραπεία οδηγεί αναπόφευκτα σε αντίσταση στο φάρμακο και αυτό έχει γίνει μια σημαντική πρόκληση για το θρίαμβο της χημειοθεραπείας. Η εμφάνιση της ανθεκτικότητας στα φάρμακα μπορεί να συσχετίζεται με την αύξηση της δραστηριότητας της αντλίας εκροής, μία μείωση στην απορρόφηση του φαρμάκου, την ενεργοποίηση των ενζύμων αποτοξίνωσης, οι μεταβολές των φαρμακευτικών στόχων και τη μείωση της κυτταρικής απόπτωσης [23]. Προηγούμενες μελέτες για την αντλία εκροής έχουν δείξει ότι P-gp, που κωδικοποιείται από το γονίδιο MDR-1, παίζει σημαντικό ρόλο, όπως αντλίες φαρμακευτικής ουσίας εκτός για τη μείωση της κυτταροτοξικότητας παρουσιάζονται από καρκινικά κύτταρα και ενισχύει την αντίσταση του καρκινώματος σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Ωστόσο, η ανθεκτικότητα στο φάρμακο παρουσιάζεται από τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να αντιστραφεί αποτελεσματικά με καταστολή P-gp έκφραση και η λειτουργία [24], [25], [26].

Sinomenine, ένα βιοενεργό αλκαλοειδές που προέρχεται από

Sinomenium acutum

, χρησιμοποιείται για τη θεραπεία ρευματικών και αρθριτικών παθήσεων στην Κίνα. Sinomenine έχει μια ποικιλία λειτουργιών συμπεριλαμβανομένης της αντι-φλεγμονής και ανοσοκαταστολή [27], [28]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι sinomenine μείωσε την εκροή των υποδειγματικών υποστρωμάτων P-gp, όπως η διγοξίνη και paeoniflorin [6], [7], και sinomenine η ίδια θα μπορούσε να είναι ένα υπόστρωμα της P-gp [29]. Έτσι, οι μέθοδοι ρύθμισης της sinomenine στο P-gp παρέμενε άγνωστη. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι sinomenine μειωτικά P-gp έκφραση σε κύτταρα MDR-Caco-2 (Εικ. 4) και ενίσχυσε την ευαισθησία των κυττάρων MDR-Caco-2 προς δοξορουβικίνη (Εικ. 2). Μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι sinomenine ανέστειλε την έκφραση της COX-2 [30], [31]. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αυτά, τα ευρήματά μας εκδηλώνεται ότι sinomenine μειωτικά η έκφραση COX-2 σε-Caco-2 MDR κυττάρων (Εικ. 4) και μείωσε την PGE

2, ένα άκρο παραγωγή COX-2, που απελευθερώνεται από MDR-Caco- 2 κύτταρα (Σχ. 3).

COX-2, ένα από τα ένζυμο περιορισμού του ρυθμού στο μεταβολισμό του αραχιδονικού οξέος σε προσταγλανδίνες, υπερεκφράζεται σε ένα μεγάλο αριθμό ανθρώπινων πρωτογενών και μεταστατικών νεοπλασμάτων [32]. Είτε COX-2 εμπλέκεται στην ανάπτυξη αντοχής φαρμάκου που χαρακτηρίζεται από Ρ-gp υπερέκφραση είναι αμφιλεγόμενη. Πολλές μελέτες έδειξαν ότι η έκφραση COX-2 συσχετίζεται με την έκφραση της P-gp [33], [34]. Έχει αναφερθεί ότι ο αδενοϊός επιμόλυνση γονιδίου COX-2 up-ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου MDR-1 σε κύτταρα σπείραμα αρουραίων και διατήρησε την τοξικότητα της αδριαμυκίνης έναντι νεφρικών κυττάρων. Με την παρουσία του αναστολέα της COX-2 NS-398, τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου MDR-1 ήταν σημαντικά μειωμένες και η κυτταροτοξικότητα αδριαμυκίνης ενισχύθηκε [35]. Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, βρήκαμε ότι η έκφραση και των δύο COX-2 και P-gp είναι σημαντικά ενισχυμένη σε κύτταρα MDR-Caco-2. Celecoxib, ένας ειδικός αναστολέας της COX-2, μειωτικά την έκφραση Ρ-σρ σε κύτταρα MDR-Caco-2 και ευαισθητοποιημένα κύτταρα MDR-Caco-2 προς δοξορουβικίνη. Όπως προαναφέρθηκε, sinomenine ανέστειλε την έκφραση της COX-2 και P-gp. Επιπλέον, όταν τα κύτταρα MDR-Caco-2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με sinomenine συν PGE

2, sinomenine απέτυχε να ενισχύσει την τοξικότητα ντοξορουμπικίνης προς κύτταρα MDR-Caco-2 (Εικ. 2).

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι MDR-1 γονίδιο περιέχει θέσεις σύνδεσης για ΝΡ-κΒ, που θα μπορούσαν να συσχετίζονται με έκφραση MDR-1 γονίδιο [16], [17].

ΝΡ-κΒ υπάρχει γενικά ως ετεροδιμερές των πολυπεπτιδίων ρ50 και ρ65 , δεσμεύεται στο κυτταρόπλασμα από την πρωτεΐνη αναστολέα ΙκΒ [36], [37]. Μετά την κυτταρική διέγερση από μια σειρά κυτοκινών ή παθογόνων, ΙκΒ φωσφορυλιώνεται από το σύμπλοκο ΙκΒ κινάσης (ΙΚΚ) σε σερίνες 32 και 36, στη συνέχεια διασπώνται από το πρωτεόσωμα 26S. Στη συνέχεια, ΝΡ-κΒ μετατίθεται στον πυρήνα, όπου συνδέεται με ρυθμιστικά στοιχεία εντός της περιοχής του υποκινητή των γονιδίων στόχων. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η ΝΡ-κΒ ήταν κατάντη της COX-2 [38], ωστόσο, οι μελέτες έχουν δείξει ότι η προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης COX-2 θα μπορούσε να αναστείλει ΝΡ-κΒ [39], [40]. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι sinomenine και celecoxib κατέστειλε την ενεργοποίηση του NF-κΒ οδού στα κύτταρα MDR-Caco-2 (Εικ. 6).

Εν κατακλείδι, έχουμε αναπτύξει μια πολυανθεκτική Caco-2 (MDR-Caco-2) κυτταρική γραμμή με την έκθεση των κυττάρων Caco-2 σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις δοξορουβικίνης, η οποία υπερεκφράζεται τόσο P-gp και COX-2. Sinomenine μειωτικά την έκφραση του MDR1 mRNA και της πρωτεΐνης μέσω NF-κΒ μονοπάτι, και ανέστειλε την έκφραση της COX-2, η οποία συσχετίζεται με την έκφραση της P-gp. Τα ευρήματά μας, ως εκ τούτου, με την προϋπόθεση νέες γνώσεις σχετικά με την ρύθμιση της έκφρασης Ρ-σρ σε πολυανθεκτικά κύτταρα και προτεινόμενες νέες πιθανές στρατηγικές για την αναστροφή της αντίστασης αντικαρκινικού φαρμάκου P-gp μεσολάβηση. Ωστόσο, άλλα μόρια σηματοδότησης μπορεί επίσης να συμμετέχει στη ρύθμιση της δραστηριότητας των κυττάρων MDR-Caco-2 και έτσι να συμβάλλει πολυανθεκτικά ανάπτυξη. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διερευνηθεί ο τρόπος της COX-2, NF-κΒ και άλλα μόρια σηματοδότησης αλληλεπιδρούν στην ανάπτυξη της Ρ-gp μεσολάβηση πολυανθεκτικά σε καρκινικά κύτταρα.