Αφηρημένο

προκαλείται από χειρουργική επέμβαση φλεγμονή είναι ένας ισχυρός υποστηρικτής της υποτροπής του όγκου και των μεταστάσεων στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Το πρόσφατα ανακαλύφθηκε οικογένεια ενζύμων Nox αντιπροσωπεύουν μια σημαντική πηγή ενδογενούς αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και τώρα σε μεγάλο βαθμό εμπλέκονται στην κυτταρική μετάσταση όγκου. Είναι ενδιαφέρον, Nox ένζυμα μπορεί να είναι «σκόπιμα» ενεργοποιούνται από φλεγμονώδεις κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες οι οποίοι είναι παρόντες σε αφθονία στο παράθυρο περιεγχειρητική. Όπως κόλον καρκινικά κύτταρα εκφράζουν ένζυμα NOx και υποδοχέα ΤοΙΙ 4 (TLR-4), υποθέσαμε ότι LPS μπορεί να ενισχύσει την ικανότητα των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου σε μεταστάσεις μέσω ένζυμο Nox μεσολαβούμενη σηματοδότηση οξειδοαναγωγής. Σε υποστήριξη αυτής της υπόθεσης, το παρόν έγγραφο καταδεικνύει ότι LPS προκαλεί μία σημαντική, παροδική αύξηση της ενδογενούς ROS στα SW480, SW620 και CT-26 καρκινικά κύτταρα κόλου. Αυτή η αύξηση στην επαγόμενη από LPS δραστηριότητας ROS πλήρως καταργείται από έναν αναστολέα NOx, diphenyleneiodonium (DPI), Nox1 siRNA και ένας αναστολέας του ΝΡ-κΒ, διϋδροχλωρίδιο. Μια σημαντική αύξηση στην έκφραση της πρωτεΐνης Nox1 και Nox2 συμβαίνει μετά τη θεραπεία με LPS. Η αναστολή της ΝΡ-κΒ εξασθενεί επίσης την αύξηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Nox1 και Nox2. Η υπο-κυτταρική τοποθεσία της προκαλούμενης από LPS παραγωγή ROS έγκειται κυρίως στο ενδοπλασματικό δίκτυο. LPS ενεργοποιεί το ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι μέσω NOx παράγονται ROS και αυτό το σήμα αναστέλλεται από DPI. Αυτό ενεργοποιηθεί με LPS μηχανισμός Nox διευκολύνει μια σημαντική αύξηση στην κυτταρική προσκόλληση SW480 καρκίνος του παχέος εντέρου στο κολλαγόνο Ι, η οποία αναστέλλεται από DPI, Nox1 siRNA και ενός αναστολέα της ΡΙ3Κ. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η οξειδοαναγωγική σηματοδότησης άξονας LPS-Nox1 διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη διευκόλυνση της προσκόλλησης κυττάρου καρκίνου του παχέος εντέρου, αυξάνοντας έτσι την μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. Nox1 μπορεί να αντιπροσωπεύει έναν πολύτιμο στόχο για την πρόληψη των μεταστάσεων του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. O’Leary DP, Bhatt L, Woolley JF, Gough DR, Wang JH, Cotter TG, et al. (2012) TLR-4 σηματοδότηση Επιταχύνει Colon Cancer Cell Πρόσφυση μέσω NF-κΒ διαμεσολαβούμενη Μεταγραφική Up-κανονισμός του Nox-1. PLoS ONE 7 (10): e44176. doi: 10.1371 /journal.pone.0044176

Επιμέλεια: Sumitra Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 29, 2012? Αποδεκτές: 30 Ιουλίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 11 του Οκτ 2012

Copyright: © O’Leary et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η δεύτερη πιο κοινή αιτία του καρκίνου. σχετικές θνησιμότητας στο δυτικό κόσμο [1]. Η χειρουργική εκτομή παραμένει ο στυλοβάτης της θεραπευτικής αγωγής για τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Ωστόσο, περίπου το 25 έως 35% του κόμβου θετικούς ασθενείς θα αναπτύξουν είτε τοπική υποτροπή ή μετάσταση μακρινό μέσα σε πέντε χρόνια μετεγχειρητικά [2]. Αυτό το φαινόμενο οφείλεται στην απελευθέρωση φλεγμονωδών μεσολαβητών σε απόκριση σε χειρουργικό τραύμα, τα οποία ενισχύουν τη μεταστατική ικανότητα των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων και όγκων υπολειμματικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα αυτού του φαινομένου εκδηλώνεται με μία σημαντική μείωση σε ελεύθερη νόσου και συνολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του παχέος.

Προσκόλληση κυττάρου

όγκου είναι ένα ουσιαστικό βήμα της μεταστατικής καταρράκτη. Πρόσφατη απόδειξη έχει αποδείξει πως εξωγενή αντιδραστικά είδη οξυγόνου που προκαλείται από τη χειρουργική επέμβαση (ROS) ενισχύουν την ικανότητα των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων να προσκολλώνται στην ενδοθηλιακή επένδυση δημιουργώντας μεσοκυττάρια χάσματα, επιτρέποντας τα καρκινικά κύτταρα να προσκολληθούν κατά προτίμηση στην εκτεθειμένη εξωκυττάρια μήτρα. Αυτές οι καταστροφικές, κυτταροτοξικές επιδράσεις των ROS συμβαίνουν σε υψηλά επίπεδα. Ωστόσο, σε χαμηλά επίπεδα, η ενδογενής ROS μπορούν να προάγουν την κυτταρική επιβίωση μέσω της ρύθμισης των οδών ευαίσθητων επιβίωσης οξειδοαναγωγής όπως ΡΙ3Κ /Akt, η οποία έχει σε μεγάλο βαθμό εμπλακεί στη διευκόλυνση της μετάστασης των καρκινικών κυττάρων.

Nox ένζυμα είναι μια σημαντική πηγή ενδογενούς γενεά ROS σε απόκριση προς φλεγμονώδεις μεσολαβητές όπως κυτοκίνες, αυξητικούς παράγοντες και συνθήκες υποξίας, τα οποία είναι όλα αυξημένα σε απόκριση σε χειρουργικό τραύμα [3] – [4]. Nox ένζυμα αποτελούνται από μια οικογένεια ενζύμων 7, Nox1-5 και Duox1,2 [5]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση του ΝΟχ ενζύμων σε καρκινικά κύτταρα έχει πρόσφατα περιγραφεί και ΝΟχ προέρχεται ROS είναι τώρα γνωστό ότι διευκολύνει την μεταστατική διαδικασία σε καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων κόλου, το μελάνωμα, παγκρεατικό και γαστρικό καρκίνο κυττάρων [6] – [8]. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι οι επιπτώσεις σηματοδότησης των Nox που προέρχονται από ROS είναι το πλαίσιο εξαρτάται, δεδομένου ότι όχι μόνο προσδίδουν προ-φλεγμονώδη δράση, αλλά επίσης να διαδραματίσει έναν ρόλο μέσα στην κυτταρική αντι-φλεγμονώδη μηχανισμό άμυνας [9].

λιποπολυσακχαρίτη ( LPS) ή ενδοτοξίνη είναι ένας ισχυρός σκανδάλη του ξενιστή φλεγμονώδεις αποκρίσεις στο παράθυρο περιεγχειρητική. LPS είναι ένα gram αρνητικό βακτηριακό αντιγόνο που μεταθέτει κατά μήκος του τοιχώματος του εντέρου μετά από μείζονα χειρουργική επέμβαση ή κατά τη διάρκεια ενός επεισοδίου σηπτικής, με αποτέλεσμα μια ενδοτοξιναιμία [10]. Η αναγνώριση των LPS από ΤοΙΙ υποδοχέα 4 (TLR4) επάγει έμφυτη ανοσία μέσω ενός ενδο-κυτταρικού καταρράκτη σηματοδότησης σε MyD88 εξαρτημένα ή ανεξάρτητο τρόπο. Τόσο in vitro και in vivo μελέτες ενοχοποιούν τώρα LPS επαγόμενη TLR-4 σηματοδότηση ως έναυσμα της κάθε πτυχή της μεταστατικής καταρράκτη συμπεριλαμβανομένου προσκόλληση [11] – [12]. Επίσης, TLR-4 έκφραση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο σχηματισμού μετάστασης ήπατος σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και προσδίδει χειρότερη πρόγνωση [13] – [15].

Όπως υποδηλώνει πρόσφατα στοιχεία, επιτυχής μετάσταση καρκινικών κυττάρων προωθείται από τις καταστροφικές επιπτώσεις των εξωγενών ROS. Υποθέσαμε ότι τα ενδογενή μη-τοξικά επίπεδα των ROS μπορούν επίσης να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στην ενορχήστρωση μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Στο παρόν, έχουμε καταδείξει πώς ένας άξονας σηματοδότηση LPS-Nox1 οδηγεί σε σημαντική αύξηση της συγκολλητικής ικανότητας των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου. LPS ενεργοποίηση της δραστηριότητας Nox συμβαίνει με τρόπο που εξαρτάται ΝΡ-κΒ η οποία οδηγεί σε μία παροδική αύξηση της ενδοκυτταρικής ROS. Αυτή η παροδική αύξηση της ενδοκυτταρικής ROS προκαλεί φωσφορυλίωση των ευαίσθητων οξειδοαναγωγής Akt. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η οξειδοαναγωγική άξονας σηματοδότηση LPS-Nox1 διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη διευκόλυνση της προσκόλλησης κυττάρου καρκίνου του παχέος εντέρου, αυξάνοντας έτσι την μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου, SW480, SW-620 και CT-26 λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ένα υπο-συρρέουσα κατάσταση χρησιμοποιώντας RPMI (Roswell Park Memorial Institute) μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, και 4 mmol /L L-Γλουταμίνη όλα από την Sigma Aldrich, Δουβλίνο, Ιρλανδία . Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν όλη τη νύκτα πριν από τη θεραπεία με LPS για να επιτραπεί η σύνδεση

Αντισώματα και Αντιδραστήρια

LPS προέρχεται

E.coli

στέλεχος 055:. Β5 αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich. Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα – Nox1, Ρ22ΡΗΟΧ, p47phox (Santa-Cruz Biotechnology, Σάντα-Κρουζ, CA, USA), Nox2 (Upstate, Milton Keynes, UK), p-Akt (Cell Signaling), ΙκΒ-α , π-ΙκΒ-α (Cell σηματοδότηση), GAPDH (Advanced Immunochemicals, Long Beach, CA, USA). αναστολέας ΙΚΚ (διυδροχλωρική) αγοράστηκε από Sigma και ο αναστολέας ΡΙ3Κ (LY294002) αγοράστηκε από την EMD Chemicals (San Diego, CA, USA). Στοχευμένη knockdown του Nox1 διεξήχθη χρησιμοποιώντας siRNA. Δύο διαφορετικά κατασκευάσματα χρησιμοποιήθηκαν (Ambion, # s25726, s25727).

Η κυτταρομετρία ροής

5 × 10

4 κύτταρα ανά πηγάδι στρώθηκαν τη διάρκεια της νύχτας σε μια πλάκα 24 φρεατίων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με LPS σε συγκέντρωση 1 μg /ml για 0,10,20,30,40,50,60 λεπτά και 24 ώρες. παραγωγή ROS μετά από αγωγή με LPS παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας 2 ‘, 7’ διοξική dichlorodihydrofluorescin (DCF) (Molecular Probes, Leidin, Κάτω Χώρες). Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στις 1000 στροφές ανά λεπτό και κατόπιν συλλέχθηκε. DCF συνέχεια προστέθηκε σε μια τελική συγκέντρωση 50 μΜ και τα δείγματα επωάστηκαν για 15 λεπτά στους 37 ° C πριν την ανάλυση σε ένα κυτταρόμετρο ροής ΡΑΟδοαη (Becton Dickinson, Οξφόρδη, Ηνωμένο Βασίλειο). Dichlorofluorescin (DCF) φθορισμού, δημιουργείται όταν DCF αλληλεπιδρά με ROS. ROS Ετσι μετράται σε κανάλι φθορισμού 1 (FL-1) (530 nm) με διέγερση στα 488 nm. CellQuest λογισμικό (Becton Dickinson) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων.

Western Blotting

Κηλίδωση Western διεξήχθη για να μετρηθεί η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες των κυττάρων σε επεξεργασία με 1 μg /ml LPS για 0,10,20, 30,40,50,60 λεπτών και 24 ωρών. Τα κύτταρα στη συνέχεια trysinised και φυγοκεντρείται για συλλογή. Ολικά κυτταρικά εκχυλίσματα κατόπιν ελήφθησαν. Τα κυτταρικά ιζήματα πλύθηκαν με παγωμένο PBS και μετά επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης 50 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 150 mMNaCl, 1 mMNa3VO4, 1 mMNaF, 1 mMEGTA, Nonidet Ρ-40, 0,25% δεοξυχολικό νάτριο που περιείχε αναστολείς πρωτεάσης 1% ( Roche Diagnostics, Lewes, UK) και 0.2 mM 4- (2-αμινοαιθυλ) υδροχλωρικής φθοριούχο βενζολοσουλφονυλ] και επωάζεται σε πάγο για 20 λεπτά. Όλα υπολείμματα απομακρύνονται με φυγοκέντρηση στους 4 ° C και συγκέντρωση πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό Bio-Rad πρωτεΐνης (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK) χρησιμοποιώντας αλβουμίνη βόειου ορού ως πρότυπο. Ισοδύναμες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας μετουσιωτική ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου θειικού δωδεκυλ-νατρίου, ακολουθούμενη από μεταφορά σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Schleicher & amp? Schuell, Whatman, Dassel, Germany). Οι μεμβράνες δεσμεύτηκαν με 5% (w /v) μη λιπαρό ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με Τπδ αλατούχο /0.1% Tween-20 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Αυτά επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύχτα με την κατάλληλη αραίωση του πρωτογενούς αντισώματος (1:1000 εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά). Μετά από 4 × 5-λεπτες πλύσεις με αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris /0.1% Tween-20, τα στυπώματα επωάστηκαν με τα αντίστοιχα συζευγμένο με υπεροξειδάση δεύτερο αντίσωμα (αραίωση 1:1000) για 1 ώρα. Αυτά στη συνέχεια πλύθηκαν και πάλι και αναπτύσσονται με αντιδραστηρίου ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Σχολαστικά για GAPDH (1:5000) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί ίση φόρτωση πρωτεϊνών.

ανοσοφθορισμού και Μικροσκοπία

Για να εντοπιστεί ROS που δημιουργούνται κατά την επεξεργασία με LPS σε κύτταρα SW480, κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες πριν από το πείραμα σε γυάλινα πιάτα πυθμένα (35 χλστ Petri-πιάτα με μικροφρεάτια 14 mm? MatTek Corporation, Ashland, ΜΑ, USA). Τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για ζωντανή απεικόνιση επωάστηκαν σε 50 μΜ DCF και βαφή ER ιχνηλάτης 1 μΜ (Molecular Probes, Leiden, Ολλανδία) για 1 ώρα στους 37 ° C. Ένα μικρο-μοριακή LPS προστέθηκε στα κύτταρα που περιέχουν το βαφές 30 λεπτά πριν από την απεικόνιση. Όπου αναφέρεται, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ DPI με DCF και βαφές ιχνηλάτης ER για 1 ώρα στους 37 ° C και 1 μΜ LPS προστέθηκε στα κύτταρα 30 λεπτά πριν από την απεικόνιση. Μετά από αυτή την επώαση με τις βαφές, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν και απεικονίστηκαν σε κάθε μέσο ανάπτυξης που περιέχει LPS ή LPS και DPI ή το μέσο ανάπτυξης μόνο. Συγκεντρώσεις για DPI και LPS διατηρήθηκαν στην πλύση μέσο ανάπτυξης και ενώ απεικόνισης κυττάρων. κύτταρα SW480 επίσης χρωματίστηκαν με 8 μΜ Μεναδιόνη για 1 ώρα μαζί με 10 μΜ MitoPY και 1 μΜ Mitotracker βαθύ κόκκινο (Invitrogen). Μεναδιόνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Επιπροσθέτως, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με MitoPY υποβλήθηκαν σε αγωγή με LPS 1 μg /ml πριν από την απεικόνιση. SW480 κυττάρων απεικονίστηκαν με ένα μικροσκόπιο πολυφωτονικών λέιζερ σάρωσης Flouview1000 MPE (Mason Τεχνολογίας, Δουβλίνο, Ιρλανδία) με ένα υπέρυθρο κόκκινο Ti: Sapphire λέιζερ που είναι η λειτουργία κλειδωμένο. Οι εικόνες ελήφθησαν και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα XLPLN 25 × στόχος βύθιση στο νερό WMP (1,05 αριθμητικό άνοιγμα: Ολύμπου Optical GmbH, Hamburg, Germany) και οι εικόνες αποθηκεύονται με το λογισμικό flouview1000 Ολύμπου (Mason Τεχνολογίας, Δουβλίνο, Ιρλανδία). Κατά τη διάρκεια της απόκτησης, ρυθμίσεις ανίχνευση διατηρήθηκαν σταθερές για DCF να επιτρέψει την άμεση σύγκριση των επιπέδων ROS, όπου κύτταρα που κατεργάζονται με LPS συγκρίθηκαν με μη επεξεργασμένα ή LPS και DPI επεξεργασμένα κύτταρα. Οι εικόνες έχουν παρασταθεί ως ένα ενιαίο κομμάτι από μία προεξοχή Ζ-stack.

ποσοτική PCR

Ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε σε ολιγο-άΤ cDNA που παράγεται χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης 2 MJ Research Opticon σε συνδυασμό με η Quantitect SYBR Green ΡΟΚ Master Mix (Qiagen, Crawley, Ηνωμένο Βασίλειο). Οι εκκινητές για Nox1, Nox2 και β-ακτίνης αγοράστηκαν ως Quantitect Primer δοκιμασίες (Qiagen). Οι ακόλουθες παράμετροι της PCR χρησιμοποιήθηκαν για κάθε σετ εκκινητή: μετουσίωση στους 95 ° C για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από 45 κύκλους των 94 ° C για 15 δευτερόλεπτα, θερμοκρασία ανόπτησης 56 ° C για 30 δευτερόλεπτα και επέκταση στους 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα . RNA δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν και Nox1 ή Nox2 έκφρασης σε σχέση με β-ακτίνης προσδιορίζεται μέσω της 2

-ΔΔCt μέθοδο.

δοκιμασίας προσκόλλησης

96 φρεατίων επικαλύφθηκαν με 150 μl /φρεάτιο 0.01% κολλαγόνο Ι όλη τη νύχτα στους 4 ° C και στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν με 1% BSA για 1 ώρα στους 37 ° C πριν την σπορά των κυττάρων. 5 × 10

4 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 100 μΐ μέσου καλλιέργειας και σπείρονται σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 1 ώρα. Κάθε φρεάτιο στη συνέχεια πλύθηκε με PBS και στη συνέχεια 1% crystal violet χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των κυττάρων για 20 λεπτά. Πλάκα πλύθηκε 3 φορές και στη συνέχεια αφήνεται όλη τη νύχτα να στεγνώσει σε tempeture δωματίου. Κρύσταλλο χρώση ιώδες στη συνέχεια διαλύθηκε σε 10% οξικό οξύ και η συγκέντρωση προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 570 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτομετρικό αναγνώστη μικροπλακός.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SPSS έκδοση 18.1 για των windows (SPSS, Δουβλίνο, Ιρλανδία). Τα δεδομένα δίδονται ως μέση τιμή ± SD. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε με t-test του Student για συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων, και η ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA). Πυκνότητας σε κηλίδες Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ImageJ (από https://rsb.info.nih.gov/ij/download.html). Γραφικές παραστάσεις κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το Microsoft Excel 2010. Όλες οι τιμές γράφημα αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές +/- τυπική απόκλιση. Η τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

LPS επαγόμενη σηματοδότηση TLR-4 αυξάνει τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS στα άνω και κάτω τελεία καρκινικά κύτταρα

SW480, SW620 και CT. -26 κύτταρα εκφράζουν TLR-4 και, συνεπώς, επιλέξαμε να εξετάσουμε την επίδραση του LPS επαγόμενη παραγωγή ROS [16]. Όπως προσδιορίζεται με FACScan ανάλυση, μια παροδική αύξηση του ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS παρατηρείται σε απόκριση στη θεραπεία LPS μετά από 40 λεπτά σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1 (α)). Ενδογενή επίπεδα των ROS είναι σχεδόν στα επίπεδα του ελέγχου σε 60 λεπτά. Αυτά τα δεδομένα ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα υπολογιστή CellQuest για τη μέτρηση των γεωμετρικών μέσων των καμπυλών (Σχήμα 1 (β)). κύτταρα SW480 παράγουν σταθερά υψηλότερα επίπεδα ενδοκυτταρικής ROS σε σύγκριση με SW620 και κύτταρα CT-26. Σε αυτή τη βάση κύτταρα SW480 είναι η κύρια εστίαση της τα επόμενα πειράματα.

(α) LPS προκάλεσε μία παροδική, σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα ROS σε SW480, SW620, Ct-26 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. SW480, SW620 και CT-26 κύτταρα κατεργάστηκαν με LPS (1 μg /ml) σε είκοσι, σαράντα και εξήντα λεπτά. DCF φθορισμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής ΡΑΟδοαη και λογισμικό CellQuest. Αυτά τα αποτελέσματα συγκεντρώνονται στα παραπάνω ιστογράμματα. Το Υ-άξονας αντιπροσωπεύει τον αριθμό των κυττάρων και για τα μέτρα άξονα χ του επιπέδου φθορισμού. Μια στροφή προς τα δεξιά κατά μήκος του άξονα x αντιπροσωπεύει το υψηλότερο επίπεδο φθορισμού DCF και έτσι την παραγωγή ROS. Όλα τα ιστογράμματα δείχνουν ελέγχου (στερεά μαύρη γραμμή) με μια γραμμή το χρώμα που αντιπροσωπεύει μια αύξηση του φθορισμού DCF. Η επίδραση του LPS στην δραστικότητα ROS σε SW480, SW620 και CT-26 κύτταρα καρκίνου κόλου ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας CellQuest για τη μέτρηση των γεωμετρικών μέσων των καμπυλών και συγκρίθηκαν με δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής δοκιμάστηκαν την ίδια ημέρα, και σε σύγκριση με ραβδόγραμμα. (Β) LPS επάγει μία εξαρτώμενη από τη δόση ROS έσκασαν σε 40 λεπτά. Μια κυτταρομετρία ροής ιστόγραμμα δείχνει μια εξαρτώμενη από τη δόση της δραστηριότητας ROS. (Στερεά μαύρη γραμμή = χωρίς θεραπεία, πράσινο = 0,1 μg /ml, κόκκινη = 1 μg /ml, μπλε = 10 μg /ml Η εξαρτώμενη επίδραση δόση ποσοτικά και συγκρίνονται με ένα γράφημα μπαρ * P & lt?… 0.05 Τα στοιχεία αυτά είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξαρτήτων πειραμάτων.

η

επόμενο επεδίωξε να εξετάσει αν αυτή η επαγόμενη από LPS αύξηση σε ενδογενή ROS ήταν αποκρίνονται σε μεταβολές στη δόση του LPS. Δείχνουμε ότι καθώς η δόση του LPS αυξάνει, η ROS αυξήσεις απόκριση (Σχήμα (1 b)). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα κύτταρα SW480 παράγουν ενδογενή ROS σε απόκριση προς TLR-4 σηματοδότηση σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

επαγόμενη από LPS παραγωγή ROS στα κύτταρα SW480 είναι καταργήθηκε από Nox αναστολέα ενζύμου

Δεδομένου ότι TLR-4 σηματοδότηση προκαλεί μια σημαντική αύξηση των ενδογενών επιπέδων ROS, εμείς δίπλα επιδίωξε να αποδείξει την ενδοκυτταρική πηγή της προκαλούμενης από LPS ROS. LPS επαγόμενη δραστικότητα ROS είναι γνωστό ότι περιλαμβάνει TLR-4 μεσολαβεί αλληλεπίδραση με Nox4 σε εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα [17]. Ωστόσο, η ενδο-κυτταρική πηγή του LPS επαγόμενης ROS σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Άλλες εύλογες πηγές της ενδογενούς παραγωγής ROS εκτός από τα ένζυμα Nox περιλαμβάνουν τα μιτοχόνδρια και τα ένζυμα COX. Με αυτό στο μυαλό μας χρησιμοποιείται στοχευμένες αναστολείς την πρόληψη της παραγωγής ROS στα κύτταρα SW480 από όλες αυτές τις πηγές, συμπεριλαμβανομένου ενός αναστολέα μιτοχονδριακό (ροτενόνη), ένας αναστολέας COX (diclofenac) και ενός αναστολέα της πρωτεΐνης Nox (DPI). Προ-θεραπεία με rotenone συνδέθηκε με μια μικρή αύξηση στα επίπεδα ROS, σύμφωνα με τις πρόσφατες αναφορές ότι ροτενόν να ενεργοποιήσετε δραστηριότητα Nox [18]. Diclofenac δεν προκαλεί σημαντική μείωση στην επαγόμενη από LPS ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS (Σχήμα 2 (α) και (β)). Είναι ενδιαφέρον ότι, προ-θεραπεία με DPI έχει ως αποτέλεσμα την πλήρη κατάργηση της προκαλούμενης από LPS δραστηριότητας ROS σε 40 λεπτά (Σχήμα 2 (γ)). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι Nox ένζυμα είναι η πιο πιθανή ενδο-κυτταρική πηγή των ROS εξής TLR4 σηματοδότησης σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

(α) Μια σημαντική εξασθένιση του φθορισμού παρατηρήθηκε σε δείγματα που κατεργάζονται με το DPI ( 2 μΜ). DCF φθορισμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής ΡΑΟδοαη και λογισμικό CellQuest. Στερεά μαύρη γραμμή (ελέγχου). Κόκκινη γραμμή (αντιμετωπίζεται LPS). Πράσινη γραμμή (αντιμετωπίζεται LPS + DPI). (B, c) Ροτενόνη και δικλοφενάκη απέτυχε να αναστείλει LPS (1 μg /ml) προκάλεσε δραστηριότητα ROS σε 40 λεπτά. * P & lt? 0,05. Αυτά τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

χορήγηση LPS των κυττάρων SW480 αυξάνει τα επίπεδα της έκφρασης Nox1 και Nox2

Όπως DPI οδήγησε στην πλήρη κατάργηση της LPS-επαγόμενη δραστηριότητα ROS, εμείς θέλησε να διερευνήσει περαιτέρω το ρόλο των ενζύμων Nox στην επαγόμενη από LPS παραγωγή ROS στα SW480 κύτταρα. Κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορίσει την έκφραση του ενζύμου ΝΟx. Nox1 καθώς Nox2 βρέθηκαν να εκφράζονται (Σχήμα 3 (α), (β)). Είναι ενδιαφέρον ότι, το επίπεδο της Nox1 και Nox2 έκφραση αυξάνει σε απόκριση προς τη χορήγηση LPS. αυξάνει την έκφραση της πρωτεΐνης Nox1 σημαντικά πάνω από το μη επεξεργασμένο επίπεδο έκφρασης σε 40 λεπτά (Σχήμα 3 (α)). Μία παρόμοια αύξηση παρατηρείται στο πρότυπο έκφρασης του Nox2 (Σχήμα 3 (β)). Η αύξηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Nox1 και Nox2 συμπίπτει με τη σημαντική αύξηση των LPS επαγόμενη-ROS γενιά σε 40 λεπτά δει στην κυτταρομετρία ροής.

(α) Χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western δείχνουμε ότι η έκφραση Nox1 στα κύτταρα SW480 αυξήσεις στην απάντηση σε LPS (1 μg /ml). (Β) Κηλίδωση Western δείχνει επίσης ότι LPS αυξημένη έκφραση του Nox2 σε 40 λεπτά. (Γ) Ρ22ΡΗΟΧ φαίνεται να εκφράζονται και να αυξάνει την έκφραση νωρίτερα από Nox1 και Nox2. (Δ) p47phox φαίνεται να εκφράζεται αλλά η έκφραση είναι σταθερή κατά τη διάρκεια των χρονικών σημείων. (Ε) Η ποσοτική ανάλυση PCR του Nox1 και Nox2 mRNA σε κύτταρα SW480 σε επεξεργασία με LPS (1 μg /ml) επί μία ώρα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με τον έλεγχο χωρίς θεραπεία κύτταρα ώρες, όπως προσδιορίζεται με τη μέθοδο 2-ΔΔCt. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD και είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0,05. Αυτά τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η ενεργοποίηση του ενζύμου

Nox εξαρτάται από τη συναρμολόγηση των επιμέρους μονάδων. Ως εκ τούτου, εξετάστηκε επίσης η επίδραση της θεραπείας LPS σε πρωτεΐνη έκφραση Ρ22ΡΗΟΧ και p47phox (Σχήμα 3 (γ, δ)). Δεν υπήρξε καμία αλλαγή στην έκφραση p47phox, ωστόσο, υπήρξε μια αύξηση στην έκφραση Ρ22ΡΗΟΧ σε είκοσι λεπτά και παρέμεινε διατηρηθεί έως 60 λεπτά.

Εμείς διερευνήθηκε περαιτέρω με την αύξηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Nox1 και Nox2 στην ανταπόκριση στη θεραπεία LPS χρησιμοποιώντας RT-PCR για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων Nox1 και Nox2 mRNA σε απόκριση σε LPS (Σχήμα 3 (e)). Μια δραματική αύξηση 6 φορές σε επίπεδα Nox1 mRNA και αύξηση κατά 5 φορές σε επίπεδα Nox2 mRNA σε σύγκριση με μη κατεργασμένους μάρτυρες συμβαίνει στα 20 λεπτά μετά τη χορήγηση LPS. Αυτή η αύξηση στα επίπεδα mRNA είναι παροδική και υπάρχει μία σημαντική μείωση κατά 40 λεπτά και 60 λεπτά μετά τη χορήγηση LPS. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι LPS ενεργοποιεί ένα παράγοντα μεταγραφής, πιθανότατα ΝΡ-κΒ, η οποία αυξάνει Nox1 και Nox2 mRNA σε απόκριση σε LPS. Αυτό, στη συνέχεια, διευκολύνει μια αύξηση στην έκφραση Nox1 και Nox2 στους 40 πρακτικά, τα οποία εκδηλώνεται με σημαντική αύξηση σε ενδογενή επίπεδα ROS σε SW480 κύτταρα. Για να επαληθευθεί αυτή τη θεωρία, χρειαζόμασταν για να αποσπάσει το ρόλο του NF-κΒ σε LPS επαγόμενη από ενδογενή δραστηριότητα των ROS.

LPS που προκαλείται από ROS είναι NF-κΒ εξαρτάται

Δεδομένου ότι υπάρχει μια καθιερωμένη σύνδεση εμφανείς μεταξύ LPS και ενεργοποίηση του NF-κΒ μέσω της οδού MyD88, ερευνήσαμε αν NF-κΒ έπαιξε ρόλο στην επαγόμενη από LPS δραστηριότητας ROS. κινάσης Ι-κάπα Β (ΙΚΚ) είναι ένα ένζυμο το οποίο είναι απαραίτητο για την ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ. Ένας αναστολέας ΙΚΚ χρησιμοποιήθηκε για να αναστέλλουν τη δραστικότητα του ΝΡ-κΒ (Σχήμα 4 (α)). Προ-επεξεργασία με το ΙΚΚ-αναστολέα οδήγησε σε πλήρη κατάργηση της προκαλούμενης από LPS δραστηριότητας ROS σε 40 λεπτά. ΙΚΒ-α είναι ένας ανασταλτικός υπομονάδα του ΝΡ-κΒ. Η φωσφορυλίωση του ΙΚΒ-α είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ. Στη βάση αυτή εξετάσαμε την έκφραση pIKB-α σε απόκριση προς τη χορήγηση LPS. Είναι ενδιαφέρον ότι, το επίπεδο της pIKB-α είναι σημαντικά αυξημένα στα 20 λεπτά μετά την αγωγή με LPS (Σχήμα 4 (β)). Είναι πιθανό ότι η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ στα 20 λεπτά μετά τη χορήγηση LPS επιτρέπει μεταγραφή του mRNA είναι αναγκαίες για την αύξηση της έκφρασης Nox1 και Nox2 παρατηρήθηκε σε 40 λεπτά.

(α) Ποσοτικοποίηση φθορισμού DCF με χρήση λογισμικού CellQuest καταδεικνύει μια σημαντική μείωση της προκαλούμενης από LPS δραστηριότητας 40 λεπτά με τα πόδια ROS παρουσία του αναστολέα ΙΚΚ (40 μg /ml) μετά από αγωγή με LPS (1 μg /ml). (Β) π-ΙκΒ αυξημένη έκφραση στα 20 λεπτά μετά τη χορήγηση LPS. * P & lt? 0,05. Αυτά τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) LPS (1 μg /ml) που επάγεται έκφραση Nox1 αυξήθηκε κατά 40 λεπτά μετά την αγωγή με LPS, ωστόσο προ-θεραπεία με αναστολέα ΙΚΚ για 1 ώρα μείωσε το επίπεδο έκφρασης με τα μη επεξεργασμένα επίπεδα. (Δ) LPS επαγόμενη έκφραση Nox2 στους 40 λεπτών μειώνεται επίσης από τον αναστολέα ΙΚΚ. * P & lt? 0,05. Αυτά τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Για να αποδείξει ότι η ενεργοποίηση του NF-κΒ ήταν απαραίτητη για την αύξηση της έκφρασης Nox1 και Nox2 μετά τη θεραπεία με LPS, ένας αναστολέας του NF-κΒ χρησιμοποιήθηκε και πάλι. Που προκαλείται από LPS έκφραση πρωτεΐνης Nox1 στους 40 λεπτών ήταν μειωμένη κατά τον αναστολέα ΙΚΚ (Σχήμα 4 (c)). Που προκαλείται από LPS έκφραση πρωτεΐνης Nox2 επίσης μειώθηκε σημαντικά κατά 40 λεπτά παρουσία του αναστολέα ΙΚΚ (Σχήμα 4 (d)). Έτσι, φαίνεται ότι προκαλείται από LPS παραγωγή ROS εξαρτάται από την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ η οποία οδηγεί σε μια αύξηση της έκφρασης Nox1 και Nox2 σε SW480.

επαγόμενη από LPS DCF φθορισμού συν-εντοπίζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο σε κύτταρα SW480

Πρόσφατα θεραπείες αντι-οξειδωτικό είναι πιο αποτελεσματικά λόγω της μεγαλύτερης βιοδιαθεσιμότητας και την ικανότητα να στοχεύουν σε συγκεκριμένα οργανίδια παραγωγή ROS, όπως τα μιτοχόνδρια. Καθώς δεν υπήρχε μείωση των επιπέδων ROS με τη χρήση της ουσίας rotenone, ρωτήσαμε τον υποκυτταρικό διαμέρισμα που ήταν υπεύθυνη για την παραγωγή ROS σε LPS. Πρέπει πρώτα συν-χρώση SW480 κύτταρα με DCF και μια χρωστική ER tracker και στη συνέχεια εξετάζονται φθορισμού χρησιμοποιώντας πολυφωτονικών μικροσκόπιο. DCF εμφανίζει ένα ξεχωριστό πρότυπο περι-πυρηνική χρώση σε κύτταρα SW480 σε απόκριση σε θεραπεία με LPS (Σχήμα 5α). Αυτό το μοτίβο είναι πολύ παρόμοιο με αυτό που παρατηρούμε με μια χρωστική ER tracker και συν-εντοπίζεται με DCF. Αυτό υποδηλώνει ότι η αύξηση των ROS μετά από αγωγή με LPS παράγεται στο ER. Όταν τα κύτταρα SW480 υποβλήθηκαν σε αγωγή με DPI, αυτό εξασθενεί το φθορισμό DCF στο ER, παρέχοντας έτσι περαιτέρω απόδειξη ότι προκαλείται από LPS δραστηριότητας ROS σχετίζεται με την έκφραση του ενζύμου ΝΟx. Αυτά τα πειράματα δείχνουν ότι ROS που δημιουργούνται σε απόκριση σε LPS εντοπίζεται στο ER και μαζί με πρόσφατα στοιχεία που δείχνουν ότι οι TLR-4 /MD2 σύμπλοκο σημάτων μέσω του ER, καταδεικνύουν ότι το ER παίζει κομβικό ρόλο στην TLR-4 σηματοδότηση.

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες σε γυάλινα πυθμένα πιάτα. (Α) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DCF και μια χρωστική ER ιχνηλάτη για 1 ώρα στους 37 ° C με LPS (1 μg /ml) προστέθηκαν 30 λεπτά πριν από την απεικόνιση με πολυφωτονικών μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ. (Β) Τα κύτταρα βάφτηκαν με Mitotracker βαθύ κόκκινο (1 μΜ) και (10 μΜ) MitoPY, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Μεναδιόνη (8 μΜ) ή LPS (1 μg /ml) για 1 ώρα στους 37 ° C. Η ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει 20 μm.

Η

Είμαστε δίπλα ήθελε να εξετάσει την μιτοχόνδρια ως ενδοκυτταρική πηγή LPS που προκαλείται από ROS. Μια προηγούμενη μελέτη από Dickenson et al απέδειξαν ότι υπεροξυ-κίτρινο (MitoPY), ένα φθορίζον ανιχνευτής μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά για την εικόνα H

2O

2 εντός των μιτοχονδρίων των ζωντανών κυττάρων [19]. Εδώ, έχουμε συν-χρώση MitoPY με βαθύ κόκκινο Mitotracker και στη συνέχεια κατεργάζεται τα κύτταρα SW480 με Μεναδιόνη σε 8 μΜ για 1 ώρα στους 37 ° C (Σχήμα 5b) [20]. Επιβεβαιώσαμε ότι MitoPY στοχεύει στα μιτοχόνδρια και ανιχνεύει μιτοχονδριακή ROS όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Μεναδιόνη. Εμείς στη συνέχεια κατεργάζεται SW480 κυττάρων με LPS και παρατηρήθηκαν ελάχιστα επίπεδα των ROS που δημιουργούνται στα μιτοχόνδρια σε σύγκριση με τον θετικό έλεγχο, όπου τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Μεναδιόνη.

TLR-4 που προκαλείται από ROS ρυθμίζουν μεταστατικό μονοπάτια μεταγωγής σήματος σε κύτταρα SW480

κανονισμός μονοπατιών κυτταρικής σηματοδότησης είναι ένα από μια σειρά από ενδο-κυτταρικών επιδράσεων που προέρχονται από TLR-4 σηματοδότηση. Μεμονωμένα οδών επιβίωσης, συμπεριλαμβανομένης της ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι, το οποίο είναι γνωστό ότι διευκολύνει μετάσταση όγκου, μπορούν να ενεργοποιηθούν από TLR-4 σηματοδότηση. Οι ανασταλτικές πρωτεΐνες αυτής της οδού, όπως ΡΤΕΝ, είναι γνωστό ότι είναι ευαίσθητα οξειδοαναγωγής. Αφού διαπιστώθηκε ότι SW480 κύτταρα παράγουν ενδογενή ROS από την ER σε ένα ΝΡ-κΒ με τρόπο που εξαρτάται σε απόκριση προς TLR-4 σηματοδότηση, μπορούμε έτσι διερευνήθηκε αν LPS επαγόμενο ενδογενούς ROS θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα ρόλο στην ρύθμιση αυτών των ευαίσθητων οξειδοαναγωγής οδούς. Βλέπουμε μια αύξηση στην pAkt σε 40 λεπτά μετά την αγωγή με LPS η οποία αντιστοιχεί με την αύξηση της επαγόμενης από LPS δραστηριότητας ROS παρατηρείται επίσης σε 40 λεπτά (Σχήμα 6 (α)). pAkt έκφραση στους 40 λεπτών αναστέλλεται από DPI (Σχήμα 6 (β)). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν πως TLR-4 που προκαλείται από δραστικότητα ROS μπορεί να ρυθμίσει μεταστατικό μονοπάτια σηματοδότησης όπως ΡΙ3Κ /Akt.

(α) LPS (1 μg /ml) αγωγή προκαλεί μία παροδική αύξηση της φωσφορυλίωσης Akt, μέγιστη στα 30- 40 λεπτά. (Β) έκφραση pAkt αυξάνεται σε απόκριση σε θεραπεία με LPS στα 40 λεπτά και αναστέλλεται πλήρως από DPI (2 μΜ). * P & lt? 0,05. Αυτά τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

LPS επαγόμενη προσκόλληση διευκολύνεται με Nox τρόπο που εξαρτάται από

Πρόσφατες μελέτες έχουν αναφέρει ότι η LPS μπορεί να αυξήσει τα καρκινικά κύτταρα προσκόλληση, ένα ουσιαστικό βήμα για την επιτυχημένη μετάσταση [21]. LPS διευκολύνει αυτό μέσω πάνω ρύθμιση των πρωτεϊνών όπως β1-ιντεγκρίνης [22]. Το κύριο μονοπάτι σηματοδότησης υπεύθυνη είναι η οδός ΡΙ3Κ /Akt που έχουμε δείξει να ρυθμίζεται από ενεργοποίηση LPS του ΝΟΧ που προέρχονται ROS. Έτσι θελήσαμε να διαπιστωθεί αν Nox σηματοδότησης διευκόλυνσης LPS καρκίνου του παχέος εντέρου προσκόλληση κυττάρων σε LPS. Μια σημαντική αύξηση σε κυτταρική προσκόλληση SW480 σε κολλαγόνο Ι παρατηρείται σε 1 ώρα (Σχήμα 7 (α, β)). Αυτή η αύξηση στην προσκόλληση αναστέλλεται από DPI και ενός αναστολέα της ΡΙ3Κ, LY294002. Αυτό υποδηλώνει ότι ο μηχανισμός που ευθύνεται εξαρτάται από Nox σηματοδότηση. Έχοντας δείξει ότι η LPS προκαλεί ROS μέσω ενός μηχανισμού Nox, θελήσαμε να διερευνήσουμε περαιτέρω το μέλος της οικογένειας Nox ήταν υπεύθυνος γι ‘αυτή την αύξηση της δραστηριότητας των ROS και την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων. Η αποτελεσματικότητα του παράγοντα siRNA ελέγχθηκε με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής. Το δεύτερο siRNA παρείχε την καλύτερη μείωση και μάλιστα προκάλεσε μια σχεδόν πλήρη κατάργηση της LPS επαγόμενης ROS (Σχήμα 7 (γ)). Έτσι φαίνεται Nox1 συμβάλλει το μεγαλύτερο μέρος των ROS και ίσως έχει ένα πιο λειτουργικό ρόλο από Nox2 σε απόκριση προς τη χορήγηση LPS. Κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την αποτελεσματικότητα της κάθε επιμόλυνση siRNA (Σχήμα 7 (c)).

(a, b) θεραπεία LPS είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική αύξηση στην κυτταρική προσκόλληση SW480 στο κολλαγόνο Ι μετά από 1 ώρα. Αυτό ανεστάλη με αναγνωρισμένη αναστολέα NOx, DPI (2 μΜ), και έναν αναστολέα της ΡΙ3Κ, LY294002 (5 μΜ). (Γ) Nox1 siRNA καταργεί LPS προκαλούμενη ROS και Nox1 νοκ ντάουν επιβεβαιώνεται με κηλίδωση Western. (Δ) Η αύξηση των SW480 πρόσφυση καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων ανεστάλη πλήρως από Nox1 siRNA. * P & lt? 0,05. Αυτά τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

κύτταρα επεξεργασμένα Nox1 siRNA στη συνέχεια χρησιμοποιείται για να διερευνήσει το ρόλο των Nox1 στον καρκίνο του παχέος εντέρου προσκόλληση των κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ότι, μια σημαντική μείωση των καρκινικών κυττάρων προσκόλληση παρατηρήθηκε στα κύτταρα Nox1 siRNA μετά τη θεραπεία με LPS, υποδεικνύοντας ότι Nox1 προέρχονται ROS είναι απαραίτητα για την δυναμικοποίηση της καρκίνου του παχέος εντέρου προσκόλληση των κυττάρων σε απόκριση σε LPS (Σχήμα 7 (δ)).

Συζήτηση

Ο σύνδεσμος μεταξύ συστηματική φλεγμονή και την προώθηση της μετάστασης των όγκων έχει καθιερωθεί [23]. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε πώς Nox που προέρχονται από ROS παρέχουν ένα «χαμένο κρίκο» στην κατανόηση του πώς η φλεγμονή ενεργοποιεί τα μονοπάτια μεταγωγής σήματος υπεύθυνη για την επανεμφάνιση του όγκου και των μεταστάσεων. Αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι LPS ρυθμίζει ΡΙ3Κ /Ακί σηματοδότησης μέσω ΝΟχ προέρχεται ROS σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Κατά συνέπεια, αυτή η LPS ενεργοποιηθεί ο μηχανισμός οξειδοαναγωγής είναι υπεύθυνη για την προώθηση της τήρησης των όγκων, ενισχυτικά του κινδύνου επιτυχημένη μετάσταση.

Χειρουργική φλεγμονή ενισχύει τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων μέσω PI3K /Akt της σηματοδότησης. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει μια σημαντική αύξηση σε πνευμονική μετάσταση μετά την χειρουργική επέμβαση και το αποτέλεσμα αυτό παρεμποδίζεται από έναν αναστολέα της ΡΙ3Κ [24]. Παρομοίως, Hsu et al απέδειξαν πρόσφατα ότι η προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων εξαρτάται από την σηματοδότηση ΡΙ3Κ σε απόκριση σε LPS [11]. Πράγματι, LPS έχει δειχθεί ότι ενεργοποιούν άμεσα ΡΙ3Κ /Akt σηματοδότησης, ωστόσο, όπως δείχνουν τα αποτελέσματα μας, ΝΟχ προέρχεται ROS παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση οξειδοαναγωγής αυτού του μονοπατιού [25] – [26]. Είναι ενδιαφέρον, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι ΝΟχ προέρχεται ROS ενεργοποιημένου καθοδικά ΡΙ3Κ /Akt σηματοδότηση [27].