Abstract

Ιστορικό

Ο hedgehog (Hh) μονοπάτι έχει ενοχοποιηθεί στην παθογένεση του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του πόρου αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος (PDAC). Πρόσφατες μελέτες έχουν προτείνει ότι η ογκογόνος λειτουργία του Hh σε PDAC εμπλέκει σηματοδότηση στα στρωματικά κύτταρα και όχι αυτόνομες επιδράσεις κυττάρου επί των κυττάρων του όγκου. Ωστόσο, η προέλευση και η φύση του τύπου (ες) στρωματικών κυττάρων που αποκρίνονται σε σηματοδότηση Hh παρέμεινε άγνωστη. Από σηματοδότηση Hh παίζει καθοριστικό ρόλο κατά την εμβρυϊκή και μεταγεννητική αγγειογένεση, έχουμε σκεφτεί ότι Hh συνδετήρας μπορεί να ενεργεί για αγγείωσης του όγκου αποδίδοντας ιδιαίτερη σημασία στη μυελού των οστών (ΒΜ) προερχόμενο από κύτταρα.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

η κυκλοπαμίνη χρησιμοποιήθηκε για να αναστείλει την οδό Hh σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές PDAC και ξενομοσχεύματα τους. BM μεταμοσχεύσεις, τα συστήματα συν-καλλιέργεια των κυττάρων όγκου και ΒΜ-προερχόμενο προ-αγγειογενετική κύτταρα (BMPCs) χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί ο ρόλος του που προέρχονται από όγκους Hh στη ρύθμιση της διαμέρισμα BM και τη συμβολή της BM-προερχόμενα κύτταρα να αγγειογένεσης σε PDAC. χορήγηση κυκλοπαμίνη εξασθενημένη σηματοδότηση Hh στο στρώμα και όχι στα καρκινικά κύτταρα, όπως αντικατοπτρίζεται από μειωμένη έκφραση του πλήρους μήκους Gli2 πρωτεΐνη και Gli1 mRNA ειδικά στο διαμέρισμα. Η κυκλοπαμίνη ανέστειλε την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων PDAC σε συνδυασμό με υποχώρηση του αγγειακού συστήματος του όγκου και μειωμένη παλιννόστησης των ΒΜ-προερχόμενα κύτταρα στον όγκο. Host-παράγωγα επίπεδα Ang-1 και IGF-1 mRNA ρυθμίζεται προς τα κάτω από τα κυκλοπαμίνη στα ξενομοσχεύματα όγκου.

In vitro

συν-καλλιέργεια και προσδιορισμούς βύσμα matrigel απέδειξαν ότι PDAC που προέρχεται από κύτταρα Shh επαγόμενη Ang-1 και IGF-1 παραγωγής σε BMPCs, έχοντας σαν αποτέλεσμα αυξημένη δραστικότητα τους μορφογένεση μετανάστευση και τριχοειδή.

συμπεράσματα /Σημασία

Έχουμε εντοπίσει το BMPCs ως εναλλακτική στόχους στρωματικά ΗΗ-συνδετήρα σε PDAC γεγονός που υποδηλώνει ότι η αγγείωση του όγκου είναι ένας ελκυστικός θεραπευτικός στόχος του αποκλεισμού HH. Τα δεδομένα μας είναι συνεπής με την αναδυόμενη ιδέα ότι BM-προερχόμενα κύτταρα κάνουν σημαντικές συνεισφορές σε επιθηλιακό ογκογένεση

Παράθεση:. Nakamura Κ, Sasajima J, Mizukami Υ, Sugiyama Υ, Yamazaki Μ, Fujii R, et al. (2010) Hedgehog Προωθεί νεοαγγείωση σε καρκίνους του παγκρέατος με τη ρύθμιση Ang-1 και IGF-1 έκφραση σε μυελό των οστών που προέρχεται Pro-αγγειογενετική Cells. PLoS ONE 5 (1): e8824. doi: 10.1371 /journal.pone.0008824

Επιμέλεια: Sudha Agarwal, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Οκτώβρη του 2009? Αποδεκτές: 1η Ιανουαρίου 2010? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιαν., 2010

Copyright: © 2010 Nakamura et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση για να ΥΜ από την Νέα Ενέργεια και Βιομηχανικής Οργάνωσης Τεχνολογικής Ανάπτυξης της Ιαπωνίας (07A05010a). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) είναι η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τις Ηνωμένες Πολιτείες και την πέμπτη στην Ιαπωνία, και το συνολικό ποσοστό της επιβίωσης 5 ετών είναι μόλις 5,0 με 9,7% [1], [ ,,,0],2]. Γεμσιταβίνης με βάση χημειοθεραπεία για τοπικά προχωρημένο ή μεταστατικό PDAC έχει μόνο μέτρια δραστηριότητα με ένα μικρό όφελος επιβίωσης [3]. Η ταυτοποίηση νέων μοριακών στόχων για PDAC να ξεπεραστεί η θλιβερή πρόγνωση είναι συνεπώς αναγκαίο. Μέχρι στιγμής, μια σειρά από στοχευμένες θεραπείες έναντι EGFR [4], Ras /ΜΕΚ [5] και VEGF [6] έχουν αποτύχει να βελτιώσει την επιβίωση σημαντικά σε κλινικές δοκιμές.

Η ανώμαλη ενεργοποίηση του hedgehog (Hh) μονοπάτι έχει πρόσφατα αναγνωριστεί ως ένας από τους μεσολαβητές της ανάπτυξης PDAC και επομένως θεωρείται ότι είναι ένα υποσχόμενο στόχο για θεραπεία [7], [8]. Hh είναι ένα μορφογονίδιο που απαιτούνται για τη σωστή διαμόρφωση των προτύπων κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης. Αυξημένη έκφραση του Hh που σχετίζονται πρωτεΐνες, Sonic hedgehog (Shh) ή indian σκαντζόχοιρος (Ihh), εξασθενίζει παγκρέατος μορφογένεση με αυξήσεις στο μεσέγχυμα και μειώνεται στο επιθηλιακό διαμέρισμα [9], υποδεικνύοντας ότι η αυστηρή ρύθμιση του συνολικού επιπέδου της δραστηριότητας HH είναι ζωτικής σημασίας για την κανονική ανάπτυξη του παγκρέατος. Από Shh είναι misexpressed όχι μόνο σε PDAC αλλά και στις πρόδρομες βλάβες του παγκρέατος ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (PanIN) [8] και ενδοπορικού θηλώδη βλεννώδες νεοπλασία [10], απορύθμιση αυτού του μονοπατιού μπορεί να παίζει ένα ρόλο κατά τη διάρκεια πρώιμα στάδια της ογκογένεσης. Ένας αριθμός γονιδίων ΗΗ-στόχου, όπως ΒΜΡ [11], FOXM1 [12], και ΡΜΡ22 [13], υπερεκφράζονται σε PDAC, και υπάρχει cross-talk μεταξύ ογκογόνο οδών συμπεριλαμβανομένων ΜΑΡΚ /ΕΚΚ, ΡΙ3Κ /Akt [14 ], Wnt [15], TGFβ /BMP [16] και σηματοδότηση Hh. Μεταξύ των μορίων που συμμετέχουν στην σηματοδότηση Hh, smoothened (SMO), έχει αναγνωριστεί ως ένας μεσολαβητής κλειδί της σηματοδότησης? είναι ένα από τα συστατικά του υποδοχέα για συνδέτη Hh και μετατρέπει Gli2 σε μεταγραφικός ενεργοποιητής [17]. Έτσι, ΠΕΑ είναι ένα ιδιαίτερα υποσχόμενο στόχο για αντικαρκινική θεραπεία [18]. Η κυκλοπαμίνη, ένα φυσικό στεροειδές αλκαλοειδές, έχει ισχυρή ανασταλτική δράση κατά του ΠΕΑ [18] και θεραπεία κυκλοπαμίνη στο πειραματικό περιβάλλον αναστέλλει την ανάπτυξη πολλών καρκίνων [19], [20], [21]. Τα παράγωγα κυκλοπαμίνης με διάφορα δομικά μοτίβα έχουν δημιουργηθεί και παρουσιάζουν υπόσχεση για πιθανή κλινική χρήση [22].

Συγκεκριμένα, αρκετές μελέτες έχουν δείξει σημαντική αναστολή της ανάπτυξης των PDAC

in vivo από

αποκλεισμό της οδού Hh [ ,,,0],7], [23]. Ο μηχανισμός αναστολής αύξησης όγκου έχει πιστεύεται ότι διαμεσολαβείται κυρίως μέσω αναστέλλοντας ένα αυτοκρινή βρόχο που μπορεί να απαιτηθούν για τον πολλαπλασιασμό [7], επιβίωση [8] και κινητικότητα [21] των καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, η διαγραφή Smo στον παγκρεατικό επιθήλιο δεν βλάπτει την ογκογένεση σε ένα μοντέλο ποντικού PDAC [24], και οι συνδέτες Hh δεν επάγουν μεταγραφική ρεπόρτερ της οδού στις γραμμές PDAC. Επιπλέον, η διαγονιδιακή έκφραση ενός ενεργοποιημένου αλληλόμορφο Smo στον παγκρεατικό επιθήλιο αποτυγχάνει να διεγείρει Smo γονιδίων-στόχων οδού ή για την επαγωγή νεοπλασματικής αλλαγής [25]. Συνεπώς, έχει υποτεθεί ότι σηματοδότηση Hh μπορεί να παίξει παρακρινή ρόλο μέσα στο μικροπεριβάλλον του όγκου, σε επιθηλιακά καρκίνους που έχουν έλλειψη μεταλλάξεων στα συστατικά σηματοδότηση Hh. Πράγματι, μελέτες που πραγματοποιήθηκαν από εμάς και άλλοι έχουν οριστεί κρίσιμους ρόλους των καρκινικών κυττάρων που προέρχονται Hh σε τύπους κυττάρων εντός των διαμερισμάτων των στρωματικών όγκων [26], [27], [28]. Παρά αυτά τα ευρήματα, οι ακριβείς μηχανισμοί με τους οποίους ορισμένα κύτταρα όγκου είναι ευαίσθητη στην αναστολή Hh και ο τύπος (-οι) στρωματικών κυττάρων που αποκρίνονται σε σηματοδότηση Hh παρέμεινε άγνωστη. Ως εκ τούτου, ανέλαβε τις μελέτες για τη διαλεύκανση των μηχανισμών αυτών.

Μέθοδοι

Πολιτισμός τηλέφωνα, ανάλυση πρωτεϊνών και RNA Ανάλυση

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου PDAC ελήφθησαν από την ATCC, Υγεία Science Research Resources Τράπεζα (Osaka, Japan) και κυττάρων Resource Center για βιοχημικές Ερευνών (Σεντάι, Ιαπωνία). απομόνωση BMMNC, δοκιμασίες πολλαπλασιασμού, συν-καλλιέργεια, δοκιμασίες μετανάστευσης, ανοσοαποτύπωση, και qPCR περιγράφονται στο Methods S1. Οι αλληλουχίες εκκινητών συνοψίζονται στον Πίνακα S1.

Ζώα, Μεταμόσχευση Μυελού των Οστών (ΒΜΤ) και ανοσοϊστοχημεία

θεραπευτικές μελέτες με κυκλοπαμίνη διεξήχθησαν με γυμνούς ξενομοσχεύματα ποντικών όπως περιγράφεται [7]. Οι διαδικασίες ΒΜΤ παρέχονται στις Μεθόδους S1. Πρωτόκολλα για τα πειράματα σε ζώα έχουν εγκριθεί από το Θεσμικό Animal Care and Use Επιτροπή Asahikawa Ιατρική κολάζ.

Οι ιστοί υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [26]. Τα αντισώματα και οι προϋποθέσεις για ανοσοϊστοχημεία παρουσιάζονται στο Μέθοδοι S1.

Κυτταρική, Μοριακή, και Στατιστικές Αναλύσεις

Οι λεπτομερείς περιγραφές των διαδικασιών που προβλέπονται στις Μεθόδους S1.

Αποτελέσματα

In Vivo

Επιδράσεις της κυκλοπαμίνης για KP-1Ν Ξενομοσχεύματα

για να φωτιστούν οι μηχανισμοί με τους οποίους σηματοδότηση Hh θα μπορούσε να υποστηρίξει την εξέλιξη του όγκου σε ένα καρκινικό κύτταρο μη αυτόνομων μόδας, αξιολογήσαμε ο ρόλος της σηματοδότησης Hh στην ανάπτυξη της PDAC

in vivo

. Έχουμε επιλέξει μια κυτταρική γραμμή, KP-1N, που έδειξαν υψηλή έκφραση της Shh, αλλά ήταν ευαίσθητη στην αναστολή της ανάπτυξης από την κυκλοπαμίνη

in vitro

(Σχήμα S1, S2 και S2 Πίνακα). Θεραπεία της KP-1N ξενομοσχεύματα με κυκλοπαμίνη ημερησίως για 7 ημέρες προκάλεσε μια μείωση κατά 46 τοις εκατό του βάρους του όγκου σε σύγκριση με έκδοχο μάρτυρα όγκους (Σχήμα 1Α). Η ιστοπαθολογική ανάλυση αποκάλυψε ότι οι όγκοι αντιμετωπίζονται κυκλοπαμίνη είχαν άφθονη περιοχές νέκρωσης με αποτέλεσμα τη μείωση 59% σε βάρος του όγκου βιώσιμα. Σύμφωνα με αυτά τα ευρήματα, χρώση για Ki-67 και TUNEL έδειξαν ότι η θεραπεία με κυκλοπαμίνη μειωμένο πολλαπλασιασμό κατά 14% και την αύξηση του κυτταρικού θανάτου κατά 9%

in vivo

(Εικόνα 1Β)? Σε αντίθεση, δεν υπήρχε σημαντική επίδραση της κυκλοπαμίνης επί του πολλαπλασιασμού /κινητική του κυτταρικού θανάτου

in vitro

(Εικόνα S2).

(Α) CD-1 γυμνούς ποντικούς που φέρουν KP-1N ξενομοσχεύματα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς κυκλοπαμίνη (50 mg /kg /ημέρα? sc) ημερησίως για 7 ημέρες (10 ξενομοσχεύματα για κάθε ομάδα). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος βάρος του όγκου ± SEM (mg). Τα H-Ε χρώσεις για τα τμήματα ξενομοσχεύματος που παρουσιάζονται και μετρήθηκε% νεκρωτική περιοχή (Ν). Κλίμακα μπαρ? 200 μm. (Β) ξενομοσχεύματος ιστοί βάφτηκαν με αντι-Ki-67 (ράβδοι Κλίμακα? 200 μm) και δοκιμασία TUNEL (Ράβδοι κλίμακας? 500 μm) διεξήχθη. Ποσοτικοποίηση των πολλαπλασιαζόμενων /αποπτωτικών παρουσιάζεται ως επί τοις εκατό θετικά κύτταρα σε 5 βιώσιμα πεδία από 10 τμήματα. (C) RNA εξήχθη από ιστό ξενομοσχεύματος και τα επίπεδα mRNA για Ptch1 και Gli1 ήταν ποσοτικά με TaqMan qPCR.

Η

Για να καθοριστεί ποια κύτταρα επηρεάζεται από τη θεραπεία με κυκλοπαμίνη, μετρήσαμε την έκφραση της Ptch1 και Gli1 mRNA, μεταγραφική στόχους σηματοδότησης Hh, σε αμφότερες τις ξενομόσχευμα ανθρώπινα κύτταρα όγκου όπως επίσης και το διαμέρισμα στρωματικά ποντίκι. Για να γίνει αυτό, κάναμε χρήση των ειδών-ειδικών ανιχνευτών. Παρατηρήσαμε ότι η ανθρώπινη Ptch1 και Gli1 σε ξενομοσχεύματος ιστοί μόνο συγκρατημένα μειώθηκαν κατά κυκλοπαμίνη θεραπείας (σχήμα 1Γ). παρατηρήθηκαν συγκρίσιμες, ήσσονος σημασίας μειώσεις στην έκφραση

in vitro

(Σχήμα S3). Σε σύγκριση, τα επίπεδα Ptch1 ποντίκι και Gli1 mRNA έδειξαν μια σημαντικά πιο έντονη μειορύθμιση, υποδεικνύοντας ότι τα στρωματικά κύτταρα είναι σημαντικά στόχοι του αποκλεισμού Hh. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αντικαρκινική δράση της κυκλοπαμίνης στην ανάπτυξη ξενομοσχεύματος κυρίως με τη μεσολάβηση ενός προς τα κάτω ρύθμιση των σηματοδότηση Hh σε σχετίζονται με όγκους στρώματος.

Επιδράσεις της κυκλοπαμίνης στο αγγειακό σύστημα του όγκου

μεταξύ των συνιστωσών στρωματικά σε PDAC ξενομοσχεύματα, ήμασταν ιδιαίτερα περιέργεια για το αγγειακό σύστημα του όγκου, αφού έχουμε αποδείξει ότι BM-προερχόμενο προ-αγγειογενετική (πρόδρομα) κύτταρα αποκρίνονται στο συνδέτη Hh κατά τη διάρκεια νεοαγγειοποίησης [26], [29]. Συνεπώς, διερευνήσαμε την επίδραση της κυκλοπαμίνης στο αγγειακό σύστημα του όγκου σε ΚΡ-1Ν ξενομοσχεύματα. Η ανοσοχρώση για τον δείκτη ενδοθηλιακού κυττάρου CD31 αποκάλυψαν ότι η πυκνότητα μικροαγγειακή ήταν σημαντικά μειωμένη (42,6%), όταν οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε αγωγή με κυκλοπαμίνη (Σχήμα 2Α). Η προκύπτουσα αγγείωση του όγκου μειώθηκε και κατακερματισμένη, και η μείωση στη μέση περιοχή σκάφος ήταν δραματική (64,8%). Η αναστολή της αγγειογένεσης με κυκλοπαμίνη παρατηρήθηκε επίσης στο κοστούμι-2 ξενομοσχεύματα (Σχήμα S4).

(Α) ΚΡ-1Ν ξενομοσχεύματα σε επεξεργασία με ή χωρίς κυκλοπαμίνη βάφτηκαν με CD31. Κλίμακα μπαρ? 500 μm. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM MVD και σημαίνουν περιοχή σκάφος. (Β) Διπλή χρώση ανοσοφθορισμού με α-λείου μυός ακτίνη (SMA) με CD31 ή CD31 NG2 με. Κλίμακα μπαρ? 200 μm. Ο αριθμός των CD31

+ μικροαγγείων καλύπτονται με α-SMA ή NG2 θετικά περικύτταρα εμφανίζεται.

Η

Τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι ο αποκλεισμός της σηματοδότησης Hh «αποσταθεροποιεί» τα σκάφη του όγκου. Θέλαμε να επιβεβαιωθεί αυτή η υπόθεση με ανοσοϊστοχημική χρώση για την α-ακτίνη των λείων μυών (SMA), NG2, και CD31. SMA και NG2 εκφράζονται από περικύτταρα, τα οποία είναι κύτταρα που συνδέουν στενά με ενδοθηλιακά κύτταρα CD31-θετικά για τη σταθεροποίηση των αιμοφόρων αγγείων [30], [31]. Παρατηρήσαμε 50,0% ή 62,1% λιγότερα CD31

+ μικροαγγείων καλύπτεται με SMA

+ ή NG2

+ περικύτταρα στους όγκους αντιμετωπίζονται κυκλοπαμίνη (Σχήμα 2Β). Έτσι, σηματοδότηση Hh είναι σημαντικό για την ωρίμανση ή /και τη σταθεροποίηση της αγγείωσης του όγκου.

προέρχεται από όγκο Hh Προωθεί Ενσωμάτωση BM-παραγόμενα κύτταρα στη νεοαγγείωση

μυελού των οστών (ΒΜ) προερχόμενο τα κύτταρα πιστεύεται ότι παίζουν ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου [32], [33]. Για παράδειγμα, οι διάφοροι τύποι ΒΜ προερχόμενων αιμοποιητικά κύτταρα έχουν παρατηρηθεί να συνδέσει στενά με την νεοαγγείωση όγκου [34], [35], και πράγματι, ένας μικρός αριθμός ΒΜ-προερχόμενα προγονικά κύτταρα καταδείχθηκαν να ενσωματώσει μέσα στον αυλό του ένα αυξανόμενη αγγείωση όπου διαφοροποιούνται σε ενδοθηλιακά κύτταρα σε ένα μοντέλο καρκίνου του πνεύμονα ποντικού [36]. Διάφοροι παράγοντες στο μικροπεριβάλλον του όγκου μπορούν να διαμορφώσουν την πρόσληψη και διατήρηση του ΒΜ-προερχόμενα κύτταρα κατά την διάρκεια της ανάπτυξης του αγγειακού συστήματος του όγκου [37]. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί αν σηματοδότηση Hh συμβάλλει σε αυτή τη διαδικασία σε PDAC. Προκειμένου να εντοπίσει BM-προερχόμενα κύτταρα, που εμφυτεύονται KP-1Ν ξενομοσχευμάτων σε χιμαιρικά ποντίκια με GFP-επισημασμένα ΒΜ (μοντέλο μεταμόσχευσης μυελού των οστών GFP-? Βλέπε Μέθοδοι). Η κυκλοπαμίνη μείωσε σημαντικά την πρόσληψη BM-προερχόμενα κύτταρα εντός των ξενομοσχευμάτων κατά 60% σε σύγκριση με όγκους ελέγχου (Σχήμα 3Α).

(AD) GFP-ΒΜΤ-χιμαιρικά ποντίκια που φέρουν KP-1N ξενομοσχεύματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς κυκλοπαμίνης. Πρόσληψη ΒΜ-προερχόμενα κύτταρα εντός του όγκου παρακολουθούνται με ανοσοχρώση με αντι-GFP (Α). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM των αριθμών των GFP

+ κύτταρα. Μπαρ κλίμακα? 100 μm. KP-1N ιστοί ξενομοσχεύματος ανοσοχρωματίστηκαν με Gli2 (Β), CD31, VE-καδερίνη ή NG2 (Γ), σε συνδυασμό με GFP. Μπαρ κλίμακα? 100 μm. Που παρουσιάζονται είναι μέση τιμή ± SEM της GFP

+ κύτταρα προσλαμβάνονται σε CD31

+ αγγεία του όγκου (

πάνω πίνακα

) και ο αριθμός των GFP

+ κύτταρα συν-εντοπίζεται με CD31, VE-cadherin

+, και NG2 (

κάτω πίνακα

).

η

Μεταξύ Gli οικογένεια των παραγόντων μεταγραφής, τον έλεγχο της υποβάθμισης της Gli2 και τη μεταποίηση σε μορφή καταστολέας της ορίζουν τη σηματοδότηση Hh απάντηση [38]. πρωτεΐνη Gli2 επεξεργασία και αποδομείται σε απουσία συνδέτη Hh, ενώ η παρουσία του συνδέτη Hh προάγει Smo εμπλουτισμό σε πρωτογενείς βλεφαρίδες [39], με αποτέλεσμα την πυρηνική μετατόπιση της πλήρους μήκους, μεταγραφικά αρμόδιες πρωτεΐνη Gli2 [40]. Ως εκ τούτου, αξιολόγησε την επίδραση της κυκλοπαμίνης στην Gli2 πρωτεΐνη μέσω ανάλυσης ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον μορφή πλήρους μήκους της Gli2 [41] (Εικόνα S5A). BM-προερχόμενα κύτταρα εκφράζουν πλήρους μήκους Gli2 πρωτεΐνη και κυκλοπαμίνης μειωθεί τόσο τον απόλυτο αριθμό και το σχετικό ποσοστό των Gli2 θετικών ΒΜ-προερχόμενα κύτταρα (Σχήμα 3Β), δεικνύοντας ότι σηματοδότηση Hh ενεργοποιείται σε BM-προερχόμενα κύτταρα σε ένα κυκλοπαμίνη ευαίσθητα (Smo εξαρτώμενη) τρόπο. Ptch1 πρωτεΐνη παρατηρήθηκε επίσης σε BM-προερχόμενα κύτταρα καθώς και στα καρκινικά κύτταρα και κυκλοπαμίνης μείωσε την έκφραση Ptch1 σε στρωματικό διαμέρισμα (Εικόνα S5B). Εμείς δεν μπόρεσαν να αποδείξουν ισχυρή έκφραση πρωτεΐνης Gli1 στον ιστό ξενομοσχεύματος (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

όγκους ελέγχου, GFP-θετικά BM-προερχόμενα κύτταρα συνδέονται στενά με CD31

+ καρκινικών αγγείων, αλλά δεν είναι ενσωματωθεί στον αυλό των αγγειώσεις (Σχήμα 3C). Από την άλλη πλευρά, ένα υποσύνολο των ΒΜ-προερχόμενα κύτταρα συν-εκφράζεται VE-cadherin που αποδεικνύουν ότι BM-προερχόμενα κύτταρα δεν είναι μόνο προσλαμβάνονται στην περιοχή περι-αγγειακές αλλά επίσης να οδηγήσει απευθείας στο ενδοθήλιο του όγκου. Η πρωτεογλυκάνη NG2 εκφράζεται από εν τω γεννάσθαι περικύτταρα κατά τα πρώτα στάδια της αγγειογένεσης, και ένα υποσύνολο των ΒΜ-προερχόμενα κύτταρα σε όγκους ξενομοσχεύματος συν-εκφράζονται NG2. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι BM-προερχόμενα κύτταρα συμβάλλουν στην ανάπτυξη του αγγειακού συστήματος του όγκου όχι μόνο από τα οποία προκύπτει το συγκεκριμένο τύπο των κυττάρων, αλλά και συσχετίζοντας με διαφορετικούς τρόπους. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η θεραπεία με κυκλοπαμίνη μείωσε σημαντικά την ενσωμάτωση της GFP

+ BM-προέρχεται προ-αγγειογενετική κύτταρα (BMPCs) σε CD31

+, VE-cadherin

+, ή NG2

+ αγγειώσεις όγκου. Επιβεβαιώσαμε ότι BMPCs ήταν αποκρίνεται σε Hh επειδή

in vitro

συγκαλλιέργειες με καρκινικά κύτταρα KP-1Ν οδήγησε σε κυκλοπαμίνη ευαίσθητο επαγωγή του mRNA Gli1 /Ptch1 σε BMPCs, αλλά όχι στην ώριμη ενδοθηλιακή κυτταρική γραμμή MS -1 (Σχήμα S6 και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η οδός Hh παίζει ένα ρόλο στη νεοαγγειοποίηση με ρύθμιση της ενσωμάτωσης BM-προερχόμενο προ-αγγειογενετική κύτταρα (πρόδρομος) στα καρκινικά αγγεία.

προέρχεται από όγκο Hh Προωθεί Μετανάστευση BM- προέρχεται Pro-αγγειογενετική Cells

In Vitro

και

In Vivo

η

πιθανολογείται ότι οι μειωμένους αριθμούς ΒΜ-παραγόμενα κύτταρα στους όγκους που έλαβαν κυκλοπαμίνη μπορεί να είναι το αποτέλεσμα του εξασθενημένα κινητοποίηση των κυττάρων από το ΒΜ. Ωστόσο, ο αριθμός των κυκλοφορούντων BMPCs, όπως μετρήθηκε με σήμανση καλλιεργημένα ΤΜΧ περιφερικού αίματος με AcLDL /ισολεκτίνη Β4 [42], δεν ήταν σημαντικά μειωμένη με την παρουσία της κυκλοπαμίνης (Σχήμα S6). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι Hh μπορεί να ρυθμίσει άμεσα την πρόσληψη, τη διαφοροποίηση, ή μετανάστευση των πρόδρομων ουσιών για BMPCs μέσα στο μικροπεριβάλλον του όγκου και όχι που επηρεάζουν την κινητοποίηση των πρόδρομων ουσιών από το μυελό.

Επειδή η αναστολή της σηματοδότησης Hh δεν επηρέασε την κινητοποίηση του BMPCs, επιδιώξαμε να διερευνηθούν οι μηχανισμοί με τους οποίους σηματοδότηση Hh θα μπορούσαν να ενισχύσουν την ενσωμάτωσή τους στο αγγειακό σύστημα του όγκου. Για να γίνει αυτό, εξετάσαμε τις επιδράσεις της hh σηματοδότησης για τη μετανάστευση των προδρόμων ουσιών. Η μετανάστευση των BMPCs μέσω μιας μεμβράνης transwell

in vitro

μετρήθηκε υπό την παρουσία KP-1Ν στο χαμηλότερο φρεάτιο. Καλλιεργημένα BMMNCs εκφράζουν c-Kit, CD11b και VE-καδερίνη χρησιμοποιήθηκαν ως οι πρόδρομοι για BMPCs (Σχήμα S6). Ο αριθμός του BMPCs μεταναστεύουν προς την κάτω πλευρά της μεμβράνης ήταν σημαντικά αυξημένη όταν συν-καλλιεργήθηκαν με ΚΡ-1Ν σε σχέση με τις προ-αγγειογενετική κύτταρα χωρίς KP-1N, υπονοώντας ότι εκκρινόμενη παράγοντες από τα κύτταρα PDAC μπορεί να ενισχύσει την μετανάστευση οι πρόδρομοι (Σχήμα 4Α). Συνεπής με ένα ρόλο για το μονοπάτι HH-Smo, προετοιμασία του BMPCs με κυκλοπαμίνη μείωσε δραματικά την ικανότητά τους να μεταναστεύουν με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα 4Α). Για να αντιμετωπίσει άμεσα το ρόλο της Smo εξαρτώμενη σηματοδότηση σε BM-προερχόμενα προ-αγγειογενετική κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε τα κύτταρα ΒΜ έχουν μολυνθεί με ένα shRNA φακοϊό στόχευση Smo (Σχήμα 4Β). Καταστολή της ΠΕΑ εξασθενεί σημαντικά τη μετανάστευση τους σε καρκινικά κύτταρα KP-1N. Ο ρόλος των όγκων προερχόμενων Shh στη μετανάστευση των προδρόμων επιβεβαιώθηκε επίσης με τη χρήση ενός Shh εξουδετερωτικό αντίσωμα (Σχήμα 4C).

(Α-Β) Η μετανάστευση των BM-προερχόμενο προ-αγγειογενετική κύτταρα (BMPCs) αξιολογήθηκε. BMMNCs καλλιεργήθηκαν σε μέσο EGM2-MV για 4 ημέρες και συνδεδεμένα κύτταρα σπάρθηκαν επί transwell (5 μm πόρου) επικαλυμμένα με 0,1% ζελατίνη, και τα κύτταρα KP-1N σπάρθηκαν στο χαμηλότερο φρεάτιο. Αριθμός μετανάστευσαν κυττάρων εντός της κάτω πλευράς της μεμβράνης προσδιορίστηκε ποσοτικά με χρώση ϋΑΡΙ μετά από 18 ώρες επώασης. Οι BMPCs προκατεργάστηκαν με κυκλοπαμίνη (Α), shRNA φακοϊού για Smo (Β), και αντι-Shh και /ή αντι-VEGF αντίσωμα εξουδετέρωσης (C) όταν εμβολιάζονται πάνω στο φρεάτιο. Για ένα θετικό μάρτυρα, ανθρώπινο VEGF (50 ng /mL) προστέθηκε στο κατώτερο φρεάτιο, και οι BMPCs καλλιεργήθηκαν μόνα ως αρνητικός έλεγχος.

Η

Προκειμένου να μελετήσουμε τις επιδράσεις της διαφοροποίησης οδού Smo για τη μετανάστευση του BMPCs

in vivo

, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις βύσμα matrigel. Όταν συμπυκνωμένο υπερκείμενο από κύτταρα KP-1N αναμιγνύεται με Matrigel εμφυτεύθηκε υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς, ο αριθμός των κυττάρων ξενιστών που μεταναστεύουν εντός του matrigel ήταν σημαντικά αυξημένη, και τα κύτταρα που σχηματίζονται μία δομή κορδόνι-όπως, μιμούμενη τριχοειδή μορφογένεση

in vivo

(Σχήμα 5Α). Για να γίνεται διάκριση BM-προερχόμενα κύτταρα από άλλους στρωματικά κύτταρα, το πείραμα επαναλήφθηκε με τη χρησιμοποίηση άλλων χιμαιρικών ποντικών που υποβλήθηκε σε ΒΜΤ. Από τη στιγμή που παρατηρήθηκε σημαντική έκφραση Tie2 mRNA στα BM-προερχόμενο προ-αγγειογενετική χρησιμοποιουμένων κυττάρων σε

in vitro

δοκιμασίες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), τα ποντίκια Tie2 /LacZ χρησιμοποιήθηκαν ως δότης για την ΒΜΤ [42]. Ένα μεγάλο κλάσμα των κυττάρων εντός matrigel προήλθε από ΒΜ όπως αντικατοπτρίζεται από θετικές ανοσοχρώση για β-gal (Σχήμα 5Β). Η μετανάστευση των κυττάρων ξενιστών σε βύσματα Matrigel εξασθένησε σημαντικά όταν η κυκλοπαμίνη προστέθηκε στο matrigel. Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα ελήφθη επίσης χρησιμοποιώντας ένα αντι-Shh αντίσωμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Matrigel δοκιμασία βύσμα χρησιμοποιώντας Tie2 /LacZ-ΒΜΤ χιμαιρικά γυμνούς ποντικούς. αυξητικού παράγοντα μειωμένη matrigel αναμιγνύεται με πυκνό ρυθμισμένο μέσο από ΚΡ-1Ν (CM

KP-1Ν) μεταμοσχεύθηκαν σε χιμαιρικά ποντίκια. Σε πειραματικές ομάδες, matrigel αναμίχθηκε επίσης με κυκλοπαμίνη. (Α) μορφογένεση Τριχοειδούς εντός του matrigel ποσοτικοποιήθηκε από τον αριθμό των σημείων διακλάδωσης σε τομές H-E. (Β) Matrigel είχε ανοσοχρώση με β-gal. Ορατή είναι μέση τιμή ± SEM του β-gal θετικά κύτταρα.

Η

Συλλογικά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η αναστολή του όγκου που προέρχεται σηματοδότηση Hh οδηγεί σε αναστολή της αγγειογένεσης του όγκου και της αποσταθεροποίησης του αγγειακού συστήματος με ταυτόχρονη μείωση στην πρόσληψη της BMPCs στο στρώμα του όγκου.

κανονισμός του Προ- και Αντι-αγγειογενετικών παραγόντων με σηματοδότηση Hh

Για να προσδιοριστεί η μοριακή βάση της αγγειακής διαταραχής με αποκλεισμό Hh, έχουμε ποσοτικά τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του προ- και αντι-αγγειογόνους παράγοντες εις PDAC ξενομοσχεύματα χρησιμοποιώντας συγκεκριμένα είδη σύνολα εκκινητών /ανιχνευτών για qPCR. Συγκεκριμένα, ήμασταν περίεργοι να ξέρουν τα επίπεδα του VEGF και SDF-1, οι οποίες θεωρούνται προ-αγγειογενετικών παραγόντων λόγω καταδείξει τις επιπτώσεις τους στην πρόσληψη και τη διατήρηση των προ-αγγειογενετική πρόδρομα κύτταρα σε θέσεις σχηματισμού όγκων [34], [ ,,,0],43].

Βρήκαμε ότι τα ανθρώπινα VEGF και η έκφραση mRNA SDF-1 μειώθηκαν κατά 31% και 33%, αντίστοιχα, στους όγκους που έλαβαν κυκλοπαμίνη (Σχήμα S7). Αυτά τα αποτελέσματα είναι σε αντίθεση με τη μέτρια ρύθμιση προς τα κάτω του VEGF και SDF-1 mRNA σε κυκλοπαμίνη επεξεργασμένα κύτταρα KP-1N

in vitro

, είτε σε νορμοξικά ή υποξικές συνθήκες (Σχήμα S8). Ομοίως, η σταθερότητα HIF-1α δεν επηρεάστηκε υπό συνθήκες υποξίας

in vitro

. Επιπλέον, το κλείδωμα Shh με εξουδετέρωση αντίσωμα δεν προκαλεί μια μείωση στην VEGF mRNA σε κύτταρα KP-1N, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι αυτοκρινείς σηματοδότηση Shh δεν προσδίδει ένα αγγειογόνο φαινότυπο απευθείας στο ΚΡ-1Ν (Σχήμα S8). Αντίθετα, αυτά τα συλλογικά αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι σηματοδότηση Hh προσκρούει επάνω στο στρώμα και ότι στρωματικά προερχόμενο παράγοντες θα μπορούσαν να συμβάλλουν στην έκφραση του VEGF και SDF-1 στα κύτταρα όγκου

in vivo

.

έχει αποδειχθεί ότι ο καρκίνος σχετίζεται ινοβλάστες εκκρίνουν SDF-1 για την πρόσληψη του μυελού των οστών προερχόμενα ενδοθηλιακά πρόδρομα κύτταρα εντός του στρώματος του όγκου, προκειμένου να μεσολαβήσει την αγγειογένεση [44]. Ως εκ τούτου, έχουμε την επόμενη ποσοτικοποιηθεί η έκφραση αυτών των προ /παράγοντες αντι-αγγειογενετική του στρώματος του όγκου ποντικού. Mouse VEGF και τα επίπεδα SDF-1 δεν επηρεάστηκαν από κυκλοπαμίνη

in vivo

(Σχήμα 6Α), υποδεικνύοντας ότι Hh δεν εμπλέκεται στη ρύθμιση αυτών των προ-αγγειογόνων παραγόντων από στρώματος του όγκου.

εκφράσεις (Α) mRNA του ποντικού προ /αντι-αγγειογόνους παράγοντες σε ξενομοσχεύματα προσδιορίστηκαν ποσοτικά με qPCR. (Β, C) δοκιμασία συν-καλλιέργεια διεξήχθη χρησιμοποιώντας trenswell. BM-προερχόμενα προ-αγγειογενετική κύτταρα (BMPCs) μολύνθηκαν με φακοϊό εκφράζουν ελέγχου shRNA ή Smo shRNA και συν-καλλιέργεια με κύτταρα KP-1N εμβολιάζονται σε transwell (0,4 μm). RNA συλλέχθηκε από το BMPCs 12 ώρες μετά για qPCR (κανονικοποιημένη σε κύτταρα χωρίς KP-1Ν). (D) δοκιμασία σχηματισμού Tube διεξήχθη με καλλιέργεια MS-1 επί matrigel σε παρουσία ή απουσία GFP-επισημασμένου BMPCs. Τριχοειδής μορφογένεση παρατηρήθηκε μετά από 8 ώρες επώασης με ή χωρίς αντι-IGF-1 εξουδετερωτικών αντισωμάτων. μπαρ κλίμακα, 500 μm. Αριθμός σημείων διακλάδωσης και την ενσωμάτωση των BMPCs σε σωλήνα ποσοτικά.

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε την έκφραση των παραγόντων που ρυθμίζουν την αγγειακή σταθερότητα. Στους όγκους ποντικών που έλαβαν κυκλοπαμίνη, σημειώσαμε σημαντική μείωση σε μυϊκά Ang-1, IGF-1, και ΡϋΟΡ-Β mRNA, παράγοντες που είναι γνωστό για τη σταθεροποίηση της νεοαγγείωση. Ang-1 παίζει έναν κρίσιμο ρόλο κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης για τη σταθεροποίηση neovessels [30], και τον συγγενή υποδοχέα της Tie2 εκφράζεται σε ECs, προ-αγγειογενετική μονοκύτταρα, καθώς και πρόδρομοι περικύτταρο μεσεγχυματικής προέλευσης [45]. Η μείωση της Ang-1 συζεύχθηκε με 86,3% προς τα πάνω ρύθμιση της Ang-2, ένα φυσικό ανταγωνιστή για Tie2, που οδηγεί σε διάσπαση του επιχρίσματος τοιχογραφία κύτταρο να κινήσει την αγγειογένεση [46] (Εικόνα S9). Σε μια προσπάθεια να κατανοήσουμε τη ρύθμιση αυτών των παραγόντων με σηματοδότηση Hh, συγκρίναμε τα επίπεδα τους mRNA σε BMPCs που ήταν συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα KP-1N. Παρατηρήθηκε Ang-1 και IGF-1 αλλά όχι PEDF-B mRNA ρυθμίζεται αυξητικά κατά περισσότερο από 2 φορές σε κυκλοπαμίνη ευαίσθητο τρόπο (Σχήμα 6Β), και ταυτόχρονη ρύθμιση προς τα κάτω της Ang-2 mRNA στους προδρόμους. Η αλλοιωμένη έκφραση της Ang-1 και Ang-2 ακυρώθηκε από κυκλοπαμίνη, και η επίδραση στην Ang-1 αναλογία Ang-2 /ήταν δραματική (54,3% μείωση? Σχήμα S9). Συνεπής αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όταν στοχευμένη Smo στις BM-προερχόμενο προδρόμων από λεντοϊού shRNA, επιβεβαιώνοντας ότι η μεταβολή της γονιδιακής έκφρασης Ang-1 με κυκλοπαμίνη οφειλόταν σε αποκλεισμό της Smo που εξαρτώνται οδού (Σχήμα 6C). Έτσι, HH-εξαρτώμενη σηματοδότηση Ang-1 /Τίε2 φαίνεται να είναι ένας από τους δυνητικούς μηχανισμούς με τους οποίους BMPCs σταθεροποίηση neovessels.

IGF-1 είναι ένας στόχος της σηματοδότηση Hh σε BM-Προέρχονται Pro-αγγειογενετική Cells

Η μείωση της IGF-1 mRNA που παρατηρήθηκε σε ξενομοσχεύματα αγωγή με κυκλοπαμίνη (Σχήμα 6Α) επίσης ανακεφαλαιώνονται στους προσδιορισμούς συγκαλλιέργειας? δηλαδή, η ισχυρή επαγωγή του IGF-1 σε BMPCs από KP-1Ν-προερχόμενο παράγοντες εμποδίστηκε σημαντικά είτε με κυκλοπαμίνη ή shRNA έναντι Smo (Σχήμα 6Β, Γ). Για την επαλήθευση της ρόλος του IGF-1 κατά τη διάρκεια νεοαγγειοποίησης, μια δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα διεξήχθη χρησιμοποιώντας MS-1 (ποντικού ώριμη γραμμή ΕΚ) με ΒΜ-προερχόμενο προ-αγγειογενετική προδρόμων GFP-επισημασμένο (Σχήμα 6D). Τριχοειδής μορφογένεση από το MS-1 που προκαλείται από το BMPCs, και το αποτέλεσμα ενισχύθηκε όταν είχαν προετοιμάζονται παρουσία κυττάρων KP-1Ν. Εντυπωσιακά, η επίδραση επί του σχηματισμού των τριχοειδών ήταν σημαντικά μειωμένη κατά την κατεργασία με ένα εξουδετερωτικό αντίσωμα αντι-IGF-1. Έτσι, ο IGF-1 είναι ένας σημαντικός στόχος της σηματοδότηση Hh σε BM-προερχόμενα κύτταρα, και η προς τα κάτω ρύθμιση του IGF-1 σε ξενομοσχεύματα όγκου με αγωγή με κυκλοπαμίνη θα μπορούσε να συμβάλει στη διάσπαση της αγγειογένεσης.

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, έχουμε εντοπίσει τους BM-προερχόμενο προ-αγγειογενετική κύτταρα (BMPCs) ως ένας από τους στόχους του παρακρινούς Hh, η οποία παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην προώθηση της αγγειογένεσης των όγκων και της προόδου του όγκου. Η αποσταθεροποιηθεί αγγείωσης του όγκου που παρατηρείται κατά την αγωγή με κυκλοπαμίνη πρώτα μας οδηγούν να υποθέσουμε ότι θα μπορούσαμε να παρατηρήσουμε μία μείωση σε στρωματικά Ang-1 και IGF-1, παράγοντες που είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται από Hh μονοπάτι [47], [48].

Ang-1 αναπτύσσει και σταθεροποιεί την πρωτόγονη αγγείωσης υπό σηματοδότηση Hh σε πνεύμονα διακλάδωση μορφογένεση [49] και Shh αύξησε τα επίπεδα του mRNA της Ang-1 σε ινοβλάστες, αλλά μειώθηκε Ang-2 [47], [50]. πείραμα συγκαλλιέργειας μας απέδειξαν Ang-1 mRNA σε BMPCs ρυθμίζεται αυξητικά από διαλυτούς παράγοντες από KP-1Ν σε ένα SMO-εξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας ένα ρόλο των προδρόμων ως δεξαμενή της Ang-1 στο μικροπεριβάλλον του όγκου για να σταθεροποιήσει Tie2 εκφράζουν ECs καθώς και υποσύνολα των προ-αγγειογόνων κυττάρων. Πράγματι, ένα ορισμένο κλάσμα του ΒΜ-προερχόμενα κύτταρα εκφράζουν επίσης Tie-2 υποδοχέα [51], υποστηρίζοντας μια εναλλακτική αυτοκρινή ή παρακρινή επίδραση στην αγγειογενετική δραστηριότητα τους από τον περιβάλλοντα στρώμα μέσω Ang-1 συνδέτη.

Υπάρχουν διάφορες κυτταρικές πηγές του IGF-1 στο στρώμα του όγκου, και η μείωση του στρώματος προερχόμενα IGF-1 που παρατηρήσαμε μπορεί να εξηγήσει την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων PDAC

in vivo

όταν σηματοδότηση Hh μπλοκαρίστηκε [27]. IGF-1 μπορεί επίσης να ενισχύσει την δραστικότητα του ΒΜ-προερχόμενα κύτταρα για την προώθηση νεοαγγείωση μέσω ΡΙ3Κ /Akt σηματοδότηση [52]. Στην παρούσα μελέτη, η ενίσχυση των τριχοειδών μορφογένεση MS-1 κύτταρα από τις BMPCs διεγερμένα με PDAC κύτταρα σαφώς εξασθενημένα από αντι-IGF-1 (Σχήμα 5D). Έτσι, ο IGF-1 φαίνεται να είναι ένα από τα σημαντικότερα στόχων σηματοδότησης Hh στο BMPCs και μεσολαβεί επίδρασή της στην νεοαγγείωση. Υπήρξε μια σημαντική μείωση στην έκφραση του PDGF-Β στο στρώμα του όγκου

in vivo

καθώς και σε BMPCs

in vitro

? Ωστόσο, ανάλυση της συν-καλλιέργειας μας BMPCs με ΚΡ-1Ν δεν έδειξε προς τα επάνω ρύθμιση του PDGF-Β mRNA, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο καρκίνος που προέρχεται Hh συνδετήρας είναι απίθανο να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην επαγωγή PDGF-Β. Ωστόσο, η ρύθμιση προς τα κάτω του PDGF-Β με κυκλοπαμίνη μπορεί εν μέρει ευθύνονται για τη μειωμένη πρόσληψη περικύτταρα σε πρόσφατα σχηματισμένο αγγειακό δίκτυο σε ξενομοσχεύματα.

Οι μοριακοί μηχανισμοί που αποκαλύφθηκαν εδώ σαφώς καταδεικνύουν ότι σηματοδότηση Hh παίζει ένα ρόλο στην παρακρινή εξέλιξης του όγκου. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι μεταγραφική επαγωγή Gli μπορεί να διατηρηθεί ανεξάρτητα από Smo [24], και η μη κανονική ρύθμιση των γονιδίων Gli-στόχος διαμεσολαβείται εν μέρει μέσω του ΤΟΡ-β και σηματοδότηση Kras. Πράγματι, οι περισσότεροι PDAC κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων KP-1N, εκφράζουν ογκογόνο Kras και έχει αποδειχθεί ότι ο ΤΟΡ-β-Smad οδός ενεργοποιείται σε κύτταρα KP-1N [53]. Αυτά τα μονοπάτια μπορεί να ευθύνονται για τη μέτρια μείωση των Gli1 μεταγραφή από την κυκλοπαμίνη που παρατηρήσαμε. Είναι επίσης πιθανό ότι η

in vivo

ανάπτυξη αναστολή από αποκλεισμό Hh που παρατηρήσαμε μπορεί να προκαλείται μέσω μιας επίδρασης στην αυτο-ανανέωση ιδιότητα των σπάνιων PDAC κύτταρα έναρξης [54]. Ωστόσο, η σημαντική αλλαγή στη κινητική πολλαπλασιασμού /θάνατος που παρατηρήσαμε σε ένα μεγάλο ποσοστό των καρκινικών κυττάρων στα ξενομοσχεύματα σε επεξεργασία με cyclopaminewas σαφώς συνοδεύεται από την αναστολή της αγγειογένεσης.

Η κυκλοπαμίνη εξασθενημένο όχι μόνο την πρόσληψη BM-προερχόμενο κύτταρα στον όγκο αλλά και την ενσωμάτωσή τους στο αγγειακό σύστημα του όγκου, υποστηρίζοντας μια εμπλοκή του Hh στον όγκο που σχετίζεται με αγγειογένεση. Τα δεδομένα μας δεν υποστηρίζουν την ιδέα ότι αυτοκρινή σηματοδότηση Hh σε καρκινικά κύτταρα συμβάλλει στην αγγειογένεση όγκου, και μάλλον υποδηλώνουν ότι Hh δρα αποκλειστικά στο στρώμα. Shh έχει αποδειχθεί ότι ελέγχουν άμεσα τη δραστηριότητα των κυττάρων BMPCs διεγείροντας τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση τους και την πρόκληση αγγειογόνοι παράγοντες για την προώθηση της αγγειακής αναδιαμόρφωσης [26], [29], [55]. Δείξαμε ότι οι παράγοντες που εκκρίνονται από τα κύτταρα PDAC μπορεί να ενισχύσει τη μετανάστευση των προδρόμων κυττάρων τουλάχιστον εν μέρει σε ένα SMO-εξαρτώμενο τρόπο. Υπήρχε μια πρόσθετη επίδραση της Hh σηματοδότησης για τη συναρμολόγηση ΕΚ μέσω της ενεργοποίησης των BMPCs μαζί με βλάστησης ώριμη ECs. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η Shh μπορεί να ενισχύσει την δραστικότητα των προδρόμων για την προώθηση των τριχοειδών μορφογένεση από HUVEC [26]. Κλίμακα μπαρ? Κλίμακα μπαρ?