Αφηρημένο

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι ο γυναικολογικός καρκίνος που παρουσιάζει την υψηλότερη νοσηρότητα και τη βελτίωση των θεραπειών εξακολουθεί να απαιτείται. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα υποδοχέων οιστρογόνων βήτα (Ετβ) μειώθηκε μαζί με ωοθηκών καρκινογένεση. Εδώ, παρουσιάζουμε στοιχεία ότι επαναφορά του ΕΡβ στην BG-1 επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, που εκφράζουν ΕΡα, οδηγεί

in vitro

σε μείωση των βασικών και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων οιστραδιόλης-προωθείται. ΕΡβ μείωσε τη συχνότητα των κυττάρων στη φάση S και αύξησε το ένα από τα κελιά σε G2 /M φάση. Στο μοριακό επίπεδο, βρήκαμε ότι το ΕΡβ μειωτικά σύνολο ρετινοβλάστωμα (Rb), φωσφορυλιωμένη Rb και φωσφο-ΑΚΤ κυτταρικό περιεχόμενο, καθώς και κυκλίνες D1 και Α2. Επιπλέον, ΕΚβ είχε άμεση επίδραση στην ΕΡα, αναστέλλοντας έντονα την έκφραση και τη δραστηριότητα του, η οποία θα μπορούσε να εξηγήσει μέρος της αντι-πολλαπλασιαστική δράση των ΕΚβ. Με την ανάπτυξη ενός νέου προκλινικό μοντέλο καρκίνου των ωοθηκών με βάση ένα φωτοβόλο ορθοτοπική ξενομοσχεύματος σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς, έχουμε αποκάλυψε περαιτέρω ότι η έκφραση ΕΚβ μειώνει την ανάπτυξη του όγκου και την παρουσία καρκινικών κυττάρων σε θέσεις μετάστασης, ως εκ τούτου, με αποτέλεσμα τη βελτίωση της επιβίωσης των ποντικών. Συνολικά, αυτά τα ευρήματα αποκαλύπτουν μια πιθανή ογκοκατασταλτικών ρόλο του ΕΚβ στη ωοθηκών καρκινογένεση, η οποία θα μπορούσε να είναι πιθανή κλινική σημασία για την επιλογή της καταλληλότερης θεραπείας για τους ασθενείς

Παράθεση:. Bossard C, Busson M, Vindrieux D, Gaudin F, Machelon V, Brigitte M, et al. (2012) δυνητικός ρόλος των υποδοχέων οιστρογόνων Beta ως Ογκοκατασταλτικής του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 7 (9): e44787. doi: 10.1371 /journal.pone.0044787

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 του Νοεμβρίου 2011? Αποδεκτές: 13 Αύγ 2012? Δημοσιεύθηκε: 6η Σεπτεμβρίου του 2012

Copyright: © Bossard et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από ARC (Association pour la Recherche contre le Cancer, Grant Νο 3582) (https://www.arc-cancer.net), Η Ligue Nationale contre le Cancer (http: //www.ligue-cancer .καθαρά). Muriel Busson υποστηρίχθηκε από FRM (Fondation pour la Recherche Médicale) (https://www.frm.org). DV ήταν αποδέκτης της Ligue Nationale contre le Cancer. CB υποστηρίχθηκε από μια ΕΠΑΣ υποτροφία (https://www.hfsp.org/). Η KB εργαστήριο υποστηρίζεται από την Agence Nationale de la Recherche (ANR, χορηγεί αριθμό 2010 JCJC 1104 01) (https://www.agence-nationale-recherche.fr/), το Πανεπιστήμιο Paris-Sud, το Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) και το Ligue Nationale Contre le Καρκίνο (Comité Val d’Oise), και είναι μέλος του Εργαστηρίου αριστείας LERMIT (Εργαστήριο αριστείας στην έρευνα για φαρμακευτική αγωγή και καινοτόμες θεραπείες) που υποστηρίζεται από επιχορήγηση από ANR (Investissements d’Avenir). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το ενιαίο επιθηλιακό κυτταρικό στρώμα που περιβάλλει τις ωοθήκες σήμερα πιστεύεται ότι είναι μία από τις πηγές της προ-νεοπλασματικών βλαβών που οδηγούν άνοδο σε επιθηλιακά καρκινώματα των ωοθηκών, που αντιπροσωπεύουν τη συντριπτική πλειοψηφία των ωοθηκών [1]. Επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) είναι η έβδομη πιο κοινή μορφή καρκίνου. Ωστόσο, παραμένει η τέταρτη πιο θανατηφόρα, διότι είναι δύσκολο να εντοπιστεί σε πρώιμο στάδιο και, ως εκ τούτου, για τη θεραπεία του [2]. Είτε προσδιορίζονται σε μορφολογικά κατηγορίες (δηλαδή, ορώδης, βλεννώδες, ενδομητριοειδές, και σαφής κύτταρα) με βάση τις ιστολογικές κριτήρια και ομοιότητα στα επιθηλιακά συστατικά του κανονικού αναπαραγωγικής οδού, ή, πιο πρόσφατα, έχουν ταξινομηθεί ως χαμηλής ή υψηλής ποιότητας όγκους [2], EOC είναι μια πολύπλοκη ασθένεια για την οποία η αιτιολογία είναι ελάχιστα κατανοητή. Μυθιστόρημα δείκτες και στόχους για θεραπείες έτσι χρειάζονται επειγόντως.

Ωοθηκών είναι το κύριο όργανο της παραγωγής των οιστρογόνων, τα οποία κυρίως αντίκτυπο στην ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και τη λειτουργία των αναπαραγωγικών ιστών [3]. Μέσα από μιτογόνο δράση τους, τα οιστρογόνα παίζουν ρόλο στην ωοθηκών καρκινογένεση. Αρκετές μελέτες έχουν επισημάνει έναν αυξημένο κίνδυνο καρκίνου των ωοθηκών σε ασθενείς που λαμβάνουν μακροχρόνια θεραπεία αντικατάστασης οιστρογόνου [4], [5], [6], [7], ενώ οι ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με από του στόματος αντισύλληψη συνδυασμό οιστρογόνων και προγεστινών έδειξαν μειωμένο κίνδυνο την ανάπτυξη ενός καρκίνου των ωοθηκών [8], [9]. οιστρογονική δράση διαμεσολαβείται από δύο υποδοχείς, ΕΚα και ΕΚβ, δύο παράγοντες μεταγραφής μιας μεγάλης οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων [10], [11]. Περίπου 40 έως 60% των καρκίνων των ωοθηκών εκφράζουν ΕΚα [12], αλλά είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι μόνο ένα μικρό ποσοστό από αυτά θα επωφεληθούν από την αντι-οιστρογόνο θεραπεία [13]. Ο ρόλος του ΕΚβ στη βιολογία των ωοθηκών παραμένει ελάχιστα κατανοητή, αλλά φαίνεται να είναι διαφορετική από εκείνη των ΕΚα [14].

ΕΚβ

knock-out ζώα (βERKO) είναι υπογόνιμο, παράγουν λιγότερες γέννες και κουτάβια μετά από επαγωγή υπερωορηξίας [15], [16]. Οι ωοθήκες των ζώων βERKO περιέχουν λιγότερες μεγάλες άντρου ωοθυλακίων και ωχρού σωματίου σε σύγκριση με νεογνά άγριου τύπου, το οποίο είναι ταυτόχρονη με χαμηλότερα επίπεδα οιστραδιόλης παράγονται [17] και μια μειωμένη έκφραση των βασικών γονιδίων που εμπλέκονται στην λειτουργία των ωοθηκών όπως αρωματάσης (

Cyp19a1

), υποδοχέα LH (

Lhcgr

), και προσταγλανδίνης συνθάσης 2 (

Ptgs2

) [18].

Αρκετές μελέτες έχουν κατέρρευσε ένα δυναμικό ρόλο για την ΕΚβ στην EOC. Ειδικότερα, τα επίπεδα ήταν χαμηλότερα ΕΡβ σε όγκους των ωοθηκών σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς [19], [20], [21], [22]. Επιπλέον, η απώλεια της έκφρασης ΕΚβ μπορεί να συσχετιστεί με μικρότερη συνολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών [23]. επίπεδα ΕΡβ συνδέονται επίσης με μεταστατική κατάσταση λεμφαδένων [24]. Ένας πολυμορφισμός (rs127572) του

ΕΡβ

γονίδιο έχει επίσης ταυτοποιηθεί πρόσφατα και φαίνεται να σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης μιας καρκίνο των ωοθηκών [25]. Ωστόσο, εξακολουθεί να είναι άγνωστο αν αυτός ο πολυμορφισμός επηρεάζει την έκφραση του ΕΚβ. Η ενδοκυτταρική τοποθεσία του ΕΚβ σε κύτταρα όγκου φαίνεται να είναι σημαντική. Πράγματι, μια πρόσφατη μελέτη έχει δείξει ότι το ΕΚβ εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων, ενώ ήταν κυρίως πυρηνική σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα [26]. Επιπλέον, κυτταροπλασματική έκφραση ΕΚβ συσχετίστηκε με κακή έκβαση για ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο των ωοθηκών ορώδες [14]. Αυτά τα ευρήματα, σε συνδυασμό με τις προαναφερθείσες κλινικές συσχετίσεις μεταξύ Ετβ και την επιβίωση του ασθενούς, μας οδηγούν στην υπόθεση ότι το ΕΡβ είναι ένας κρίσιμος παράγοντας στην πρόοδο του όγκου των ωοθηκών και να οριοθετηθούν την ακριβή συμβολή αυτού του υποδοχέα στα μοριακά μονοπάτια υποκείμενες EOC καρκινογένεση.

Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε BG-1 κύτταρα ως ένα κυτταρικό μοντέλο και εκμεταλλεύτηκε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού που έχουμε αναπτύξει. BG-1 κυτταρική γραμμή είναι μία ανθρώπινη κυτταρική γραμμή EOC που προέρχεται από ένα στερεό ιστό πρωτοπαθούς όγκου από έναν ασθενή με στάδιο III, αδενοκαρκίνωμα χαμηλής διαφοροποίησης των ωοθηκών [27]. Αυτά τα κύτταρα εκφράζουν ΕΚα και είναι ευαίσθητα σε οιστρογόνα από την άποψη της διάδοσης [21], [28]. Πειραματικά μοντέλα της ωοθηκικής καρκινογένεσης είναι απαραίτητες για την κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη της νόσου, αλλά επίσης για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα των νέων θεραπευτικών φαρμάκων [29]. Πολλά μοντέλα έχουν αναπτυχθεί, συμπεριλαμβανομένων των διαφόρων ξενομόσχευμα και διαγονιδιακά μοντέλα, κανένα δεν είναι πλήρως ικανοποιητική. Τα μοντέλα ξενομοσχεύματος που χρησιμοποιούνται σήμερα είναι είτε ενδοπεριτοναϊκή, υποδόρια ή εντός του θυλάκου ορθοτοπικά στην ωοθήκη. Μόνο λίγες εκθέσεις περιγράφουν ορθοτοπική ξένου μοσχεύματος. Παρ ‘όλα αυτά, ορθοτοπική εμφύτευση κυττάρων μπορεί να εκληφθεί ως περισσότερο φυσιολογική, καθώς τα καρκινικά κύτταρα εμβολιάστηκαν απευθείας στο περιβάλλον και των ωοθηκών μπορεί να οδηγήσει σε μετάσταση. Επομένως, για να διερευνηθεί ο ρόλος του ΕΚβ σε EOC καρκινογένεση, επιλέξαμε να επωφεληθούν από ένα ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού που βασίζονται στη χρήση του λουσιφεράσης (Luc) εκφράζοντα ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών BG-1.

δείχνουν εδώ ότι η επανεισαγωγή του ΕΚβ σε κύτταρα BG-1 με τη χρήση ενός αδενοϊού οδηγεί

in vitro

σε μια αναστολή τόσο της βασικής και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που προκαλείται από εστραδιόλη. ΕΡβ ασκεί αντι-πολλαπλασιαστική δράση του μέσω της μείωσης της συχνότητας των κυττάρων στη φάση S, μία αύξηση των κυττάρων σε G2 φάση, μαζί με μια αλλοιωμένη έκφραση των ρυθμιστικών του κυτταρικού κύκλου. Στο μοριακό επίπεδο, ΕΡβ ήταν σε θέση να καταστείλει την έκφραση, τη δραστηριότητα και τη σηματοδότηση του ΕΚα, και έτσι να εμποδίσει δράση πολλαπλασιασμού του. Επιπλέον, ΕΡβ ήταν σε θέση να μειώσει σημαντικά την ανάπτυξη του ορθοτοπική ξενομοσχεύματος ωοθηκών, καθώς και την παρουσία καρκινικών κυττάρων οι θέσεις μετάστασης, οδηγώντας σε αυξημένη επιβίωση των ποντικών. Συνολικά, τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν ένα ρόλο για το ΕΚβ ως ογκοκατασταλτικών στην EOC καρκινογένεση.

Αποτελέσματα

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το ΕΡβ είναι ασθενώς εκφράζεται σε ιστούς EOC και κυτταρικές σειρές που προέρχονται σύγκριση με φυσιολογικό ιστό [11]. Πήραμε πλεονέκτημα της ανθρώπινης κυτταρικής γραμμής EOC BG-1, η οποία εκφράζει ενδογενή επίπεδα ΕΚα και είναι ευαίσθητη σε οιστρογόνα [27]. Εδώ, πρέπει πρώτα να επιβεβαιώσει ότι τα κύτταρα BG-1 εμφανίζουν χαμηλά επίπεδα σταθερής κατάστασης των προϊόντων ΕΚβ, δηλαδή mRNA και πρωτεϊνών (Εικ. 1Α, Β). Το επόμενο βήμα για την αξιολόγηση του ρόλου της ΕΚβ σε ωοθηκών καρκινογένεση ήταν να αποκατασταθεί η έκφρασή της σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Έτσι, BG-1 κύτταρα μολύνθηκαν με ένα σκελετό (Ad5) ή ανθρώπινο

ΕΡβ

(Adβ) που κωδικοποιεί αδενοϊού [30], [31].

ΕΡβ

υπερέκφραση όντως ελήφθη στο Adβ κύτταρα μολυσμένα επικυρωμένα με πραγματικού χρόνου PCR και αναλύσεις στυπώματος Western (Σχ. 1Α, Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα ΕΡβ ήταν έντονα κάτω-ρυθμίζονται από οιστραδιόλη (Ε2), τόσο σε επίπεδο RNA και πρωτεΐνης. Επιπλέον, σε περίπτωση απουσίας του ΕΚβ, τα επίπεδα ΕΚα επίσης ήταν ρυθμισμένη προς τα κάτω από την Ε2, αν και σε μικρότερο βαθμό. Όταν ΕΡβ εισήχθη στα κύτταρα, το βασικό επίπεδο έκφρασης του ΕΚα απουσία Ε2 μειώθηκε και κατά το ήμισυ. Η παρουσία του ΕΚβ έντονα μειωμένα επίπεδα ΕΚα υπό την παρουσία Ε2 (μείωση πάνω από 15 φορές σε 3 ώρες), υποδεικνύοντας ότι το ΕΡβ ενισχύει την αποικοδόμηση του ΕΚα. Αυτό είναι πιθανό να οφείλεται στην πρωτεασώματος εξαρτώμενη αποδόμηση των πρωτεϊνών ΕΚα και ΕΚβ [32]. Τα αποτελέσματα των ΕΚβ υπερέκφραση για την ανταπόκριση των οιστρογόνων στη συνέχεια διερευνώνται. Αναλύσαμε την ικανότητα των ΕΡβ να διενεργοποιεί ένα συνθετικό ανταποκριτή λουσιφεράσης ευαίσθητη σε οιστρογόνα στα κύτταρα BG-1. Η ενδογενής ΕΚα ήταν σε θέση να ενεργοποιήσει τον ανταποκριτή παρουσία Ε2 (Εικ. 1 C). ΕΡβ κατασταλεί έντονα τη δραστικότητα του ΕΚα σε απόκριση προς Ε2, γεγονός που υποδηλώνει ότι με την παρουσία του ΕΚα, ΕΡβ συμπεριφέρεται μάλλον σαν ένα καταστολέα από έναν ενεργοποιητή της σηματοδότησης των οιστρογόνων. Για να εξασφαλιστεί από τη λειτουργικότητα του υποδοχέα που παράγεται, ελέγξαμε επίσης τη δραστηριότητα του ΕΚβ στη ΕΓΚ κυτταρική σειρά PEO14 [33] που φέρεται να εκφράζει χαμηλά επίπεδα Ετα (Εικ. 1 Ε) και ως εκ τούτου δεν ανταποκρίνεται σε οιστρογόνα [34] . Τόσο Ετα και Ετβ ήταν σε θέση να διεγείρει μια οιστρογόνο ευαίσθητη ρεπόρτερ κατά την έκθεση Ε2, αν και ΕΡβ ήταν λίγο λιγότερο δραστική από ΕΚα (Σχ. 1D). Ως εκ τούτου, σε περίπτωση απουσίας του ΕΚα, ΕΡβ διατηρεί την ικανότητα να μετενεργοποιούν οδούς οιστρογόνων σηματοδότησης. Όταν ΕΡα και ΕΡβ έχουν συνεκφράζονται σε ΡΕΟ-14 κύτταρα, η δραστικότητα του ανταποκριτού παρουσία της Ε2 ήταν παρόμοια με εκείνη του ΕΚα και μόνο. Αυτό υποδηλώνει ότι το ER-αρνητική κυτταρική γραμμή ΡΕΟ-14, ΕΡβ δεν μπορεί να επηρεάσει ΕΚα δραστηριότητα. πειραμάτων Western Blot σε ΡΕΟ-14 κύτταρα δείχνουν ότι όταν ΕΚα και ΕΚβ εκφράστηκαν ξεχωριστά, τα επίπεδά τους ήταν έντονα μειωμένη παρουσία Ε2 (Σχ. 1Ε). Όταν οι συνεκφράστηκε ΕΚα και ΕΚβ, η υποβάθμιση των ΕΚα υπό την παρουσία Ε2 αυξήθηκαν ελαφρά αλλά όχι στην αναλογία παρατηρείται σε κύτταρα BG-1. Για ΕΚβ, η συνέκφραση του ΕΚα ενισχυμένης ελαφρώς την αποικοδόμηση της ΕΚβ. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα επίπεδα ΕΚα δεν ρυθμίζονται με τον ίδιο τρόπο σε BG-1 και ΡΕΟ-14 κύτταρα, τα οποία θα μπορούσε να εξηγήσει γιατί ΕΚα δραστηριότητα δεν μειώνεται δραστικά από την παρουσία του ΕΚβ σε ΡΕΟ-14 σε σύγκριση με BG-1 κυττάρων.

BG-1 κύτταρα μολύνθηκαν με Ad5 ή Adβ αδενοϊούς και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 24 ώρες με αιθανόλη όχημα ελέγχου (Control) ή Ε2 10

-8M (Ε2). Η έκφραση του γονιδίου αναφοράς ΕΡβ και rS9 μετρήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD της έκφρασης ΕΚβ κανονικοποιείται rS9 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. Μετρήσεις Adβ και Adβ + Ε2 ομάδες συγκρίθηκαν με

t

τεστ αταίριαστο του Student. ** P & lt? 0.001. B. Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από κύτταρα μολυσμένα υπό τις ίδιες συνθήκες όπως στο Α και υποβάλλεται σε επεξεργασία για 0, 3, 6 ή 24 ώρες με Ε2 10

-8M (Ε2). Τα επίπεδα της Ετα και Ετβ αναλύθηκαν με western blot. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η ανώτερη ζώνη του ΕΚβ κηλίδος επισημασμένο με ένα αστέρι αντιστοιχεί ύπαρξης ενός ειδικού χρώση. δραστηριότητα Γ Μεταγραφική του ΕΚβ. κύτταρα BG-1 μολύνθηκαν με Ad5 ή Adβ αδενοϊούς και επιμολύνθηκαν με ERE2-ΤΚ-Luc ανταποκριτή μαζί με β-γαλακτοσιδάση ανταποκριτού. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αιθανόλη ως όχημα (έλεγχος) ή Ε2 (10-8Μ) για 24 ώρες. Τα αποτελέσματα δείχνουν σχετικές δραστηριότητες Luc (% των τιμών του Ad5-μολυσμένα κύτταρα χωρίς Ε2) ± SD μετά από κανονικοποίηση με δραστικότητα β-gal (3 ανεξάρτητα πειράματα). Οι μετρήσεις των ομάδων Ad5 + Ε2 και Adβ + Ε2 σε σύγκριση με

t

τεστ αταίριαστο του Student. * P & lt? 0,05. κύτταρα D. PEO14 μολύνθηκαν με Ad5, Adα, Adβ ή τον συνδυασμό Adα και Adβ αδενοϊό και επιμολύνονται με ERE2-ΤΚ-LUC ανταποκριτή μαζί με β-γαλακτοσιδάση ανταποκριτού. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ελέγχου (έλεγχος) ή Ε2 (10-8Μ) για 24 ώρες. Τα αποτελέσματα δείχνουν σχετικές δραστηριότητες της λουσιφεράσης (% των τιμών του Ad5 μολυσμένα κύτταρα χωρίς Ε2) ± SD μετά από κανονικοποίηση με δραστικότητα β-gal (3 ανεξάρτητα πειράματα). Μετρήσεις Adα, Adβ και Adα + ομάδες β συγκρίθηκαν με

t

τεστ αταίριαστο του Student. *** P & lt? 0.001. NS: μη σημαντική. Ε πρωτεϊνών από κύτταρα μολυσμένα PEO14 στις ίδιες συνθήκες όπως στο Α και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αιθανόλη όχημα (έλεγχος) ή Ε2 10

-8M (Ε2) για 3, 6 ή 24 ώρες αναλύθηκαν με κηλίδα western με αντισώματα έναντι Ετα και Ετβ . Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η ανώτερη ζώνη επισημαίνονται με ένα αστέρι στο δεξί πάνελ αντιστοιχεί ύπαρξης ενός ειδικού χρώση.

Η

Μελετήσαμε επόμενο τα αποτελέσματα των

ΕΚβ

έκφρασης επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. BG-1 κύτταρα μολυσμένα με Ad5 ή Adβ αδενοϊοί αναπτύχθηκαν

in vitro

απουσία ή την παρουσία του Ε2. Όπως ήταν αναμενόμενο, Ε2 διέγειρε τον πολλαπλασιασμό του ελέγχου BG-1 κύτταρα (Σχ. 2Α). Είναι ενδιαφέρον, ΕΡβ καταστέλλεται κατά 50% τόσο την βασική όσο και Ε2-εξαρτώμενο πολλαπλασιασμό των κυττάρων BG-1. Παρατηρήσαμε επίσης αντι-πολλαπλασιαστική δράση του ΕΚβ σε ERα- και Ετβ-αρνητικά κύτταρα PEO14. Ωστόσο, αυτή η αναστολή δεν επηρεάστηκε από την Ε2 (Σχήμα S2). Ενώ η

in vitro

επιπτώσεις της ΕΚβ έχουν παρατηρηθεί μέχρι σήμερα, πολύ λίγα είναι γνωστά για

in vivo

τη δράση της στα μοντέλα του καρκίνου των ωοθηκών. Ως μια πρώτη προσέγγιση για την αξιολόγηση του σημείου αυτού, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο υποδόριας ένεσης. Για να ενεργοποιήσετε μια ευαίσθητη, δυναμική και έγκαιρη παρακολούθηση της ανάπτυξης του όγκου, έχουμε σταθερά επιμολυσμένα BG-1 κύτταρα με έναν συστατικό ρεπόρτερ Luc. Ωοθηκεκτομή αθυμικά γυμνά ποντίκια εμφυτεύθηκαν ένα σφαιρίδιο της χοληστερόλης ή Ε2 και ένεση με BG-1 κύτταρα μολυσμένα με Ad5 ή Adβ αδενοϊούς. BG-1 κύτταρα σχημάτισαν όγκους μόνο με την παρουσία του Ε2 (Σχ. 2Β).

ΕΚβ

έκφραση μειώνεται σημαντικά κατά 70% το Ε2-προωθείται ανάπτυξη των κυττάρων BG-1, στηρίζοντας έτσι μια πιθανή αντι-πολλαπλασιαστική ρόλο για ΕΚβ στο ΕΓΚ.

Η ανάπτυξη της BG-1 κύτταρα , εκφράζοντας είτε όχι ΕΚβ, παρακολουθήθηκε

in vitro

χρησιμοποιώντας έναν μετρητή κυττάρων. κύτταρα BG-1 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και καλλιεργούνται παρουσία του οχήματος ή Ε2 (10

-8M). Ο πολλαπλασιασμός εκφράζεται ως% των κυττάρων ελέγχου αναπτύχθηκαν κατά την ημέρα 0. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από τριπλούν. Οι μετρήσεις των ομάδων Ad5 + Ε2 και Adβ + Ε2 σε σύγκριση με

t

τεστ αταίριαστο του Student. ** P & lt? 0.001. B. ΕΡβ αναστέλλει την ανάπτυξη όγκου σε ένα bioluminescent υποδόριο μοντέλο ποντικού. BG-1 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά Luc και μολύνθηκαν με Ad5 ή Adβ αδενοϊούς ενέθηκαν υποδορίως σε υποστεί ωοθηκεκτομή θηλυκούς γυμνούς ποντικούς. Η δραστικότητα λουσιφεράσης παρακολουθήθηκε για 25 ημέρες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε φωτόνια /s (Ph /s) και αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από 8 ζώα. Οι μετρήσεις των ομάδων Ad5 + Ε2 και Adβ + Ε2 σε σύγκριση με

t

τεστ αταίριαστο του Student. * P & lt?. 0.05

Η

Στη συνέχεια, διερευνώνται οι μηχανισμοί που ευθύνονται για την αντι-καρκινική δράση των ΕΚβ. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου συγκρίθηκε με κυτταρομετρία ροής σε έλεγχο και Ετβ κύτταρα που εκφράζουν BG-1 (Σχ. 3Α). Εμείς δεν εντόπισε καμία αιχμή SubG0, γεγονός που υποδηλώνει ότι δεν υπήρξε απόπτωση.

ΕΡβ

έκφραση δεν τροποποίησε την αναλογία των κυττάρων BG-1 σε G0-G1 φάση, αλλά έντονα μειωμένη εκείνη των κυττάρων στη φάση S. Βρήκαμε επίσης ότι

ER

β έκφραση προκάλεσε μια αύξηση του αριθμού των κυττάρων στη φάση G2-M του κυτταρικού κύκλου. Η έκφραση των δεικτών του κυτταρικού κύκλου ήταν δίπλα παρακολουθήθηκε με αναλύσεις στυπώματος Western (Σχ. 3Β). Αρκετές ρυθμιστικές του κυτταρικού κύκλου όπως κυκλίνες Α και D1, ΑΚΤ και Rb αναφερθεί ότι ρυθμίζεται από οιστρογόνα [35]. Παρατηρήσαμε ότι η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ ήταν αυξημένη κατά την επεξεργασία της Ε2 σε Ad5 μολυσμένα BG-1 κύτταρα (Σχ. 3Β).

ΕΡβ

έκφραση οδήγησε σε μείωση της φωσφο-ΑΚΤ περιεκτικότητα σε αμφότερες φορέα και E2-υπέστη επεξεργασία κύτταρα και αυτό συνέβη σε 3, 6 και 24 ώρες. ΕΚβ προκάλεσε παρόμοιες αλλαγές στην κυκλίνης D1, συνολικής Rb και φωσφορυλιωμένη Rb έκφρασης. Πράγματι, τα επίπεδα της κυκλίνης D1, σύνολο Rb και Rb φωσφορυλιωμένη ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω κατά την κατεργασία Ε2 σε Ad5 μολυσμένα κύτταρα και αυτό επαγωγή μειώθηκε κατά Ετβ. Η κυκλίνη Α2 εμφανίζεται μια καθυστερημένη επαγωγή 24 ώρες μετά τη θεραπεία Ε2 και αυτό μειώθηκε από την παρουσία ΕΡβ.

κύτταρα BG-1 συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά τη μόλυνση με Ad5 ή Adβ αδενοϊούς και αναλύθηκαν για τη διανομή του κυτταρικού κύκλου. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SEM 3 πειραμάτων. Ad5 και Adβ ομάδες συγκρίθηκαν με

t

τεστ αταίριαστο του Student. ** P & lt? 0.001. Β κύτταρα BG-1 μολύνθηκαν με Ad5 ή Adβ ιούς. Μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 3, 6 ή 24 ώρες με όχημα (αιθανόλη, C) ή 10

-8M Ε2. 30 μg εκχυλισμάτων πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκαν για στύπωμα Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Εκτός αν ορίζεται, ο λόγος των πρωτεϊνών στόχων επί β-ακτίνης υποδεικνύεται κάτω από τα πηκτώματα. Εκπρόσωπος του 2 πειράματα.

Η

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το

in vivo

ρόλος του ΕΚβ στη ωοθηκών καρκινογένεση, έχουμε δημιουργήσει ένα πιο φυσιολογικό μοντέλο ορθοτοπική εμφύτευση των κυττάρων του όγκου στην ωοθήκη. Ad5- ή Adβ κύτταρα μολυσμένα BG-1-Luc ενέθηκαν στον αριστερό ανάπτυξη ωοθήκη και του όγκου παρακολουθήθηκε με βιοφωταύγεια. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α,

ΕΚβ

έκφραση εμπόδισε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου. Όταν υποβάλλονται σε ευθανασία την ημέρα 28 μετά την ένεση, τα ποντίκια ελέγχου παρουσίασαν σαφή αύξηση της περιτοναϊκής όγκου και του όγκου του όγκου στο αριστερό ωοθήκη (Εικ. 4Β). Σε έντονη αντίθεση, ο όγκος των δύο περιτοναίου και των ωοθηκών εμφανίστηκε πολύ μειωμένη σε ποντίκια που ενέθηκαν με Ετβ κύτταρα που εκφράζουν BG-1. Είμαστε δίπλα προσδιοριστεί αν η μεταστατική διαδικασία επηρεάστηκε από

ΕΚβ

έκφρασης. Για να επιτευχθεί αυτό, ο πνεύμονας, το ήπαρ και ετερόπλευρη δεξιά ωοθήκη συλλέχθηκαν. Η έκταση των κυττάρων του όγκου που υπάρχει σε αυτά τα όργανα εκτιμήθηκε με μέτρηση της δραστικότητας Luc σε ορθοτοπικό μοντέλο μας. Η δράση φωτοφεράσης ανιχνεύτηκε στον πνεύμονα, το ήπαρ και αντίπλευρη ωοθηκών από ποντικούς που ενέθηκαν με Ad5-μολυσμένα κύτταρα BG-1, (Σχ. 5Α). Είναι ενδιαφέρον ότι,

ΕΡβ

έκφραση μειώνεται έντονα την παρουσία καρκινικών κυττάρων και δυνητικά μετάσταση σε όλα αυτά τα όργανα, γεγονός που υποδηλώνει ότι το ΕΡβ ασκεί έναν διπλό ρόλο στην ανάπτυξη και τη διάδοση του όγκου. Αυτό επιβεβαιώθηκε από

in vitro

επούλωσης πληγών πειράματα που δείχνουν ότι

ΕΡβ

έκφραση μειώνει την κινητικότητα των κυττάρων BG-1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Από ΕΚβ επηρεάστηκαν και από την αύξηση του όγκου και της διάδοσης των κυττάρων, αναρωτηθήκαμε αν αυτό θα μπορούσε να δώσει τη δυνατότητα να βελτιώσουν την επιβίωση ποντικών. Τα ποντίκια παρακολουθήθηκαν για 80 ημέρες και καθημερινή ελέγχεται για οποιοδήποτε σημάδι της νοσηρότητας.

ΕΡβ

έκφραση καθυστέρησε σημαντικά θάνατο ως δύο μήνες μετά την ένεση με Adβ-μολυσμένα κύτταρα BG-1, το 50% των ποντικών επιβίωσε ακόμη (Σχ. 5Β). Αυτό έρχεται σε έντονη αντίθεση με το θάνατο του 100% των ποντικών ελέγχου, η οποία λαμβάνει χώρα σε λιγότερο από δύο μήνες.

κύτταρα BG-1-Luc μολύνθηκαν με Ad5 ή Adβ αδενοϊούς ενέθηκαν στην αριστερή ωοθήκη γυμνών ποντικών. Luc δραστηριότητα παρακολουθήθηκε για 35 ημέρες, όπως περιγράφεται στο Σχ. 1C. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε φωτόνια /s (Ph /s) και αποτελούν ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα που αντιστοιχεί στον μέσο όρο ± SD από τουλάχιστον 5 ζώα ανά ομάδα. Mann-Whitney test χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση. * P & lt? 0,05 και ** p & lt? 0,01. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα της ημέρας 35 φαίνεται. Οι Β Εκπρόσωπος εικόνες ολόκληρων ζώων και γεννητικό σύστημα των ζώων ευθανασία την ημέρα 35 εμφανίζεται.

Η

Γυμνά ποντίκια ένεση με κύτταρα BG-1-Luc υπό τις ίδιες συνθήκες όπως στο σχήμα. 4. υποβλήθηκαν σε ευθανασία 28 ημέρες μετά την ένεση. Πνεύμονα, του ήπατος και δεξιά ωοθήκη ετερόπλευρο ελήφθησαν και δραστικότητα Luc αναλύθηκε όπως προαναφέρθηκε. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως φωτόνια /s /mg πρωτεϊνών και αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή των 5 ζώων ± SEM. Mann-Whitney test χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση. * P & lt? 0,05 και ** p & lt? 0,01. Β καμπύλη επιβίωσης Kaplan-Meier. 10 ποντίκια ήταν ορθοτοπικά ξενομόσχευμα με κύτταρα BG-1 που εκφράζουν σταθερά Luc, μολύνθηκαν με Ad5 ή Adβ αδενοϊούς, παρακολουθήθηκαν καθημερινά για την ανάπτυξη της αναπνευστικής δυσφορίας, παράλυση των άκρων και η απώλεια βάρους, και σε ευθανασία αμέσως εάν σημειώνεται. τιμή P είναι εκείνο που ελήφθη στις δοκιμές log-rank.

Η

Συζήτηση

Αναφέρουμε εδώ ότι η εισαγωγή του ΕΚβ σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών εμφανίζουν ενδογενή επίπεδα της Ετα οδηγεί σε ισχυρή αναστολή του

in vivo

ανάπτυξη και τη διάδοση των κυττάρων, που προκαλείται μέσω του ελέγχου της έκφρασης ΕΚα και σηματοδότηση.

In vitro

πειράματα πολλαπλασιασμού δείχνουν σαφή αναστολή της Ε2-εξαρτώμενο πολλαπλασιασμό από ΕΚβ στον ΕΚα-θετικού καρκίνου κυτταρική γραμμή ωοθηκών BG-1. Αυτή είναι η πρώτη επίδειξη ενός αντι-πολλαπλασιαστική δράση του ΕΚβ σε ΕΚα-θετικού καρκίνου κυτταρική γραμμή ωοθηκών. Επιπλέον, θα μπορούσε επίσης να ΕΡβ αναστέλλουν την ανάπτυξη του ΕΚα αρνητικών καρκινικών κυττάρων ωοθηκών γραμμή ΡΕΟ-14. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με τα προηγούμενα ευρήματα μας που ελήφθησαν με ΕΚα-αρνητικές κυτταρικές σειρές από μαστό [31] και του προστάτη [30] καρκινικά κύτταρα και με μια άλλη μελέτη που διεξήχθη σε ΕΚα-αρνητικά SKOV3 EOC κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται [36]. Σε κύτταρα στερούνται υποδοχέων οιστρογόνων, είναι πιθανό ότι η αποκατάσταση του ΕΚα δεν μπορεί να επιτρέψει μια διέγερση του πολλαπλασιασμού μετά κατεργασία Ε2, δεδομένου ότι ενεργοποιεί ένα διαφορετικό πρόγραμμα μεταγραφική ρύθμιση, σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν φυσικά ΕΚα, όπως έδειξε προηγουμένως σε καρκινικά κύτταρα του μαστού [37 ]. Πράγματι, παρατηρήσαμε ότι ενδογενή επίπεδα ΕΡα σε κύτταρα BG-1 ισχυρώς μειώνεται με την παρουσία του ΕΚβ, ενώ ΕΡβ επηρεάζονται λιγότερο επίπεδα ΕΡα σε ΡΕΟ-14 κύτταρα. Επιπλέον, θα μπορούσε να αναστείλει ΕΡβ εντελώς ΕΡα δραστικότητα σε κύτταρα BG-1 αλλά όχι σε ΡΕΟ-14 κύτταρα. Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται στο γεγονός ότι σε κύτταρα BG-1, ενδογενής ΕΚα είναι υπό τον έλεγχο του δικού του προαγωγού, ενώ σε ΡΕΟ-14 κύτταρα, εξωγενές ΕΚα ελέγχεται από έναν ιικό προαγωγέα. Επιπλέον, κανείς δεν μπορεί να αποκλείσει ότι οι συμπαράγοντες που απαιτούνται για τη δραστηριότητα Ετα και Ετβ στους δύο τύπους κυττάρων είναι διαφορετική, η οποία αντιπροσωπεύει το διαφορικό δραστηριότητά τους στα κύτταρα BG-1 και ΠΕΟ-14.

Η καινοτομία της μελέτης μας είναι να έχουν επεκταθεί τα δεδομένα αυτά σε δύο

in vivo

μοντέλα. Αν κλινικές ενδείξεις με βάση τα επίπεδα Ετβ σε φυσιολογικό ιστό και τον καρκίνο δείχνουν ότι αυτός ο υποδοχέας θα μπορούσε να λειτουργήσει ως ένα δυναμικό ογκοκατασταλτικό, μέχρι στιγμής, δεν προκλινικές απόδειξη έχει τεθεί για την επιβεβαίωση αυτής της υπόθεσης. Εμείς χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά μια κλασική υποδόριο μοντέλο, για να απαντήσει στο ερώτημα αυτό και με μεγαλύτερη ακρίβεια για να καθορίσει εάν τα οιστρογόνα απαιτούνταν ή όχι. BG-1

in vivo

ανάπτυξης ήταν σαφώς εξαρτώμενος από την παρουσία οιστραδιόλης και ΕΚβ θα μπορούσε να εξουδετερώσει την ανάπτυξη του όγκου. Χρησιμοποιήσαμε επίσης ορθοτοπική εμφύτευση bioluminescent κυττάρων στην ωοθήκη. Σε συμφωνία με

in vitro πειράματα

, παρατηρήσαμε μια ισχυρή μείωση της ανάπτυξης του όγκου, όταν τα κύτταρα BG-1 εκφράζουν ΕΚβ.

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου κατέδειξε ότι το ΕΡβ ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, με μείωση της αναλογίας του κυττάρων σε φάση S και αυξάνοντας το ποσοστό των κυττάρων στη φάση G2-M. Η κατάσταση αυτή είναι παρόμοια με εκείνη που αναφέρθηκε σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [38]. Στο μοριακό επίπεδο, ΕΡβ θα μπορούσε να μειώσει τη φωσφορυλίωση της Akt και Rb. Επιπλέον, ΕΡβ μείωσε επίσης την έκφραση της κυκλίνης D1 και κυκλίνη Α Κυκλίνη D1 αλληλεπιδρά με Κυκλίνη-Dependent κινάσης-4 και -6, η οποία οδηγεί σε φωσφορυλίωση της Rb και το διαχωρισμό του Rb /E2F συγκρότημα, το οποίο προκαλεί την εξέλιξη μέσω το G1 [35]. Η κυκλίνη Α αλληλεπιδρά με κυκλίνη κινάσης Dependent-2 για την προώθηση της μετάβασης από το S προς φάση G2 [39]. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ ευνοεί G1 /S μετάβαση αναστέλλοντας τη μεταγραφική δραστηριότητα των παραγόντων FOXO, τα οποία ρυθμίζουν Κυκλίνη D1 και έκφραση p21 [40]. Με βάση αυτά τα ευρήματα, προτείνουμε ότι το ΕΡβ οδηγεί σε μείωση στην φωσφορυλίωση της ΑΚΤ, η οποία με τη σειρά του οδηγεί σε μια μειωμένη έκφραση της κυκλίνης D1 και φωσφορυλίωση Rb.

Για να εξηγήσει πώς ΕΡβ μπορούν να επηρεάσουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, έχουμε διερευνηθεί κατά πόσον θα μπορούσε να τροποποιήσει άμεσα την έκφραση ΕΡα και σηματοδότηση στα κύτταρα BG-1. Είναι πράγματι ενδιαφέρον να παρατηρήσετε ότι το ΕΡβ έχει επίσης σοβαρές επιπτώσεις των επιπέδων Ετα καθώς μειώνεται από την έκφραση περίπου 15 φορές ΕΡα στην 3η. Αν και οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που αντιπροσωπεύουν την αρνητική επίδραση του ΕΚβ στη ΕΚα σε κύτταρα BG-1 παραμένει να διευκρινιστεί, η έκταση και ο ρυθμός της αποδόμησης του ΕΚα είναι ασφαλώς ζωτικής σημασίας για τη δράση του και αυτές οι παράμετροι αλλάζουν αν ΕΡβ είναι παρόν ή όχι. Πράγματι, σε γονικά κύτταρα BG-1, που εκφράζει μόνο ΕΚα, ο υποδοχέας υποβάλλεται επίσης σε E2-εξαρτώμενη αποικοδόμηση. Αυτό είναι πιθανό να οφείλεται στην υποβάθμιση του πρωτεασώματος του υποδοχέα, όπως φαίνεται σε έναν αριθμό κυτταρικών τύπων με προηγούμενες μελέτες [41], [42]. Παραδόξως, η Ε2-εξαρτώμενη πρωτεασώματος υποβάθμιση της Ετα απαιτείται επίσης για την πλήρη δράση του μέσω της ρύθμισης των αλληλεπιδράσεων των υποδοχέων με συνενεργοποιητές της [42] και την ποδηλασία της Ετα στον υποκινητή των γονιδίων στόχων του [43]. Η κατάσταση εμφανίζεται διαφορετικά όταν ΕΚβ συνεκφράζεται με Ετα στα κύτταρα BG-1. Πράγματι, αναφέρουμε ότι το ΕΡβ θα μπορούσε να μειώσει ταχύτερα και έντονα την έκφραση των ΕΚα σε κύτταρα BG-1 παρουσία του Ε2, σε σύγκριση με κύτταρα στα οποία μόνο ΕΚα είναι παρούσα. Αυτό είναι σε συμφωνία με αυτό που παρατηρείται στην ΕΚα-θετικό καρκίνο του μαστού κυτταρική γραμμή T47-D επιμολυσμένα με ΕΚβ [44]. Αυτό υποδηλώνει ότι το ΕΡβ μπορούσε να προκαλέσει μια ταχεία αποδόμηση του πρωτεασώματος του ΕΚα υπό την παρουσία της Ε2. Εάν υποθέσουμε ότι Ετα και Ετβ μορφή ετεροδιμερή όπως περιγράφηκε προηγουμένως [45], [46], ΕΡβ μπορεί να αυξήσει την αποικοδόμηση των ΕΚα υπάρχει στο σύμπλοκο, με την αλλαγή του διαμόρφωση και την πρόληψη από το να είναι ενεργό. Κατά συνέπεια, ΕΡα θα ήταν λιγότερο αποτελεσματική για την ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων του και δεν μπορούσε να παίξει το ρόλο του πολλαπλασιασμού.

Μάλιστα, εκτός από τις επιπτώσεις του στην έκφραση ΕΚα, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι το ΕΡβ μειώνει επίσης δραστηριότητα ΕΡα, όπως φαίνεται από διαμόλυνση ενός οιστρογόνου αποκρίνονται ρεπόρτερ σε κύτταρα BG-1. Αυτό είναι σε συμφωνία με μια προηγούμενη μελέτη πραγματοποιείται σε ένα ΕΚα-θετικό καρκίνο του μαστού κυτταρικές γραμμές στις οποίες επιμολύνθηκε ΕΚβ, υποδεικνύοντας ότι ΕΡα και ΕΡβ έχουν διακριτούς ρόλους [47]. Με τη σειρά του, αυτό θα μπορούσε να επηρεάσει την Ε2-εξαρτώμενη σηματοδότηση του ΕΚα, η οποία δεν θα μπορούσε να ρυθμίζουν τα επίπεδα της δραστηριότητας των βασικών γονιδίων στόχων που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό, όπως ΑΚΤ, Rb, κυκλίνη D1 ή κυκλίνη Α2. Επιπλέον, άλλες μελέτες έχουν αναφέρει μια αρνητική δράση του ΕΚβ σε ΕΚα σηματοδότηση [44], [48]. Ειδικότερα, ΕΡβ έχει δειχθεί ότι μεταβάλλει την πρόσληψη του ΑΡ-1 συμπλοκών προς ΕΚα γονιδίων-στόχων [44], το οποίο είναι γνωστό ότι δρα σε συνέργεια με ΕΚα. Μόλις ετεροδιμεριστεί με Ετα, ΕΚβ θα μπορούσε επίσης να τροποποιήσουν τη δυνατότητα της Ετα να αλληλεπιδρούν με συνενεργοποιητές. Μια προηγούμενη μελέτη έχει προτείνει επίσης μια δράση Ying Yang του ΕΚβ

in vivo

, η οποία είναι ένας καταστολέας του ΕΚα σηματοδότησης παρουσία ΕΚα, αλλά μπορεί επίσης να αντικαταστήσει ΕΡα απουσία ΕΚα [48]. Η προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ΕΚα με ΕΚβ μπορεί να μην είναι ο μόνος μηχανισμός αναστολής της ανάπτυξης με ΕΚβ, καθώς ΕΡβ μπορεί επίσης να μειώσει την ανάπτυξη των κυττάρων του ΕΚα αρνητικών ΡΕΟ-14 κύτταρα. Είναι πιθανό ότι το ΕΡβ επηρεάζουν άμεσα παράγοντες που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, όπως μεταγραφικές coregulators, ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου, αλλά και παράγοντες ανάπτυξης.

Αναφέρουμε ότι το ΕΡβ θα μπορούσε όχι μόνο να μειώσει την ανάπτυξη του πρωτογενούς όγκου, αλλά θα μπορούσε επίσης να μειώσει την έκταση της μετάστασης, ή τουλάχιστον η παρουσία των κυττάρων όγκου σε διάφορα όργανα. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι το ΕΡβ θα μπορούσε να αναστείλει

in vitro

εισβολή των καρκινικών κυττάρων [31], η οποία αντιπροσωπεύει ασφαλώς για τη μειωμένη διάδοση παρατηρήθηκε. Ωστόσο, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε εντελώς την πιθανότητα ότι η μειωμένη ανάπτυξη του πρωτογενούς όγκου οδηγεί επίσης σε μειωμένη μετάσταση. Όποια και αν είναι η επίδραση που ασκείται από ΕΚβ, η μείωση αυτή της μετάστασης εξηγεί σίγουρα την αυξημένη επιβίωση των ποντικών εμφυτευμένων με κύτταρα ΕΚβ.

Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας παρέχουν ενδείξεις για ένα σενάριο στο οποίο ΕΡβ δρα ως δυνητικός ογκοκατασταλτικού και αντιπροσωπεύει ένα πιθανό στόχο για μελλοντικές θεραπείες της EOC. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη

in vivo

επίδειξη των αντι-πολλαπλασιαστική και -metastatic δράσεις του ΕΚβ σε ένα προκλινικό ορθοτοπικό μοντέλο ωοθηκών καρκινογένεσης. Τα αποτελέσματά μας συνδέει Ετβ και τη διαδικασία mestastasis είναι σε πλήρη συμφωνία με τις κλινικές μελέτες αποκαλύπτουν ότι το ΕΡβ δεν εκφράζεται σε μεταστατικό μορφές καρκίνου των ωοθηκών [20] και η απώλεια της έκφρασης του συσχετίζεται με βραχύτερη συνολική επιβίωση [23]. Εδώ, θα ξετυλίξουν περαιτέρω ότι ΕΚβ έχουν άμεσο αντίκτυπο στην έκφραση ΕΚα, του κυτταρικού κύκλου και επεμβατική ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων. Οι λόγοι που αντιπροσωπεύουν το αδύναμο έκφραση του ERβ στον καρκίνο των ωοθηκών παραμένει άπιαστο. Πρόσφατες εκθέσεις δείχνουν πιθανές επιγενετικές τροποποιήσεις που οδηγούν σε

ΕΚβ

φίμωση, ως θεραπεία των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα με μεθυλοτρανσφεράσης DNA ή αναστολείς των αποακετυλασών των ιστονών θα μπορούσε να αποκαταστήσει την έκφρασή του [49], [50], [51]. Μια άλλη υπόθεση θα ήταν ένα προτιμησιακής υποβάθμισης του ΕΚβ πρωτεΐνη από το πρωτεάσωμα, με αποτέλεσμα χαμηλά επίπεδα αυτού του υποδοχέα στα καρκινικά κύτταρα [32]. Αυτές θα μπορούσαν να είναι τα κομμάτια να διερευνήσει στο μέλλον για τον έλεγχο της έκφρασης Ετβ και την ανάπτυξη νέων θεραπειών για τον καρκίνο των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

όγκου κυτταρική γραμμή

Το ανθρώπινο κύτταρο ωοθηκών