Αφηρημένο

Η υαλουρονάνη-συνδεδεμένη πρωτεΐνη 1 (HAPLN1), η οποία έχει αποδειχθεί ότι είναι άκρως εκφράζεται σε κακοήθεις υπεζωκότα μεσοθηλίωμα (MPM) , ανιχνεύθηκε στον ορό χρησιμοποιώντας μία ηλεκτροχημική μέθοδο επιφάνεια-αποτύπωση. Πρώτον, η μέθοδος ανίχνευσης ήταν βελτιστοποιημένη χρησιμοποιώντας αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) ως πρότυπο πρωτεΐνης για να μιμούνται τις βέλτιστες συνθήκες που απαιτούνται για την αποτύπωση του παρόμοια πρωτεΐνη βάρος HAPLN1 μοριακό. BSA αποτυπώθηκε στο χρυσό ηλεκτρόδιο με υδροξύλιο τερματιστεί αλκάνιο θειόλες, η οποία σχηματίζεται μια αυτο-συναρμολογούνται μονοστιβάδα (SAM) γύρω BSA. Η αναλύτη (BSA) ακολούθως πλένεται μακριά και το αποτύπωμά του (άδειο κοιλότητα με το σχήμα-μνήμης) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της BSA σε διάλυμα, χρησιμοποιώντας ηλεκτροχημικό δυναμικό μέθοδο ανοικτού κυκλώματος, δηλαδή ποτενσιομετρία. Παράγοντες θεωρείται για να βελτιστοποιηθούν οι συνθήκες περιλαμβάνουν χρόνο επώασης, συγκέντρωση πρωτεΐνης, όριο ανίχνευσης και το μέγεθος του ηλεκτροδίου. Matrix υποβοηθούμενη ιονισμού εκρόφησης λέιζερ-χρόνου πτήσεως σπεκτρομετρίας μάζης (MALDI-TOF MS) χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί η επιλεκτικότητα των αποτυπωμάτων. Με τους λαμβάνονται παραμέτρους ελέγχου αποτύπωση, HAPLN1 αποτυπώθηκε εις διπλούν και η ανίχνευση των αιχμηρών HAPLN1 επιτυχία διεξήχθη σε ορό

Παράθεση:. Mathur Α, Blais S, Goparaju CMV, Neubert Τ, πέρασμα H, Λεβόν Κ ( 2013) Ανάπτυξη ενός βιοαισθητήρα για την ανίχνευση μεσοθηλίωμα του υπεζωκότα Καρκίνος βιοδεικτών που χρησιμοποιούν επιφανειακό Αποτύπωση. PLoS ONE 8 (3): e57681. doi: 10.1371 /journal.pone.0057681

Επιμέλεια: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 10, 2012? Αποδεκτές: 28η Ιανουαρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 Μαρτίου 2013

Copyright: © 2013 Mathur et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη έχει χρηματοδοτηθεί από επιχορήγηση του στρατού (W911NF-09-1-0499) για την ανίχνευση Potentiomeric των παθογόνων. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μια πιθανή θεραπεία του καρκίνου θα ήταν πιο πιθανό, αν η ασθένεια μπορεί να ανιχνευθεί νωρίς για τη βελτιστοποίηση των θεραπευτικών διαδικασιών. Εξωκυττάρια μήτρα (ECM) έχει τη σημασία του όχι μόνο για τη φυσική υποστήριξη των διαφόρων κυττάρων, αλλά και σε αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου, κυτταρική σηματοδότηση και διαδικασίες επισκευής των κυττάρων. Ως εκ τούτου, οι ίδιοι οι πρωτεΐνες ECM παρουσιάσει ένα πιθανό στόχο την παρακολούθηση αντανακλώντας τις συνεχιζόμενες αλλαγές. Εάν προκύψουν οι αλλαγές λόγω της παρουσίας μιας ασθένειας όπως ο καρκίνος, η ανίχνευση των αλλαγών αυτών θα ήταν μια συμπερασματική αποκάλυψη του καρκίνου πριν εμφανιστούν συμπτώματα. Ως παράδειγμα, ηπαρινάσης ένζυμο [1], μια ενδο-β-γλυκουρονιδάση, είναι μια πολυλειτουργική ένζυμο που επηρεάζουν βασικά βήματα της ανάπτυξης πολλών τύπων καρκίνου όπως γαστρικό [2], μη μικροκυτταρικό πνευμονικό [3], του οισοφάγου [4] , κεφαλής και λαιμού [5], του μαστού [6] και του παγκρέατος [7] καρκίνων ως παραδείγματα.

ηπαρινάσης διασπά θειικό ενζυματικώς ηπαρίνη και με πρωτεϊνάσες σερίνης και οι μεταλλοπρωτεϊνάσες διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην εξωκυτταρική μήτρα αναδιαμόρφωση σχετίζονται τόσο με in situ όγκων ανάπτυξη και την εισβολή μετάσταση σχετίζονται των καρκινικών κυττάρων. Η ενζυμικά αδρανής μορφή της ηπαρινάσης έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζει σηματοδότηση κυττάρων, και αυξάνοντας έτσι την ανάπτυξη του καρκίνου με προς τα πάνω ρύθμιση έκφρασης αρκετών γονιδίων [8]. Εμπορική βιοδείκτες για την παρακολούθηση της δραστηριότητας μεσοθηλίωμα αμίαντο που προκαλείται είναι mesothelin και συναφή πεπτίδιο διαλυτό mesothelin (SMRP). Η οστεοποντίνη (ΟΡΝ) και CA125 έχουν παρομοίως σχετίζονται με δραστικότητα ηπαρινάσης καρκίνο συνδέονται εκτός από υαλουρονάνη, TRA και φερριτίνη. Τα γεγονότα ECM αναδιαμόρφωση μπορεί βεβαίως να είναι ένας στόχος για τη διάγνωση των πρώιμων σταδίων της εισβολής του καρκίνου [9], καθώς και ως στόχοι για αντι-καρκινικές θεραπείες. Το υαλουρονικό οξύ (υαλουρονάνη, υαλουρονικό, ΗΑ) είναι ένα γραμμικό, πολύ υψηλού μοριακού βάρους γλυκοζαμινογλυκάνης, είναι μία από τις πιο άφθονες πρωτεΐνες ECM. ΗΑ έχει δειχθεί ότι υπάρχουν σε υψηλά επίπεδα σε ορθοκολικό, επιθηλιακά ωοθηκών, και καρκίνων του μαστού [10] – [12], καθώς και την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου έχει τεκμηριωθεί όταν έχουν επηρεαστεί μοτίβα πρόσδεσης ΗΑ [13]. ΗΑ υπερέκφραση εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την CD44, έτσι ώστε η ρύθμιση της ανάπτυξης του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, εισβολή και αγγειογένεση έχει αποδειχθεί ότι λαμβάνει χώρα δια της CD44 με ΗΑ συνθάσης-1 έκφραση [14]. Καθώς η έκφραση ΗΑ φαίνεται να είναι αυξημένα σαφώς την εμφάνιση του καρκίνου, δεν είναι έκπληξη το γεγονός ότι Ivanova et al έχουν δείξει ότι επίσης HAPLN1 πρωτεΐνη, η οποία βοηθά τη σύνδεση πρωτεογλυκάνες σε έναν πυρήνα ΗΑ, έχει δειχθεί ότι είναι αυξημένα στα καρκινικά κύτταρα.

Κακόηθες μεσοθηλίωμα του υπεζωκότα είναι μια σπάνια κακοήθεια που προκαλείται από την έκθεση στον αμίαντο, η οποία έχει φτωχή πρόγνωση. Ο χόνδρος HAPLN1 συνδετικής πρωτεΐνης μελετάται ως υποψήφιο βιοδείκτη, βρέθηκε να υπερεκφράζεται σε στάδιο μεσοθηλίωμα 1 μαζί με ένα υψηλής εκφράσεως οστεοποντίνη καρκίνος βιοδεικτών (OPN1) που βρίσκεται στο ίδιο σετ γονίδιο [15]. Οι ανοσοπροσδιορισμοί χρησιμοποιούνται συνήθως για την ανίχνευση του καρκίνου του βιοδείκτες όπως δείχνουν ανώτερη εκλεκτικότητα, αλλά μπορεί να είναι χρονοβόρα και δαπανηρή. Τα βιολογικά χαρακτηριστικά των δεικτών όπως ηπαρινάσης τονίσει τη σημασία για το σχεδιασμό οικονομικά αποδοτικές μεθόδους που επιτρέπουν την έγκαιρη ανίχνευση τέτοιων βιοδεικτών σε ορό και ιστούς τόσο για διαγνωστικούς και προγνωστικούς σκοπούς, καθώς και για την παρακολούθηση της θεραπείας του καρκίνου.

Επίσης ανίχνευση πολύ χαμηλή συγκέντρωση αυτών των βιοδεικτών με δοκιμές ELISA είναι δύσκολη. Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για την ανάπτυξη νέων τεχνολογιών, οι οποίες είναι ταχείες και πολύ ευαίσθητη για την ανίχνευση χαμηλών συγκεντρώσεων βιοδεικτών. Η έγκαιρη διάγνωση θα προσφέρει περισσότερο χρόνο για τη θεραπεία του καρκίνου, η οποία είναι ζωτικής σημασίας για να σώσει μια ζωή. Τα μοριακά αποτυπωμένα πολυμερή που θεωρείται ως κατάλληλο ανταλλακτικό για συστήματα που βασίζονται σε αντίσωμα ως βιοαισθητήρες, λόγω της καλύτερης σταθερότητας και της επαναχρησιμοποίησης των επιφανειών βιο-αναγνώρισης [16]. Οι βιοαισθητήρες που αποτελείται από δύο συνιστώσες, στοιχείο βιο-υποδοχέα και το στοιχείο μεταγωγής σήματος. Μια επιφάνεια βιο-υποδοχέα γίνονται με μοριακά αποτυπωμένων πολυμερών θα ήταν δύο τάξεις μεγέθους φθηνότερα τότε αντισώματα. Καθώς η τιμή του υδροξυλιομένου αλκανοθειόλη πολυμερές θα κόστιζε περίπου $ 0.2-0.6 mg

-1 σε σύγκριση με αντισώματα, τα οποία ποικίλουν ανάλογα με το στόχο. Τα αντισώματα που δημιουργούνται για τη στόχευση ανθρώπινη πρωτεΐνη HAPLN1 θα κόστιζε περίπου $ 900- $ 1000 mg

-1. Ακόμη και η χαμηλή πυκνότητα αυτών των αντισωμάτων σε κασέτες ανοσοσυγγένειας έχουν υψηλότερη τιμή από ό, τι μοριακού αποτυπωμένα πολυμερή, κοστίζει μεταξύ $ 10 έως $ 100 mg-1. Υψηλή τιμή του HAPLN1 αντισώματα αυξάνουν το κόστος των HAPLN1 Elisa κιτ που διατίθεται στο εμπόριο σε $ 10 /δοκιμή. Ενώ μια αποτυπωμένη χρυσό επικάλυψη τσιπ αισθητήρα (1 cm × 1 cm) θα κόστιζε περίπου $ 1,2 /δοκιμή και μπορεί να χρησιμοποιηθεί επανειλημμένα για πολλαπλές αναλύσεις σε αντίθεση με τα αντισώματα, τα οποία δεν μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν.

Στη μελέτη μας αποσκοπεί στην ανάπτυξη ένα εργαλείο για την έγκαιρη ανίχνευση των βιοδεικτών. πρωτεϊνικά μόρια-στόχοι συν-προσροφηθεί στην επιφάνεια του χρυσού ηλεκτροδίου με τις θειόλες και σχηματίζουν από κοινού ένα καλά συσκευασμένο μονοστιβάδας. Απομάκρυνση των πρωτεϊνικών μορίων από τις κοιλότητες μορφή αποτύπωμα SAM και στη λειτουργική ομάδα υδροξυλίου επικεφαλής των θειόλες παρέχει εξειδίκευση στην κοιλότητα. Η συμπληρωματικότητα σε μέγεθος, σχήμα και υδροφοβικότητα παρέχει συγγένεια προς το ίδιο μόριο, το οποίο έχει αποτυπωθεί.

Το εντυπωμένο ηλεκτρόδιο στη συνέχεια χρησιμοποιείται για να προσδιοριστεί το πρότυπο σε ρυθμιστικό χρησιμοποιώντας ποτενσιομετρία. Καθώς το φορτισμένο μόριο πρωτεΐνης σε ρυθμιστικό δεσμεύεται με τις κοιλότητες αλλάζει το δυναμικό του ηλεκτροδίου αίσθησης. Σύνθεση της επιφάνειας αποτύπωμα είναι απλή και δεν απαιτεί καμία ακριβή τεχνολογία για προετοιμασία. Πρόκειται για ένα παλιό, αλλά πολλά υποσχόμενη τεχνολογία, η οποία έχει αναπτύξει με τις προκλήσεις που έχει αντιμετωπίσει στο παρελθόν.

Το 1930 ένας σοβιετικός επιστήμονας MV Polyakov αποδεικνύεται ότι η γέλη πυριτίου που παρασκευάζεται με την παρουσία ενός πρόσθετου διαλύτη έδειξε προτιμώμενη σύνδεση στον ίδιο διαλύτη [17]. Linus Pauling και ο Frank Dickey δημοσιεύθηκε το 1949 ότι πυριτίου παρουσιάζει ειδικότητα για βαφές αποτυπώνεται στην επιφάνεια [18]. Σημαντική ανακάλυψη στη μοριακή αποτύπωση πραγματοποιήθηκε το 1972, όταν Gunter Wulff παρασκευάζεται μοριακού έντυπη οργανικά πολυμερή που χρησιμοποιούν την προσέγγιση ομοιοπολική σύνδεση, η οποία μπορεί να γίνει διάκριση μεταξύ εναντιομερή γλυκερικό οξύ [19]. Wulff et al. χρησιμοποιείται μια προσέγγιση, η οποία έγινε το πιο διάσημο για τις μελέτες μοριακής αποτύπωσης κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του ’70 μέχρι μια άλλη θεωρία εισήχθη το 1981 από Mosbach και συνεργάτες. Δημιούργησαν μοριακό αποτυπώματα βασίζονται σε δέσμευση με το πρότυπο [20] μη ομοιοπολική. Ήταν η απλότητα αυτής της προσέγγισης που πυροδότησε μια έκρηξη στο 90 με πολυμερή μοριακής αποτύπωσης. Έχουμε χρησιμοποιήσει μη ομοιοπολικούς δεσμευτική προσέγγιση που εισήγαγε Wulff et al. να αποτυπώσει το βιοδείκτη HAPLN1 χρησιμοποιώντας λειτουργικές ομάδες υδροξυλίου επί θειόλες που σχηματίζουν ασθενών αλληλεπιδράσεων με την πρωτεΐνη και ένα καλά εξοπλισμένο καλούπι γύρω από τον ίδιο. Αυτό παρέχει μεγαλύτερη ειδικότητα στην κοιλότητα, καθιστώντας έτσι την απομάκρυνση του HAPLN1 από την κοιλότητα ευκολότερη. Οι συνθήκες αποτύπωμα βελτιστοποιήθηκαν για ποτενσιομετρία χρησιμοποιώντας BSA (66 kDa) πρωτεΐνη (Σχήμα 1), λόγω της ομοιότητας του μεγέθους με HAPLN1 βιοδεικτών του καρκίνου (65 kDa). Ελέγξαμε την εξειδίκευση των αποτυπωμένα κοιλοτήτων, με τη χρήση MALDI-TOF, με τη διενέργεια δοκιμών για να αποδείξει ότι μία σχετικά μικρότερη πρωτεΐνη μυοσφαιρίνης (17 kDa) δεν δεσμεύεται σε BSA αποτυπώματα.

(Α-Γ) Παρεμβολή του πρωτεΐνης μέσα στο SAM. (D) Wash. (Ε-Ρ) Δέσμευση της πρωτεΐνης αναλύτη BSA, αιμοσφαιρίνη ως ένα μη ειδικό έλεγχο.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Αρχή της ποτενσιομετρικής

ανίχνευσης

Στην τεχνολογία μας, έχουμε χρησιμοποιήσει ποτενσιομετρία για την ανίχνευση του αναλύτη στόχου HAPLN1. Ένα ποτενσιόμετρο μετρά τη διαφορά δυναμικού μεταξύ ενός ηλεκτροδίου αναφοράς (Ag /AgCl) και του ηλεκτροδίου εργασίας. Αναλύτης δεσμεύεται στην επιφάνεια bioreceptor στο ηλεκτρόδιο εργασίας σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα, με αποτέλεσμα μια μεταβολή στην διαφορά δυναμικού μεταξύ των δύο ηλεκτροδίων. Αυτή η αλλαγή στη συνέχεια μετράται με το σύστημα. Μικρότερες Βιομακρομορίων ιόντα δεν οδηγούν σε μια τάση που παραμένουν σε ισορροπία με τον ηλεκτρολύτη.

Τα ισχυρά αποτελέσματα απόκριση τάσης από τα macroions δεσμευτική μέσω του εκτεταμένου δεσμού μακρομοριακές υδρογόνου γύρω από το αποτύπωμα στο ηλεκτρόδιο εργασίας (χρυσό επικάλυψη τσιπ πυριτίου ), ένα μεγάλο biomacromolecule ανασυνδυασμένου HAPLN1, 65 kDa πρωτεΐνη μεγέθους συναρμολογεί με θειόλες, τα οποία αποτελούν μια οργανωμένη, πυκνό SAM γύρω από τον αναλύτη. Θειόλες έχουν την τάση να αυτο συναρμολογούνται στην επιφάνεια χρυσού ως η ομάδα θείου στο άκρο της ουράς θειολών σχηματίζει ένα θείο-μέταλλο δεσμό με χρυσό [21]. Οργανωμένη SAM είναι ένα σημαντικό «κολλητών» κατά interferrents και μικρές οπές για παρασιτικές ρεύμα. Το μακρομόριο στη συνέχεια πλένεται από την επιφάνεια, η οποία οδηγεί σε σχηματισμό κοιλοτήτων. Το εντυπωμένο ηλεκτρόδιο δρα ως το στοιχείο bioreceptor του βιοαισθητήρα. Έτσι τυπωμένα ηλεκτρόδιο λειτουργεί με ίδιες αρχές όπως εκλεκτικά ηλεκτρόδια ιόντων εμπορικές, τα οποία έχουν μια συγκεκριμένη ιονοφόρου να αναγνωρίσει το ιόν αναλύτη. Δείχνουμε ότι ποτενσιομετρία μπορεί να χρησιμοποιηθεί με καλή ευαισθησία και εκλεκτικότητα για την ανίχνευση του καρκίνου του βιοδείκτη στόχου σε ρυθμιστικό διάλυμα και σε εμβολιασμένο ορό. Η ηλεκτροχημική αντίδραση που λαμβάνεται με αυτήν την τεχνική είναι λόγω του ενδεχόμενου αλλαγή μετά την δέσμευση της πρωτεΐνης πρότυπο. Η μεταβολή στο δυναμικό μετριέται σε σχέση με ένα ηλεκτρόδιο αναφοράς Ag /AgCl [22], [23].

Υλικά που απαιτούνται για την ηλεκτροχημική μέτρηση

αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) από το αίμα βοοειδών ( Mw = 66.3 Κ), μυοσφαιρίνης από ίππου σκελετικό μυ (Mw = 17.6 Κ), 11-μερκαπτο-1-ενδεκανόλη (97%) (θειόλη), απόλυτη αιθανόλη, μεθανόλη και ισοπροπανόλη αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Ανθρώπινα HAPLN1 (64,68 kDa) πλήρους μήκους ORF (AAH57808, 1-354 αμινοξέα) ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη με GST-tag στο Ν-τερματικό αγοράστηκε από Abnova Corporation (καρυδιά, CA) και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Όλες οι πρωτεΐνες και τα χημικά χρησιμοποιήθηκαν όπως λήφθηκαν. Δύο είδη ηλεκτρόδια χρησιμοποιήθηκαν ως ηλεκτρόδιο αίσθησης: χρυσού (50 nm) διασκόρπισης επικαλυμμένο πλακίδιο πυριτίου (1 cm χ 2 cm) και ηλεκτρόδια χρυσού (2 mm

2) αγοράστηκε από την Βάση (West Lafayette, ΙΝ). Οι ποτενσιομετρική μετρήσεις έγιναν σε 10 ml 1Χ PBS σε γυάλινο φιαλίδιο των 20 ml, εξοπλισμένη με ένα μαγνητικό αναδευτήρα. Όταν αραιώνεται προς συγκέντρωση 1Χ, 10 Χ ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich (St Louis, ΜΟ) δώσει μία συγκέντρωση φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος 0,01 Μ και μία συγκέντρωση χλωριούχου νατρίου από 0,154 Μ με ρΗ 7,4. Το σύστημα δύο ηλεκτροδίων αποτελείτο από ένα Ag /AgCl ως το ηλεκτρόδιο αναφοράς και το πυρίτιο επικαλυμμένα χρυσό ηλεκτρόδιο χρυσού τσιπ ως το ηλεκτρόδιο εργασίας. Οι δυνατότητες του ηλεκτροδίου εργασίας κατά το ηλεκτρόδιο αναφοράς μετρήθηκαν με ένα ποτενσιόμετρο Accumet AR15 αγοράστηκε από τη Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) και EMF 16 καναλιών Ηλεκτροχημική Interface αγοράζονται από Lawson Labs (Malverin, PA)

απαιτείται

Υλικά MALDI TOF

πλάκα χρυσού στόχο αγοράστηκε από Bruker Daltonics (Billerica, ΜΑ). διάλυμα TA (0,1% τριφθοροοξικό οξύ /ακετονιτρίλιο, 2:01, vol:vol) και σιναπινικό οξύ αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ) για την παρασκευή μήτρα για την ακινητοποίηση της πρωτεΐνης δεσμεύεται στην επιφάνεια της πλάκας-στόχου . Bruker Autoflex MALDI-TOF αγοράστηκε από την Bruker Daltonics (Billerica, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η ειδικότητα της πρωτεΐνης που δεσμεύεται με την αντίστοιχη αποτυπώματα στην επιφάνεια της πλάκας-στόχου. Ανθεκτικά στις χημικές ουσίες προσαρμόσιμη PTFE (Teflon) Ταινία αγοράστηκε από CS Hyde εταιρείας (Lake Villa, IL). αέριο άζωτο παρέχεται από Presto-O-Πωλήσεων και Υπηρεσιών (LIC, NY).

Αισθητήρας BSA Κατασκευή

Τα τσιπ πυριτίου καθαρίστηκαν με υπερήχους σε απιονισμένο νερό, μεθανόλη και ισοπροπανόλη. Silicon μάρκες αφέθηκαν να ξηραθούν όλη τη νύκτα και στη συνέχεια βομβαρδίστηκαν με σωματίδια χρυσού. Οι χρυσού επικαλυμμένα τσιπς στη συνέχεια πλύθηκαν με απιονισμένο νερό και στέγνωσε με καθαρό αέριο άζωτο. Ομοίως χρυσός ηλεκτρόδια καθαρίζονται με 0,1 και 0,05 micron αλουμίνας και στη συνέχεια υφίσταται κατεργασία με υπερήχους με απιονισμένο νερό για να απομακρυνθούν τυχόν σωματίδια δεσμευμένο αλουμίνας. Δεδομένου ότι οι πρωτεΐνες μετουσίωση σε μη υδατικό διάλυμα και θειόλες δείχνουν φτωχή διαλυτότητα σε υδατικό διάλυμα πρωτεΐνες διαλύθηκαν σε απιονισμένο νερό ενώ θειόλες διαλύθηκαν σε απόλυτη αιθανόλη. Διακυβεύεται η μικτή λύσεις των 19:01 και 18:02 (αιθανόλη water:) με τελική συγκέντρωση θειόλης 0,1 mM και 0,2 mM παρασκευάστηκαν σε καθαρά γυάλινα δοχεία και συγκριτικά μελετηθεί για να επιτευχθεί καλή διαλυτότητα της θειόλες και να αποφευχθεί η καθίζηση της πρωτεΐνης. Το χρυσό επικαλυμμένο ηλεκτρόδιο κατόπιν βυθίζεται μέσα στο μικτό διάλυμα για να σχηματιστεί η αυτο συναρμολογούνται μονοστιβάδα πρωτεΐνης και θειόλης. Ο χώρος κεφαλής του δοχείου είναι γεμάτη με αδρανές αέριο άζωτο και καλύπτονται με parafilm. Ο χρόνος επώασης του τσιπ στο μικτό διάλυμα κυμαινόταν για μια καλύτερη αποτυπωθεί επιφάνεια. Το χρυσό τσιπ στη συνέχεια ξεπλένονται καλά με απιονισμένο νερό για την απομάκρυνση της δεσμευμένης πρωτεΐνης. Επίσης διαφορετικές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των 30 μg /ml, 10 ng /ml και 1 ng /ml χρησιμοποιήθηκαν για να σχηματίσουν τα αποτυπώματα και τα δεσμευτικά αποτελέσματα συγκρίθηκαν. Τα ηλεκτρόδια παρασκευάζονται στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο πρόσδεσης απόκριση με μεταβλητές συγκεντρώσεις BSA σε ρυθμιστικό διάλυμα.

Παρασκευή Αποτυπώματα επί MALDI-TOF στόχος πλάκα

Εκτός από την επιφάνεια που περιέχει 384 φρεάτια, και το υπόλοιπο της πλάκα χρυσού στόχου (8 cmx12.5 cm) καλύφθηκε με μη αντιδραστικό κολλητική ταινία τεφλόν. Η επιφάνεια χρυσού στόχος καθαρίστηκε με αιθανόλη και απιονισμένο νερό. Ελεγχόμενη ροή αδρανούς αερίου αζώτου χρησιμοποιήθηκε για να στεγνώσει η επιφάνεια-στόχο. Το διάλυμα Α παρασκευάζεται με ένα μίγμα 19:01 από 16,17 mg μυοσφαιρίνης (δηλαδή 1,7 μΜ) σε 540 ml απιονισμένου νερού και 0,22 g 11-μερκαπτο-1-ενδεκανόλη (δηλαδή 2 mM) σε 540 ml απόλυτης αιθανόλης. Η λύση αυτή δημιουργήθηκε για να δημιουργήσετε αποτυπώματα μυοσφαιρίνης στο ένα μισό του χρυσού πλάκα στόχου. Διάλυμα Β περιείχε 19:01 μίγμα αναλογίας (water: αιθανόλη) του 16,17 g βόειας λευκωματίνης ορού (δηλαδή 0,432 μΜ) διαλυμένη σε 540 ml απιονισμένο νερό και 0.22 g 11 mercapto1-ενδεκανόλη (δηλαδή 2 mM) σε 540 ml απόλυτης αιθανόλης. Αυτό το διάλυμα παρασκευάστηκε για να δημιουργήσει BSA αποτυπώματα στο άλλο μισό της πλάκας χρυσού στόχου. Το ήμισυ της πλάκας Au βυθίστηκε σε διάλυμα Α για 12 ώρες για να συν-απορροφούν την πρωτεΐνη και θειόλης, και κατόπιν ξηράνθηκε με καθαρό αέριο άζωτο. Ομοίως το άλλο μισό της πλάκας χρυσού στόχος είναι βυθισμένη σε διάλυμα Β για 12 ώρες και στέγνωσε με καθαρό αέριο άζωτο. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης και θειόλης κρατήθηκαν ίδιο όπως χρησιμοποιείται για αποτύπωση σε χρυσό ηλεκτρόδιο για ποτενσιομετρία. Κοιλότητες οποία είναι συμπληρωματικά με τις πρωτεΐνες πρότυπο δημιουργήθηκαν στην μονοστιβάδα με απομάκρυνση των μορίων πρωτεΐνης μέσω επαναληπτικών ξέβγαλμα με απιονισμένο νερό. Το διάλυμα Γ παρασκευάστηκε με ισομοριακό μίγμα 1 ng /ml BSA και μυοσφαιρίνης σε 540 ml απιονισμένο νερό. Αυτό το διάλυμα σχηματίστηκε με τη σύνδεση με δύο διαφορετικούς τύπους κοιλοτήτων στην επιφάνεια χρυσού πλάκα στόχος πρωτεΐνη δοκιμασίας. Wells στην επιφάνεια-στόχο χωρίστηκαν σε τέσσερα τεταρτημόρια (Σχήμα 2) και πηγάδια σε σειρά I (1-24) έως P (1-24) εμβαπτίζονται για 10-15 λεπτά σε διάλυμα C. Η επιφάνεια ξεπλύθηκε απαλά και αφέθηκε να στεγνώσει χρησιμοποιώντας αέριο άζωτο. Στη συνέχεια, 1 μΙ SA μήτρα προστίθεται στο στόχο και αφήνεται να στεγνώσει. Λοιπόν στη σειρά Α (1-24) με Η (1-24) χρησιμοποιήθηκαν για μελέτες ελέγχου. Η πλάκα στόχος στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση MALDI- TOF.

Στήλες (1-12) για μυοσφαιρίνη και στήλες (13-24) για τις περιοχές αποτύπωση BSA. Σειρές Ι Ρ βυθίστηκαν στο διάλυμα αναλύτη C που περιέχει δύο πρωτεΐνες αναλύτη.

Η

Κατασκευή HAPLN1 αισθητήρα

πρωτεΐνη HAPLN1 υπερεκφράζεται στην πλειονότητα των μεσοθηλιωμάτων και ως εκ τούτου να θεωρείται ως πιθανών βιοδεικτών για την ανίχνευση του καρκίνου. Σε ένα καθαρό γυάλινο δοχείο 20 μα HAPLN1 (64,68 kDa) πρωτεΐνη διαλύεται σε 10 ml απιονισμένου ύδατος (δηλαδή 0,03 μΜ) και 4 mg 11-μερκαπτο-1-ενδεκανόλη διαλύθηκε σε 10 ml αιθανόλης (δηλαδή 0,1 mM) . Ένα μεικτό διάλυμα σχηματίζεται, με διάλυση τόσο των διαλυμάτων σε 19:01 αναλογία (water: αιθανόλη), έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση του θειόλης στο διάλυμα γίνεται 0,1 mm. Τρία χρυσά ηλεκτρόδια Α, Β και C βυθίστηκαν στο διάλυμα για 12 ώρες και στη συνέχεια τα ηλεκτρόδια ξεπλύθηκαν εξαντλητικά με απιονισμένο νερό για την απομάκρυνση δεσμευμένης πρωτεΐνης στην επιφάνεια.

απόκριση του αισθητήρα να HAPLN1 εμβολιασμένα δείγματα ορού

HAPLN1-αποτυπώνεται ηλεκτρόδια χρησιμοποιήθηκαν επίσης για ποτενσιομετρική απόκριση στο βιοδείκτη καρκίνο εμβολιάζεται στον ορό. Το διάλυμα 100 ηΜ απόθεμα στο 1:08 ορό και ρυθμιστικό αναλογία παρασκευάστηκε αραιώνοντας 100 μΙ ανθρώπινου ορού με 650 μl διαλύματος 1Χ PBS και με 250 μΐ το διάλυμα του εμπορίου /mL HAPLN1 102 μg (δηλαδή συνολικά 25,5 μg του HAPLN1). Η συγκέντρωση HAPLN1 στο διάλυμα στοκ στη συνέχεια 6,5 μg /ml (100 ηΜ). 10 μl διαλύματος χρησιμοποιήθηκε για την ογκομέτρηση σε 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος PBS, και η υψηλότερη συγκέντρωση της πρωτεΐνης είναι 10

-9 Μ υπόλοιπα Πρότυπα παρασκευάστηκαν διατηρώντας το ίδιο ποσοστό αραίωσης (1:08) του ορού σε ρυθμιστικό αλλά αναλύτη συγκέντρωση μειώθηκε δέκα φορές με αύξοντα 6,5 μg /ml (100 ναυτικών μιλίων) πρότυπο εμβολιασμένο λύση.

Αποτελέσματα

Βελτιστοποίηση των παραμέτρων για αισθητήρα BSA

Τα μόρια πρωτεΐνης BSA ήταν με τυπωμένο το υδροξυλίου τερματιστεί αλκάνιο θειόλες στην επιφάνεια χρυσού. Όπως θειόλες σχηματίζουν ένα οργανωμένο μονοστιβάδα με το χρόνο στο χρυσό επιφάνεια ήταν αποφασιστικής σημασίας για τη μελέτη του χρόνου επώασης του χρυσού επικαλυμμένα τσιπ πυριτίου μέσα στο διάλυμα πρωτεΐνης-θειόλη για να επιτευχθεί σταθερή αποτυπώματα. Σε αυτό το πείραμα η συγκέντρωση BSA στο μικτό διάλυμα ήταν 30 μg /ml και το Σχήμα 3α δείχνει την επίδραση του χρόνου επωάσεως επί της σταθερότητας των αποτυπωμάτων. Τρία ηλεκτρόδια παρασκευάστηκαν με τη διατήρηση των τσιπ στο εσωτερικό του διαλύματος για 2, 6 και 12 ώρες. Το μικτό διάλυμα σε αυτό το πείραμα είχε μια αναλογία 18:02 (αιθανόλη water:) με 0.2 mM 11 mercapto1-ενδεκανόλη. Όλες οι μετρήσεις έγιναν σε ρυθμιστικό φωσφορικού αλατόνερου (ρΗ 7,4) σε ένα διάλυμα 10 ml. Μια λογαριθμική αύξηση του δυναμικού παρατηρήθηκε με αυξανόμενη συγκέντρωση BSA σε ρυθμιστικό μόνο με το ηλεκτρόδιο, το οποίο επωάστηκε για μέχρι και 12 ώρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι περισσότερο σταθερή αποτυπώματα σχηματίστηκαν όταν τσιπ κρατήθηκαν σε διάλυμα για 12 ώρες. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν έπειτα τη βελτιστοποίηση των συνθηκών για την επίτευξη σταθερών αποτυπώματα πρωτεΐνη. Η ποτενσιομετρική απόκριση μελετήθηκε με μεταβολή της συγκέντρωσης του BSA αποτυπώνεται επί του ηλεκτροδίου για το σχηματισμό των κοιλοτήτων. Σε αυτό το πείραμα δύο ηλεκτρόδια παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις 30 μg /ml και 1 ng /ml BSA σε μικτά διαλύματα πρωτεΐνης και θειόλης.

A. Επίδραση του χρόνου πόντισης των 2 ωρών (___), 6 ώρες (…) και 12 ώρες (—). B. Επίδραση της συγκέντρωσης πρωτεΐνης 30 μg /mL (▴, x) και 2 ng /mL (◊, △). C. Επίδραση της συγκέντρωσης πρωτεΐνης 10 ng /mL (□) και 1 ng /mL (▴) και τους ελέγχους επί SAM μόνο (x, ◊).

Η

Αυτά τα αναμεμιγμένα διαλύματα παρασκευάσθηκαν με ένα 19 :1 αναλογία (water: αιθανόλη) που έχει μια τελική συγκέντρωση 0.1 mM 11-μερκαπτο-1-ενδεκανόλη. Ο χρόνος επώασης διατηρήθηκε σε 12 ώρες, όπως αυτή φαίνεται να υποστηρίξει τον σχηματισμό από τις πιο σταθερές αποτυπώματα.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3b, μία λογαριθμική αύξηση της μεταβολής του δυναμικού γίνεται με αύξηση της συγκέντρωσης πρωτεΐνης . Η απόκριση του ηλεκτροδίου παρασκευάζονται με συγκέντρωση πρωτεΐνης αποτύπωσης /ml 30 μg είναι πολύ υψηλότερο σε σύγκριση με το άλλο ηλεκτρόδιο παρασκευάστηκε με χαμηλότερη συγκέντρωση αποτύπωση πρωτεΐνης. Αυτό αποδεικνύει ότι ο αριθμός των κοιλοτήτων που σχηματίζεται στην επιφάνεια αυξάνει καθώς περισσότερες πρωτεΐνη προσροφάται στην επιφάνεια. Το ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτεΐνης ορίζεται ως το ρΗ στο οποίο το καθαρό φορτίο σε μια επιφάνεια πρωτεΐνης είναι μηδέν. Από BSA μόρια έχουν ένα ισοηλεκτρικό σημείο 4.7 έχουν ένα καθαρό αρνητικό φορτίο σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα με ρΗ 7.4. Καθώς όλο και περισσότεροι φορτισμένα μόρια συνδέονται προς την επιφάνεια του ηλεκτροδίου οδηγεί σε μια δραστική αλλαγή στο δυναμικό. Τα αποτελέσματα επαναλήφθηκαν επιτυχώς για επιβεβαίωση. Εικόνα 3b καταδεικνύουν επίσης μια υψηλότερη πιθανή αλλαγή με αναλογία 19:01 (water: αιθανόλη) σε σύγκριση με μια αναλογία 18:02 από το Σχήμα 3α. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι οι περισσότερες κοιλότητες σχηματίζονται ως η συγκέντρωση θειόλης στο διάλυμα μειώνεται. Για να downscale τη διαδικασία και προετοιμασία πιο ευαίσθητα ηλεκτρόδια, χαμηλές συγκεντρώσεις αποτύπωση του 1 ng /ml και 10 ng /ml επιλέχθηκαν με βάση τα προηγούμενα πειραματικά δεδομένα. Τα πειράματα διεξήχθησαν με χρυσό ηλεκτρόδιο πολύ μικρότερη επιφάνεια (2 mm

2). Το ηλεκτρόδιο εργασίας παρασκευάζεται σε μία αναλογία 19:01 (water: αιθανόλη) με μια τελική συγκέντρωση 0.1 mM 11-μερκαπτο-1-ενδεκανόλη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3c ηλεκτρόδιο δείχνει μια καλή σύνδεση απόκριση 15-20 mV με πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις BSA σε σύγκριση με μια χαμηλή απόκριση πρόσδεσης του 2-4 mV παρατηρούνται με ηλεκτρόδια ελέγχου παρασκευασμένα που έχουν μόνο το SAM στην επιφάνειά τους.

Validation χρησιμοποιώντας MALDI-TOF

σε αυτό το πείραμα 1 μΙ μήτρας τοποθετήθηκε στην κορυφή κάθε φρεάτιο της αποτυπώνεται Maldi πλάκα και αφήνεται να στεγνώσει. Maldi λογισμικό ανάλυσης πλάκα με έναν αλγόριθμο για τη συλλογή δεδομένων με ένα ρυθμό σάρωσης 2,000 λέιζερ shot /s για κάθε κηλίδα σε ένα καλά επιλέχθηκε. Δεδομένου ότι το ήμισυ των 384 φρεάτων για την MALDI πλάκα ήταν αποτυπωμένα BSA και το άλλο μισό με πρωτεΐνη μυοσφαιρίνη, τυχαία πέντε φρεάτια επελέγησαν από τα φρεάτια μυοσφαιρίνη αποτυπωθεί και παρομοίως πέντε επιλέχθηκαν από την BSA αποτυπωμένα πηγάδια, για να προσδιοριστεί η πρωτεΐνη συνδέεται με τις κοιλότητες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, το σύμβολο τριών χαρακτήρων m /z σε άξονα χ χρησιμοποιείται σε φασματοσκοπία μάζας για να υποδηλώσει την αδιάστατη ποσότητα, που σχηματίζεται με τη διαίρεση της μάζας ενός ιόντος σε ενοποιημένη μονάδες ατομικής μάζας από τον αριθμό φορτίο της.

Ένα. Μυοσφαιρίνης εντυπωμένα φρεάτια και B. BSA αποτυπώνεται φρεάτια.

Η

άξονας Υ δείχνουν την ένταση του σήματος, αλλά αντί να χρησιμοποιεί μετρήσεις ανά δευτερόλεπτο (cps), η συνήθης διαδικασία είναι να συνδεθεί η ένταση με τη σχετική αφθονία με μια χρήση, εάν ένα εσωτερικό πρότυπο. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4α μυοσφαιρίνης η οποία έχει ένα μοριακό βάρος από 17 kDa παρατηρήθηκε ότι δεσμεύεται μόνο μυοσφαιρίνη αποτυπώνεται φρεάτια ως μία κορυφή εμφανίζεται στο 17 kDa για κάθε κοιλότητα και δεν μυοσφαιρίνη παρατηρήθηκε σε BSA κοιλοτήτων σύμφωνα φαίνεται στο Σχήμα 4β. BSA παρατηρήθηκε να είναι πολύ μεγάλο μοριακό βάρος κάτω από αυτές τις συνθήκες ιοντισμών.

Αισθητήρας HAPLN1

Μετά τις σπουδές BSA για τη βελτιστοποίηση των συνθηκών που απαιτούνται για την αποτύπωση βιομακρομορίων, HAPLN1 αποτυπώνεται ηλεκτρόδια κατασκευάζονται για χαμηλή συγκέντρωση ανίχνευση του βιοδείκτη. Τρεις αποτυπώνεται ηλεκτρόδια μελετήθηκαν για την επαλήθευση της απάντησης μετά την ανίχνευση. Δύο ανεξάρτητα πειράματα δείχνουν μια δραστική 25 mV αλλαγή στο δυναμικό σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις HAPLN1 10

-12 Μ ως τιτλοδοτήθηκε εντός του ρυθμιστικού διαλύματος η HAPLN1 (Σχήμα 5α). Ως μάρτυρας, BSA επίσης τιτλοδοτήθηκε υπό τις ίδιες συνθήκες που παρουσιάζουν πολύ χαμηλό δυναμικό απόκριση σε υψηλές συγκεντρώσεις BSA. Το πείραμα στη συνέχεια διεξήχθη σε ορό με ένα εμβολιασμένο συγκέντρωση HAPLN1. Σχήμα 5β δείχνει ότι η αποτυπωθεί ηλεκτρόδιο έχει υψηλή ολίσθηση στον ορό, αλλά δείχνει μια αξιοσημείωτη πιθανή αλλαγή σε 10

-9 Μ συγκέντρωση HAPLN1 στον ορό.

Α. HAPLN1 σύνδεση με HAPLN1 αποτυπώματα (δύο ανεξάρτητα πειράματα), η απόκριση ελέγχου BSA σε HAPNL1 αποτυπώματα. Β εμπλουτισμένα HAPLN1 λύση αναλύτη ορού HAPLN1 αποτυπώματα.

Η

Συζήτηση

Η ανίχνευση των βιοδεικτών του καρκίνου με χαμηλό κόστος και εύκολη στη χρήση της μεθόδου είναι σημαντικό για τη συνεχή παρακολούθηση των πολλαπλών δείκτες. HAPLN1 είναι ένα παράδειγμα της αυξανόμενης σημασίας στον τομέα, όπως για παράδειγμα Nelson et al [24] ολοκλήρωσε πρόσφατα μια ανάλυση μεταγραφικό στην αγγειακή αίματος (BEC) και του λεμφικού ενδοθηλιακά κύτταρα (LEC) και την ανάλυση ομαδοποίησης έδειξε σαφώς διαφορικής έκφρασης γονιδίων για BECs και LECs . HAPLN1 ήταν δεύτερο υψηλότερο εκφρασμένο γονίδιο σε LECs και ως όγκοι λάβει το πλεονέκτημα αυτών των μεταστατικό δυναμικό των μορίων Ενίσχυση, η παρατηρούμενη έκφραση υψηλού HAPLN1 μπορεί να οδηγήσει σε νέες θεραπευτικές αγωγές για μετάσταση καρκίνου στους λεμφαδένες. Δύο-διαστάσεων τεχνολογία μοριακής αποτύπωσης έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για να αποτυπώσει και τον εντοπισμό μικρών μορίων [25] – [29], όπως πεπτίδια αλλά αποτύπωση μακρομόρια παρέμεινε ένα δύσκολο έργο. Βιολογικών μακρομορίων όπως οι πρωτεΐνες έχουν υψηλού μοριακού βάρους και ως εκ τούτου, το μεγάλο μέγεθος τους εμποδίζει την προσρόφηση στην επιφάνεια και την απομάκρυνση από την έτοιμα αποτύπωμα [30] – [33]

Ο μεγάλος αριθμός των θέσεων δέσμευσης και λειτουργική. ομάδες στην επιφάνεια πρωτεΐνη μπορεί να αυξήσει τα προβλήματα που σχετίζονται με την μη-ειδική σύνδεση με μοριακά αποτυπωμένων πρωτεΐνες (ΕΤΕ) που οδηγεί σε κακή επιλεκτικότητα [34]. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να βελτιστοποιήσουν όλες τις απαιτούμενες παραμέτρους και συνθήκες για να διατηρηθεί η σταθερότητα των συγκεκριμένων μεγάλες δομές σε όλη τη διαδικασία της αποτύπωσης. Έχουμε επιλέξει πρωτεΐνης BSA (65 kDa) για την διαδικασία βελτιστοποίησης λόγω παρόμοιου μεγέθους του στις υποψήφιες καρκίνο βιοδείκτη HAPLN1. Στο σχήμα 3α και Σχήμα 3β είναι πιο σταθερές αποτυπώματα που σχηματίζονται με χρόνο επώασης 12 ώρα και μια αύξηση στην απόκριση εμφανίζεται όταν τα περισσότερα μόρια-στόχους αποτυπώνεται στα 30 μg /ml σε σύγκριση με 1 ng /ml συγκέντρωση. Παρόμοιες συνθήκες χρησιμοποιήθηκαν από τους Wang et al [35], για να δείξει πώς τα αποτυπώματα σχηματίζονται με διαφορετικές πρωτεΐνες μέγεθος είναι εξαιρετικά ειδικό για αντίστοιχο ηλεκτρόδιο αποτύπωμα τους χρησιμοποιώντας ποτενσιομετρικής ανίχνευσης. τεχνική MALDI TOF έχει χρησιμοποιηθεί ως μια νέα μέθοδο στο έργο μας για την επιβεβαίωση της ιδιαιτερότητα του χώρου αποτύπωμα, που φαίνεται επίσης με ποτενσιομετρική ανίχνευση. Το Σχήμα 4 δείχνει πρωτεΐνες μυοσφαιρίνης δεσμεύονται ειδικά σε αποτυπωθεί κοιλοτήτων και όχι στις κοιλότητες BSA. Πιστεύουμε ότι αφού μυοσφαιρίνης πρωτεΐνες είναι πολύ μικρότερα σε μέγεθος (17 kDa) σε σύγκριση με BSA, μυοσφαιρίνη δεν θα ταίριαζε στο καλούπι BSA και ως εκ τούτου δεν δεσμεύει σε μεγαλύτερες κοιλότητες BSA. Αποτελέσματα της ειδικότητας BSA δεν μπορούσε να επιβεβαιωθεί με MALDI-TOF λόγω της κακής ευαισθησία του εξοπλισμού προς πρωτεΐνες υψηλού μοριακού βάρους. Έχουμε χρησιμοποιήσει ποτενσιομετρική ανίχνευση για τη βελτιστοποίηση των κοιλοτήτων με BSA και για την ανίχνευση των HAPLN1 σε ρυθμιστικό διάλυμα και σε εμβολιασμένο ορό. Τα αποτελέσματα μας στο Σχήμα 5Α δείχνουν 25 mV απόκριση του HAPLN1 να HAPLN1 αποτυπώνεται ηλεκτρόδιο σε σύγκριση με χαμηλή απόκριση με BSA πρωτεΐνη σε ρυθμιστικό διάλυμα και παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε εμβολιασμένο ορό. Παρά το γεγονός ότι έχουμε δείξει η ποτενσιομετρική απόκριση που λαμβάνεται είναι ειδικά για την πρωτεΐνη αποτυπώνεται και είναι αποτέλεσμα της συνδετικής πρωτεΐνης, η σαφής κατανόηση λείπει σήμερα για το ηλεκτροχημικό σήμα (πιθανή αλλαγή) που προκαλείται από την προσρόφηση πρωτεϊνών. Αρκετοί μηχανισμοί έχουν προταθεί μεταξύ άλλων με την Thompson et al. Προτείνει παράγοντες, οι οποίοι θα μπορούσαν να συμβάλλουν στις αλλαγές της συνάρτησης έργου [36] του χρυσού όταν πρωτεΐνη δεσμεύεται στην επιφάνεια του χρυσού και έτσι να δείχνει πώς η αλλαγή στα αποτελέσματα συνάρτηση έργου σε αλλαγή του δυναμικού επιφανείας. Σε μελλοντικά πειράματα σχεδιάζουμε να ελέγξετε την περαιτέρω εξειδίκευση των HAPLN1 πρωτεΐνη που δεσμεύεται με αποτύπωμα κοιλότητες από την τεχνολογία επιφάνειας συντονισμό πλάσματος (SPR), καθώς και για τη λήψη κλινικών δεδομένων για την επικύρωση.

Συμπεράσματα

Τα δεδομένα μας καταδεικνύουν την χρήση του SAM σχηματίζουν υδατοδιαλυτά υδροξυλιωμένων αλκανεθειόλες να αποτυπώσει βιομακρομορίων. BSA φάνηκε να είναι ένας αποτελεσματικός μοντέλο πρωτεΐνης για τη βελτιστοποίηση των παραμέτρων ελέγχου όπως η συγκέντρωση πρωτεΐνης, αναλογία των μοριακών συστατικών, και ο χρόνος επώασης του τσιπ για downscale τη διαδικασία της αποτύπωσης για την ανίχνευση των χαμηλών συγκεντρώσεων των πρωτεϊνών. Μοριακής αποτύπωσης βασίζεται βιοαισθητήρα με επιτυχία χτίστηκε για να αναγνωρίσει κακοήθεις υπεζωκότα HAPLN1 μεσοθηλίωμα του καρκίνου βιοδεικτών και επέδειξε μεγάλη ευαισθησία από την ανίχνευση χαμηλής συγκέντρωσης των βιοδεικτών σε ορό /ρυθμιστικού διαλύματος. Ο αισθητήρας έδειξε ένα όριο ανίχνευσης της picomolar συγκεντρώσεις με χρόνο απόκρισης 2-5 λεπτά. Το χαμηλό κόστος του αισθητήρα βασίζεται στην έλλειψη ακριβά μονοκλωνικά αντισώματα, επιπρόσθετα μόρια επισήμανσης και στην απλότητα της ανοικτής κύκλωμα δυναμικού μέτρηση με ένα ποτενσιόμετρο, το οποίο επίσης είναι πολύ εύκολο στη χρήση (παρόμοιο με πεχάμετρο).