Abstract

Το συζευγμένο υποδοχέα G-πρωτεΐνη (GPCR), κυστεΐνη (C) -Χ-C Receptor 4 (CXCR4), παίζει σημαντικό ρόλο στη μετάσταση του καρκίνου του προστάτη. CXCR4 θεωρείται γενικά ως ένας υποδοχέας μεμβράνης πλάσματος όπου μεταδίδει σήματα που υποστηρίζουν το μετασχηματισμό, την εξέλιξη και την ενδεχόμενη μετάσταση. Λόγω του κεντρικού ρόλου των CXCR4 στην ογκογένεση, θεραπευτικά προσεγγίσεις όπως ανταγωνιστή και μονοκλωνικά αντισώματα έχουν επικεντρωθεί σε υποδοχείς που υπάρχουν επί της μεμβράνης του πλάσματος. Μια αναδυόμενη ιδέα για G-πρωτεΐνη υποδοχείς είναι ότι μπορούν να εντοπίσουν και να συνδεθούν με τον πυρήνα, όπου διατηρεί τη λειτουργία και να μεσολαβήσει πυρηνική σηματοδότηση. Στο παρόν, έχουμε αποδείξει ότι CXCR4 που συνδέονται με τον πυρήνα των κακοηθών ιστών καρκίνου του προστάτη. Παρομοίως, η έκφραση του CXCR4 ανιχνεύθηκε σε πυρηνικό κλάσματα ανάμεσα σε αρκετές καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές, σε σύγκριση με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη. Οι μελέτες μας εντόπισε μια πυρηνική πισίνα του CXCR4 και ορίσαμε ένα μονοπάτι πυρηνικής μεταφοράς για CXCR4. Εμείς αποκαλύπτουν μια υποθετική αλληλουχία πυρηνικού εντοπισμού (NLS), «RPRK», στο πλαίσιο CXCR4 που συνέβαλαν στην πυρηνική εντόπιση. Επιπλέον, η πυρηνική CXCR4 αλληλεπιδράσει με Transportinβ1 και Transportinβ1-σύνδεση με το CXCR4 προωθείται πυρηνική μετατόπιση της. Σημαντικά, G μελέτες

αi ανοσοκαθίζηση και κινητοποίηση ασβεστίου έδειξαν ότι η πυρηνική CXCR4 ήταν λειτουργική και συμμετείχε σε σηματοδότηση G-πρωτεΐνης, αποκαλύπτοντας ότι ο πυρηνικός πισίνα του CXCR4 διατηρούνται λειτουργίας. Δεδομένου η πρόταση ότι η λειτουργική, η πυρηνική CXCR4 μπορεί να είναι ένας μηχανισμός που υπογραμμίζει υποτροπής του καρκίνου του προστάτη, η αυξημένη μεταστατική ικανότητα και χειρότερη πρόγνωση μετά όγκοι υποστεί επεξεργασία με θεραπεία που στοχεύει μεμβράνη πλάσματος CXCR4, οι μελέτες αυτές αντιμετωπίζει ένα νέο μηχανισμό της πυρηνικής σηματοδότησης για CXCR4, μία νέα μηχανισμός της κλινικής στόχευση, και να επιδείξει ενεργό πυρηνικό πισίνα που παρέχει σημαντικές νέες πληροφορίες για να φωτίσει αυτό που έχει πρωτίστως κλινικές αναφορές των πυρηνικών CXCR4

Παράθεση:. Don-Salu-Hewage AS, Chan SY, McAndrews KM, Chetram ΜΑ, Dawson MR, Bethea DA, et al. (2013) Κυστεΐνη (C) -Χ-C Receptor 4 υποβάλλεται Transportin 1-Εξαρτημένων πυρηνικό εντοπισμό και παραμένει σε λειτουργία στο πυρήνα των κυττάρων Μεταστατικό καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 8 (2): e57194. doi: 10.1371 /journal.pone.0057194

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20, Νοεμ 2012? Αποδεκτές: 18 του Ιανουαρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 28, Φεβρουαρίου, 2013

Copyright: © 2013 Don-Salu-Hewage et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε, εν μέρει, από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί 2R25GM060414, P201MD002285 (CVH), F31CA153908 (MAC), 2G12RR003062-22 (CVH) και το Διεθνές Ερευνητικό AAAS Γυναικών Συνεργασία (WIRC) Ευπαθών σερβιρίσματος Ιδρύματα (MSI), το National Science επιχορήγηση του Ιδρύματος (CVH). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η δεύτερη κύρια αιτία της αυξημένης εμφάνισης καρκίνου και θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο μεταξύ των ανδρών στις Ηνωμένες Πολιτείες [1], [2]. Παρά τη θεραπεία, τα υψηλά ποσοστά θνησιμότητας σε προστάτη που δόθηκε στη μετάσταση, το οποίο είναι το κύριο εμπόδιο στη θεραπεία του προστάτη [3]. Αρκετά μόρια και μηχανισμοί συμβάλλουν στην καρκινικών κυττάρων της μετάστασης. Για παράδειγμα, χημειοελκτικό κυτοκίνες (χημειοκίνες) ενισχύει την μεταστατικό δυναμικό των προστάτη με σύνδεση και ενεργοποίηση μιας οικογένειας G-πρωτεΐνη υποδοχείς (GPCRs) [4], [5], [6], [7], που κινεί τα σήματα για την ενίσχυση της κυτταρικής πρόσφυση, την εισβολή και την κίνηση, και στη συνέχεια, την επιβίωση του όγκου στο νέο site της μετάστασης. GPCRs αποτελούν τη μεγαλύτερη οικογένεια της μεμβράνης μεμβράνης πλάσματος (PM) υποδοχείς [8]. Στη συμβατική σηματοδότηση GPCR, οι υποδοχείς εντοπίζονται στο ΡΜ και να επηρεάσει την δραστικότητα του ΡΜ-εντοπισμένη ενζύμων, διαύλων ιόντων, και /ή δεύτερους αγγελιοφόρους. ενεργοποίησή τους με ένα κατάλληλο συνδετήρα ενεργοποιεί σηματοδότηση μέσω G-πρωτεΐνης άλφα (G

α) και /ή βήτα-γάμμα (G

βγ) υπομονάδες [9], που οδηγεί σε μεταβλητής αποτελεσμάτων, τα οποία μπορούν να θετικά και /ή ρυθμίζουν αρνητικά τη δραστηριότητα των μορίων τελεστών σε καταρράκτες σηματοδότησης εντός του κυττάρου [10], [11]. Επιπροσθέτως, τα ενεργοποιημένα GPCRs ενεργοποιούν επίσης μια σειρά από μοριακές αλληλεπιδράσεις που επιτρέπουν την ρύθμιση ανάδρασης σύζευξης G-πρωτεΐνης και ενδοκυττάρωση υποδοχέα να μετριάσει τα σήματα υποδοχέα [12], [13], [14], [15], [16], [17 ], [18]. Müller

et al

. αρχικά περιγράφεται η συμμετοχή των υποδοχέων χημειοκινών GPCR σε μετάσταση καρκίνου [19] και Akashi

et al.

ανέφεραν ότι η χημειοκίνη GPCR, CXCR4, ήταν εντόνως εκφρασμένο σε ανθρώπινο κακόηθες PCa σε σύγκριση με κανονικό προστάτη [20]. Πολυάριθμες μελέτες έχουν τεκμηριώσει τη συμμετοχή των CXCR4 στα βασικά βήματα του προστάτη μετάστασης: (i) τη σηματοδότηση? [21], [22]? (Ii) εισβολή και τη μετανάστευση [23]? και (iii) η καθιέρωση ενός αγγειακού δικτύου [24]. Ως εκ τούτου, πολλές θεραπευτικές ουσίες για καρκινικών κυττάρων της μετάστασης έχουν σχεδιαστεί για να ανταγωνίζονται CXCR4 μεσολάβηση σηματοδότηση [25], [26]. Στη συμβατική σηματοδότηση CXCR4, στρωματικών κυττάρων που προέρχονται από παράγοντα 1 άλφα (SDF1α) είναι ο αποκλειστικός συνδέτης για CXCR4 [27], η οποία οδηγεί στην ενεργοποίηση των μονοπατιών κάνει αυτός ο υποδοχέας ευνοϊκό για ογκογένεση: (i) G-πρωτεΐνη υποδοχέα (GPCR) σηματοδότησης ? (Ii) PI3K /AKT? (Iii) ΜΑΡΚ? (Iv) JAK /STAT? (V) Src κινάση και (vi) HER2 [28], [29], [30].

Είναι ενδιαφέρον, έχουν GPCRs έχουν ανιχνευθεί σε υποκυτταρικά οργανίδια διακρίνεται από την κλασική θέση ΡΜ του [31]. Αυτά τα οργανίδια περιλαμβάνουν την συσκευή Golgi [32], ενδοπλασματικό δίκτυο [33], τον κυτταρικό σκελετό [34] και τον πυρήνα /πυρηνικής μεμβράνης [35]. Hanyaloglu και von Ζάστροου αξίωμα ότι προεπιλογή ανακύκλωση GPCRs από ενδοσώματα μπορεί να συμβάλει στην ενίσχυση της εκ νέου παράδοση των GPCRs στον ΡΜ, ή στην εναλλακτική οργανίδια μέσα στο κύτταρο, χωρίς να καταστρέφει την ικανότητα σηματοδότησης τους [36]. Παρ ‘όλα αυτά, αυτά τα εναλλακτικά-μεταφρασμένη υποδοχείς GPCR αποκαλύπτουν ένα νέο επίπεδο πολυπλοκότητας που μπορεί να είναι σημαντική στη ρύθμιση της λειτουργίας τους. Ένας αυξανόμενος αριθμός GPCRs έχουν παρατηρηθεί εντός του πυρήνα ή πυρηνικής μεμβράνης, όπως υποδοχείς λυσοφωσφατιδικό οξύ, μεταβοτροπικοί υποδοχείς γλουταμινικού, υποδοχείς παράγοντα ενεργοποίησης αιμοπεταλίων, αγγειοτενσίνης 2 υποδοχείς τύπου Ι, υποδοχείς προσταγλανδίνης, υποδοχείς ενδοθηλίνης, ορμόνη απελευθέρωσης τύπου ορμόνη Ι υποδοχέα [ ,,,0],37] και

β

-αδρενεργικών υποδοχέων [38], [39], [40], [41], [42], [43], [44]. Οι Πυρηνική GPCRs έχουν προταθεί για τη ρύθμιση ενός αριθμού φυσιολογικών διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, επιβίωσης, φλεγμονώδεις αποκρίσεις, ογκογένεση, τη σύνθεση του DNA και η μεταγραφή [43], [45], [46], [47], [48], [49 ], [50]. Πυρηνική GPCRs μπορούν να είναι ουσιαστικά δραστική, ή ενεργοποιούνται από την εσωτερική, νεοσυντιθέμενη συνδέτες που δεσμεύονται για έκκριση [51]. Στη συνέχεια, η κλασική οδούς δεύτερη σηματοδότηση αγγελιοφόρος, όπως αδενυλική κυκλάση επαγόμενη Πρωτεΐνης Κινάσης Α (ΡΚΑ) ενεργοποίηση [38], φωσφολιπάση-επαγόμενη απελευθέρωση του intranuclear ασβέστιο, διακυλγλυκερόλη επαγόμενη πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC) [39], [52], ERK1 /2, οι κινάσες ρ38 ΜΑΡ και πρωτεϊνικής κινάσης Β (ΡΚΒ) [49], [50] έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιούνται από την πυρηνική GPCRs.

πυρηνικός εντοπισμός των πρωτεϊνών υπαγορεύεται από πυρηνική εισαγωγή και εξαγωγή μέσα από την πυρηνική συγκροτήματα πόρων [53]. Μικρές πρωτεΐνες (& lt? 30-50 kDa) μπορούν να περάσουν μέσω του πυρηνικού πόρου με ελεύθερη διάχυση? Ωστόσο, οι περισσότερες πρωτεΐνες του φορτίου απαιτούν ενεργό μεταφορά να εισέρχεται στον πυρήνα [54]. Μεγαλύτερες πρωτεΐνες χρησιμοποιούν μηχανισμούς ενεργού μεταφοράς, οι οποίες απαιτούν βοήθεια από πρωτεΐνες μεταφοράς [55], [56], [57]. Πολλές πρωτεΐνες στοχεύουν στον πυρήνα περιέχει μια κλασική σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NLS), που αναγνωρίζεται από έναν ετεροδιμερικό υποδοχέα που αποτελείται από την εισαγωγή importin άλφα και βήτα importin. Πολλοί από αυτούς τους υποδοχείς αναγνωρίζουν άμεσα τις πρωτεΐνες του φορτίου και τους στοχεύουν άμεσα στο πυρηνικό πόρων [58]. Στην περίπτωση αυτή τη μεγάλη οικογένεια, τα σήματα στόχευσης εντός των πρωτεϊνών του φορτίου δεν είναι συχνά σαφώς καθορισμένα [59]. Κάθε πρωτεΐνη που εντοπίζεται στον πυρήνα πρέπει να διαθέτει μια λειτουργική NLS ή υποχρεούται να συνδέεται προς πρωτεΐνες φορτίου, που διαθέτουν ένα NLS (ες). Importin άλφα αναγνωρίζει την NLS στην πρωτεΐνη του φορτίου, ενώ importin βήτα στοχεύει το συγκρότημα εισαγωγής του πυρηνικού πόρου [58], [60]. Importin beta είναι μέρος μιας μεγαλύτερης οικογένειας των υποδοχέων των μεταφορών συχνά αποκαλείται importins /exportins [59].

Ενώ ένα υποθετικό NLS έχει ταυτοποιηθεί σε CXCR4 [61], η λειτουργία του πυρηνικού σήματος που στοχεύουν στο πλαίσιο της CXCR4 δεν έχει εξεταστεί. Μια ξεχωριστή διαδρομή μεταφοράς importin-εξαρτώμενη έχει ενοχοποιηθεί για τη μεταφορά της C-C τύπου υποδοχέα χημειοκινών 2 ​​(CCR2) [62]. Favre

et al

. Βρέθηκε ότι ένα κατασκευασμένο, ΗΑ-tagged CCR2 σχετίζονται με ένα μέλος της οικογένειας του importin πυρηνικών υποδοχέων μεταφοράς, Transportinβ1 (TRN1), σε μία κυτταρική γραμμή CCR2-null [62]. Μια αλληλεπίδραση του CCR2 με TRN1 όφειλε να ανιχνεύσει CCR2 στα πυρηνικά κλάσματα, γεγονός που υποδηλώνει ότι CCR2 μεταφέρεται στον πυρήνα μέσω TRN1 [62]. TRN1 έχει εμπλακεί στην GPCR εσωτερίκευση και απευαισθητοποίηση [63]. Επιπλέον, TRN1 χρησιμεύει ως υποδοχέας για NLS-null πρωτεϊνών σε NLS-υποστρώματα που περιέχουν φορτίου [64], καθιστώντας το ένα ουσιαστικό πρωτεΐνη για εισαγωγή μέσω του πυρηνικού πόρου συγκρότημα [65]. Λαμβανόμενες μαζί, αυτές οι μελέτες προτείνουν ότι τόσο η κλασσική μηχανήματα πυρηνικής εισαγωγής και TRN1 είναι υποψήφιοι που παίζουν ένα ρόλο στην CXCR4 πυρηνική μετατόπιση [66].

έκφραση πρωτεΐνης Πυρηνική CXCR4 έχει παρατηρηθεί σε κακοήθη ηπατοκυτταρικό, του παχέος εντέρου, των νεφρών και ρινοφαρυγγικά καρκινώματα [67], [68], [69], [70]. Αυτές οι μελέτες, ωστόσο, έχουν αναφερθεί ως κλινικές παρατηρήσεις, και απέτυχε να ερευνήσει τους μηχανισμούς της CXCR4 εντοπισμού ή οποιαδήποτε βιολογική λειτουργία που σχετίζεται με τον πυρηνικό υποδοχέα. Αυτά τα δεδομένα είναι σύμφωνα με αναφορές που έχουν αποδείξει λειτουργική GPCRs που συνδέονται με τον πυρήνα, και συμβάλλουν περαιτέρω στη συνεχή καρκίνο θεραπευτικές παρεμβάσεις κατά CXCR4. Είναι σημαντικό ότι, ένα λειτουργικό πυρηνικό CXCR4 μπορεί να συνεισφέρει προς PCA υποτροπή παρά την τρέχουσα ανταγωνιστές και μονοκλωνικά αντισώματα έναντι ΡΜ-δεσμευμένο CXCR4 και δεν μπορεί να σχεδιαστεί για να διασχίσει το ΡΜ, η οποία θα πρέπει να ανταγωνίζονται ενεργό CXCR4 στο πυρήνα. Επιπλέον, ο προσδιορισμός των οδών μεταφοράς που απαιτούνται για την πυρηνική εντόπιση του CXCR4 μπορεί να αποκαλύψει επιπλέον στόχους για θεραπευτική ανάπτυξη για να εμποδίσουν προστάτη μετάσταση του καρκίνου και βελτιώνουν την επιβίωση των ασθενών.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture, Αντισώματα και αντιδραστηρίου Συνθήκες

PC3, DU145, 22RV1 καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές ανθρώπου (PCA), RWPE1 ανθρώπινη κυτταρική σειρά προστάτη και 293Τ ανθρώπινη εμβρυϊκή νεφρική κυτταρική γραμμή ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). PC3, DU145, 22RV1 και 293Τ κύτταρα διατηρήθηκαν σε πλήρες μέσο RPMI: RPMI 1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 1% μη απαραίτητα αμινοξέα και 1% αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό στους 37 ° C σε 5% CO

2. κύτταρα RWPE1 διατηρήθηκαν σε κερατινοκυττάρων μέσο άνευ ορού (KSFM) που περιέχει 50 mg /ml γενταμυκίνη, 0,05 mg /ml εκχυλίσματος υποφύσεως βοοειδών (ΒΡΕ), και 5 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (Invitrogen) στους 37 ° C σε 5% CO

2. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 60% έως 80% συρροή. PC3 κύτταρα που αρχικά απομονώθηκε από ένα προστάτη σπονδυλική μετάσταση, ενώ τα κύτταρα DU145 λήφθηκαν από μετάσταση στον εγκέφαλο του προστάτη. 22RV1 κύτταρα ήταν από ένα ανθρώπινο καρκίνωμα του προστάτη επιθηλιακή κυτταρική γραμμή που προέρχεται από ένα ξενομόσχευμα που σειριακά πολλαπλασιαστεί σε ποντικούς, και τα κύτταρα RWPE1 απομονώθηκαν από φυσιολογικό ανθρώπινο επιθήλιο προστάτη. προμηθειών καλλιέργεια κυττάρων και θειική καναμυκίνη (61-176-RG) ήταν από MediaTech? SDF1α (300-28A) ήταν από την PeproTech. Τα ακόλουθα αντιδραστήρια και ανθρώπινα αντισώματα ήταν από τη Cell Signaling: 10 × ρυθμιστικό λύσης κυττάρου (9803), IgG αντι-κουνελιού ποντικού (5127), αντι-CD44 (156-3C11), αντι-GFP (2956S) και αντι-G

αi (5290). Αντι-CXCR4 (MAB172) ήταν από την R & amp? D Systems. Anti-Topoisomerase1 (SC-271285), αντι-Lamin A /C (SC-20681), φουσίνης (H-118) -CXCR4 (SC-9046), φουσίνης (4G10) -CXCR4 (SC-53534), αντι-Ινωδονεκτίνης IgG2B (SC-271098), αντι-GFP (sc-9996), /G Plus-αγαρόζης πρωτεΐνης Α (SC-2003), αντι-Karyopherinβ2 (SC-166127), Karyopherinβ2 siRNA (h) (SC-35737) και DAPI (SC-3598) ήταν από την Santa Cruz Biotech. NE-PER Πυρηνικής και κυτταροπλασματικά Extraction Kit (78.833), αναστολέα πρωτεάσης Cocktail Kit (78410) και να σταματήσει TM Φωσφορικό Αναστολέας Κοκτέιλ (78420) ήταν από την Thermo Scientific. Anti-αTubulin (T5168), αντι-βActin (A5441) Triton Χ-100 (T8532) και ιωδιούχο προπίδιο (Ρ4170) ήταν από την Sigma-Aldrich. ασθένεια του προστάτη συστοιχία ιστού φάσματος (PR8011) αγοράστηκε από Biomax. αντιδραστήριο επιμόλυνσης JetPRIME® πολύποδας (114-07) ήταν από VWR International. Nonidet P-40 Αναπληρωτές (M158) ήταν από BioExpress και FluoForte Κιτ Δοκιμασίας Ασβεστίου (ENZ-51016) ήταν από την Enzo Επιστημών Ζωής

Χαρακτηρισμός CXCR4 IgG2B (R & amp? Συστήματα D). Αντίσωμα

Εξειδίκευση του μονοκλωνικού αντισώματος αντι-ανθρώπινης CXCR4 ποντικού (R &? D Systems) για CXCR4 πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με ανοσοκαταβύθιση και ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας CXCR4-θετικά PC3 και CXCR4-null 293Τ λύματα ολόκληρων κυττάρων. Εν συντομία, PC3 και 293Τ κύτταρα (5 × 10

6) αναπτύχθηκαν σε 100 mm δίσκους σε πλήρες μέσο επί μία νύκτα, ακολουθούμενη από επώαση σε RPMI μόνο (ορός-ασιτία) για 24 ώρες. Κυττάρων πλύθηκαν με 1 χ αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και συλλέχθηκαν σε 1 × Cell Signaling ρυθμιστικό λύσης. Ίσες συγκεντρώσεις πρωτεΐνης εκτιμήθηκαν με δοκιμασία Bradford (BioRad) και ίσες ποσότητες αξιολογήθηκαν για ανάλυση western blot με CXCR4-IgG2B μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού ή 1 mg υπερκείμενο ανοσοκαταβυθίστηκε (ΙΡ) με CXCR4-IgG2B μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού ή φιμπρονεκτίνη IgG2B μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C (Santa Cruz? 1 μα ανά 250 μα πρωτεΐνης), που ακολουθείται από επώαση με σφαιρίδια /G Plus-Agarose Protein Α για 2 ώρες στους 4 ° C. σφαιρίδια αγαρόζης πρωτεΐνης-δεσμευμένη διαχωρίστηκαν από κυτταρολύματα με μια σειρά από 3 πλύσεις με 1 χ PBS και (θερμοκρασία μέγιστη ταχύτητα /2 min /δωμάτιο [RT]) φυγοκέντρηση. Χάντρες σε ρυθμιστικό Lammelli διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε πολυβινυλιδενοφθορίδιο (PVDF) και μεμβράνες ανιχνεύθηκαν για CXCR4-IgG2B (1:1000). Για να επιβεβαιωθεί ότι τα κύτταρα PC3 εκφράζεται Fibronectin, 25 μg του προϊόντος λύσης ολικού κυττάρου συλλέχθηκε για ανάλυση στυπώματος western. Βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

ανοσοϊστοχημεία (IHC)

ανάλυση

IHC διεξήχθη σε μια ασθένεια του προστάτη συστοιχίας ιστού φάσμα (Biomax) κυμαινόμενη από φυσιολογική έως υψηλού βαθμού μεταστατικό ιστούς. Η συστοιχία αποτελείτο από 80 συνολικών πυρήνων ιστού που περιλαμβάνει αδενοκαρκίνωμα, μεταστατικό, υπερπλασία, χρόνια φλεγμονή, παρακείμενο φυσιολογικό ιστό και φυσιολογικό ιστό. Κάθε επιμέρους πυρήνας είχε διάμετρο 1,5 mm και ένα πάχος 0,5 μm. Εν συντομία, στερεωμένοι με φορμαλίνη, τα δείγματα εγκλεισμένα σε παραφίνη ανακτήθηκαν σε πλύσεις ξυλόλιο, αιθανόλη, και διάλυμα ανάκτησης αντιγόνου, ρΗ 6,0, (Biocare Medical) στους 125 ° C για 30 sec. Τα δείγματα εξουδετερώθηκαν σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,3% για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT), πλύθηκε με 1 χ PBS σε υγροποιημένο θάλαμο και αποκλείστηκαν με διάλυμα αποκλεισμού (5% φυσιολογικό ορό κατσίκας /Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα /Tween-20? TBST) για 30 λεπτά. CXCR4 ανιχνεύθηκε με ένα αντι-ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού CXCR4 (R &? D Systems? 1:1000) σε διάλυμα αποκλεισμού επί μία νύκτα στους 4 ° C, που ακολουθείται από ένα βιοτινυλιωμένο καθαρισμένη με συγγένεια κατσίκας αντι-ποντικού IgG (H + L) δευτερεύον αντίσωμα ( Vector Laboratories? 1:1000), σε διάλυμα αποκλεισμού για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα πλύθηκαν διεξοδικά μεταξύ επωάσεων, που αναπτύχθηκε σε διαμινοβενζιδίνη (Vector Laboratories) για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και με αιματοξυλίνη του Meyer χρησιμοποιώντας πρότυπες τεχνικές. Ένα αρνητικό δείγμα ιστού έλεγχος παρασκευάστηκε με επώαση σε βιοτινυλιωμένο συγγένεια καθαρισμένο κατσίκα αντι-ποντικού IgG (Η + L) αντίσωμα, μόνο, όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα δείγματα αναλύθηκαν και φωτογραφήθηκαν από τον Δρ Dezhi Wang [71] στο Κέντρο Μεταβολικών Νοσημάτων των Οστών κεντρικό εργαστήριο, UAB της Ιατρικής Σχολής του Μπέρμιγχαμ, Αλαμπάμα. Η κατανομή των θετικών κυττάρων για CXCR4 καταγράφηκε να απεικονίσουν την διάχυτη ή εστιακή φύση των θετικών κυττάρων ως σποραδικές (θετικά κύτταρα & lt? 5%)? εστίασης (θετικά κύτταρα & gt? 11% αλλά λιγότερο από 50%)? ή διάχυτη (θετικά κύτταρα & gt? 50%). σύμφωνα με τη μέση πυκνότητα των θετικών κυττάρων για το CXCR4 (DAB βάφονται), για να δείτε την προφανή διαφορά στη δύναμη της έκφρασης CXCR4

Histomophometry Μέτρηση της χρώσης Ένταση για CXCR4 στην Καρκίνος του προστάτη Οι ιστοί

Η μέση πυκνότητα των θετικών κυττάρων (DAB βάφονται) μετρήθηκε με τη χρήση Bioquant® Εικόνα Λογισμικό Ανάλυσης (RtmBometrics) και ένα Όλυμπο BX51 μικροσκόπιο με μια φωτογραφική μηχανή Q-απεικόνισης. Το λογισμικό που αναλύθηκαν κατά μέσο όρο ομάδα πίξελ και επέστρεψε μία τιμή δεδομένων με βάση την αξία χρώμα των εικονοστοιχείων σε χρωματισμένο δείγματα. Τρία τυχαία πεδία των ιστών του προστάτη επιλέχθηκαν σε μεγέθυνση (400Χ) για κάθε τμήμα με βάση το μέγεθος του ιστού. Σε κάθε τυχαία περιοχή, αυτά τα κύτταρα (μια ομάδα pixel) που βάφτηκαν θετικά (καφέ) με το αντίσωμα CXCR4 επιλέχθηκαν από το εργαλείο κατωφλίου του λογισμικού. Η πηγή φωτός δείγμα είναι γνωστό ότι επηρεάζει τη μέτρηση της πυκνότητας? Ως εκ τούτου, όλα τα τμήματα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας την ίδια διόρθωση υποβάθρου που παρέχεται από Bioquant.

Υποκυτταρική κλασματοποίηση

ΠΑΠ και φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα προστάτη (1 × 10

6) έχουν τον ορό επί 3 hrs (22RV1 και RWPE1) ή 24 ώρες (PC3 και DU145), πριν από την κατεργασία με SDF1α (100 ng /μl) για 30 λεπτά. Υποκυτταρική κλασματοποιήσεις εκτελέσθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Thermo Scientific). Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν σε μια σειρά ρυθμιστικών διαλυμάτων και τα βήματα φυγοκέντρηση για να ληφθεί ένα μη-πυρηνικό κλάσμα και ένα άθικτο πυρηνικό σφαιρίδιο, που ακολουθείται από περαιτέρω λύσεως για την απομόνωση πυρηνικές πρωτεΐνες. Σαράντα έως εκατό μικρογραμμάρια των πυρηνικών και μη πυρηνικών κλάσματα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Η έκφραση της CXCR4 ή πρωτεΐνη σύντηξης GFP-CXCR4 ανιχνεύθηκε με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού GFP (Santa Cruz? 1:500) ή αντι-ανθρώπινο αντίσωμα CXCR4 (R &? D Systems? 1:1000). Anti-τοποϊσομεράση Ι (Santa Cruz? 1:1000) και αντι-CD44? Χρησιμοποιήθηκαν (Cell Signaling 1:1000) αντισωμάτων για την εξασφάλιση της ακεραιότητας των κλασμάτων και ως μάρτυρες φόρτωσης. φιλμ ακτίνων Χ σαρώθηκαν και Ποσότητα Ένα πρόγραμμα λογισμικού που χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση πυκνομετρίας.

Έμμεση Ανοσοκυτοχημεία (ΔΠΔ) για την CXCR4

Cells (3 × 10

5) απλώθηκαν σε γυάλινο καλυπτρίδες (Fisher), στέρηση ορού, όπως περιγράφεται, πριν τις θεραπείες με SDF1α (100 ng /μl). Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με παγωμένη 100% μεθανόλη για 5 λεπτά στους -20 ° C και πλύθηκαν με 1 χ PBS. Μη ειδικές πρωτεΐνες αποκλείστηκαν με διάλυμα αποκλεισμού (3% φυσιολογικό γάιδαρος ορό /1% BSA /0,1% Triton Χ-100 σε 1 × PBS) για 30 λεπτά σε RT, πριν να επώαση με CXCR4 (R &? D Systems, 1: 100), Lamin A /C (Santa Cruz, 1:100), ή μονοκλωνικό αντίσωμα GFP ποντικού (Santa Cruz, 1:100) σε διάλυμα αποκλεισμού στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Δευτερογενής ανίχνευσης ήταν με Cy3-συζευγμένο γαϊδάρου αντι-ποντικού IgG ή FITC συζευγμένο αντι-κουνελιού IgG (Jackson Immuno Research, 1:1000) σε διάλυμα αποκλεισμού σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, που ακολουθείται από τρεις εκπλύσεις σε 1 χ PBS. Σε ορισμένες περιπτώσεις, οι πυρήνες ανιχνεύτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (1 μg /μΙ) ή ϋΑΡΙ (1:250) σε 1 χ PBS πριν από την τοποθέτηση σε Aqua-Polymount (Polyscience, Inc). Εικόνες ελήφθησαν στο Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA με 63x /1.40 Στόχος 63x Plan-Αχρωματικός Oil DIC σε ένα Zeiss LSM-510 UV Ομοεστιακή μικροσκόπιο σε διέγερση 488 nm για FITC και 543 nm για Cy3 ή σε Clark Atlanta University, Atlanta, GA με το λογισμικό Axiovision 4.8.2 σε ένα μικροσκόπιο φθορισμού Zeiss Axio Imager.z1 σε μεγέθυνση 40 φορές σε διέγερση 470 nm για FITC, 358 nm για DAPI και 551 nm για Cy3.

Μεταλλαξιογένεση

R146A και σημειακές μεταλλάξεις R148A εντός της NLS, και διαγραφή της NLS, εντός πρωτεΐνη σύντηξης GFP-CXCR4 παράχθηκαν χρησιμοποιώντας το Quik Αλλαγή XL τοπο-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)? pEGFPN1-CXCR4 χρησίμευσε ως το εκμαγείο [72]. Τα εμπρός και όπισθεν εκκινητές R146A, R148A και τα διαγράφονται NLS ήταν (DNA Ολοκληρωμένες τεχνολογίες): (i) R146A: FWD5′-CACGCCACCAACAGTCAGGCACCAAGGAAGCTGTTGGCTG-3 ‘, 5′-REV CAGCCAACAGCTTCCTTGGTGCCTGACTGTTGGTGGCGTG-3′? (Ii) R148A: FWD5`-CCAACAGTCAGAGGCCAGCGAAGCTGTTGGCTGAAA-3`, REV 5`-TTTCAGCCAACAGCTTCGCTGGCCTCTGACTGTTGG-3`? και (iii) NLS διαγραφή: FWD5’-CGCCACCAACAGTCAGCTGTTGGCTGAAAAGG-3 ‘και REV5′-CCTTTTCAGCCAACAGCTGACTGTTGGTGGCG-3’. Τα προκύπτοντα πλασμίδια ήταν pEGFPN1-CXCR4R146A, pEGFPN1-CXCR4R148A και pEGFPN1-CXCR4ΔNLS. Θετική CXCR4 μεταλλαγμένο κλώνοι επιλέχθηκαν με καναμυκίνη και περαιτέρω καθαρίζεται με maxi-prep (Bio-Omega tek). Ακρίβεια των μεταλλάξεων επιβεβαιώθηκε με ανάλυση της αλληλουχίας του DNA σε ένα ΑΒΙ 3130 XL Gene Analyzer Sequencer σε Μόρχαουζ της Ιατρικής Σχολής, Atlanta, GA.

παροδικές επιμολύνσεις

Παροδικές επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με 2 μg συμπυκνωμένου DNA και jetPRIME® πολύποδας επιμόλυνση, σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Εν συντομία, τα κύτταρα PC3 επωάσθηκαν με σύμπλοκα jetPRIME®-DNA σε 15% FBS /RPMI για 4 ώρες και το μέσο αντικαταστάθηκε με 15% FBS σε μέσο RPMI για επιπλέον 18 ώρες, πριν από την ασιτία ορού (24 ώρες). Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν για τις αντίστοιχες πειράματα.

Έκφραση Transportinβ1 (TRN1)

άνευ ορού κύτταρα (5 × 10

6) υποβλήθηκαν σε αγωγή με SDF1α για 30 λεπτά πριν από τη συλλογή 60 μα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου για ανάλυση στυπώματος western. Η έκφραση του TRN1 ανιχνεύθηκε με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Santa Cruz? 1:1000)? α-τουμπουλίνης ή β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης

Ανοσοκαταβύθιση

Ένα χιλιοστόγραμμο του PC3 ολόκληρο κυτταρολύματα ανοσοκαταβυθίστηκαν για CXCR4. (Santa Cruz? 1 μα ανά 250 μα πρωτεΐνης) όλη τη νύκτα στους 4 ° C, που ακολουθείται από επώαση με σφαιρίδια Protein Α /G Plus-αγαρόζης (Santa Cruz) για 2 ώρες στους 4 ° C. σφαιρίδια αγαρόζης CXCR4-δεσμευμένο διαχωρίστηκαν από λύμα από μια σειρά από 3 πλύσεις με PBS και φυγοκέντρηση σε μέγιστη ταχύτητα για 1 λεπτό στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια υποβάλλονται σε επεξεργασία για ανάλυση κηλίδος western για TRN1 (Santa Cruz? 1:1000) και ακολούθως ξαναϊχνηθετούνται για CXCR4 με αντίσωμα κουνελιού αντι-CXCR4 (Santa Cruz, 1:500) που ακολουθείται από επώαση με IgG αντι-κουνελιού ποντικού (κυτταρική σηματοδότηση) δευτεροβάθμια αντίσωμα. Τριάντα μικρογραμμάρια του υπερκειμένου που λαμβάνεται μετά από επώαση με σφαιρίδια αγαρόζης επίσης διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE, και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ανάλυση στυπώματος western για CXCR4, όπως περιγράφεται στο χαρακτηρισμό του CXCR4 αντισώματος.

σύντομης παρεμβολής RNA Επιμόλυνση

Παροδική επιμόλυνση TRN1 ειδικών siRNA (Santa Cruz) πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα PC3 επιστρώθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες χρησιμοποιώντας JetPRIME®. Εν συντομία, τα κύτταρα (2 χ 10

5) τοποθετήθηκαν σε 35 mm, 6 πιάτα φρεατίων και επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ TRN1-siRNA (Santa Cruz) σε 15% FBS /RPMI media στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα επιμολυσμένα κύτταρα ήταν άνευ ορού για 24 ώρες, πριν από την ανάλυση ανοσοκυτταροχημεία.

Ανοσοκαταβύθιση G

αi

κύτταρα στερούνται ορού (5 × 10

6) ήσαν κατεργάζεται με SDF1α για 30 λεπτά πριν από τη συγκομιδή για ανοσοκαθίζηση. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν σε 1 χ PBS και απαλά αποξέστηκαν σε ΝΡ-40 ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (1 χ PBS ρΗ 7.4, 0.1% Triton Χ 100, 0.1% ΝΡ40 και 1 × αναστολέα κοκτέιλ). Μετά από 30 λεπτά επώαση επί πάγου, το προϊόν λύσης φυγοκεντρήθηκε στα 600 RCF /5 λεπτά /4 ° C). Το υπερκείμενο μεταγγίσθηκε απαλά, και το πυρηνικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, 10 φορές τον όγκο του σφαιριδίου πυρήνων, και υφίσταται κατεργασία με υπερήχους επί πάγου επί 3 δευτερόλεπτα. Το προϊόν λύσης φυγοκεντρήθηκε στα 600 RCF /5 λεπτά /4 ° C, και 1 mg υπερκείμενο ανοσοκαταβυθίστηκε για CXCR4 (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, Santa Cruz) όλη τη νύκτα στους 4 ° C, που ακολουθείται από επώαση με /G Plus-αγαρόζης πρωτεΐνης Α ( Santa Cruz) για 2 ώρες στους 4 ° C. σφαιρίδια αγαρόζης CXCR4 δεσμευμένα διαχωρίστηκαν από λύμα από μια σειρά από 3 πλύσεις με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ΝΡ40 και φυγοκέντρηση (5000 pm /2 min /RT). Η τελική πλύση ήταν με 1 χ PBS. Χάντρες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση Western blot και μεμβράνες ανιχνεύτηκαν για G

αi (Cell Signaling? 1:1000). Στη συνέχεια, οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν και πάλι για CXCR4 με αντίσωμα κουνελιού αντι-CXCR4 (Santa Cruz, 1:500) που ακολουθείται από επώαση με IgG αντι-κουνελιού ποντικού (Cell Signaling) δευτερογενές αντίσωμα. Topoisomerase1 (Santa Cruz) και αντι-CD44 (Cell Signaling) χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της καθαρότητας των πυρήνων λύματα.

intranuclear ασβεστίου (Ca

2+) Κινητοποίηση

Ο ορός-πεινασμένο PC3 κύτταρα (2.5 × 10

5) συλλέχθηκαν για να ληφθούν ανέπαφα πυρήνες σε ΝΡ-40 ρυθμιστικό λύσης όπως περιγράφεται παραπάνω, πριν από την διεξαγωγή δοκιμασίας σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Enzo Life Sciences). Εν συντομία, ακατέργαστα απομονωμένα πυρήνες επαναιωρήθηκαν σε 100 μΐ διαλύματος FluoForte χρωστικής φόρτωσης (Enzo Life Sciences) για 45 λεπτά στους 37 ° C και 15 λεπτά σε RT, στη συνέχεια, φυγοκεντρείται στα 600 RCF /5 λεπτά /RT. Διαλύματα AMD3100 (100 ng /μl) και τοξίνη κοκκύτη (ΡΤΧ) (200 ng /ml) παρασκευάσθηκαν σε ασβέστιο ελεύθερο, φαινόλη δωρεάν RPMI. δείγματα Πυρήνες επαναιωρήθηκαν σε 100 μΐ AMD3100 και ΡΤΧ, κλασματοποιήθηκαν σε πλάκες με μαύρα τοιχώματα, διαυγούς πυθμένος 96 φρεατίων και επωάστηκαν για 1 ώρα. Στη συνέχεια, το SDF1α προστέθηκε σε δείγματα σε πλάκες, (τελική αραίωση 100 ng /μl) και επωάζεται για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Intranuclear κινητοποίηση του ασβεστίου προσδιορίστηκε από την ένταση (αύξηση) του φθορισμού (FluoForte) το δεσμευμένο Ca

2+ στα μέσα μαζικής ενημέρωσης. Τα αποτελέσματα μετρήθηκαν σε αναγνώστη μικροπλάκας σε διέγερση 490 nm και εκπομπή 525 nm. Κάθε δείγμα παρασκευάστηκε εις τριπλούν ανά πείραμα, και εκτελούνται τουλάχιστον τρεις φορές.

Στατιστική Ανάλυση

Ανάλογα με την περίπτωση, τα δεδομένα αναλύθηκαν με t-test μια αξιόπιστη μαθητή ή ANOVA χρησιμοποιώντας GraphPad Prism (GraphPad ) του λογισμικού. Οι τιμές Ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

Αποτελέσματα

CXCR4 εκφράζεται σε πυρήνα των ιστών του προστάτη

Προηγούμενη ανάλυση του πεδίου του CXCR4 πρότεινε ότι CXCR4 περιέχει ένα πυρηνικό σήμα στόχευσης μεταξύ των αμινοξέων 90-170 [73]. Μια ανάλυση βιοπληροφορικής χρησιμοποιώντας το λογισμικό NLS πρόβλεψης PSORT II (https://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/) αποκάλυψε μία υποθετική αλληλουχία πυρηνικού εντοπισμού, «RPRK ‘[72], [74], [75], [76] μεταξύ των αμινοξέων 146-149 μέσα CXCR4 (Πίνακας 1). Επιπλέον, ένα HomoloGene /NCBI αναζήτησης βάσης δεδομένων για την NLS μέσα CXCR4 αποκάλυψε ότι «RPRK» γίνεται έχουν συντηρημένη μεταξύ των ειδών, συμπεριλαμβανομένων των κοτόπουλο, ποντίκι, χιμπαντζή και άλλοι (Πίνακας 2). Επιπλέον, CXCR4 έχει ανιχνευθεί στον πυρήνα πολλών ιστών του καρκίνου [68], [70]. Με βάση αυτά τα δεδομένα, ελέγξαμε εάν CXCR4 πρωτεΐνη μπορούσε να ανιχνευθεί εντός του πυρήνα των ιστών του προστάτη. Χρησιμοποιώντας μια μικροσυστοιχία προστατικό ιστό κυμαινόμενη από φυσιολογική έως υψηλού βαθμού μεταστατικών βλαβών, ανιχνεύσαμε θετικό ανοσοαντιδραστικότητα για CXCR4 σε δείγματα προστάτη. Θετική ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε ως σποραδική (CXCR4 θετικά κύτταρα & lt? 5%), εστιακή (CXCR4 θετικά κύτταρα & gt? 11%, αλλά λιγότερο από 50%), ή διάχυτη (θετικά κύτταρα CXCR4 & gt? 50%), σε σύγκριση με το μέσο όρο της συνολικής πυκνότητα των θετικών κυττάρων για CXCR4 (DAB βάφονται). Δείγματα με ανοσοϊστοχημική βαθμολογίες των αρνητικών, αδύναμη ή μέτρια χρώση, με σποραδικές να εστιακή διανομές, θεωρήθηκαν ότι έχουν «χαμηλή» έκφραση, ενώ διάχυτη κατανομή της χρώσης θεωρήθηκαν ότι έχουν «υψηλή» έκφραση για το CXCR4. Ένταση χρώσης ήταν σποραδική εστιακής στον πυρήνα των ιστών του προστάτη χαμηλού βαθμού (Εικ. 1Α), ενώ υψηλού βαθμού κακοήθεις ιστούς (Εικ. 1Α), εμφανίζεται μια αυξημένη ένταση χρώσης και διάχυτη έκφραση του CXCR4 όλη ιστού σε σύγκριση με το χαμηλής ποιότητας. Σε αμφότερες τις όγκους χαμηλής και υψηλής ποιότητας, ένα κλάσμα του CXCR4 σαφώς συν-εντοπισμένη με τον πυρήνα. Ένταση χρώσης για CXCR4 ήταν αδύναμο, ή ακόμη και μηδενική, σε φυσιολογικούς ιστούς (Εικ. 1Α).

Μια

, μια σειρά ανθρώπινο ιστό του προστάτη, που κυμαίνονται από την κανονική σε καρκίνο του προστάτη υψηλής ποιότητας, αξιολογήθηκε με IHC για έκφραση CXCR4 χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους. Τα δείγματα αξιολογήθηκαν σε μεγέθυνση 40Χ, χρησιμοποιώντας μια κάμερα Q-Απεικόνιση του Ολύμπου BX51 Μικροσκόπιο με Bioquant® Εικόνα Λογισμικό Ανάλυσης (RtmBometrics). Φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη κατέδειξε ελαφρώς αδύναμη ή μη ανιχνεύσιμη καφέ χρώση για CXCR4 (θετικά κύτταρα & lt? 5%), και καμία έκφραση CXCR4 στον πυρήνα. Εκπρόσωπος χαμηλής ποιότητας προστατικό ιστό (βαθμός 2, στάδιο ΙΙ, Τ

2Ν

0M

0, αδενοκαρκίνωμα) έδειξε τυχαία /εστιακή θετική χρώση για CXCR4 στον πυρήνα (θετικά κύτταρα & gt? 11%, αλλά λιγότερο από ό, τι 50%), υποδεικνύοντας χαμηλή έκφραση του CXCR4. Εκπρόσωπος υψηλού βαθμού μεταστατικού προστατικού ιστού (βαθμός 4, στάδιο IV, Τ

4Ν

1Μ

1, αδενοκαρκίνωμα) έδειξε διάχυτη /έντονη χρώση (θετικά κύτταρα & gt? 50%), υποδεικνύοντας υψηλή έκφραση για CXCR4 στην πυρήνας. μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 50 μm.

B

, CXCR4 IgG2B μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αξιολογήθηκε για ειδικότητα προς CXCR4 πρωτεΐνη με ανάλυση Western blot σε κυτταρικές σειρές PC3 (CXCR4 θετικό) ή 293Τ (CXCR4 null).

C

, CXCR4 αντίσωμα αξιολογήθηκε για ειδικότητα προς CXCR4 πρωτεΐνης με ανοσοκαταβύθιση για CXCR4 και ανάλυση κηλίδας Western για CXCR4.

D

, CXCR4 IgG2B αντίσωμα αξιολογήθηκε για ειδικότητα προς CXCR4 πρωτεΐνης με ανοσοκαταβύθιση με ινονεκτίνη IgG2B μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (άσχετα έλεγχος ισοτύπου) και ανάλυση στυπώματος Western για CXCR4? έκφραση της φιμπρονεκτίνης πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με ανάλυση Western blot. Βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Η

Έχουμε αναφέρει ότι τα κύτταρα PC3 ήταν θετικά και τα κύτταρα 293Τ ήταν μηδενική, αντίστοιχα, για CXCR4 πρωτεΐνη [21]. Για να εξασφαλιστεί η ειδικότητα του μονοκλωνικού αντισώματος CXCR4 (MAB172IgG2b) χρησιμοποιούνται για να ανιχνεύσουν αντίστοιχη πρωτεΐνη του στον πυρήνα των ιστών του προστάτη, έχουμε εκ νέου αναλύθηκαν PC3 και 293Τ για CXCR4 με CXCR4 αντίσωμα (MAB172IgG2b) με ανάλυση κηλίδας Western (Εικ. 1Β). Παρόμοια με προηγούμενες μελέτες μας, CXCR4 ανιχνεύθηκε σε PC3, αλλά όχι σε 293Τ προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου (Εικ. 1Β). Η μετέπειτα ανάλυση των κυτταρολυμάτων με ανοσοκαταβύθιση με MAB172 IgG2b ακολουθούμενη από ανάλυση στυπώματος western με MAB172 IgG2b να ανιχνεύεται CXCR4 μόνο σε προϊόντα λύσης PC3 (Εικ. 1 C). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η ειδικότητα του MAB172IgG2b με το CXCR4, λύματα κυττάρων PC3 υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση με ινονεκτίνη IgG2b, ένα στοιχείο ελέγχου ισοτύπου, ακολουθούμενη από ανάλυση στυπώματος western με MAB172 IgG2b (Σχ. 1D). Φιμπρονεκτίνης δεν ανιχνεύθηκε από IP με CXCR4, αλλά εντοπίστηκε από κηλίδα western με ένα αντίσωμα Φιμπρονεκτίνης (Εικ. 1D).

CXCR4 είναι παρούσα στην Πυρηνική κλάσματα των κυττάρων του προστάτη Καρκίνος

Εμείς χρησιμοποιείται βιοχημική κλασματοποίησης για να επιβεβαιώσετε την πυρηνική εντόπιση του CXCR4 ανιχνεύθηκε σε κηλίδωση των ιστών μας. από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *, P & lt? 0,05. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (μπλε). Sun

et al

. Wang

et al

. Είμαστε επίσης ευγνώμονες για την Δρ.