Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα microRNAs ενεργεί ως μεταγραφικούς ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης σε πολλές βιολογικές διεργασίες. απορρυθμίσεις τους συμβαίνουν συχνά σε καρκίνο του στομάχου (GC). Αν και μεθυλίωσης του DNA αποτελεί ένα σημαντικό μηχανισμό για microRNA απορρύθμιση στον καρκίνο, αυτό το πεδίο παραμένει σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Το συνολικό RNA εξήχθη από τους ιστούς των 100 ασθενών με GC και τέσσερις γαστρική καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα επίπεδα έκφρασης του miR-10a προσδιορίστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου με ειδικούς ανιχνευτές TaqMan. Επιπλέον, διεξήχθη μια λειτουργική ανάλυση του miR-10a στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, τη μετανάστευση και εισβολή. Στη συνέχεια, η ποσοτική μεθυλίωση-ειδική PCR (qMSP) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της κατάστασης μεθυλίωσης του DNA στα νησιά CpG ανάντη του

miR-10a

. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η έκφραση του miR-10a στα κύτταρα GC ήταν χαμηλότερη από ότι στα φυσιολογικά κύτταρα, η οποία οφειλόταν στην υπερμεθυλίωση των CpG νησίδες ανάντη του

miR-10a

. Έχουμε επικυρωθεί επίσης την ελαφρώς χαμηλότερη έκφραση του miR-10a σε ιστούς GC από παρακείμενα μη νεοπλασματικών ιστών τους σε 100 ασθενείς GC και επιβεβαίωσε την υπερμεθυλίωση των CpG νησίδων ανάντη του

miR-10a

σε ορισμένους ασθενείς. Επιπλέον, η εκ νέου εισαγωγή του miR-10a σε κύτταρα GC ήταν ικανή να αναστείλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή. Βιοπληροφορική και ανάλυση ανοσοκηλίδας υπέδειξε ότι οι ρόλοι ογκοκατασταλτικό του miR-10a στα κύτταρα GC ήταν πιθανώς μέσω στόχευσης HOXA1.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι το miR-10a δρα ως καταστολέας των όγκων στα κύτταρα GC και εν μέρει σιγήσει DNA υπερμεθυλίωση στο GC, υποδηλώνοντας ότι το miR-10a μπορεί να χρησιμεύσει ως μια πιθανή διαγνωστική ή θεραπευτικό στόχο της GC

Παράθεση:. Jia η, Zhang Ζ, Ζου D, Wang Β, Yan Υ, Luo M, et al. (2014) microRNA-10α ρυθμίζεται προς τα κάτω από την μεθυλίωση του DNA και λειτουργεί ως ογκοκατασταλτικό σε κύτταρα γαστρικού καρκίνου. PLoS ONE 9 (1): e88057. doi: 10.1371 /journal.pone.0088057

Επιμέλεια: Jorg Tost, CEA – Institut de Genomique, Γαλλία

Ελήφθη: 26 Γενάρη του 2013? Αποδεκτές: 4 Ιαν 2014? Δημοσιεύθηκε: 31 Ιαν, 2014

Copyright: © 2014 Jia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (2011, 91129716, για να JY), το Πεκίνο Δημοτική Επιστήμης 2010PYB06, να J.Y .; 2012G04, να Ι.Υ.). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι η δεύτερη πιο συχνή αιτία θανάτου από καρκίνο στον κόσμο [1]. Μέχρι στιγμής, λίγοι ογκοκατασταλτικών γονιδίων και γονιδίων που σχετίζονται με όγκους έχουν αναφερθεί σε GC. Παρά το γεγονός ότι έχουν εκτεταμένες μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί για τον εντοπισμό γενετικών οδών και των μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου, έχουν μερικές βελτιώσεις για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου έχουν γίνει. Τα microRNAs (miRNAs) είναι ενδογενείς μικρά μη-κωδικοποίησης RNAs που έχουν προσδιοριστεί ως μεταγραφικούς ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι miRNAs ασκούν τα καθήκοντά τους με ατελή ζευγάρωμα βάσεων με την 3 ‘μη μεταφραζόμενη περιοχή (3’UTR) του στόχου mRNAs [2] και τα miRNAs μελετηθεί εκτενώς στο πλαίσιο της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου, διαφοροποίηση, ανάπτυξη και απόπτωση [3], [4]. Συσσωρευμένες στοιχεία δείχνουν ότι τα miRNAs απελευθερωθεί σε διάφορες ασθένειες, ιδιαίτερα στον καρκίνο. Για παράδειγμα, miR-216b είναι αισθητά κάτω-ρυθμίζονται σε ρινοφαρυγγικό καρκίνωμα [4]? miR-340 είναι απορυθμισμένη στον καρκίνο του μαστού και μπορεί να αναστείλει μαστού μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή [5]? και miR-31 ταυτοποιήθηκε ως ογκογονίδιο σε οισοφαγικό καρκίνωμα πλακώδους κυττάρου [6]. Στο σύνολό τους, έχουν miRNAs έχουν ταυτοποιηθεί ως πιθανοί υποψήφιοι για νέα διαγνωστική βιοδείκτες ή θεραπευτικοί στόχοι του καρκίνου.

MiR-10α έχει αναφερθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη γένεση και την ανάπτυξη μιας ποικιλίας ανθρώπινων καρκίνων. Για παράδειγμα, miR-10α απορυθμισμένη στο κεφάλι και το λαιμό καρκινώματα πλακωδών κυττάρων και επίσης σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [7], [8]. Περαιτέρω, στον ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, miR-10a χρησιμεύει ως ένα ογκογονίδιο ρυθμίζοντας CHL1 [9]? κάτω ρύθμιση του miR-10a σε χρόνια μυελογενή λευχαιμία προωθεί CD34

+ κύτταρα πολλαπλασιασμού [10]. Ωστόσο, η λειτουργία του miR-10a και ο μηχανισμός υποκείμενη γαστρική καρκινογένεση παραμένουν ασαφείς. Σε αυτή τη μελέτη, μετρήθηκε με ακρίβεια την έκφραση του miR-10a σε 100 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου και διερευνήθηκαν οι ρόλοι των miR-10a σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Βρήκαμε ότι το miR-10a ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε ιστούς GC και να εκτελεστεί η έκφραση του miR-10a καταπιεσμένη τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων του GC.

Επιγενετική τροποποιήσεις, συμπεριλαμβανομένων υπερμεθυλίωση του DNA, απακετυλίωση ιστόνης και ιστόνης μεθυλίωση είναι στενά που σχετίζονται με την απενεργοποίηση του γονιδίου. Ο υποστηρικτής υπερμεθυλίωση πιστεύεται ότι είναι έναν εναλλακτικό μηχανισμό για τη μειωτική ρύθμιση του όγκου γονίδια καταστολής σε ανθρώπινους καρκίνους [11]. MiRNAs του οποίου η έκφραση καταστέλλεται από μεθυλίωση του DNA έχουν αναφερθεί σε μερικές ανθρώπινους καρκίνους [12] – [14]. Για να διερευνηθεί περαιτέρω αν η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-10a προέρχεται από την υπερμεθυλίωση της γονιδιωματικής περιοχής ανοδικά του

miR-10a

, αναλύσαμε το DNA μεθυλίωση CpG νησίδα στην περιοχή προαγωγού του

ΜΙΚ 10α

σε 55 ασθενείς GC και βρέθηκε ότι τα κάτω ρύθμιση του miR-10a σε ιστούς GC μπορεί να οφείλεται στην υπερμεθυλίωση των αλληλουχιών CpG σε προαγωγέα.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και δείγματα

Ανθρώπινα κλινικά δείγματα συλλέχθηκαν από χειρουργικά δείγματα από 100 ασθενείς με GC στο Ινστιτούτο Καρκίνου και το νοσοκομείο, κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών, Γενικό Νοσοκομείο Απελευθερωτικού Λαϊκού Στρατού και Shanxi Αντικαρκινικό Νοσοκομείο. Οι αντίστοιχες παρακείμενες μη νεοπλασματικών ιστών από τη μακροσκοπική περιθώριο όγκου απομονώθηκε κατά τον ίδιο χρόνο και χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Οι όγκοι οργανώθηκαν σύμφωνα με το ΤΝΜ (2010) τα κριτήρια κατάταξης της Ένωσης για θέματα Διεθνούς Ελέγχου του Καρκίνου (UICC). Όλα τα δείγματα χωρίστηκαν σε δύο μέρη και αμέσως καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την εκχύλιση του RNA. Τέσσερις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 και ΜΚΝ-45) ήταν όλα διατηρούνται στο εργαστήριο μας και διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ ή 1640 με 10% FBS. Η Κλινική Έρευνα επιτροπή δεοντολογίας του Ινστιτούτου Βασικών Ιατρικών Επιστημών, Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών ενέκρινε τα ερευνητικά πρωτόκολλα και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τους συμμετέχοντες.

RNA Extraction, cDNA Σύνθεση mRNAs και miRNAs, και Σε πραγματικό time PCR Δοκιμασίες

Ολικό RNA εξήχθη από γαστρικό καρκινικούς ιστούς και τα κύτταρα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. RNA ποσοτικοποιήθηκε με απορρόφηση στα 260 nm και cDNA συντέθηκε από την M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (Invitrogen) από 2 μg ολικού RNA. Ολίγο (dT) 18 χρησιμοποιήθηκε ως εκκινητές RT για την αντίστροφη μεταγραφή του mRNA. Ένα στέλεχος-βρόχος RT εκκινητής χρησιμοποιήθηκε για την αντίστροφη μεταγραφή του miRNA. Ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα Bio-Rad CFX96 πραγματικού χρόνου PCR System (Bio-Rad, CA, USA) χρησιμοποιώντας SYBR Προμίγμα Εχ Taq kit (Takara, Dalian, Κίνα) ή TaqMan διερευνητές (Applied Biosystems, Foster City, CA , USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι συνθήκες PCR είχαν ως εξής: 95 ° C για 30 s, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 5 s και 60 ° C για 34 s. Για mRNAs, τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τον ενδογενή μάρτυρα GAPDH. Για miRNAs, U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε ως το ενδογενές ελέγχου. Η σχετική ποσότητα του miR-10a μετρήθηκε με τη μέθοδο -ΔΔCT 2

. Οι αλληλουχίες των εκκινητών παρουσιάζονται στον Πίνακα S1.

DNA Extraction, μεθυλίωσης-ειδική PCR (MSP) και Ποσοτική μεθυλίωσης-ειδική PCR (qMSP)

Υψηλή βάρος γονιδιακό DNA μοριακού εξήχθη από γαστρικό καρκινικούς ιστούς χρησιμοποιώντας ένα κιτ DNA Extraction (Biomed, BJ, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τροποποίηση όξινου θειώδους εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ αλληλούχισης Epitect Bisulfite (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο. Μέχρι 2 μg γενωμικού DNA χρησιμοποιήθηκε ως υλικό εκκίνησης. Κανονική DNA των λεμφοκυττάρων σε επεξεργασία με CpG μεθυλοτρανσφεράσης (M.SssI) (ΝΕΒ, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας, και ένα σύστημα αντίδρασης χωρίς εκμαγείο χρησιμοποιήθηκε ως τυφλός μάρτυρας.

Ο νάτριο bisulfate- αντιμετωπίζονται DNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας την Bio-Rad CFX96 πραγματικού χρόνου PCR System (Bio-Rad) με τη χρήση ΚΑΠΑ SYBR® Kits FAST qPCR (Κάπα Biosystems) με τις ακόλουθες συνθήκες: 95 ° C για 5 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 30 s, 54 ° C για 30 s και 72 ° C για 30 s και μία τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. qMSP αντιδράσεις εκτελέστηκαν εις τριπλούν. Το επίπεδο της μεθυλίωσης σε ένα δείγμα υπολογίστηκε ως Lu L et al. περιγράφεται [15]. Οι αλληλουχίες εκκινητών παρουσιάζονται στον Πίνακα S1.

5-Αζα-2′-deoxyazacytidine Θεραπεία

Γαστρικό καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν σε δίσκους των 10 cm (1 χ 10

6 κύτταρα ανά δίσκο) μία ημέρα πριν από φαρμακευτική αγωγή. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ 5-αζα-2′-deoxyazacytidine (5-ΑΖΑ) (Sigma, ΜΟ, USA) κάθε 24 ώρες για 3 ημέρες.

Κυτταροκαλλιέργεια και ολιγονουκλεοτίδια Μορφομετατροπή

Οι ανθρώπινες γαστρικού κυτταρικές σειρές HGC-27, SGC-7901 και ΜΚΝ-45 καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) μέσα συμπληρωμένα με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, και MGC-803 διατηρήθηκε σε DMEM (Gibco, BRL , UK) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Αυτές οι κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο αέρα που περιέχει 5% CO

2.

Το miR-10a μιμούνται, το σκαρφάλωμα μιμούνται, siHOXA1 siRNA και αγωνίζομαι siRNA συντέθηκαν από GenePharma (Σαγκάη, Κίνα ) και επιμολύνονται στα κύτταρα σε τελική συγκέντρωση των 50 nmol /L χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο DharmaFECT1 (Dharmacon, TX, USA).

κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της αποικίας Δοκιμασία σχηματισμού

οι mimic- ή siRNA- επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (5000 κύτταρα /φρεάτιο). Τα κύτταρα επωάστηκαν με 10% CCK-8 (Dojindo, Japan) στους 37 ° C μέχρις ότου έλαβε χώρα οπτική μετατροπή χρώματος. ρυθμούς πολλαπλασιασμού προσδιορίστηκαν σε 0, 12, 24, 48, 72, 96 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Οι μιμούνται-επιμολυσμένα κύτταρα σε επεξεργασία με θρυψίνη και ανακαλλιεργήθηκαν σε 200 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων και διατηρήθηκαν σε 1640 με 10% FBS. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 7 ημέρες, στερεώθηκαν με μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες σε 20% μεθανόλη για 15 λεπτά.

κυτταρικής απόπτωσης Δοκιμασία

Δοκιμασίες απόπτωσης διεξήχθησαν σε HGC-27 και κυτταρικές σειρές MGC-803 χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης αννεξίνης V-FITC απόπτωση Ι (BD Biosciences) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και μετά αναλύθηκαν με Calibur Κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson).

κυτταρική μετανάστευση και εισβολή Δοκιμασίες

Μια δοκιμασία επούλωση της πληγής διεξήχθη για να αξιολογηθεί η κυτταρική μετανάστευση. Μια τεχνητή πληγή δημιουργήθηκε σε συρροή μονοστιβάδα κυττάρων χωρίς FBS χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας 200 μλ 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Για την οπτικοποίηση μεταναστεύοντα κύτταρα και την επούλωση τραυμάτων, οι εικόνες λήφθηκαν σε 0, 12, 24, 36, 48, 60 ώρες.

Για τους προσδιορισμούς Transwell εισβολή, HGC-27 και κύτταρα MGC-803 αιωρήθηκε σε 0.2 ml RPMI 1640 ή ϋΜΕΜ χωρίς FBS τοποθετήθηκαν στην κορυφή του θαλάμου του κάθε ενθέτου (Millipore, ΜΑ, USA) προεπικαλυμμένα με 40 μΙ 1 mg /ml matrigel. Η κάτω θάλαμος γέμισε με 600 μΙ RPMI 1640 ή ϋΜΕΜ μέσο με 10% FBS ως διατροφική προσελκυστικό. 24 ώρες αργότερα, τα κύτταρα εισβολή που συνδέονται με την κάτω επιφάνεια μονιμοποιήθηκαν με 20% μεθανόλη και χρωματίσθηκαν με May-Gruwald-Giemsa (MGG). Οι μεμβράνες στη συνέχεια σκαλισμένα και τα ενσωματωμένα κάτω από καλυπτρίδες. Τα κύτταρα σε τρία διαφορετικά οπτικά πεδία μετρήθηκαν, και όλες οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Western Blotting

ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με πρότυπες μεθόδους. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεμβράνες PVDF (Amersham, Buckinghamshire, UK). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν για όλη τη νύχτα με 5% άπαχο ξηρό γάλα και επωάστηκαν για 2 ώρες με ένα αντι-HOXA1 αντίσωμα (Bioworld, ΜΝ, USA) σε 1:500 αραιώσεις ή αντι-GAPDH αντίσωμα (Proteintech, Chicago, USA) σε 1: 50000 αραιώσεις. Μετά από πλύση με TBST (10 mM Tris, ρΗ 8,0, 150 mM NaCl, και 0,1% Tween20), οι μεμβράνες επωάστηκαν για 2 ώρες με δευτερογενές αντίσωμα (zsgb-bio, Beijing, Κίνα).

Στατιστικά

Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. t test του φοιτητή (two-tailed) και το x

2 τεστ διεξήχθησαν, και η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως α = 0.05 (δύο-πλευρά). Τα μέσα ± SD εμφανίζεται στις εικόνες.

Αποτελέσματα

miR-10a ρυθμίζεται προς τα κάτω σε γαστρικός καρκίνος κύτταρα

Εξετάσαμε την έκφραση του ώριμου miR-10a σε τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 και ΜΚΝ-45) και ένα ανθρώπινο γαστρικό επιθήλιο κυτταρική γραμμή (GES). Το επίπεδο έκφρασης του miR-10a σε ΓΕΣ ήταν σημαντικά υψηλότερο από τα επίπεδα των δύο κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου (HGC-27 και MGC-803) και ήταν μη σημαντικά αλλά καταφανές υψηλότερα από τα επίπεδα των άλλων δύο κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου (ΜΚΝ-45 και SGC-7901) (Σχ. 1α). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-10a μπορεί να είναι σχετικές με τη γένεση και την ανάπτυξη του GC.

α Η έκφραση του miR-10a σε τέσσερις ανθρώπινα κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (HGC-27, MGC- 803, SGC-7901 και ΜΚΝ-45) και ένα ανθρώπινο γαστρικό επιθήλιο κυτταρική γραμμή (ΓΕΣ) ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου με ανιχνευτές TaqMan. β Η έκφραση του miR-10a σε 100 ζεύγη των ιστών GC σε σχέση με συμφωνημένα παρακείμενες μη νεοπλασματικών ιστών τους. c Η έκφραση του miR-10a στους ιστούς GC ήταν χαμηλότερη από ότι σε παρακείμενους ιστούς, αν και δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές. Ρ = 0,148, paired t-test, δίπλευρη. U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενή έλεγχο.

Η

Η έκφραση του miR-10a σε κλινικούς ασθενείς GC και η συσχέτισή τους με κλινικοπαθολογοανατομικές Χαρακτηριστικά

Για να μελετήσει περαιτέρω τη σχέση μεταξύ miR-10a και GC γένεση, ανιχνεύσαμε την έκφραση του miR-10a σε 100 κλινικές ασθενείς με TaqMan ανιχνευτή προερχόμενο PCR πραγματικού χρόνου όπως περιγράφεται παραπάνω. Από τα 100 ζεύγη δειγμάτων GC, η έκφραση του miR-10a ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε 58 περιπτώσεις (58/100, 58%) σε σύγκριση με τις αντίστοιχες γειτονικούς ιστούς (Σχ. 1β). Συνολικά, η έκφραση του miR-10a ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε ιστούς GC σε σχέση με τους γειτονικούς ιστούς, αν και η ρύθμιση προς τα κάτω δεν ήταν στατιστικά σημαντική (ρ = 0,148, paired t-test, two-tailed) (σχ. 1γ).

για να αξιολογηθεί η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-10a και τα κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά, οι ασθενείς χωρίστηκαν σε δύο ομάδες ανάλογα με τη σχετική έκφραση του miR-10a σε ιστούς του καρκίνου, σύμφωνα με μια προηγουμένως δημοσιευμένη εργασία [16] . Όπως φαίνεται στον Πίνακα S2, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ των δύο ομάδων ΤΝΜ. Υπάρχουν περισσότεροι ασθενείς που βρίσκονται σε φάση Ι + ΙΙ στην ομάδα με χαμηλότερη έκφραση του miR-10a σε ιστούς GC τους. Η σχέση αυτή έδειξε ότι το miR-10a μπορεί να είναι πιο σημαντική στις αρχές της καρκινογένεσης του καρκίνου. Ωστόσο, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι το επίπεδο έκφρασης του miR-10a είχαν καμία σχέση με την ηλικία, το φύλο, ιστολογικό τύπο, το ποσοστό του όγκου, φλεβική εισβολή, νεύρο εισβολή, θέση, Borrmann πληκτρολόγηση, το στάδιο Pt, βαθμίδα Ρη ή το στάδιο pM.

miR-10a αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

in vitro

η

Για να διερευνήσουν το ρόλο του miR-10a σε γαστρική καρκινογένεση, εμείς επιμολυσμένα miR-10a μιμούνται στις κυτταρικές GC γραμμές HGC-27 και MGC-803, δύο εκ των οποίων έδειξε υψηλή αποτελεσματικότητα μορφομετατροπής (σχ. 2α). Όπως αποδεικνύεται από CCK 8-δοκιμασίες ανάπτυξης 0, 1, 2, 3 και 4 ημέρες μετά τη μιμούνται την επιμόλυνση, η υπερέκφραση του miR-10a μειωμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, ενώ η μιμητικό σκαρφάλωμα δεν είχε καμία επίδραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 2β). Στη συνέχεια, προσδιορισμοί σχηματισμού αποικίας διεξήχθησαν για να αξιολογηθεί η πολλαπλασιαστική ικανότητα των μιμούνται-επιμολυσμένα HGC-27 και MGC-803 κύτταρα και αποκάλυψε ότι η υπερέκφραση του miR-10a σε HGC-27 κύτταρα μειωμένο σχηματισμό αποικίας (ΣΧ. 2c). Ωστόσο, κανένα από τα κύτταρα MGC-803 σχηματίζονται αποικίες, η οποία μπορεί να οφείλεται σε σχετικά χαμηλή προσκόλληση των κυττάρων. Για την περαιτέρω αντιμετώπιση της επίδρασης του miR-10a στην κυτταρική απόπτωση στις δύο κυτταρικές σειρές GC, η πρώιμη απόπτωση των MGC-803 και HGC-27 κυττάρων εξετάστηκε με χρώση Αηηβχίη V μετά miR-10a μιμούνται επιμόλυνση. Όπως ήταν αναμενόμενο, μερικά πρώτα αποπτωτικά κύτταρα (20,8% σε HGC-27 και 22,9% σε MGC-803) ανιχνεύθηκαν στις σκαρφάλωμα μιμούνται κατεργασμένα κύτταρα, ενώ κατεργασία μιμείται miR-10a αύξησε το ποσοστό των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων (28,4% σε HGC -27 και 27,7% σε MGC-803) (εικ. 2d). Συλλογικά, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το miR-10a θα μπορούσε να καταστείλει την επιβίωση των κυττάρων σε κύτταρα GC με επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης.

μια έκφραση του miR-10a σε HGC-27 και κύτταρα MGC-803 επιμολυσμένα με 50 nmol /L αγωνίζομαι ή ΜΙΚ 10α μιμούνται για 48 ώρες. β Growth δοκιμασίες με CCK-8 σε 0, 1, 2, 3, 4 ημέρες μετά την επιμόλυνση μιμούνται. δοκιμασία σχηματισμού γ αποικίας των μη επεξεργασμένων, αγωνίζομαι-επιμολυσμένα, και miR-10a-επιμολυσμένα HGC-27 κύτταρα. d MGC-803 και HGC-27 κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΕ Annexin V και 7-AAD 72 ώρες μετά την αγωγή με μιμείται miR-10a ή σκαρφάλωμα. Νωρίς τα αποπτωτικά κύτταρα εμφανίζονται στο κάτω δεξιά τεταρτημόριο. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. *, P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01, *** P & lt?. 0.001

Η

miR-10a Αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή

in vitro

Η

αξιολογηθεί περαιτέρω η επιδράσεις του miR-10a για τη μετανάστευση των κυττάρων και την εισβολή, οι οποίες ήταν οι βασικοί παράγοντες που καθορίζουν την κακοήθη εξέλιξη και μετάσταση. Η ικανότητα της μετανάστευσης αποδείχθηκε με δοκιμασία επούλωση τραυμάτων /το μηδέν σε HGC-27 και MGC-803 κύτταρα. Και οι δύο κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπεία με miR-10a μιμητικό ήταν αισθητά λιγότερο μεταναστευτικά από εκείνους που αντιμετωπίστηκαν με τον έλεγχο σκαρφάλωμα ή μη επεξεργασμένα κύτταρα σε 12, 24, και 36 ώρες μετά το ξύσιμο (σχ. 3α). Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία κυττάρων εισβολή Matrigel και χρωματίζονται τα εισέβαλαν κύτταρα για να μετρηθούν τα κατευθυντική ικανότητες εισβολή των κυττάρων μετά εκτοπικά εκφράζουν miR-10a στις δύο κυτταρικές σειρές. Η ικανότητα εισβολής των κυττάρων επιμολυσμένων με miR-10a μιμητικό ήταν δραματικά μειωμένη σε σύγκριση με τον έλεγχο σκαρφάλωμα και μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 3β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το miR-10a έπαιξε σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της μετανάστευσης των κυττάρων και εισβολής σε GC και πρότεινε ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-10a θα μπορούσε να συμβάλει στη μετάσταση των όγκων στο γαστρικό καρκινογένεση.

ένα HGC-27 και MGC -803 κύτταρα χωρίς θεραπεία ή επιμολυσμένα με 50 nmol /L σκαρφάλωμα ή miR-10a για 24 ώρες, και τραύματα έγιναν. Η σχετική αναλογία του κλεισίματος του τραύματος ανά πεδίο εμφανίζεται σε 0, 12, 24, 36, 48 ώρες. Bar, 500 μm. β HGC-27 και MGC-803 κύτταρα ήταν χωρίς θεραπεία ή επιμολυσμένα με 50 nmol /L σκαρφάλωμα ή miR-10a για 24 ώρες, και μια δοκιμασία transwell εισβολή πραγματοποιήθηκε. Η σχετική αναλογία των μεταστατικών κυττάρων ανά πεδίο εμφανίζεται. Bar, 50 μm και 100 μm. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. *, P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01, *** P & lt?. 0.001

Η

miR-10a Στόχοι HOXA1 σε GC

miRNAs προβαίνει σε βιολογικές λειτουργίες μέσω ρυθμίζουν αρνητικά γονίδια στόχους τους. Έχει αναφερθεί ότι το ογκογονίδιο HOXA1 είναι ένας άμεσος στόχος του miR-10a σε μεγακαρυοκυττάρων και ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου του [17] – [19]. Όπως προβλέπεται από PicTar, υπήρχε μια συμπληρωματική αλληλουχία μεταξύ έχει-miR-10a και HOXA1 3’UTR (σχ. 4α). Ωστόσο, είναι άγνωστο αν miR-10a ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή σε GC με στόχευση HOXA1. Να διευκρινίσει ρυθμιστικές σχέση τους, που εντοπίστηκε για πρώτη φορά την πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA των HOXA1 στο miR-10a μιμούνται-επιμολυσμένα HGC-27 και MGC-803 κύτταρα χρησιμοποιώντας Western και RT-PCR. Παρατηρήσαμε μια εμφανή μείωση στο επίπεδο πρωτεΐνης HOXA1 παρουσία μιμείται miR-10a σε σύγκριση με τον έλεγχο σκαρφάλωμα στα δύο κύτταρα (Σχ. 4β). Το επίπεδο του mRNA της HOXA1 επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω σε HGC-27 κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι miR-10a αναστέλλει την έκφραση HOXA1, υποβαθμίζοντας mRNA του HOXA1 σε HGC-27 κύτταρα. Ωστόσο, υπήρξε μικρή μεταβολή στο επίπεδο του mRNA της HOXA1 σε MGC-803 κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι miR-10a θα μπορούσε να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση HOXA1 μέσω μεταφραστικής καταστολής αλλά δεν mRNA διάσπασης σε MGC-803 κύτταρα (Σχ. 4c). Επιπλέον, αναλύσαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης του HOXA1 σε 24 ασθενείς GC. Μεταξύ αυτών των δειγμάτων, υπήρχαν 12 ασθενείς στους οποίους miR-10a ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε ιστούς GC τους και 12 ασθενείς στους οποίους miR-10a ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ιστούς GC τους (σχ. 4d). HOXA1 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε περισσότερους από τους ασθενείς στους οποίους miR-10a ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω στους ιστούς GC τους. Ομοίως, HOXA1 ήταν κάτω ρυθμισμένα στους περισσότερους από τους ασθενείς στους οποίους miR-10a ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ιστούς GC τους. Μια σύγκριση των επιπέδων miR-10a και τα επίπεδα της πρωτεΐνης του HOXA1 σε GC αποκάλυψε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του miR-10a και HOXA1 (r

2 = 0,1839, Ρ = 0,0366) (σχ. 4ε). Συλλογικά, τα ευρήματα αυτά παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι HOXA1 είναι ένας άμεσος στόχος του miR-10a σε GC. Διαπιστώσαμε επίσης το επίπεδο του mRNA του HOXA1 σε αυτούς τους ασθενείς και παρατήρησε ότι το επίπεδο mRNA του HOXA1 σε μερικούς ασθενείς δεν ήταν σύμφωνη με το επίπεδο πρωτεΐνης η οποία έδειξε ότι miR-10a ρυθμίζει την έκφραση του στόχου της, HOXA1, μέσω μεταφραστικής καταστολής αλλά όχι mRNA διάσπαση σε αυτούς τους ασθενείς (Σχ. S1).

α η πρόβλεψη της σύνδεσης μεταξύ των miR-10a και HOXA1 από Pictar. β έκφραση της πρωτεΐνης HOXA1 σε HGC-27 και MGC-803 κυττάρων επιμολυσμένα με μιμείται miR-10a. επίπεδο γ HOXA1 mRNA σε HGC-27 και MGC-803 κυττάρων επιμολυσμένα με μιμείται miR-10a. δ ανάλυση Western blot της πρωτεΐνης επίπεδο HOXA1 σε 24 ασθενείς GC. Το αριστερό πάνελ παρουσιάζει την έκφραση του HOXA1 σε 12 ασθενείς στους οποίους GC miR-10a ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε ιστούς GC τους (C) σε σύγκριση με τα αντίστοιχα γειτονικά μη νεοπλασματικά ιστούς (Ν). Το δεξί πάνελ παρουσιάζει την έκφραση του HOXA1 σε 12 ασθενείς στους οποίους GC miR-10a ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ιστούς GC τους (C) σε σύγκριση με τα μη-νεοπλασματικών ιστών (Ν). ε αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων της πρωτεΐνης HOXA1 και την έκφραση του miR-10a στα παραπάνω 24 ασθενείς GC.

Η

Νοκ-κάτω της HOXA1 Καταστολής του καρκίνου Γαστρικό ανάπτυξη των κυττάρων και Μετανάστευσης

in vitro

στη συνέχεια, ρωτήσαμε αν HOXA1 έπαιξε σημαντικό ρόλο στη γαστρική καρκινικά κύτταρα. Να εξετάσει το ρόλο των HOXA1 σε GC, έχουμε γκρέμισε ενδογενή HOXA1 σε κυτταρικές σειρές MGC-803 HGC-27 και για την ανίχνευση της επίδρασης επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των κυττάρων. Παρατηρήσαμε ότι HOXA1 καταστολή ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και μετανάστευση των HGC-27 και MGC-803 κύτταρα, αντίστοιχα (Σχ. 5α και 5β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι miR-10a λειτουργεί ως καταστολέας όγκων σε κύτταρα GC καταστέλλοντας την έκφραση HOXA1.

αύξηση δοκιμασίες με CCK-8 σε 0, 1, 2, 3, 4 ημέρες μετά την επιμόλυνση siHOXA1. β HGC-27 και MGC-803 κύτταρα ήταν χωρίς θεραπεία ή επιμολυσμένα με siHOXA1 ή έλεγχο για 24 ώρες, και τραύματα έγιναν. Η σχετική αναλογία του κλεισίματος του τραύματος ανά πεδίο εμφανίζεται σε 0, 12, 24, 36 ώρες. Bar, 500 μm. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. *, P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01, *** P & lt?. 0.001

Η

miR-10a είναι επιγενετικώς Σίγαση στο GC Γραμμές κυττάρων

Για να διευκρινιστεί αν η χαμηλή έκφραση του miR-10a σε GC ιστού ήταν αποτέλεσμα της epigenetical αλλαγές, θα αντιμετωπίζονται HGC-27, MGC-803, ΓΓΕ-7901 και ΜΚΝ-45 κύτταρα με έναν αναστολέα μεθυλίωσης του DNA 5-ΑΖΑ. Η έκφραση του miR-10a ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε HGC-27, SGC-7901 και ΜΚΝ-45 κύτταρα όταν υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΑΖΑ, υποδηλώνοντας ότι η έκφραση του miR-10a θα μπορούσε να κατασταλεί σε αυτά τα κύτταρα με DNA μεθυλίωση (ΣΧ. 6α).

επικύρωση της έκφρασης του miR-10a σε HGC-27, MGC-803, ΓΓΕ-7901 και κυτταρικές σειρές ΜΚΝ-45 που έλαβαν θεραπεία με 5-ΑΖΑ. β Η γονιδιωματική δομή του

miR-10a

και τη γύρω περιοχή. Το νησί CpG βρίσκεται στο 1,6 kb ανάντη του

miR-10a

. Κάθετη τσιμπούρια αντιπροσωπεύουν θέσεις CpG. γ qMSP ανάλυση του επιπέδου μεθυλίωσης του

miR-10a

περιοχή γονιδιώματος σε κυτταρικές σειρές GC και μετά τη θεραπεία 5-ΑΖΑ. δ Το επίπεδο της μεθυλίωσης του

miR-10a

περιοχή γονιδιώματος σε ιστούς GC (καρκίνος) ήταν υψηλότερη από ό, τι ταιριάζει παρακείμενες μη νεοπλασματικών ιστών τους (κανονική) σε 55 ασθενείς με GC. e Η αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης miR-10a και την κατάσταση μεθυλίωσης της γονιδιωματικής περιοχής miR-10a στα 55 ασθενείς ερευνήθηκαν GC. f Το επίπεδο της μεθυλίωσης της γονιδιωματικής περιοχής miR-10a σε GES, HGC-27 και MGC-803 κύτταρα. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. *, P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01, *** P & lt?. 0.001

Η

Για να μελετηθεί η ρύθμιση των miR-10a με μεθυλίωση του DNA, ψάξαμε τη βάση δεδομένων του ανθρώπινου γονιδιώματος για την παρουσία των CpG νησίδων γύρω από το miR -10a χρησιμοποιώντας το λογισμικό «CpG νησί Searcher» και προσδιόρισε νησί CpG βρίσκεται 1638 bp ανοδικά του

miR-10a

(Σχ. 6β). Περαιτέρω, ανιχνεύσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA με τη χρήση qMSP και MSP στις τέσσερις κυτταρικές GC γραμμές. Το νησί CpG ήταν υπερμεθυλίωση σε τέσσερις GC κυτταρικές γραμμές, οι οποίες ήταν σύμφωνο με τη χαμηλή έκφραση του miR-10a σε αυτές τις κυτταρικές σειρές GC. Όταν οι γραμμές κυττάρων GC έλαβαν θεραπεία με 5-αζα-CdR, το επίπεδο μεθυλίωσης μειώθηκε σε σύγκριση με την ομάδα DMSO (Σχ. 6c).

Η προς τα κάτω ρύθμιση του miR-10a σε GC ασθενείς οφειλόταν σε η υπερμεθυλίωση των CpG νησίδων της

Εξετάσαμε περαιτέρω την κατάσταση μεθυλίωσης του νησιού CpG στον ιστό GC και το παρακείμενο φυσιολογικό ιστό του 55 τυχαία επιλεγμένες περιπτώσεις μέσω qMSP. Το επίπεδο μεθυλίωσης στους 55 ιστούς GC ήταν υψηλότερη από ότι στα γειτονικά μη-καρκινικούς ιστούς (ρ & lt? 0,01), το οποίο ήταν σύμφωνο με τη χαμηλή έκφραση του miR-10a σε ιστούς GC (ΣΧΗΜΑ 6d.). Επιπλέον, επιλέξαμε τυχαία δύο ζεύγη δειγμάτων για την ανάλυση του επιπέδου μεθυλίωσης του DNA με όξινο θειικό αλληλουχίας PCR (BSP) για την επικύρωση της ακρίβειας του ΘΧΣ. Τα αποτελέσματα της BSP ήταν συνεπής με εκείνη του qMSP και συμπληρώθηκαν ως ΣΧ. S2. Επιπλέον, το επίπεδο μεθυλίωσης του miR-10a (Μ /Μ + U) σε αυτούς τους ασθενείς GC εμφάνισε μια αντίστροφη συσχέτιση με την έκφραση του miR-10a (r

2 = 0,1956, Ρ = 0,0006) (εικ. 6ε). Διαπιστώσαμε επίσης το επίπεδο μεθυλίωσης του miR-10a σε φυσιολογικά γαστρικά κύτταρα και κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Τα αποτελέσματα της qMSP αποκάλυψε ότι το νησί CpG ήταν μερικώς μεθυλιωμένα στα κύτταρα GES αλλά εξαιρετικά υπερμεθυλιωμένων στις δύο κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου HGC-27 και MGC-803, το οποίο πρότεινε, επίσης, ότι το νησί CpG ανάντη του

miR-10a

ήταν υπερμεθυλίωση στα κύτταρα GC (σχ. 6f). Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα παρέχουν ισχυρή ένδειξη ότι η έκφραση του miR-10a ρυθμιζόταν από μεθυλίωση του DNA σε αυτούς τους ασθενείς GC. Η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-10a σε ασθενείς GC οφειλόταν στην υπερμεθυλίωση των CpG νησίδων του.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το miR-10a ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο οφείλεται εν μέρει σε υπερμεθυλίωση προαγωγέα DNA του. Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι η υπερέκφραση του miR-10a κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη μετανάστευση και εισβολής στις κυτταρικές GC γραμμές HGC-27 και MGC-803, πιθανώς μέσω στόχο την HOXA1 ογκογονίδιο.

έχουν miRNAs έχουν αναφερθεί για τη ρύθμιση των διαφόρων αναπτυξιακών και κυτταρικών διεργασιών, και εμπλέκονται σε πολλές ανθρώπινες ασθένειες, ειδικά στον καρκίνο. MiRNAs καταστέλλουν τη γονιδιακή έκφραση με στόχευση mRNAs μέσω σύνδεσης προς 3 ‘UTRs τους. Αυτά τα miRNAs παρουσιάζουν ρυθμιστικούς ρόλους στην παθογένεση του καρκίνου και εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση, τη μετάσταση και την αντίσταση [4], [20]. MiR-10α παίζει ένα σημαντικό ρόλο σε διάφορες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του ηπατοκυτταρικό καρκίνο [9], του καρκίνου του παγκρέατος [17], οξεία μυελοειδή λευχαιμία [21] και της χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας [10]. Η ανώμαλη έκφραση του miR-10a είναι πιθανό να διαδραματίσει έναν κρίσιμο ρόλο στη κακοήθη μετασχηματισμό και είναι σχετική με ιστο-ειδικότητα. απορρύθμιση της μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη της νεοπλασίας του στομάχου.

Η επικύρωση της έκφρασης του miR-10a σε κλινικά δείγματα έδειξαν ότι το miR-10a ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε 58 (58/100, 58%) σε ιστούς GC σε σύγκριση με παρακείμενους ιστούς. Ωστόσο, Weidong Chen

et al.

Διερευνήθηκε η έκφραση του miR-10a σε 33 περιπτώσεις GC και παρατήρησε ότι η έκφραση miR-10a ήταν υψηλότερη σε ιστούς GC σε σχέση με τα γειτονικά τους ιστούς [22]. Η ασυνέπεια μπορεί να είναι αποτέλεσμα της διαφορετικής ποσότητας κλινικών δειγμάτων και την indistinctive αλλαγή του miR-10a σε ιστούς GC. Τα δεδομένα μας πρέπει να είναι πιο βιολογικώς αντπροσωπευτικές λόγω του μεγαλύτερου αριθμού κλινικών δειγμάτων. Μόνο ένα μεγαλύτερο μέρος, αλλά όχι όλοι οι ασθενείς έχουν μια GC ρύθμιση προς τα κάτω του miR-10a σε ιστούς GC τους αν και miR-10a λειτουργεί ως καταστολέας όγκων σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Αυτό μπορεί να οφείλεται σε διακριτή μηχανισμός για τη γένεση του GC σε διαφορετικά άτομα. Μπορεί να υπάρχουν κάποια άλλα σημαντικά γονίδια ή παράγοντες που ευθύνονται για καρκινογένεση στους ασθενείς GC του οποίου GC ιστών miR-10a παρέμεινε αμετάβλητος ή up-ρυθμίζεται. Επιπλέον, η έκφραση του miR-10a εμφάνισαν καμία συσχέτιση με κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά εκτός από το στάδιο TNM, υποδεικνύοντας ότι miR-10a θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα μερικό ρόλο στην ογκογένεση ιδιαίτερα σε πρώιμα στάδια.

Πολλοί miRNAs έχουν αναφερθεί ότι συσχετίζονται με ογκογένεση, ωστόσο, η υποκείμενη μοριακός μηχανισμός παραμένει ασαφής. Στην έκθεσή μας, μια λειτουργική ανάλυση του miR-10a, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή δοκιμασίες, μας βοήθησε να κατανοήσουμε καλύτερα τη συμβολή του miR-10a σε γαστρική καρκινογένεση. Η επιμόλυνση του miR-10a μιμούνται τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ανέστειλε σημαντικά, τη μετανάστευση και διεισδυτικότητα σε κύτταρα GC, υποδεικνύοντας ότι η καταστολή του miR-10a θα μπορούσε να προωθήσει την εξέλιξη του όγκου σε γαστρικό καρκινογένεση. Οι μελλοντικές μελέτες για να διαλευκανθεί αυτό το μηχανισμό.

Στο ανθρώπινο γονιδίωμα,

miR-10a

βρίσκεται ανάντη του

HOXB4

.

MiR-10b

, ένα άλλο μέλος του miR-10 οικογένεια, βρίσκεται ανάντη του

HOXD4

. Αυτά τα δύο μέλη είναι διαφορετικό από κάθε άλλο σε μία μόνο βάση και παρουσιάζουν ταυτόσημες αλληλουχίες σπόρων, υποδηλώνοντας παρόμοια τους λειτουργίες. Kwoneel Kim [12] έχει αναφέρει ότι miR-10b παίζει ένα ρόλο σε GC ως καταστολέας όγκου. Στη μελέτη μας, αποδείξαμε ότι η υπερέκφραση του miR-10a ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των όγκων, τη μετανάστευση και τη διεισδυτικότητα, η οποία ήταν παρόμοια με τη λειτουργία του miR-10b με CG. γονίδια ΗΟΧ είναι πολύ συντηρημένες παράγοντες μεταγραφής που είναι καθοριστικός για την ορθή εμπρόσθια-οπίσθια σχηματομόρφωσης του άξονα του σώματος [23]. HOXA1 έχει επικυρωθεί ως άμεσο στόχο miR-10a σε ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος [17] και μεγακαρυοκυτταροποίησης [18].