Αφηρημένο

Αναδυόμενες αποδείξεις δείχνουν ότι η microRNAs (miRNAs) μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στον καρκίνο. Ανώμαλη έκφραση των miRNAs έχει συχνά εντοπίζονται σε διαφορετικές ανθρώπινες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC). Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο απελευθερωθεί miRNAs αντίκτυπο που έχει η ανάπτυξη της CRC παραμένει σε μεγάλο βαθμό απατηλό. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι miR-124 είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται CRC σε σύγκριση με παρακείμενες μη-καρκινική παχέος ιστούς. MiR-124 καταστέλλει την έκφραση του STAT3 με απευθείας σύνδεση με 3′-αμετάφραστη περιοχή του (3′-UTR). Η υπερέκφραση του miR-124 οδήγησε σε αυξημένη απόπτωση των κυττάρων CRC και μειωμένη ανάπτυξη του όγκου in vitro και in vivo. Η κατάρριψη έκφραση STAT3 με ειδικές siRNA κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων CRC in vitro και in vivo, που μοιάζει με εκείνη του miR-124 υπερέκφραση. Επιπλέον, η υπερέκφραση του STAT3 σε miR-124-μορφομετατραπέντα κύτταρα CRC διασώθηκε αποτελεσματικά την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που προκαλείται από miR-124. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι το miR-124 χρησιμεύει ως καταστολέας των όγκων στοχεύοντας STAT3, και απαιτούν τη χρήση του miR-124 ως δυνητικό θεραπευτικό εργαλείο για CRC, όπου STAT3 είναι συχνά υπερ-ενεργοποιείται

Παράθεση:. Zhang J, Lu Υ, Yue Χ, Li H, Luo Χ, Υ Wang, et al. (2013) MiR-124 καταστέλλει την ανάπτυξη του Ανθρώπινου Καρκίνου του παχέος εντέρου από ανασταλτικός STAT3. PLoS ONE 8 (8): e70300. doi: 10.1371 /journal.pone.0070300

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18η Φεβρουαρίου 2013? Αποδεκτές: 17 του Ιουνίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 5 Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Φυσικό Επιστημονικό Ίδρυμα της Κίνας (Grant Νο 81171447), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Guangdong, Κίνα (Grant Νο 104518036002006310), Shenzhen Επιστήμης και Τεχνολογίας του έργου (GJHZ20120616153140827). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη κύρια αιτία των θανάτων μεταξύ όλων των κακοηθειών στον άνθρωπο [1], [2]. Οι περισσότεροι CRCs προκύπτουν σποραδικά, με διαδοχικές μεταλλάξεις στο

APC /β-catennin, K-Ras, COX-2

, και

p53

σηματοδότησης κατά μήκος της διαδικασίας για την έναρξη του καρκίνου, εξέλιξη και μετάσταση [3 ] – [5]. Εκτός από τους μηχανισμούς κυττάρου-ενδογενούς καρκίνος διαμεσολαβείται από αυτούς τους ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια, η αλληλεπίδραση μεταξύ καρκινικών κυττάρων και άλλων κυττάρων σε καρκινικά στρώμα παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση της ανάπτυξης των καρκίνων [6]. Σε μια διαδικασία που μιμείται τη φυσική επιλογή, τα καρκινικά κύτταρα συν-εξελίσσονται με μικροπεριβάλλον τους και επιλέγονται από την ικανότητά τους να αναδιαμορφώσει το περιβάλλον τους για την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση σε απομακρυσμένες θέσεις [6], [7].

STAT3

είναι μια κρίσιμη σύνδεση μεταξύ καρκινικών κυττάρων και μικροπεριβάλλοντα τους με τον έλεγχο τόσο την ανάπτυξη του όγκου και σχετίζονται με όγκους φλεγμονής [8], [9]. Στα καρκινικά κύτταρα,

STAT3

παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη [10] του όγκου. Ενεργός

STAT3

μπορεί να ανιχνευθεί σε πολλές ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων εκείνων του παχέος εντέρου, του δέρματος, του στομάχου, του μαστού, του πνεύμονα και άλλοι [10] – [13]. Παρουσία πυρηνικά εντοπισμένη

STAT3

σε ανθρώπινους καρκίνους εμπλέκει ότι

STAT3

μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα ογκογονίδιο για την προώθηση της ανάπτυξης του καρκίνου. Πράγματι, η διαγραφή του υπό όρους

STAT3

σε επιθηλιακά κύτταρα του κόλου και σε ηπατοκύτταρα οδήγησε σε μειωμένη ανάπτυξη του όγκου σε ποντικούς [10], [14]. Σε ένα μοντέλο ποντικού ΑΟΜ /DSS επαγόμενη κολίτιδα σχετιζόμενη CRC, διαγραφή του

STAT3

στα εντεροκύτταρα οδήγησε σε μειωμένο φορτίο όγκου στο έντερο [15], [16].

STAT3

, ενεργοποιούνται από προφλεγμονώδεις κυτοκίνες όπως η IL-6 από μυελοειδή κύτταρα όγκου που διηθούν, προωθεί τόσο την επιβίωση και την ανάπτυξη των μετασχηματισμένων εντερικών επιθηλιακών κυττάρων. Διαγραφή της IL-6 ή συγγενικό gp130 υποδοχέα της στην ΑΟΜ μοντέλο /DSS οδήγησε σε μείωση του μεγέθους του όγκου και του αριθμού των όγκων, ενώ περαιτέρω ενίσχυση της

STAT3

δραστηριότητα με την εισαγωγή υπερ-ενεργό gp130 οδήγησαν σε αύξηση της διαμέτρου του όγκου και του αριθμού των όγκων [15], [16].

STAT3

ρυθμίζει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων με την ενεργοποίηση γονιδίων που προσδίδουν ανθεκτικότητα έναντι απόπτωσης. Αυτά

STAT3

-εξαρτώμενη αντι-αποπτωτικών γονιδίων περιλαμβάνουν

Bcl-XL, Bcl-2, c-IAP2, Mcl-1

και

Survivin

[13], [15 ] – [17]. Η διαγραφή του

STAT3

σε καρκινικά κύτταρα οδήγησε σε μειωμένη έκφραση αυτών των γονιδίων προ-επιβίωσης και αύξηση της απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων [10], [15], [16]. Πρόσθετες

STAT3

στόχοι περιλαμβάνουν γονίδια που προάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, όπως

κυκλίνες Β

και

D

, και

c-Myc

[9], [16 ], η οποία εξηγεί τα μειωμένα μεγέθη του όγκου κατά την

STAT3

εκτομή [15], [16]. Με την προώθηση της επιβίωσης των κυττάρων του όγκου και την ανάπτυξη,

STAT3

χρησιμεύει ως ολοκληρωτής σήμα να επιτρέπουν μετασχηματισμένα κύτταρα να επιβιώνουν και να πολλαπλασιάζονται σε απόκριση σε ερεθίσματα προήλθε από στρωματικά κύτταρα σε μικροπεριβάλλον του όγκου [5].

miRNAs είναι μικρά μη-κωδικοποίησης RNAs από ~ 22 nt ότι η γονιδιακή έκφραση σιωπή καταστέλλοντας μετάφραση του mRNA σε πρωτεΐνες [18] – [20]. Τα miRNAs εκτιμάται ότι θα ρυθμίσει πάνω από το 60% των γονιδίων στα θηλαστικά, που τους καθιστά ένα σημαντικό μέρος στο κελί συμπεριφορές [21]. Τα miRNAs εμπλέκονται σε πολλαπλές κυτταρικές λειτουργίες όπως πολλαπλασιασμό, απόπτωση και διαφοροποίηση, και εφαρμόζονται σε διάφορες φυσιολογικές και παθολογικές διαδικασίες που κυμαίνονται από την ανάπτυξη σε καρκίνο του [18], [19], [22], [23]. Ο ρόλος των miRNAs σε καρκίνους έχουν καλά-καταδειχθεί [24] – [27]. MiRNAs μπορεί να χρησιμεύσει είτε ως ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής όγκων, ανάλογα με τη φύση των στόχων τους. Τα πρώτα στοιχεία δείχνουν εμπλοκή των miRNA στον καρκίνο προήλθε από μια μελέτη σε χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ), όπου

miR-15a

και

miR-16-1

διαγράφονται συχνά [28]. Αργότερα μελέτες έδειξαν περαιτέρω όγκου-καταστέλλοντας ρόλους των

miR-15a

και

miR-16-1

εντοπίζοντας

BCL2

ως κανονιστικό στόχο τους, που είναι ένα αντι-αποπτωτικό γονίδιο που συχνά υπερεκφράζεται σε πολλούς τύπους ανθρώπινων καρκίνων [29]. Ένα άλλο παράδειγμα του όγκου-κατασταλτικό miRNA είναι η

ας-7

οικογένεια που αναστέλλει την έκφραση του

Ras

ογκογονιδίου [30].

Ας-7

οικογένεια miRNAs βρίσκονται σε ευαίσθητες περιοχές του ανθρώπινου γονιδιώματος, και την απώλεια τους δείχνει κακή πρόγνωση σε καρκίνους του ανθρώπου [31], [32].

Πολλαπλές miRNAs με παρεκκλίνουσα έκφραση έχουν προσδιορίζονται σε διαφορετικούς ανθρώπινους κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένης της CRC [33] – [35]. Γονίδια που ρυθμίζονται από αυτές σχετίζονται με τον καρκίνο miRNAs περιλαμβάνουν

COX2

,

APC, K-Ras, EGFR

και περισσότερο, που είναι σημαντικές για την έναρξη και την εξέλιξη του CRC [34]. Μεταξύ αυτών, miR-124 είναι μια ενδιαφέρουσα στόχο να σπουδάσουν στην ανάπτυξη του καρκίνου. Υπήρξαν εκτεταμένες μελέτες σχετικά με το ρόλο του miR-124 στο νευρικό σύστημα, όπου ρυθμίζει νευρωνική ανάπτυξη και νευρική πλαστικότητα με στόχευση σηματοδότηση Notch και άλλων γονιδίων που εμπλέκονται στην διαφοροποίηση και ενεργοποίηση νευρώνα [36]. MiR-124 ρυθμίζεται προς τα κάτω σε μυελοβλαστώματος και του καρκίνου του τραχήλου [37], [38], και συμμετέχει επίσης σε μια φλεγμονώδη βρόχο ανάδρασης σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) [39]. Ο ρόλος του miR-124 στο CRC, και ο μηχανισμός με τον οποίο το miR-124 ρυθμίζει την ανάπτυξη του καρκίνου, παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ως στόχο να αποκρυπτογραφήσει το ρόλο του miR-124 στην ανάπτυξη CRC. Έχουμε αποδείξει ότι το miR-124 είναι μειωτικά στο ανθρώπινο CRC. στόχοι MiR-124 στην 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (3’UTR) του STAT3 να καταστείλει την έκφραση του. Με την ρύθμιση προς τα κάτω STAT3, miR-124 επάγει προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο σε ανθρώπινα κύτταρα CRC και καταστέλλει την ανάπτυξη των όγκων CRC in vivo.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και αντιδραστήρια

ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC SW480 και LoVo ελήφθησαν από τα κύτταρα Τράπεζα της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 2 mM γλουταμίνη, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Όλα τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο συμπληρωθεί με 5% CO

2.

MiR-124

πρόδρομος (

Pre-miR-124

), miRNA έλεγχο των πρόδρομων ουσιών (

Pre-Ομελέτα miRNA

), αντίθετης φοράς

miR-124

ολιγονουκλεοτιδίων (

AS-miR-124

), CY3-σημασμένο

miR -Scramble

, αντιπληροφοριακό miRNA ελέγχου (

AS-ομελέτα

miRNA), siRNA έναντι

STAT3

(

STAT3-siRNA

), και κωδικοποιημένα siRNA-ολιγονουκλεοτιδίων (

siRNA ελέγχου

) αγοράστηκαν από την Ambion (Austin, TX, USA).

STAT3

αντίσωμα αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, USA).

PcDNA3.0-STAT3

, ένας φορέας έκφρασης STAT3 κατασκευάστηκε από το εργαστήριο μας.

Ασθενών Δείγματα και RNA Extraction

δείγματα Ανθρωπίνων CRC ελήφθησαν από 90 χειρουργικούς ασθενείς στο Τμήμα Γαστρεντερολογίας, το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Shenzhen Νοσοκομείο. Δίπλα φυσιολογικά δείγματα βλεννογόνου βρίσκεται τουλάχιστον 2 cm από τα περιθώρια του όγκου (πολύποδας ή καρκίνωμα) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι. Όλες οι όγκοι ήταν αδενοκαρκινώματα ενώ εξαιρέθηκαν βλεννώδες καρκίνωμα (όταν πάνω από το 50% του όγκου του όγκου που αποτελείται από βλεννίνη). Του παχέος εντέρου οργανώθηκαν σύμφωνα με το σύστημα ταξινόμησης Dukes: Dukes Α (Τ1-Τ2, N0, και M0? N = 26), το Dukes Β (Τ3-Τ4, N0 και M0? N = 16), το Dukes C (οποιαδήποτε T , N1-2, Μ0? n = 38) και Dukes D (κάθε Τ και κάθε Ν και Μ1? n = 10). δείγματα CRC συλλέχθηκαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε εκτομή του εντέρου. Τα συλλεχθέντα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε υγρό άζωτο. Όλοι οι ασθενείς ενημερώθηκαν για τους σκοπούς της συλλογής δείγματος και έδωσε γραπτή συγκατάθεση, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Πεκίνου. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πεκίνου Πανεπιστήμιο Shenzhen Νοσοκομείο. MiRNA εκχυλίστηκε από φρέσκο ​​ιστούς χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης Ambion mirVana miRNA (Ambion) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ανίχνευση ώριμης

miR-124 από

TaqMan πραγματικού χρόνου RT-PCR

σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR για τις ώριμες

miR-124

διεξήχθη εις τριπλούν χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίες TaqMan microRNA (Ambion) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. αντίδραση RT περιείχε 10 ng ολικού RNA, 1 mM dNTPs, 50 U Multiscribe ανάστροφης μεταγραφάσης, 1.5 μΐ 10 χ ρυθμιστικού διαλύματος RT, 0,188 μΙ αναστολέα RNase, και 3 μΐ 5 χ TaqMan microRNA RT εκκινητή σε κάθε αντίδραση (15 μλ). Η αντίδραση RT πραγματοποιήθηκε υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 16 ° C για 30 λεπτά? 42 ° C για 30 λεπτά? 85 ° C για 5 λεπτά? και ακολούθως διατηρείται επί 4 ° C. Μετά την αντίδραση RT, τα προϊόντα cDNA από αντίδραση RT αραιώθηκαν 15 φορές. PCR διεξήχθη με 1.33 μΙ από τα αραιωμένα προϊόντα σε 20 μΐ αντίδραση PCR που περιέχει 1 μλ Δοκιμασία TaqMan microRNA και 10 μΐ TaqMan καθολική PCR Master Mix. Η ενίσχυση πραγματοποιήθηκε ως ακολούθως: 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 60 s. Σχετική έκφραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο CT και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση του

RNU6B

(Ambion).

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση των

STAT3

mRNA Έκφραση

Το συνολικό RNA εξήχθη από κυτταρικές σειρές επιμολυσμένα με

Pre-miR-124

ή ελέγχου από το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). cDNA συνετέθη με ανάστροφη μεταγραφάση M-MLV kit (Takara, Dalian, Κίνα) χρησιμοποιώντας 1 μα ολικού RNA και 50 μΜ ολίγο (dT) εκκινητή σε 10 μΐ όγκου αντίδρασης. Αντίστροφη μεταγραφή εκτελέστηκε υπό το ακόλουθο πρόγραμμα: 30 λεπτά στους 70 ° C, στη συνέχεια ψύχθηκε σε πάγο αμέσως, 1 ώρα στους 42 ° C, 15 λεπτά στους 70 ° C και κατόπιν διατηρήθηκε στους 4 ° C. προϊόντα RT αραιώθηκαν 10-φορές. Real-time PCR έγινε εις τριπλούν με iQ-SYBR Green Supermix (Bio-Rad, CA, USA) και iCycler Μέσο (Bio-Rad, CA, USA) χρησιμοποιώντας 1 μΙ αραιωμένου cDNA ως μήτρα σε όγκο αντίδρασης 20 μΙ. αντίδραση PCR διεξήχθη ως εξής: 95 ° C για 3 λεπτά και 40 κύκλοι των 95 ° C για 20 s, 55 ° C για 30 s, και 72 ° C για 20 s. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για PCR πραγματικού χρόνου είναι οι εξής:

STAT3

πρόσθιο εκκινητή: 5′-ATCACGCCTTCTACAGACTGC-3 ‘, Reverse αστάρι:. 5’-CATCCTGGAGATTC

TCTACCACT-3′.

GAPDH

πρόσθιο εκκινητή: 5′-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3 ‘, ανάστροφο εκκινητή: 5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’. Σχετική έκφραση υπολογίστηκε με 2

-ΔΔCt μέθοδο.

Η επιμόλυνση

Για RNA ολιγονουκλεοτίδια, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siPORT NeoFX (Ambion) με 50 ηΜ siRNA ή 100 ηΜ miRNA. Για πλασμίδιο, κύτταρα επιμολύνθηκαν με 4 μg DNA σε 35mm πηγάδια με Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Στο πείραμα διάσωσης, τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ miRNA και 3 μg πλασμιδίου σε 35mm πηγάδια. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης εκτιμήθηκε με CY3-επισημασμένου miR-Scramble για RNA ολιγονουκλεοτίδια ή με φορέα GFP που εκφράζουν για το πλασμίδιο.

πρωτεομική ανάλυση

SW480 κύτταρα επιμολύνθηκαν με

Pre-miR-124

ή

Pre-Ομελέτα

έλεγχο miRNA. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, κυτταρικής πρωτεΐνης εκχυλίστηκαν και συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, CA, USA). Οι πρωτεΐνες που χρησιμοποιούνται για 2-DGE όπως περιγράφεται από χειροκίνητη Bio-Rad. Μάζα ανάλυση φασματομετρίας πραγματοποιήθηκε στο Εκπαιδευτικό Κέντρο του πειράματος Βιολογίας, Σχολή Θετικών Επιστημών Ζωής, η Sun Yat-Sen University (Guangzhou, Κίνα). 2-DGE με την πρώτη διάσταση ισοηλεκτρικής εστίασης διεξήχθη pH3-10 IPG έτοιμος λωρίδες, και στη δεύτερη διάσταση διαχωρίστηκε με 8-14% κλίση SDS-PAGE.

Κατασκευή πλασμιδίου

ενισχυμένο το τμήμα 3′-UTR του

STAT3

περιέχουν προβλεπόμενη

miR-124 ιστοσελίδα στόχου με PCR από SW480 κυττάρων γονιδιωματικό DNA, και εισάγεται το στα /HindIII θέσεις SpeI κατάντη του γονιδίου της λουσιφεράσης σε pMIR-ΕΚΘΕΣΗ λουσιφεράσης miRNA έκφραση Reporter Vector (Ambion). Σύμφωνα με την τράπεζα γονιδίων αλληλουχία του

STAT3

, σχεδιάσαμε τους ακόλουθους εκκινητές για να ενισχυθεί το 3′-UTR του

STAT3

με PCR: Εμπρός εκκινητής, 5′-CGGACTAGT AAATGAGTGAATGTGGGTG-3 ‘, και αντίστροφο εκκινητή, 5’-CCAAGCTTTGTTGCTGGAGAAGTAAGAG-3 ‘. 3’-UTR τμήμα του

STAT3

με μεταλλαγμένο

miR-124 Ιστοσελίδα στόχο δημιουργήθηκε από επικάλυψης-PCR χρησιμοποιώντας άγριου τύπου 3′-UTR κατασκευή ως πρότυπο. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργήσουν 3′-UTR που περιέχει μεταλλαγμένο

miR-124

θέση στόχο: 3′-UTR-

STAT3

-M-αντίστροφη, 5′-CCAGCCCTGAGGACTACACCACAGAAACAACCTAGCC-3 ‘, 3’-UTR-

STAT3

-M-προς τα εμπρός, 5′-GTTTCTGTGGTGTAGTCCTCAGGGCTGGGATACTTCTG-3 ‘. Όλα τα θετικά κατασκευάσματα πιστοποιήθηκαν με πέψη περιορισμού και επιβεβαιώθηκε με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA.

λουσιφεράσης

κύτταρα SW480 επιμολύνθηκαν με κατασκευές που περιέχουν λουσιφεράση 3′-UTR του

STAT3

( με τον άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο

miR-124

θέσεις στόχους) και /ή

Pre-miR-124

ή

Pre-Ομελέτα

έλεγχο miRNA. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για λουσιφεράση δοκιμασίες χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

pMIR-ΕΚΘΕΣΗ-β-gal

χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση.

Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

SW480 και LoVo κύτταρα επιμολυσμένα με

Pre-miR-124

ή

Pre-Ομελέτα miRNA

ελέγχου, όπως περιγράφεται παραπάνω. 6 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα απαριθμήθηκαν και επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 3 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων και 3 × 10

5 κύτταρα ανά 30 MM-πλάκα εις τριπλούν. δοκιμασίες WST-1 διεξήχθησαν στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Για WST-1 προσδιορισμό, φασματοφωτομετρία διεξήχθη σε λ = 450 nm και λ ref = 690 nm μετά από επώαση με 10 ul WST-1 (Roche, New York, ΝΥ, USA) για 3 ώρες.

ανοσοφθορισμού Δοκιμασία

SW480 και LoVo κύτταρα επιμολυσμένα με

Pre-miR-124

ή

miRNA

έλεγχο Pre-κωδικοποιημένο. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και κατέστησαν διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100 σε PBS. Αντισώματα κουνελιού έναντι

STAT3

(Cell Signaling Technology, BSN, USA) χρησιμοποιήθηκε ως πρωτογενές αντίσωμα και ΡΙΤΟ-συζευγμένο γίδινο αντι-κουνελιού IgG (Chemicon International, Temecula, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε ως δευτερεύον αντίσωμα για να απεικονίσει

STAT3

. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI.

Western Blotting

Η ολική πρωτεΐνη απομονώθηκε από κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με ολιγονουκλεοτίδιο RNA και /ή DNA πλασμιδίου σε ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF και 1% δεοξυχολικό νάτριο). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης Bio-Rad. Τα δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 10% SDS γέλη πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Amersham, Buckinghamshire, UK). Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν με αντισώματα εναντίον

STAT3

και φωσφο-

STAT3

(Cell Signaling Technology, BSN, USA), που ακολουθείται από μία δευτερεύουσα κρένου αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση. Τα σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος κατέστησαν ορατά χρησιμοποιώντας το κιτ ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Roche) όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή.

Η απόπτωση Ανάλυση

SW480 και LoVo κύτταρα επιμολύνθηκαν με

Pre-miR-124

ή

Pre-Ομελέτα miRNA

ελέγχου. Μετά την επιμόλυνση 72 ώρες, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και αντι-αννεξίνης-ν αντίσωμα και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Πειράματα σε ζώα

Ειδικές ελεύθερες παθογόνων θηλυκούς αθυμικούς BALB /c γυμνά ποντίκια , ηλικίας 4-6 εβδομάδων (20-30 g), ελήφθησαν από το ιατρικό εργαστήριο κέντρο ζώο Γκουανγκντόνγκ. Οι ποντικοί στεγάστηκαν 5 ανά κλωβό και αφήνεται ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Ιατρικού Κέντρου Shenzhen-PKU-HKUST (Αριθμός Άδειας: 158). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. κυτταρικές σειρές SW480 επιμολύνθηκαν in vitro με ολιγονουκλεοτίδιο RNA και /ή πλασμίδιο (pcDNA3.0-STAT3) φορέα. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, 10

7 βιώσιμα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 100 μΙ PBS και υποδορίως ένεση σε δεξιά ραχιαία οσφυϊκή περιοχή γυμνών ποντικών. Τουλάχιστον 7 ποντικούς χρησιμοποιήθηκαν ανά ομάδα για να δοκιμαστεί η επίδραση του miR-124 στην ανάπτυξη του όγκου. Η ανάπτυξη του όγκου αξιολογήθηκε με μέτρηση δισδιάστατη διαμέτρων δύο φορές την εβδομάδα με παχύμετρο. Οι όγκοι του όγκου (V) υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: V = A × B

2/2, όπου το Α αντιπροσωπεύει τη μεγαλύτερη διάμετρο και το Β είναι η μικρότερη διάμετρο. 40 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων, οι ποντικοί θυσιάστηκαν για ανάλυση των ιστών.

ανοσοϊστοχημική ανάλυση και TUNEL Δοκιμασία

μεταμοσχευμένων όγκων εκτομήθηκαν από ποντικούς ξενιστή, σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη, ενσωματωμένα σε παραφίνη, και κόπηκαν σε 4 μm τομές πάχους. Οι τομές αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν σε ξυλόλιο ακολουθούμενη από βαθμονομημένων αλκοολών, και το αντιγόνο μικροκύματα ανακτάται με 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα (ρΗ 6,0 για 15 λεπτά). Μετά την αδρανοποίηση με έκθεση σε 3% Η

2O

2 για 10 λεπτά για να εμποδίσει την ενδογενούς υπεροξειδάσης, οι τομές επωάστηκαν με 10% ορό κατσίκας σε PBS για 30 λεπτά για να εμποδίσει την μη ειδική σύνδεση αντισώματος. Οι τομές επωάστηκαν με αντίσωμα STAT3 (Cell Signaling, # 9132) σε αραίωση 1:200 όλη τη νύκτα στους 4 ° C και στη συνέχεια πλύθηκαν σε PBS. Δευτερεύον αντίσωμα (Βιοτινυλιωμένη IgG αντι-κουνελιού, αραίωση 1:200) εφαρμόστηκε και οι τομές επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση με PBS, οι τομές επωάστηκαν με σύμπλεγμα στρεπταβιδίνης σημασμένο με υπεροξειδάση για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα διάλυμα 3% διαμινο-βενζιδίνη (ϋΑΒ) ως το χρωμογόνο για 20 λεπτά. πρότυπο Fromowitz χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση ημιποσοτικά τη χρώση των STAT3 [37].

χρώση TUNEL διεξήχθη επί 6-μm τμήματα των αποκόπηκε όγκων. Οι τομές αποπαραφινοποιήθηκαν πριν την αντίδραση σήμανσης. δοκιμασία TUNEL διεξήχθη χρησιμοποιώντας τις TumorTACS In Situ Apoptosis Detection Kit (Trevigen Inc. USA). Η δοκιμασία αυτή ανιχνεύει συγκεκριμένα αποπτωτικών κυττάρων, όταν εξετάζονται μέσα από το μικροσκόπιο Zeiss.

Στατιστική Ανάλυση

ανάλυση Σημασία των μικροσυστοιχιών (SAM) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό miRNAs που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των δειγμάτων (FDR = 0).

MiR-124

εκφράσεις σε όγκους CRC και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου σε σύγκριση με το Mann-Whitney U, καθώς και στην αξιολόγηση από τις αρχές και τις προηγμένες όγκους σταδίου. Μία σύγκριση των μέσων μεταξύ δύο ή περισσότερες ομάδες διεξήχθη χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης ή t-test του Student. Όλα τα αριθμητικά δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. P-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε σημαντική. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Graphpad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) και το λογισμικό SPSS (έκδοση 11).

Αποτελέσματα

MiR-124

είναι μεταγενέστερος ρυθμίζονται τα Ανθρώπινα CRC

Για να εξετάσει το προφίλ έκφρασης του

miR-124

στην CRC, πραγματοποιήσαμε ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR χρησιμοποιώντας δοκιμασία TaqMan σε 90 ζεύγη όγκου και κανονική του παχέος δείγματα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, βρήκαμε σημαντικά μειωμένη

miR-124

σε δείγματα CRC (P & lt? 0,0001). Σε σύγκριση με ορθοκολικό καρκίνο ιστών από ασθενείς με χαμηλού βαθμού CRC (Dukes Α και Β), υψηλής ποιότητας (Dukes C και D) CRC ιστοί εκφράζουν ακόμη χαμηλότερα

miR-124

(P = 0,0156? Εικ. 1Β ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το

miR-124

μπορεί να εμπλέκεται στην παθογένεση της CRC.

(Α) ανάλυση qRT-PCR για την έκφραση του miR-124 σε σύγκριση με το CRC γειτονικά μη κακοήθεις ιστούς του παχέως από 90 ασθενείς (P & lt? 0,0001). Οι αντιδράσεις PCR εκτελέστηκαν εις τριπλούν με RNU6B ως εσωτερικός έλεγχος. (Β) Σύνδεσμος-124 miR επίπεδο έκφρασης με την εξέλιξη της CRC (P = 0.0156).

Η

STAT3

είναι ένας στόχος της μετα-μεταγραφική καταστολή από

miR-124

για να προσδιορίσει τους στόχους του miR-124 πραγματοποιήσαμε διαφορική πρωτεομική ανάλυση από την πρωτεΐνη των κυττάρων SW480 μετά τη θεραπεία είτε με την προ-miR-124 ή προ-Κωδικοποιημένα miRNA. Μετά το διαχωρισμό των πρωτεϊνών με ισοηλεκτρική εστίαση και SDS-PAGE, πήραμε 12 πρωτεΐνη κηλίδες που ρυθμίζεται προς τα κάτω περισσότερο από 2-φορές στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με

Pre-miR-124

και στη συνέχεια προσδιορίζονται με φασματομετρία μάζας ( Εικ. S1 Α). Μεταξύ αυτών,

STAT3

έχει ενοχοποιηθεί στην ογκογένεση.

STAT3

είναι ένας σημαντικός παράγοντας μεταγραφής που ρυθμίζει ποικίλες φυσιολογικές και παθολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Να χτυπήσει έξω

STAT3

στα επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου οδήγησε σε μείωση του σχηματισμού όγκου σε ένα μοντέλο κολίτιδας που σχετίζεται με CRC σε ποντίκια [15]. Για να δοκιμαστεί εάν STAT3 είναι άμεσος στόχος του miR-124 ρύθμιση, μπορούμε ενισχυμένο 3′-UTR περιοχή του

STAT3

με PCR από γονιδιωματικό DNA SW480 και εισάγεται στην προς τα κάτω του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης της

pMIR- ΕΚΘΕΣΗ

φορέας για δοκιμασία λουσιφεράσης, με

pMIR- ΕΚΘΕΣΗ β-gal

φορέα ως μάρτυρα (Σχ. S1Bi). Ανάλυση με λογισμικό TargetScan αποκάλυψε μια πιθανή θέση δέσμευσης για

miR-124

εντός της 3’UTR του

STAT3

(Εικ. S1Biii). Για να ελέγξετε αν

miR-124

συνδέεται με 3′-UTR του

STAT3

και ρυθμίζει

STAT3

έκφραση μέσω αυτής της ιστοσελίδας, κατασκευάσαμε επίσης ένα φορέα λουσιφεράσης συγχωνευμένο με

STAT3

3’ΙΙΤΡ φιλοξενούν ένα μεταλλαγμένο

miR-124

στοιχείο απόκρισης (Εικ. S1Bii). Στη συνέχεια επιμολύνονται αυτά τα κατασκευάσματα σε κύτταρα SW480 μαζί με το

Pre-miR-124

ή

pre-miRNA Κωδικοποιημένα

και μετρήθηκε η δραστικότητα λουσιφεράσης. Όπως φαίνεται στο Σχ. S1c, επιμόλυνση του

Pre-miR-124

, αλλά δεν είναι κωδικοποιημένα miRNA, μειώθηκαν σημαντικά λουσιφεράσης δραστηριότητα της λουσιφεράσης μεταφέρουν WT

STAT3

3’ΙΙΤΡ. Σε αντίθεση, ούτε

Pre-miR-124

ούτε

Pre-Ομελέτα miRNA

είχε καμία επίδραση στη δραστηριότητα της λουσιφεράσης της αναφοράς της λουσιφεράσης που περιέχει μεταλλαγμένο

miR-124 το site

δέσμευσης . Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το

miR-124 αλληλεπιδρά

άμεσα με την 3’UTR του

STAT3

και αναστέλλει την έκφραση του.

Ερευνήσαμε επίσης την επίδραση της υπερεκφράζουν

miR-124

στην ενδογενή

STAT3

έκφραση σε ανθρώπινα κύτταρα CRC. Χρησιμοποιήσαμε LoVo και τα κύτταρα SW480 με υψηλά επίπεδα

STAT3

έκφρασης για να πραγματοποιήσει αυτό το πείραμα. Σε σύγκριση με κύτταρα μη επιμολυσμένα ή επιμολυσμένα με

Pre-Ομελέτα miRNA

,

Pre-miR-124

επιμολυσμένα ανθρώπινα κύτταρα CRC έδειξαν μειωμένη

STAT3

έκφρασης αποδεικνύεται τόσο από ανοσοχρώση και Δυτική blotting (Σχ. 2Α, Β). Είναι σημαντικό, το επίπεδο της δραστικής (τυροσίνη-φωσφορυλιωμένου)

STAT3

ήταν επίσης μειωμένη σε

Pre-miR-124

-επιμολυσμένα κύτταρα CRC αλλά όχι στον έλεγχο (Εικ. 2Β). Για να επικυρώσετε περαιτέρω την επίδραση του

miR-124

στο

STAT3

στα ανθρώπινα κύτταρα CRC, θα εξουδετερωθεί ενδογενώς εκφράζονται

miR-124

χρησιμοποιώντας ολιγονουκλεοτίδιο αντίθετης φοράς (

AS- miR-124

). Μετά

miR-124

αποσιώπηση,

STAT3

πρωτεΐνης επίπεδο ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω (Εικ. 2C). Εν ολίγοις, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το

STAT3

αποτελεί άμεσο στόχο του

miR-124

.

(Α-Β) Επίδραση των

miR-124

υπερέκφραση στην ενδογενή

STAT3

επίπεδο σε ανθρώπινα κύτταρα CRC. (Α) και SW480 LoVo κύτταρα επιμολύνθηκαν με

Pre-miR-124

και χρωματίστηκαν για

STAT3

με ανάλυση ανοσοφθορισμού. Πράσινο,

STAT3

πρωτεΐνη ανοσοχρώση με αντι-

STAT3

? μπλε, πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. (Β) SW480 και LoVo κύτταρα επιμολύνθηκαν με

Pre-miR-124

και

STAT3

πρωτεΐνη επίπεδα εξετάστηκαν με ανάλυση Western blotting. (Γ) SW480 και LoVo κύτταρα επιμολύνθηκαν με AS-miR-124.

STAT3

επίπεδα πρωτεΐνης εξετάστηκαν με κηλίδωση Western. (Δ) Τα επίπεδα του

STAT3

mRNA ποσοτικοποιήθηκαν με ανάλυση qRT-PCR μετά την επιμόλυνση των προ-miR-124.

GAPDH

χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικός έλεγχος. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD ± SD.

Η

miRNAs ρυθμίζουν προς τα κάτω γονιδίων στόχων τους από την υποβάθμιση του mRNA στόχου ή αναστολή της μετάφρασης του mRNA. Για να διερευνήσουν τον μηχανισμό του

STAT3

αναστολή από

miR-124

, ελέγξαμε την επίδραση του

Pre-miR-124

επιμόλυνση στο

STAT3

mRNA σταθερότητα. Δεν υπήρχε διαφορά στα επίπεδα του

STAT3

mRNA μεταξύ των κυττάρων επιμολυσμένα με

Pre-miR-124

και

Pre-Ομελέτα miRNA

, γεγονός που υποδηλώνει ότι το miR-124 κατάντη ρυθμίζουν

STAT3

έκφραση μέσω της αναστολής της μετάφρασης (Σχ. 2D).

MiR-124

αναστέλλει την ανάπτυξη του CRC

Γνωρίζοντας ότι

miR-124

σημαντικά προς τα κάτω σε CRC, ερευνήσαμε εάν

miR-124

μπορεί να χρησιμεύσει ως καταστολέας των όγκων στο CRC. Να διερευνήσει τις επιπτώσεις της

miR-124

στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, επιμολύναμε

miR-124

προάγγελος ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC SW480 και LoVo, και μετράται ρυθμό πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης. Επιβεβαιώσαμε αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης (& gt? 90% SW480 και κύτταρα LoVo) χρησιμοποιώντας CY3-επισημασμένο miR-Scramble (Ambion, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η υπερέκφραση του

που προκαλείται miR-124

κυτταρικό θάνατο αποδεικνύεται από στρογγυλοποίηση μορφολογία των κυττάρων (Εικ. 3Α). Η ανάπτυξη και των δύο κυτταρικών γραμμών καρκίνου του ανεστάλη σημαντικά σε 48 ώρα μετά την επιμόλυνση του

Pre-miR-124

(Σχ. 3Β). Η επαγωγή της απόπτωσης μετά από υπερέκφραση

miR-124

επιβεβαιώθηκε με κυτταρομετρία ροής (FCM) (Σχ. 3C).

(Α) και SW480 LoVo κύτταρα επιμολύνθηκαν με

Pre- miR-124

ή

Pre-Ομελέτα

miRNA και εξετάζονται από οπτικό μικροσκόπιο. (Β) Τα κύτταρα επιμολυσμένα με

Pre-miR-124

ή

Pre-Ομελέτα

miRNA, και την ανάπτυξη των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία WST1. Στήλες αντιπροσωπεύουν μέση τιμή τριών ανεξάρτητων δοκιμών. Μπαρ, SD. *, P & lt? 0,05. (C) απόπτωση των κυττάρων μετρήθηκε με Annexin V και χρώση ιωδίου προπιδίου.

Η

Για να καθοριστεί περαιτέρω ο ρόλος του

miR-124

στη ρύθμιση της ανάπτυξης του όγκου in vivo, ιδρύσαμε το μοντέλο ξενομοσχεύματος με ένεση SW480 κύτταρα υποδορίως σε γυμνά ποντίκια. Πριν από την ένεση, SW480 κύτταρα επιμολυσμένα με

Pre-miR-124

ή

Pre-Κωδικοποιημένα miRNA

. Η έκφραση του

miR-124

μετά την επιμόλυνση επιβεβαιώθηκε με TaqMan RT-PCR (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Βρήκαμε ότι το 100% των ποντικών που έλαβαν ένεση με κύτταρα SW480 επιμολυσμένα με

Pre-Κωδικοποιημένα miRNA

ανέπτυξαν μετρήσιμους όγκους μετά από 10 ημέρες από τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων. Σε αντίθεση, όγκος δεν ήταν ορατή σε δύο ποντίκια ένεση με κύτταρα SW480 που έλαβαν θεραπεία με

Pre-miR-124

. Η ανάπτυξη του όγκου αξιολογήθηκε με μέτρηση δισδιάστατη διαμέτρους δύο φορές την εβδομάδα με παχύμετρο. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, οι όγκοι προέρχονται από κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με

Pre-miR-124

ήταν σημαντικά μικρότερα από εκείνα που έλαβαν θεραπεία με

Pre-Ομελέτα miRNA

, ή ψευδο-επιμολυσμένα (P & lt? 0,01) την ημέρα 40. Μέσο το βάρος του όγκου για

Pre-Ομελέτα miRNA

και χωρίς αγωγή ομάδες ήταν 4,36 ± 1,69 g και 3,99 ± 1,11 g αντίστοιχα, ενώ σε ποντίκια που εμβολιάστηκαν με το

Pre-miR-124

κύτταρα επεξεργασμένα ήταν 2,42 ± 1,55 g (ρ & lt? 0,01) (Εικ 4Β.).

STAT3

επίπεδο έκφρασης ήταν επίσης μειωμένη σε

Pre-miR-124

επιμολυσμένα όγκους των κυττάρων που προέρχονται σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. 4C), γεγονός που υποδηλώνει την αναστολή του

STAT3

από

Pre-miR-124

διατηρείται κάτω από φυσιολογικές συνθήκες. Συνεπής με το ρόλο της στην προώθηση κυτταρικό θάνατο in vitro,

Pre-miR-124

επιμολυσμένα προερχόμενο από κύτταρα όγκου έδειξε επίσης δραματικά αυξημένο κυτταρικό θάνατο, γεγονός που εξηγεί τη μείωση του μεγέθους του όγκου μετά τη μεταμόσχευση (Εικ. 4D).

(Α) κύτταρα SW480 επιμολύνονται με

Pre-miR-124

ή

Pre-Κωδικοποιημένα

miRNA. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, 10

7 βιώσιμα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 100 μΙ PBS και υποδορίως εγχύθηκαν εντός του δεξιού ραχιαία οσφυϊκή περιοχή γυμνών ποντικών. Η ανάπτυξη του όγκου αξιολογήθηκε με μέτρηση δισδιάστατη διαμέτρων δύο φορές την εβδομάδα με παχύμετρο. (Β) Το βάρος του όγκου στο τέλος της μελέτης. Την ημέρα 40 μετά την αγωγή, όλα τα ζώα θυσιάστηκαν και οι όγκοι αφαιρέθηκαν και σταθμίζονται. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον 7 ζώα ανά ομάδα. (C)

STAT3

επίπεδο προς τα κάτω σε

Pre-miR-124-

θεραπεία του παχέος ιστούς όγκων. Αριστερά: αντιπροσωπευτικό τομές ιστού ορθοκολικού όγκου χρωματίζονται με αντίσωμα έναντι

STAT3

. Δεξιά:

STAT3

ένταση χρώσης βαθμολογήθηκε από έναν παθολόγο και αναλύθηκαν με τυπικές Fromowitz του. (D) Αριστερά: τομές όγκων βάφτηκαν με προσδιορισμό TUNEL για αποπτωτικά κύτταρα. Δεξιά: ποσοτικοποίηση αριθμού των αποπτωτικών κυττάρων. Στήλες, σημαίνει τριών ανεξάρτητων δοκιμών. Μπαρ, SD, **, Ρ & lt? 0,01, *** P & lt?. 0.001

Η

Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι

miR-124

είναι ένα ογκοκατασταλτικό στο CRC .

MiR-124

Εξυπηρετεί ως ογκοκατασταλτικό από Στόχευση

STAT3

η

miRNAs προσδιορίσει τους στόχους τους μέσω εκφυλισμένη ταιριάζουν με αλληλουχίες-στόχους. Ως αποτέλεσμα κάθε miRNA μπορεί να αναστείλουν την έκφραση πολλαπλών γονιδίων. Για να επιβεβαιωθεί ότι

STAT3

είναι πράγματι ο μεταγενέστερος μεσολαβητής του

miR-124

‘s ανασταλτική επίδραση στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και ανάπτυξη του όγκου vivo, σχεδιάσαμε siRNA εναντίον

STAT3