Αφηρημένο

επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) είναι η πιο συχνή γυναικολογική κακοήθεια. Για τον προσδιορισμό των μικρο-ριβονουκλεϊκά οξέα (miRNAs) προφίλ έκφρασης σε ιστούς EOC που μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα νέο διαγνωστικό βιοδείκτη για την ανίχνευση EOC, η έκφραση του 1722 miRNAs από 15 δείγματα φυσιολογικού ωοθηκικού ιστού και 48 δείγματα καρκίνου των ωοθηκών ήταν μορφοποιημένης με τη χρήση ενός ποσοτική πραγματικού -Time αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR qRT-) δοκιμασίας. Μια δέκα microRNA υπογραφής (HSA-miR-1271-5p, HSA-miR-574-3p, HSA-miR-182-5p, HSA-miR-183-5p, HSA-miR-96-5p, HSA-ΜΙΚ 15β-5P, HSA-miR-182-3p, HSA-miR-141-5p, HSA-miR-130 Β-5P και HSA-miR-135b-3ρ) αναγνωρίστηκε για να είναι σε θέση να διακρίνει τους ανθρώπινους ιστούς καρκίνου των ωοθηκών από την κανονική ιστοί με 97% ευαισθησία και 92% ειδικότητα. Δύο miRNA συστάδες miR183-96-183 (miR-96-5p, και miR-182, miR183) και miR200 (miR-141-5p, miR200a, β, γ και miR429) είναι σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε δείγματα καρκινικού ιστού των ωοθηκών σε σύγκριση με εκείνη των φυσιολογικών δειγμάτων ιστού, γεγονός που υποδηλώνει διατριβές miRNAs μπορεί να εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών

Παράθεση:. Wang L, Zhu MJ, Ren AM, Wu HF, Han WM, Tan RY, et al. (2014) Μια Υπογραφή Δέκα-microRNA που ταυτοποιήθηκαν από ένα Genome-Wide έκφραση microRNA Profiling στην Ανθρώπινα επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 9 (5): e96472. doi: 10.1371 /journal.pone.0096472

Επιμέλεια: Liang-Hu Qu, η Sun Yat-sen University, η Κίνα

Ελήφθη: δεύτερης Νοεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: 8, Απριλίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: May 9, 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Miao-Ιούνιος Zhu, το Χονγκ-Φέι Wu, Wu-Mei Han, και Ruo-Ying Tan είναι εν ενεργεία υπαλλήλους του BioVue. Κανένας από τους συγγραφείς έχετε οποιαδήποτε οικονομικά συμφέροντα. Όλα τα δεδομένα και τα υλικά αυτής της μελέτης είναι ανοιχτές σε πρόσβαση. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνος των ωοθηκών (OC), μία από τις τρεις γυναικολογικές κακοήθειες, είναι η έβδομη πιο κοινός καρκίνος μεταξύ των γυναικών σε όλο τον κόσμο [1]. Κληρονομιά της υψηλής διεισδυτικότητας γονίδια ευαισθησίας στον καρκίνο, όπως μεταλλαγμένο BRCA1 ή BRCA2 και /ή Lynch σύνδρομο που σχετίζεται με μεταλλάξεις που ενέχουν αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης OC [2]. Επιθηλιακά Καρκίνος των ωοθηκών (EOC) αντιπροσωπεύει περίπου το 80-90% του ΣΛ [3]. EOC είναι η πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια στις δυτικές χώρες [4]. Στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής (ΗΠΑ), EOC προκάλεσε σχεδόν 15.500 θανάτους το 2012 [5]. Υπάρχουν μόνο μερικές αποτελεσματικές βιοδείκτες και θεραπείες για ΕΓΚ [6] – [8], και την έγκαιρη διάγνωση του ΕΓΚ εξακολουθεί να παραμένει μια πρόκληση για τους ογκολόγους. Το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών περισσότερο από το 70% των ασθενών με προχωρημένο στάδιο EOC είναι μόνο το 35% [5]. Καμία αποτελεσματική μέθοδος ελέγχου για την ανίχνευση πρώιμου σταδίου OC με υψηλή εξειδίκευση και η ευαισθησία είναι διαθέσιμα σήμερα, και το αντιγόνο-125 καρκίνου σε συνδυασμό με διακολπικό υπερηχογράφημα μπορεί να ανιχνεύσει μόνο 30-45% των ασθενών με πρώιμο στάδιο της νόσου [9]. Αν και δεσοξυριβονουκλεϊνικό οξύ (DNA) βιοδείκτες μεθυλίωση παίζουν ένα πολλά υποσχόμενο ρόλο στην ανίχνευση EOC, εξακολουθεί να υπάρχει μια τεράστια ανάγκη για τον εντοπισμό πιθανών βιοδείκτες με υψηλή εξειδίκευση και ευαισθησία. Οι αναλυτικές τεχνικές πρέπει επίσης να τυποποιηθεί προκειμένου να βελτιωθεί η ανίχνευση, τη βελτιστοποίηση της θεραπείας, και να επιτύχει επιθυμητή έκβαση των ασθενών [10].

Ο ρόλος των μικρο-ριβονουκλεϊκό οξέα (miRNAs) σε OC έχει κερδίσει τα τελευταία προσοχή, δεδομένου ότι προσφέρουν νέες στρατηγικές για την πρόληψη, την έγκαιρη ανίχνευση, διάγνωση και θεραπεία. Παίζουν σημαντικό ρόλο στη ουσιώδη διεργασίες όπως κυτταρική διαφοροποίηση, την ανάπτυξη, και την απόπτωση [11], [12]. Η ανώμαλη έκφραση ή μετάλλαξη miRNAs σε καρκίνους υποδεικνύεται δυνατότητά τους να δρουν ως μια νέα κατηγορία των ογκογονιδίων ή γονιδίων καταστολής του όγκου με βάση τους στόχους τους [13]. Από miRNAs θα μπορούσαν να απομονωθούν και να ανιχνευθούν από δείγματα ιστών και αίματος, miRNAs περιφερικού αίματος προερχόμενα χρησιμοποιήθηκαν ως νέες κυκλοφορούν βιοδείκτες για OC [14]. Στις περισσότερες δημοσιευμένες μελέτες, η έκφραση των miRNAs ήταν περίγραμμα από miRNA μικροσυστοιχιών και επιβεβαιώθηκε από ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (qPCR).

Η παρούσα μελέτη διεξήχθη ένα γονιδίωμα-ευρεία ιστού miRNA προφίλ έκφρασης από ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου αντίδρασης. Ένα προφίλ των 10 miRNAs ιστού βρέθηκε, το οποίο μπορεί να χρησιμεύσει ως βιοδείκτη για την ΕΓΚ και θα συμβάλει στην καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού γένεσης των ωοθηκών των όγκων και την ανάπτυξη.

Υλικά και Μέθοδοι

Συλλογή OC δείγματα ιστού

Κανονική επιθηλιακά δείγματα ωοθηκικού ιστού (Ν δείγματα) (n = 15) και κακοήθη επιθηλιακά δείγματα ωοθηκικού ιστού (δείγματα C) (n = 48) συλλέχθηκαν σε Zhongshan Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Fudan, Σαγκάη της Κίνας. Οι 48 κακοήθη επιθηλιακά δείγματα ωοθηκικού ιστού (δείγματα C) περιλαμβάνονται 41 επιθηλιακά δείγματα ωοθηκικού καρκινώματος (δείγματα CE) και 7 επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών δείγματα οριακά ιστού (δείγματα CB). Οι 48 κακοήθη επιθηλιακά δείγματα ωοθηκικού ιστού ήταν από διαφορετικούς τύπους κυττάρων: 29 ορώδες, 6 μικτή επιθηλιακά, 6 ενδομητριοειδές, 1 αδενοκαρκίνωμα (δεν προδιαγράφονται άλλως), 4 σαφές κύτταρα, και 2 βλεννώδες καρκίνωμα. Όλα τα δείγματα ιστού καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο αφού αφαιρεθεί από το σώμα και αποθηκεύονται στους -80 ° C για μακροπρόθεσμη αποθήκευση. Γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλα τα άτομα, και το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Zhongshan Νοσοκομείο. Τα δημογραφικά και τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών και υγιών μαρτύρων που παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Η

miRNA απομόνωση

Ολικό RNA απομονώθηκε από & lt? 50 mg κατεψυγμένου ιστού με miRNeasy Mini Kit (

Qiagen, USA

) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποιότητα του απομονωμένου RNA ανιχνεύθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, και η ποσότητα αναλύθηκε με υπεριώδη φασματοφωτομετρική μέθοδο χρησιμοποιώντας Biomate3 (

Thermo Scientific, USA

). Τα συνολικά RNA με αιχμηρά ζώνες 18S rRNA και 28S rRNA θεωρούνται μη-υποβαθμισμένη και χρησιμοποιούνται για miRNA προφίλ.

Η προσθήκη του πολυ (Α) ουρές και αντίστροφη μεταγραφή

Το καθαρισμένο συνολικό RNA ( συμπεριλαμβανομένων των μικρών RNA) αραιώνεται σε 125 ng /μL με ρυθμιστικό αποθήκευσης 0,1 χ RNA (Ambion, USA) που περιέχει 0.1% Tween-20 (

Sigma

). miRNAs προστέθηκαν πολυ (Α) ουρά και αντίστροφη σε μεταγραφή σε cDNA χρησιμοποιώντας Sharpvue miRNA First Strand Kit (

BioVue, Σαγκάη, Κίνα

) σύμφωνα με τις οδηγίες του κιτ. Η συγκέντρωση του ολικού RNA εις την αντίδραση προσθήκης πολυ ουρές (Α) και αντίστροφης μεταγραφής είναι 50 ng /μl.

Real-time PCR

Ο συντέθηκε cDNA miRNA αναμίχθηκε με Sharpvue 2χ Οικουμενική qPCR Master Mix (

BioVue, Σαγκάη, Κίνα

) και ύδατος άνευ νουκλεάσης. Η Sharpvue Ανθρωπίνων miRNA Primer Array-Α-Ε v1.0 384-καλά (

BioVue, Σαγκάη, Κίνα

) χρησιμοποιήθηκε και σε πραγματικό χρόνο PCR διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του Sharpvue miRNA qPCR Kit. Κάθε δείγμα ανιχνεύθηκε από 1757 miRNA εκκινητών συμπεριλαμβανομένων 35 έλεγχοι σε πέντε πλάκες 384-καλά. Κάθε πλάκα περιέχει τρεις ενδογενείς ελέγχους (HSA-7SL-scRNA, HSA-RNU6B, και HSA-RNU48) εις διπλούν και ένα κανένας έλεγχος πρότυπο. miRNAs επίπεδα έκφρασης ποσοτικά χρησιμοποιώντας ΑΒΙ 7900HT Fast Real-Time PCR System (

Applied Biosystems, USA

). Η αντίδραση PCR πραγματικού χρόνου επωάστηκε στους 95 ° C για 2 λεπτά, ακολουθούμενο από 3 κύκλους 96 ° C για 5 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 1 λεπτό, 37 κύκλοι των 96 ° C για 5 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και τρέχει τήξη καμπύλη στο τέλος. EVA-πράσινο χρώμα και βαφής Rox χρησιμοποιήθηκαν ως δημοσιογράφος και αναφορά, αντίστοιχα. Οι λεπτομέρειες της ανίχνευσης miRNA φαίνεται στο Σχήμα S1 στο S1 αρχείο.

Η στατιστική ανάλυση

Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση πακέτων Bioconductor R και. Από τους 1722 προσδιορισμούς miRNA και 2 προσδιορισμούς ενδογενούς ελέγχου (HSA-RNU6B, και HSA-RNU48), 1696 miRNAs είχε τιμή Ct κάτω = 32 (όριο ανίχνευσης) Ct μεταξύ τουλάχιστον 10% των ανιχνεύθηκαν 63 δείγματα. Τα υπόλοιπα 28 προσδιορισμοί απομακρύνθηκαν από την περαιτέρω ανάλυση. Για να εξαλείψει τις διαφορές στο δείγμα εισόδου RNA, ποσοστημόριο-Median μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για την επεξεργασία των πρώτων μετρήσεων Ct [15]. Τα δείγματα που έδειξε σημαντική διαφορά στο προφίλ (μέση απόλυτη διαφορά, πακέτο Bioconductor «arrayQualityMetrics») θεωρήθηκαν ως ακραίες τιμές και αφαιρέθηκαν από μεταγενέστερους ανάλυση. Αυτή η διαδικασία απομάκρυνε τρεις ιστούς OC (δύο δείγματα επιθηλιακού ιστού καρκινώματος και ενός επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών δείγμα οριακά ιστού) και ένας φυσιολογικά επιθηλιακά δείγμα ωοθηκικό ιστό.

ανάλυση Διαφορική έκφραση πραγματοποιήθηκε στις υπόλοιπες 59 δειγμάτων χρησιμοποιώντας t-test ( πακέτο R «limma»). miRNAs που παράγουν ψευδή ρυθμό ανακάλυψης (FDR) -adjusted p-τιμές κάτω από 0,1 και διπλώστε την αλλαγή πάνω από 2 κλήθηκαν διαφορικά εκφρασμένων.

Για να αναπτύξει έναν αλγόριθμο πρόβλεψης για τη διάγνωση OC από έναν πληθυσμό των δειγμάτων που περιέχουν 39 επιθηλιακά των ωοθηκών ιστούς καρκίνωμα μαζί με 6 επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών οριακά ιστούς και 14 φυσιολογικά επιθηλιακά ιστών ωοθήκης, τρεις μεθόδους ταξινόμησης δοκιμάστηκαν: υποστήριξη φορέα μηχάνημα (SVM, πακέτο Bioconductor «E1071″), Κ-πλησιέστερων γειτόνων (πακέτο Bioconductor «τάξη»), και διαγώνια γραμμική διακριτική ανάλυση (πακέτο Bioconductor «sfsmisc»). Η απόδοση των αλγορίθμων που είχε εκτιμηθεί αρχικά χρησιμοποιώντας διαδικασία επικύρωσης σταυρό άδεια-one-out για διαφορετικό αριθμό δεικτών πρόβλεψης. Για κάθε σύνολο των δειγμάτων εκπαίδευσης, miRNAs ταξινομήθηκαν με βάση την τιμή p t-test τους δημιουργούνται κατά τη σύγκριση του καρκίνου ιστούς κατά φυσιολογικούς ιστούς. Η κορυφή n miRNAs (όπου το η επιτρέπεται να κυμαίνεται μεταξύ 2 και 50) χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή ενός μοντέλου πρόβλεψης με βάση τις πληροφορίες σχετικά με τα δείγματα εκπαίδευση και εφαρμόζεται στο υπόλοιπο δείγμα δοκιμής. τάξη πρόβλεψη και την πιθανότητα καταγράφηκαν για κάθε δείγμα και ταξινόμηση αλγόριθμο. Σταθερότητα των καταλόγων προγνωστικό miRNA χρησιμοποιηθεί με δείγματα εκπαίδευση αξιολογήθηκε από το ποσοστό επικάλυψης από την κορυφή n miRNAs των καταλόγων αυτών. Λόγω του περιορισμένου αριθμού των δειγμάτων που διατίθενται για αυτή τη μελέτη, η κοινή miRNA από τους καταλόγους αυτούς επιλέχθηκαν ως τον τελικό κατάλογο των προγνωστικών (επιλεγμένες δείκτες). Σημαντικές διαφορές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student και θεωρούνται σημαντικές αν Ρ αξία & lt? 0,05. Στην ανάλυση, η ευαισθησία ορίζεται ως το ποσοστό των καρκινικών ιστών που έχουν αναγνωριστεί σωστά ως έχουν αυτή την κατάσταση, ενώ η εξειδίκευση ορίζεται ως το ποσοστό των φυσιολογικών ιστών που έχουν αναγνωριστεί σωστά ως κανονικό.

Αποτελέσματα

κλινικά και παθολογικά ευρήματα

τα κλινικά χαρακτηριστικά των 45 ασθενών με OC και 14 φυσιολογικούς μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη μας συνοψίζονται στον πίνακα 1. ηλικίες των ασθενών με OC κυμαίνονταν 20-81 ετών (διάμεση τιμή, 57 χρόνια), ενώ η κανονική ελέγχους κυμαίνονταν μεταξύ 21 και 75 χρόνια (διάμεση τιμή, 56). Όλα αυτά τα δείγματα είχαν διαγνωστεί με παθολογία και είχε μακροσκοπική περιγραφή. Ανά 2012 Soft Tissue OC Κατευθυντήρια γραμμή της Εθνικής Comprehensive Δίκτυο Καρκίνου, οι διαφορετικές ποιότητες της διαφοροποίησης των όγκων των ασθενών σε αυτή τη μελέτη περιελάμβανε τα εξής: 8 περιπτώσεις με βαθμού Ι (16,7%), 11 περιπτώσεις με βαθμό Β (23%), 18 περιπτώσεις με βαθμός III (37,5%), και 11 περιπτώσεις με απροσδιόριστο (23%)? και τα στάδια του όγκου ήταν 14 περιπτώσεις με το στάδιο Ι (29,2%), 5 περιπτώσεις με τη φάση ΙΙ (10,4%), 27 περιπτώσεις με σταδίου ΙΙΙ (56,3%), και 2 περιπτώσεις με το στάδιο IV (4,2%) των καρκίνων.

miRNA σύγκριση έκφραση

για να εξαλείψει τις διαφορές στις εισροές RNA που χρησιμοποιείται στο προφίλ των δειγμάτων 63 ωοθηκικού ιστού σε αυτή τη μελέτη, ο ποσοστημόριο-Median μέθοδο [16] χρησιμοποιήθηκε για την επεξεργασία των πρώτων μετρήσεων Ct. Συνολικά, τα στοιχεία των 59 δείγματα ωοθηκικού ιστού αναλύθηκαν για την έκφραση των miRNAs.

Για να διερευνηθεί η δυνατότητα να εντοπίσει μια υπογραφή έκφραση των miRNAs της OC από δείγματα ιστών, miRNA προφίλ έκφρασης των 59 δειγμάτων RNA ιστών ωοθήκης που συλλέχθηκαν από 39 δείγματα ιστού επιθηλιακό καρκίνο, καρκίνο των ωοθηκών δείγματα οριακά ιστού 6 επιθηλιακά, και 14 φυσιολογικά επιθηλιακά δείγματα ωοθηκικού ιστού αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τους προσδιορισμούς 1696 miRNA ανιχνεύεται (Ct & lt? 32) σε τουλάχιστον 10% των δειγμάτων σε αυτή τη μελέτη. Τα 45 ιστοί OC συγκρίθηκαν με τις 14 φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών χρησιμοποιώντας t-test. 305 miRNAs βρέθηκαν να έχουν FDR προσαρμοσμένο p-τιμή κάτω από 0,1 και διπλώστε την αλλαγή παραπάνω 2. Μια σύνοψη των ευρημάτων αυτών παρουσιάζονται στο Σχήμα 1. διαφορικά εκφρασμένο miRNAs κάλυψαν μεγάλο εύρος τιμών Ct και διπλώστε τις αλλαγές.

Α) Το οικόπεδο των αναλύσεων miRNA που χρησιμοποιούνται στο προφίλ συνέκριναν δείγματα: φορές αλλαγή (άξονας y) έναντι κανονικοποιημένες μετρήσεις Ct. Β) οικόπεδο Volcano των προκυπτόντων ρ-τιμές της t-test (άξονας γ) μεταξύ των C και Ν ομάδες. 305 miRNAs δείχνουν p-τιμές FDR προσαρμοσμένο κάτω από 0,1 και διπλώστε την αλλαγή πάνω από 2 (φαίνεται με κόκκινο χρώμα). Γ) Ιεραρχική ομαδοποίηση (R pvclust πακέτο) από τις 45 ωοθηκών καρκινικούς ιστούς και 14 ωοθηκών φυσιολογικούς ιστούς βασίζεται στο top 50 πιο μεταβλητή δοκιμασίες miRNA. Για κάθε ομάδα σε ιεραρχική ομαδοποίηση, οι ποσότητες που ονομάζεται

σ

-τιμές (περίπου αμερόληπτη

σ

-τιμή (κόκκινο) και p-value Bootstrap Πιθανότητα (πράσινο)) υπολογίζονται μέσω πολυ-κλίμακας εκκίνησης αναδειγματοληψία.

P

-τιμή ενός cluster είναι μια τιμή μεταξύ 0 και 1, η οποία δείχνει πόσο ισχυρή είναι η συστάδα υποστηρίζεται από τα δεδομένα. Δ) 17% της διακύμανσης που παρατηρείται στις μετρήσεις Ct των κορυφαίων 50 πιο μεταβλητή δοκιμασίες miRNA σε όλα τα δείγματα μπορεί να εξηγηθεί από το καθεστώς παθολογία του δείγματος (C ή N). Τα υπόλοιπα συμπαράγοντες που εξετάζονται εδώ (source = πηγή του νοσοκομείου, την επιβίωση, την ιστολογία του όγκου, το στάδιο της νόσου, το βαθμό του όγκου, την υποτροπή, και το στάδιο) εξηγούν το 24% της διακύμανσης.

Η

Σύγκριση των miRNA έκφραση μεταξύ διαφορετικών τύπων του ΕΓΚ δείγματα ιστού

Η έκφραση των miRNAs των δειγμάτων 59 ιστού που συγκρίθηκαν περιλαμβάνονται 45 δείγματα που περιλαμβάνει την ομάδα Γ [συμπεριλαμβανομένων 39 επιθηλιακά δείγματα ωοθηκικού καρκίνου του ιστού (ομάδα CE) και τα δείγματα καρκίνου των ωοθηκών οριακά ιστού 6 επιθηλιακά (CB ομάδα)] και 14 φυσιολογικά επιθηλιακά δείγματα ωοθηκικού ιστού (ομάδα Ν).

Η ιεραρχική ομαδοποίηση των miRNAs φάνηκε από FDR προσαρμοσμένο p-τιμές κάτω από 0.1 και διπλώστε αλλαγής πάνω από 2 (κόκκινο σημείο). Οι συγκρίσεις για 335 διαφορικά-εκφρασμένα miRNAs στις ομάδες CE και Ν φαίνεται στο Σχήμα S2 σε S1 αρχείο. Σε αντίθεση, κανένας υποψήφιος δεν miRNAs παρατηρήθηκαν όταν η ομάδα CB συγκρίθηκε με την ομάδα Ν (Σχήμα S3 στο αρχείο S1) και όταν η ομάδα CE συγκρίθηκε με την ομάδα CB (Σχήμα S4 στο αρχείο S1). Η μείωση του αριθμού των καρκινικών ιστών οριακά διαθέσιμο για αυτή τη μελέτη θα μπορούσε να περιορίσει την εξουσία στον εντοπισμό σημαντικών αλλαγών και να εξηγήσει την έλλειψη αλλαγές που παρατηρούνται σε αυτές τις συγκρίσεις.

επιλογή βιοδεικτών

Ακρίβεια των τριών δοκιμασμένες μεθόδους για διαφορετικό αριθμό δεικτών predictor που κυμαίνονται μεταξύ 2 και 50 παρουσιάζεται στο Σχήμα 2. ακρίβεια πρόβλεψης ήταν σχετικά παρόμοια μεταξύ των μεθόδων που χρησιμοποιούνται, καθώς και μια καλύτερη απόδοση για τα μοντέλα ταξινόμησης βασίστηκε σε μείωση του αριθμού των δεικτών miRNA (Εικόνα 2Α). Σταθερότητα (άξονας γ) μετρήθηκε ως επί τοις εκατό επικάλυψη μεταξύ των καταλόγων των δεικτών miRNA χρησιμοποιούνται για την ταξινόμηση (59 σε αυτή την ανάλυση, μία για κάθε δείγμα που χρησιμοποιείται για τη δοκιμή) παρουσιάζεται στο Σχήμα 2Β ως συνάρτηση του αριθμού των σημειωτών που χρησιμοποιούνται (χ-άξονας ). Όπως ήταν αναμενόμενο, η επικάλυψη μεταξύ των επιλεγμένων καταλόγων miRNA προγνωστικών αυξήθηκε στο 90% περίπου όταν η πρόβλεψη βασίστηκε σε 11 ή περισσότερους δείκτες, γεγονός που υποδηλώνει μια μειωμένη επίδραση στο στάδιο επιλογής δείκτη από μεμονωμένα δείγματα.

Α) Ποσοστό σφάλματος που παράγεται από διαφορετικούς αλγόριθμους ταξινόμησης ως συνάρτηση του αριθμού των δεικτών πρόβλεψης που χρησιμοποιείται. διαδικασία διασταυρωμένης επικύρωσης αφήσει-one-out χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί με αποτέλεσμα τα ποσοστά σφάλματος. Β) Ποσοστό επικάλυψη των προγνωστικός miRNA που επιλέγονται από τα διαφορετικά σύνολα εκπαίδευσης των δειγμάτων που χρησιμοποιούνται. C) Αφήστε-one-out αποτελέσματα σταυρό επικύρωση: κάθε πιθανότητα τάξης του δείγματος (άξονας y) υπολογίζεται με βάση το μοντέλο SVM μάθει από όλα τα άλλα δείγματα. Οι ιστοί (καρκίνος ασπρόμαυρη, κανονική κόκκινο) αντιπροσωπεύεται από την πιθανότητα κατάταξης της ύπαρξης καρκίνου. Δ) της καμπύλης ROC με βάση τα αποτελέσματα σταυρό επικύρωση άδεια-one-out με τη μέθοδο SVM.

Η

miRNA ελέγχου και δοκιμών μεταξύ του καρκίνου των ωοθηκών και κανονικές ομάδες

Οι 10 κοινές miRNAs σε όλη την καταλόγους των μεταχειρισμένων δείκτες για τις προβλέψεις που βασίζονται στις 11 miRNAs επιλέχθηκαν ως τελικός κατάλογος των βιοδεικτών για τη διάγνωση OC. Μερικά χαρακτηριστικά αυτών των miRNAs, συμπεριλαμβανομένων φορές αλλαγή μεταξύ καρκίνου και φυσιολογικούς ιστούς μαζί με τις τιμές p t-test και FDR προσαρμοσμένο ρ-τιμές, που παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Τα 10 miRNAs περιλαμβάνονται miR-1271-5p και miR-574 -3p, η οποία είχε σημαντικά χαμηλότερη έκφραση (οι τιμές Ρ παρουσιάζονται στον πίνακα 2) επίπεδα στην ομάδα του καρκίνου των ωοθηκών (ομάδα C) σε σχέση με την κανονική ομάδα. Αντίθετα, άλλες miRNAs όπως miR-182-5p, miR-183-5p, miR-96-5p, miR-15b-5P, miR-182-3p, miR-141-5p, miR-130 Β-5ρ, και miR-135b-3ρ είχαν σημαντικά υψηλότερο επίπεδο έκφρασης στην ομάδα των ωοθηκών καρκίνο δείγματα ιστών (ομάδα Γ) σε σχέση με την κανονική ομάδα (οι τιμές P παρουσιάζονται στον πίνακα 2).

η

η απόδοση ταξινόμησης του επιλεγεί 10 miRNAs για τον αλγόριθμο SVM μετά τη χρήση της άδειας-one-out διαδικασία διασταυρωμένης επικύρωσης παρουσιάζεται στο Σχήμα 3. από τη λίστα των επιλεγμένων miRNA χρησιμοποιούνται όλα τα δείγματα, η απόδοση που παρουσιάζεται εδώ μπορεί να είναι μια υπερεκτίμηση της πραγματικής μία. Αυτό αντανακλάται στην βελτιωμένη ακρίβεια της απόδοσης πρόβλεψης, όταν στάδιο επιλογής δείκτης ήταν ανεξάρτητη για το σύνολο δοκιμές των δειγμάτων (Σχήμα 3). Η παρατηρούμενη ακρίβεια ήταν 86%, ενώ η παρατηρούμενη ακρίβεια για επιλεγμένες δείκτες ήταν 96%. Η ευαισθησία στην ανίχνευση OC βάσει επιλεγμένων δεικτών ήταν 97%, ενώ η ειδικότητα ήταν 92% με μια περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) της προκύπτουσας λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη (ROC) καμπύλη των 0.978. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των μεγάλων κλινικών παραγόντων που συλλέγονται για τα δείγματα που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη (Σχήμα 3D)

Α) πιθανότητες πρόβλεψης (καρκίνος των ωοθηκών) για κάθε δείγμα που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη (C = Cancer?. Ν = Κανονικός). Β) καμπύλη ROC. Γ) σφάλμα πρόβλεψης σε διάφορες ομάδες ιστού: φυσιολογικού ιστού (Ν), επιθηλιακά καρκινώματα ιστών (CE) και οριακά ιστούς (CB). Δ) σφάλμα πρόβλεψης μέσα στις ομάδες βαθμού όγκου [Αυξημένη λάθος στο χαμηλότερο δείγματα βαθμό (αλλά όχι σημαντική)].

Η

Συζήτηση

Για να βρείτε συγκεκριμένες προφίλ των miRNAs ιστών που προέρχονται από EOC, μία συγκριτική μελέτη διεξήχθη χρησιμοποιώντας μία πλατφόρμα συστοιχίας qRT-PCR μεταξύ 45 επιθηλιακά κύτταρα των ιστών δείγματα από ασθενείς με EOC και 14 επιθηλιακά κύτταρα δείγματα φυσιολογικού ιστού από υγιείς ελέγχους. Η μελέτη αποκάλυψε ότι το 10 απορυθμισμένη miRNA υπογραφή μεταξύ των οποίων HSA-miR-1271-5p και HSA-miR-574-3p ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω? και HSA-miR-182-5p, HSA-miR-183-5p, HSA-miR-96-5p, HSA-miR-182-3p, HSA-miR-141-5p, HSA-miR-15b-5P, HSA -miR-130b-5P και HSA-miR-135b-3ρ ήταν υπερεκφράζεται σε ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών. Τα ευρήματα αυτά θα μπορούσαν να διακρίνουν αποτελεσματικά OC ιστούς από φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών, υποδηλώνοντας την παρουσία των συγκεκριμένων miRNAs στο ΕΓΚ. Η υπογραφή 10-miRNA εντοπίζονται στη μελέτη μπορεί να συμβάλει στην καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού της EOC ογκογένεσης και ανάπτυξης και επίσης να βοηθήσει στη διάγνωση του ΕΓΚ

σύστημα έκφρασης miRNA που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη κατείχε τα ακόλουθα σημαντικά πλεονεκτήματα.: (1) η μεγαλύτερη συλλογή από έγκυρες δοκιμασίες (1722 ανθρώπινα miRNAs σε miRBase κατά 20,0), (2) ένα από τα μεγαλύτερα εύρος ανίχνευσης (μέχρι 6 τάξεις μεγέθους), (3) η πιο ευαίσθητη ανίχνευση (κάτω σε ένα μόνο αντίγραφο αριθμός), (4) την υψηλότερη ειδικότητα (& lt? 3% διασταυρούμενη αντιδραστικότητα μεταξύ 8 μέλη της οικογένειας ας-7). Τρεις διαφορετικές μέθοδοι ταξινόμησης χρησιμοποιήθηκαν με ένα σταυρό διαδικασία επικύρωσης άδεια-one-out για την ελαχιστοποίηση των σφαλμάτων. Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η μεγαλύτερη κλίμακα των miRNAs (1722) έκφραση προφίλ μελέτη που πραγματοποιήθηκε με τη χρήση qRT-PCR μέχρι σήμερα.

Είχαμε αναλύσει την διακύμανση αποσύνθεση του καρκίνου και του φυσιολογικού ιστού δείγματα και έδειξε το αποτέλεσμα στο σχήμα 1D. Αναγνωρίσαμε ότι δεν υπάρχει καμία συσχέτιση με την πηγή νοσοκομείο, την επιβίωση, την ιστολογία του όγκου, το στάδιο της νόσου, τον βαθμό του όγκου και ακόμη και το υποτροπή, εκτός από τα δείγματα (δείγματα φυσιολογικού ιστού εναντίον δείγματα κακοήθους ιστού). Το πιο σημαντικό, οι 10 miRNAs διακρίσεις την ομάδα του ΕΓΚ από την κανονική ομάδα με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα, γεγονός που υποδηλώνει πιθανή αξία τους για την έγκαιρη ανίχνευση του οργανωμένου εγκλήματος. Ανέφεραν ότι η κατάταξη της ομάδας C από Ν ομάδα θα μπορούσε να αναμένεται να έχει 97% ευαισθησία και 92% ειδικότητα.

Η υπογραφή 10-miRNA εντοπίζονται στην μελέτη έδειξε εξέχοντα διαφοροποίηση μεταξύ ΕΓΚ από φυσιολογικούς μάρτυρες. Μεταξύ αυτών των miRNAs, miR-96, miR-182 και miR-183 είναι συγκεντρωμένα σε ένα τόπο του χρωμοσώματος 7 [17] και miR-141-5p ανήκει στην οικογένεια miR-200, το οποίο είναι συγκεντρωμένα στα χρωμοσώματα 12. Δεν μόλις miR-141, βρήκαμε περαιτέρω ότι και άλλα μέλη (200Α /b /c) της οικογένειας miR200 επίσης υπερεκφράζονται σε EOC σύγκριση με την κανονική (Πίνακας 3). Και οι δύο δύο συστάδες miRNA είναι γνωστό ογκογόνους συστάδες miRNA που έχουν εκτενώς αναφερθεί να συμμετάσχουν στη γένεση όγκου σε πολλούς τύπους όγκων [18] – [20]. Τα μέλη της οικογένειας του miR-200 έχουν αναφερθεί με στόχο ZEB1 και ZEB2, παράγοντες μεταγραφής Zeb είναι ζωτικής σημασίας καταστολείς της BMP σηματοδότησης, και Peart et al ανέφεραν ότι BMP σηματοδότησης ελέγχει το κακόηθες δυναμικό της ασκίτη που προέρχονται από ανθρώπινα επιθηλιακά σφαιροειδή ωοθηκών μέσω της ενεργοποίησης ΑΚΤ κινάσης [ ,,,0],21]. Τα μέλη (miR200b και miR429) της οικογένειας miR200 έχουν αναφερθεί να σχετίζεται σημαντικά με την υποτροπή του καρκίνου των ωοθηκών και της συνολικής επιβίωσης [18]. Για σύμπλεγμα miR183-96-182, Xu ανέφερε ότι υπερεκφράζεται miR-182 και miR-96 που στοχεύουν πιρούνι κουτί κεφάλι O3 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στο φαινόμενο προ-πολλαπλασιασμό της λεπτίνης σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [22]. miR-182 αναφέρθηκε άμεσα και αρνητικά ρυθμίζει μια σημαντική ογκοκατασταλτικό, προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο 4 (PDCD4) σε OC [23]. miR-183 επιβεβαιώνεται να έχει αρνητικές ρυθμιστικές επιδράσεις στην έκφραση Tiam1, η οποία συμβάλλει στην επεμβατική, μεταναστευτικών και ιδιότητες βιωσιμότητα των κυττάρων OC [24]. Μια πρόσφατη μελέτη από αλληλούχιση μικρών RNAs από ισογονιδιακές p21 + /+ και p21 – /- κύτταρα έδειξαν ότι τα διάφορα συμπλέγματα miRNA, miR-200b-200a-429, miR-200c-141 και miR-183-96-182 ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε p21-ανεπαρκή κύτταρα, εάν προσθέτοντας ανταγωνίζεται miR-200 και miR-183-96-182 miRNAs συμπλέγματος σε p21 + /+ κύτταρα, αυξήθηκε εισβολή και αυξημένα τα επίπεδα του

VIM

,

ZEB1

και

Slug

mRNA, που είναι κοινοί στόχοι του miR-183 και miR-96. Η μελέτη διαπίστωσε επίσης ότι οι μορφές p21 ένα συγκρότημα με ZEB1 στο υποστηρικτής συμπλέγματος miR-183-96-182 να αναστέλλουν μεταγραφική καταστολή αυτής της συστάδας με ZEB1 προτείνοντας αμοιβαία βρόχος ανάδρασης [25]. Μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι τα μέλη της οικογένειας miR-200 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ορώδες επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών κυτταρική γραμμή καθώς επίσης και σε ορό από ασθενείς με ορώδες επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών [26], [27].

Η

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα συμπλέγματα του miR-183-96-182 και miR200 παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στην EOC και μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πιθανοί διαγνωστικών βιοδεικτών για την ανίχνευση του ΕΓΚ καθώς έχει θεραπευτικές δυνατότητες για την καταστολή του πολλαπλασιασμού των ωοθηκών και της εισβολής .

Το μοντέλο SVM χρησιμοποιήθηκε περαιτέρω με προφίλ δεδομένα που δημιουργούνται από τα δείγματα των επιθηλιακών κυττάρων ως δεδομένα εκπαίδευσης για να ελέγξετε τον καρκίνο των ωοθηκών δείγματα επιθηλιακού ιστού οριακά. Έξι από τα δείγματα 7 OC προβλέφθηκαν ως OC, η οποία έδειξε ότι το ταυτοποιημένο υπογραφή θα μπορούσε επίσης να είναι χρήσιμη για την ανίχνευση OC από δείγματα οριακά ιστού (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Ωστόσο, αυτό μπορεί να χρειαστεί ένα μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος για επιβεβαίωση. Ωστόσο, δεν υπάρχουν σημαντικές miRNAs θα μπορούσε να διαχωρίσει CB από Ν ομάδα, ή CB από την ομάδα CE. Αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί στη μειωμένη δύναμη στην ανίχνευση των διαφορών μεταξύ 39 επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών δειγμάτων (CE) και 6 επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών δείγματα οριακά ιστού (CB). Περαιτέρω μελέτες με μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος που απαιτείται για να επιβεβαιωθεί αυτή η εξήγηση.

Μερικές σημαντικές διαφορές στην miRNAs παρατηρήθηκαν επίσης για τον διαχωρισμό των επιθηλιακών δείγματα καρκίνου των ωοθηκών (χωρίς τα επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών δείγματα οριακά ιστού) από φυσιολογικά δείγματα. Οι επτά απορυθμισμένη miRNAs συμπεριλαμβανομένων HSA-miR-182-5p, HSA-miR-183-5p, HSA-miR-96-5p, HSA-miR-1271-5p, HSA-miR-182-3p, HSA-miR-1468 -5p, και HSA-miR-135b-3ρ (Πίνακας S1 στο αρχείο S1) επιβεβαιώθηκαν με την AUC της καμπύλης ROC (AUC = 0,965) με 97% ευαισθησία και 85% ειδικότητα (Σχήμα S5 στο S1 αρχείο). 6 από αυτά τα 7 miRNAs (HSA-miR-182-5p, HSA-miR-183-5p, HSA-miR-96-5p, HSA-miR-1271-5p, HSA-miR-182-3p, και HSA- miR-135b-3ρ) είναι στην υπογραφή 10-miRNAs. Τα 10 μοναδικά προφίλ miRNA διακρίνεται επιθηλιακά δείγματα καρκινικού ιστού των ωοθηκών συμπεριλαμβανομένων των επιθηλιακών δείγματα καρκινικού ιστού των ωοθηκών και επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών δεσμεύεται δείγματα γραμμή ιστού από φυσιολογικά επιθηλιακά δείγματα ωοθηκικού ιστού με 97% ευαισθησία και 92% ειδικότητα. Το προφίλ έκφρασης του 7 miRNA υπογραφή ήταν επίσης σε θέση να ταξινομήσει επιθηλιακά δείγματα καρκινικού ιστού των ωοθηκών και φυσιολογικό επιθηλιακό ιστό των ωοθηκών. Τα ευρήματα αυτά μπορούν να αποτελέσουν τη βάση για μελλοντικές μελέτες σχετικά με την κλινική αξία των miRNAs όγκου στην πρόβλεψη θεραπευτική αποτελεσματικότητα, τη διατήρηση της επιτήρησης, καθώς και πρόβλεψη της πρόγνωσης και βοηθούν την καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού των επιθηλιακών γένεση των ωοθηκών των όγκων και την ανάπτυξη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 αρχείου.

Υποστήριξη στοιχεία πληροφοριών. Εικόνα S1, Επισκόπηση του πειραματικού σχεδιασμού. Εικόνα S2, Σύγκριση μεταξύ των ωοθηκών επιθηλιακά καρκινώματα ιστού (ομάδα CE) και φυσιολογικού ιστού (ομάδα Ν). Α) οικόπεδο MA των δοκιμασιών που χρησιμοποιούνται στο προφίλ συνέκριναν δείγματα. οικόπεδο Β) ηφαίστειο των προκυπτόντων p-τιμές του t-test ανάμεσα στο CE και τις ομάδες Ν. 335 miRNAs δείχνει προσαρμόζεται π-αξίες (FDR) κάτω από 0,1 και διπλώστε-αλλαγές πάνω από 2 (φαίνεται με κόκκινο χρώμα). Γ) Ιεραρχική ομαδοποίηση των CE και Ν ομάδες με βάση την κορυφή 50 πιο μεταβλητή δοκιμασίες miRNA. Εικόνα S3, Σύγκριση μεταξύ του οριακού ιστού (ομάδα CB) ωοθηκών και του φυσιολογικού ιστού (ομάδα Ν). Α) οικόπεδο MA των δοκιμασιών που χρησιμοποιούνται στο προφίλ συνέκριναν δείγματα. οικόπεδο Β) ηφαίστειο των προκυπτόντων p-τιμές του t-test μεταξύ της ΚΤ και των ομάδων Ν. Δεν miRNA δείχνει προσαρμοσμένη p-τιμές (FDR) κάτω από 0,1 και διπλώστε-αλλαγές πάνω από 2 (φαίνεται με κόκκινο χρώμα). Γ) Ιεραρχική ομαδοποίηση των CB και Ν ομάδα που βασίζεται στο top 50 πιο μεταβλητή δοκιμασίες miRNA. Εικόνα S4, Σύγκριση μεταξύ του επιθηλιακού ιστού των ωοθηκών καρκινώματα (ομάδα CE) και των ωοθηκών οριακά ιστού (ομάδα CB). Α) οικόπεδο MA των δοκιμασιών που χρησιμοποιούνται στο προφίλ συνέκριναν δείγματα. οικόπεδο Β) ηφαίστειο των προκυπτόντων p-τιμές του t-test μεταξύ CE και CB ομάδες. Δεν miRNAs δείχνει προσαρμόζεται π-αξίες (FDR) κάτω από 0,1 και διπλώστε-αλλαγές πάνω από 2 (φαίνεται με κόκκινο χρώμα). Γ) Ιεραρχική ομαδοποίηση των CE και CB ομάδες με βάση την κορυφή 50 πιο μεταβλητή δοκιμασίες miRNA. Εικόνα S5, επτά επιλεγμένα miRNAs συγκρίνοντας ομάδα CE με την κανονική ομάδα. Α) πιθανότητα Πρόβλεψη SVM, 53 δείγματα με ένα σφάλματα = 3 (0,06 & gt? 0,05). Β) Η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC = 0,965) εκτίμηση για τον πίνακα microRNA στην ομάδα CE από την κανονική ομάδα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0096472.s001

(DOC)