πρόσφυση

Αφηρημένο

κυττάρου-κυττάρου είναι υψίστης σημασίας για την παροχή και τη διατήρηση πολυκύτταρους δομή και μετάδοση σημάτων μεταξύ των κυττάρων. Στο δέρμα, διαταραχή των δεσμοσωμάτων ρυθμιζόμενη μεσοκυττάρια συνδεσιμότητα μπορεί να οδηγήσουν σε διαταραχές της κερατινοποίησης και υπερπολλαπλασιαστικών ασθένεια συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Πρόσφατα δείξαμε διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν δεσμογλεΐνης 2 (Dsg2) στην επιδερμίδα την ανάπτυξη υπερπλασίας. Μετά μικροσυστοιχιών και ανάλυση του δικτύου γονιδίων, έχουμε αποδείξει ότι Dsg2 προκάλεσε μια βαθιά αλλαγή στο μεταγραφικό των κερατινοκυττάρων

in vivo

και μεταβάλλεται μια σειρά από γονίδια σημαντικά στην επιθηλιακή δυσπλασία όπως: ασβέστιο-δεσμευτικές πρωτεΐνες (S100A8 και S100A9), τα μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών κυκλίνης, και η πρωτεάση κυστεΐνη αναστολέα κυστατίνη Α (CSTA). CSTA απορυθμίζεται σε διάφορες καρκίνου του δέρματος, συμπεριλαμβανομένων καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (SCC) και απώλεια μεταλλάξεων λειτουργίας οδηγούν σε υπολειπόμενες διαταραχές ευθραυστότητα του δέρματος. Τα αποτελέσματα μικροσυστοιχιών επιβεβαιώθηκαν με qPCR, ανοσοαποτύπωση και ανοσοϊστοχημεία. CSTA ανιχνεύθηκε σε υψηλό επίπεδο καθ ‘όλη τη νεογέννητο επιδερμίδα του ποντικιού, αλλά δραματικά μειωθεί με την ανάπτυξη και ανιχνεύθηκε κυρίως στα διαφοροποιημένα στρώματα. Σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα, knockdown του Dsg2 με siRNA ή shRNA μειωμένη έκφραση CSTA. Επιπλέον, siRNA knockdown του CSTA οδήγησε σε κυτταροπλασματικό εντοπισμό του Dsg2, διαταράσσεται χρώση κυτοκερατίνης 14 και μειωμένα επίπεδα δεσμοπλακίνη σε απόκριση σε μηχανική ένταση. Τόσο knockdown του είτε Dsg2 ή CSTA επαγόμενη απώλεια της κυτταρικής πρόσφυσης σε μία δοκιμασία που βασίζεται σε δισπάση και η επίδραση ήταν συνεργιστική. Τα ευρήματά μας εδώ προσφέρουν μια νέα πορεία της ρύθμισης CSTA που αφορούν Dsg2 και μια πιθανή στιχομυθία μεταξύ Dsg2 και CSTA που ρυθμίζει την κυτταρική προσκόλληση. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν περαιτέρω τις πρόσφατες ανθρώπινη γενετική ευρήματα ότι η απώλεια των μεταλλάξεων λειτουργίας στο γονίδιο αποτέλεσμα CSTA στην ευθραυστότητα του δέρματος που οφείλονται σε διαταραχή της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου: αυτοσωματικό υπολειπόμενο-απολεπιστική ιχθύαση ή των άκρων ξεφλούδισμα του δέρματος σύνδρομο

Παράθεση:. Gupta Α, Nitoiu D, Brennan-Κρίσπι D, Addya S, Riobo NA, Kelsell DP, et al. (2015) Cell Κύκλια- και σχετίζονται με τον καρκίνο γονιδίων Δίκτυα Ενεργοποιείται από Dsg2: Απόδειξη της Cystatin Α απορρύθμιση και έναν πιθανό ρόλο στην κυττάρων-κυτταρικής προσκόλλησης. PLoS ONE 10 (3): e0120091. doi: 10.1371 /journal.pone.0120091

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Johanna Μ Brandner, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Hamburg-Eppendorf, Γερμανία

Ελήφθη: 5 Σεπ, 2014? Αποδεκτές: 2 του Φεβρουαρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 18 Μάρτη του 2015

Copyright: © 2015 Gupta et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και. δεδομένων των μικροσυστοιχιών υποβλήθηκε στην έκφραση γονιδίων (αριθμός Προσχώρησης: GSE62814) Omnibus

Χρηματοδότηση: Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (Mahoney, R01AR056067? Riobo, RO1 GM088256).. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

δεσμοσώματα αποτελούν μείζονες δομές προσκόλληση εντοπίζεται στα κυττάρου-κυττάρου σύνορα των επιθηλιακών κυττάρων όπου τα κυτταροπλασματικά συστατικά πλάκας, συμπεριλαμβανομένου του plakin (δεσμοπλακίνη) και κερατίνη οικογένειες, συναρμολόγηση με την Armadillo (πλακοσφαιρίνη και plakophilins) και καντερίνη (δεσμογλεΐνες και desmocollins) οικογένειες πρωτεϊνών [1,2]. Αυτές οι δομές προσκόλληση είναι ουσιαστικής σημασίας όχι μόνο για τη διατήρηση της δομής των κυττάρων και την ακεραιότητα, αλλά και για την ανάπτυξη των ιστών και μορφογένεση. Μεταλλάξεις εντός του δεσμόσωμα είναι η υποκείμενη αιτία πολλών διαταραχών ευθραυστότητα δέρματος, με ή χωρίς την καρδιά ανωμαλίες [3]. Επιπλέον, δεσμοσώματα επίσης να χρησιμεύσει ως «κέντρα σηματοδότησης» παίζουν ενεργό ρόλο στη διαμόρφωση πολλών σημαντικών οδών, συμπεριλαμβανομένης της Wnt /β-κατενίνης και /λεμφικών παράγοντα ενισχυτικό παράγοντα Τ-κυττάρων [4]. Αυξανόμενες αποδείξεις υποστηρίζει τη συμμετοχή τους στη διαμόρφωση της κυτταρικής τύχης και την επιβίωση. Δεσμοσωμάτων πρωτεΐνες μπορεί να ενεργοποιήσει την ενδοκυτταρική σηματοδότηση μέσω της ρύθμισης των επιπέδων έκφρασης και τα πρότυπα, τα οποία μπορεί να αλλάξει δραματικά την προσκόλληση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [5,6]. Στα ενδοφολιδωτά επιδερμίδα, Dsg2 κανονικά εκφράζεται σε πολύ χαμηλό επίπεδο και περιορίζονται στην πολλαπλασιαστική στρώμα βασικών κυττάρων. Πρόσφατα, έχουμε αναπτύξει ένα διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού που υπερεκφράζουν δεσμογλείνης 2 (Dsg2) στο δέρμα [5]. Διαπιστώσαμε ότι έκτοπη έκφραση Dsg2 ενεργοποιεί πολλαπλά μονοπάτια της ανάπτυξης και επιβίωσης που μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου. Αν και η Inv-Dsg2 διαγονιδιακά ποντίκια ανέπτυξαν προκαρκινικές θηλώματα και ήταν περισσότερο επιρρεπή σε επαγόμενη από χημικά καρκινογένεση, ο μηχανισμός με τον οποίο Dsg2 επάγει αυτές τις αλλαγές παραμένει ασαφής. Πρόσφατα έδειξε ότι Dsg2 συνεργάτες με caveolin-1 παρέχει ένα μηχανισμό για τη ρύθμιση μιτογονικής σηματοδότησης και ρύθμιση της παρουσίασης κυτταρική επιφάνεια, δύο από τα οποία μπορεί να συμβάλλουν σε κακοήθη μετασχηματισμό και την εξέλιξη του όγκου [7]. Στην έκθεση αυτή, επιδιώξαμε να αναγνωριστούν γονίδια που σχετίζονται με το φαινότυπο υπερπολλαπλασιαστικών με σύγκριση του προφίλ έκφρασης του Inv-Dsg2 διαγονιδιακά ποντίκια με cDNA από ποντίκια άγριου τύπου ως έλεγχος, μέσω ανάλυσης μικροσυστοιχιών.

Συγκεκριμένα, βρήκαμε Dsg2 συνδέθηκε με τη ρύθμιση της κυστατίνης α (CSTA? ποντικός Csta1-3), που αναφέρεται επίσης ως stefin α, αναστολέας πρωτεάσης κυστεΐνης οξύ, keratolinin ή «αναστολέας πρωτεάσης SH-επιδερμική», ένα μέλος των αναστολέων πρωτεάσης κυστεΐνης τύπου 1 [ ,,,0],8-11]. CSTA εκφράζεται κυρίως σε επιθηλιακά και λεμφοειδείς ιστούς όπου προστατεύει την πρωτεολυτική επεξεργασία των κυτταροπλασματικών και κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών με αναστολή καθεψίνες, οι παπαΐνη-όπως, λυσοζωμικού πρωτεασών κυστεΐνης [12-14]. Ως εκ τούτου, δεν αποτελεί έκπληξη ότι CSTA διαθέτει έναν αριθμό βιολογικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένης μιας βακτηριοστατική ρόλο για την προστασία των ιστών από πρωτεάσες κυστεΐνης που παράγονται από την εισβολή παθογόνων [15]. στο δέρμα, CSTA ταυτοποιήθηκε αρχικά στο φάκελο κερατινοποιημένου κυττάρου και προτείνεται να παίζει ένα ρόλο στην λειτουργία φραγμού στόχευση πρωτεάσες ακάρεα σκόνης [16]. Πιο πρόσφατα, ανακαλύψαμε ότι μεταλλάξεις στο

CSTA

γονιδίων είναι η υποκείμενη γενετική αιτία της πάθησης ευθραυστότητα δέρματος γνωστή ως αποφολιδωτική ichthyosis με διαταραγμένη προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου στα κατώτερα στρώματα της επιδερμίδας [17]. Επιπλέον, υπολειπόμενες μεταλλάξεις CSTA μπορεί να σχετίζεται με άκρων κατάσταση απολέπιση του δέρματος [18,19]. Εδώ, περιγράφουμε μια σειρά από μελέτες που διερευνούν Dsg2 και CSTA στην προσκόλληση των κερατινοκυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας που λειτουργεί κάτω Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον εσωτερική Φροντίδα ζώων και Επιτροπής Χρήση (IACUC) εγκεκριμένα πρωτόκολλα (642B και 642D).

Δημιουργία Inv-Dsg2 διαγονιδιακά ποντίκια

Σας έχει προηγουμένως συσταθεί διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν Dsg2 στο διακριτικής στρώματα της επιδερμίδας κάτω από τον έλεγχο του ινβολουκρίνης (Inv) προαγωγό (Σχ-Dsg2) [5]. Εν συντομία, ο ποντικός

Dsg2

.

Flag

cDNA υποκλωνοποιήθηκε στον επίτοπο πατρικό φορέα pH3700-pL2 στο

Δεν Ιστοσελίδα περιορισμού Ι καθοδικά του προαγωγέα ινβολουκρίνης. Γονοτυποποίηση και ο χαρακτηρισμός των διαγονιδιακών ποντικών έχουν περιγραφεί προηγουμένως λεπτομερώς [5]. ελέγχου άγριου τύπου και Inv-Dsg2 διαγονιδιακών αδελφών της παλιάς περίπου 6 εβδομάδων χρησιμοποιήθηκαν για αυτές τις μελέτες.

μικροσυστοιχιών ανάλυση

ιστούς του δέρματος με το ποντίκι, αποθηκεύονται σε RNAlater (Qiagen, Valencia, CA), κονιοποιήθηκαν με ένα θανάσιμο και γουδοχέρι και ομογενοποιήθηκε σε ομογενοποιητή Dounce. Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) και RNeasy (Qiagen) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα των κατασκευαστών. Συμπληρωματικό DNA (cDNA) συντέθηκε από 2 μg RNA χρησιμοποιώντας εξα-τυχαίων εκκινητών και M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (SuperScriptIII System, Invitrogen). Πρώτου κλώνου cDNA συντέθηκαν από 5 μg ολικού RNA (2 άγριου τύπου και 2 δείγματα διαγονιδιακά) με αντίστροφη μεταγραφή και χρησιμοποιείται για να παράγει επισημασμένα με βιοτίνη cRNA από

in vitro

μεταγραφή. Οι μικροσυστοιχίες στη συνέχεια σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας Στρεπταβιδίνη-Alexa 647 συζυγούς. Μετά τον υβριδισμό πλύθηκαν διαφάνειες σαρώθηκαν για την απόκτηση σημάτων φθορισμού για κάθε τοποθεσία με μια ScanArray XL-5000 ομοεστιακό σαρωτή (PerkinElmer, Boston, ΜΑ). Για να ποσοτικοποιηθούν οι εντάσεις φθορισμού για κάθε κηλίδα στη συστοιχία, εικόνες 16-bit, αναλύθηκαν με Quant Array 3,0 λογισμικού (PerkinElmer). Μετά την επεξεργασία της εικόνας, τα δεδομένα αναλύθηκαν από GeneSpring 11,5 λογισμικό (τεχνολογίες Agilent, Santa Clara, CA). Οι τιμές υποβάθρου με βάση την ένταση του σήματος γύρω από κάθε σημείο αφαιρέθηκαν, και τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν από quantile εξομάλυνση και χρησιμοποιώντας μέση αρχική τιμή μετατροπής όλων των δειγμάτων. δεδομένων των μικροσυστοιχιών υποβλήθηκε στην έκφραση γονιδίων Omnibus (αριθμός Προσχώρησης: GSE62814)

οικόπεδα Ηφαίστειο χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (μεγαλύτερη από ίση με 2 φορές και η στατιστική σημαντικότητα της P & lt? 0,05) με τη χρήση του μαθητή

t-test

(αταίριαστο) και όχι πολλαπλές διορθώσεις δοκιμές. Η διαφορικά εκφρασμένων λίστα γονίδιο φορτώθηκε σε Ingenuity Ανάλυση Pathway (IPA 9.0), το λογισμικό για την ανάλυση του δικτύου.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση (qRT-PCR) του

RT-PCR και Dsg2

,

Csta1

,

Csta2

,

Csta2l1

, και

Csta3

η

cDNA συνετέθη από 1 μg του RNA χρησιμοποιώντας την υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Εξόνιο που εκτείνονται qPCR εκκινητές σχεδιάστηκαν ως εξής:

Dsg2

, μπροστά 5′-GAG GAA TTG AGT GCA GCA CAT AC-3 ‘, αντίστροφη 5’-CTT GCT TCC ACC GTC ΑΑΟ G?

Csta1

: προς τα εμπρός 5′-TGC ΤΑΑ CAA GGT CAG ACC TCA G-3 ‘, αντίστροφη 5′-CCA TGG ΤΤΤ TGT CAG TCT GGT-3’?

Csta2

: προς τα εμπρός 5′-TGA ATG TAG GAC ΟΤΟ ΟΤΤ GC-3 ‘, αντίστροφη 5′-GGG ATC ΑΓΓ TCA AGT ΤΟΟ AA-3’,

Csta2l1

: προς τα εμπρός 5′ TGT CTT ΑΑΟ ΤΟΟ ΤΑΤ TTC CAG TGA ΑΑΑ CGA C-3 ‘, αντίστροφη 5′-CAT CTC ΤΤΤ ACA ATG GGG GGG GG-3’?

Csta3

: προς τα εμπρός 5′-GCC CAT CAA TGA GTC ΑΑΟ ΑΑΑ-3 ‘, αντίστροφη 5′-GGC CTC TGA AGA CTT TCA TGT G-3’ και για τον εσωτερικό έλεγχο

GAPDH

: προς τα εμπρός 5′-CCC ATC ACC ATC TTC CAG GAG CGA-3 ‘, αντίστροφη 5′-TCC ACC CTT CAA ΟΤΟ GGC CCC-3’. cDNA ενισχύθηκαν σε ρυθμιστικό PCR που περιέχει 1 μονάδα Taq DNA πολυμεράση (Qiagen), 200 μΜ dNTPs, διάλυμα Q 1 μονάδα, 0,5 μΜ εκκινητών. Ενίσχυση του κάθε ένα από τα cDNA ήταν ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης στους 94

° C για 3 λεπτά και 35 κύκλους μετουσίωσης στους 94

° C για 30 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 58

° C για 1 λεπτό και επέκταση σε 72

° C για 1 λεπτό, που ακολουθείται από τον τελευταίο κύκλο της επέκτασης στους 72

° C για 7 λεπτά.

επίπεδα έκφρασης γονιδίων προσδιορίστηκαν με ανάλυση qRT-PCR με τη χρήση 1 μΙ το cDNA και SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) σύμφωνα με ένα πρότυπο πρωτόκολλο ενίσχυσης σε έναν ΑΒΙ Prism 7900 Σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας (Applied Biosystems).

GAPDH

έκφραση χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση των δεδομένων. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για qRT-PCR για

Dsg2

,

Csta1

,

Csta2

,

Csta2l1

, και

Csta3

είναι περιλαμβάνονται παραπάνω.

Η ανοσοϊστοχημεία και Ανοσοστύπωμα

Εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά, όλα τα χημικά ήταν είτε από την Sigma (St. Louis, ΜΟ) ή Fisher (Waltham, MA). Για ιστολογία, ιστούς του δέρματος καθορίστηκαν σε όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου σε ένα διάλυμα φορμαλίνης 10%. Οι ιστοί εμπεδώθηκαν σε παραφίνη, τεμαχίστηκαν (4 μm), τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες, και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Για ανοσοκηλίδωση, σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εγκλεισμένοι σε παραφίνη ιστοί θερμάνθηκαν στους 60 ° C για 1 ώρα και αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο (3 φορές), 100% EtOH (2 φορές), 95% EtOH (2 φορές), 75% EtOH, 50% EtOH, και H

2O [20]. Αντιγόνα ανακτήθηκαν με μικροκύματα σε Tris-EDTA ρυθμιστικό (10 mM Tris Base, διάλυμα 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, ρΗ 9.0). Οι ιστοί στη συνέχεια δεσμεύτηκαν σε ρυθμιστικό αποκλεισμού (5% φυσιολογικό ορό κατσίκας, 1% BSA, 0,1% Ttriton Χ-100 σε PBS) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (RT) και στη συνέχεια επωάστηκαν με κυστατίνη Α αντίσωμα (1:50? AB4065, Millipore , Temecula, CA), Dsg2 AB10 (1: 10.000) και Flag Μ2 (1: 500, Sigma) σε ρυθμιστικό διάλυμα παρεμπόδισης, όλη τη νύκτα στους 4

° C. Οι ιστοί πλύθηκαν σε PBS (2 φορές) και επωάστηκαν με Alexa Fluor αντι-κουνελιού IgG 488 και αντι-Ποντικού 594 IgG (1: 400? Molecular Probes, Oregon) για 1 ώρα, σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (1: 1000, Sigma) για 1 λεπτό σε RT στο σκοτάδι ακολουθούμενη από πλύση σε PBS

Για κηλίδες Western, οι ιστοί δέρματος φλας καταψύχθηκε σε υγρό άζωτο, κονιοποιημένο με θανάσιμο και γουδοχέρι. και ομογενοποιούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet Ρ-40, 0.5% δεοξυχολικό, 0.1% SDS, αναστολέα πρωτεάσης (PI) κοκτέιλ (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ), 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF) και αναστολέα φωσφατάσης κοκτέιλ (Fisher). η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε (Pierce κιτ BCA, Pierce Biotech, Rockford, IL) και ανοσοκηλίδωση διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [21] με ~ 20 μg πρωτεΐνης σε κάθε λωρίδα . επιλυθούν κατά 4-20% SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: Flag Μ2 (1: 2000, Sigma)? ακτίνη (1: 5000? Calbiochem, San Diego, CA)? Cystatin Α (1: 1000? Millipore, Temecula, CA)? ανθρώπινο Dsg2 (1: 100? μονοκλωνικό Ab 10D2)? DSP Ι /ΙΙ (1: 250? Clone 5-11F? [22])? βινκουλίνης (1: 1000? . Abcam, Cambridge, UK) σήματα ανιχνεύθηκαν με την προσθήκη του δευτερογενούς αντισώματος HRP-συζευγμένο (1: 5000? Jackson Labs, Bar Harbor, ΜΕ), οπτικοποιήθηκε με χημειοφωταύγεια (ECL? Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Εναλλακτικά, τα σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ειδικά αντι-ποντικού αιγός IR-Dye 800 CW (1:. 20000? LI-COR Cat 926-32210) ή κατσίκας αντι-κουνελιού IR Dye 800 CW (1:. 20000? LI-COR Cat 926 -32.211) και αναλύονται περαιτέρω και να ποσοτικοποιούνται με σύστημα απεικόνισης Οδύσσεια IR (LI-COR Βιοεπιστημών, Lincoln, NE). Western κηλίδες αναλύθηκαν από χημειοφωταύγειας προσδιορίστηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ αναπτύχθηκε στο National Institutes of Health (ιστοσελίδα: https://rsbweb.nig.gov/ij/). Η στατιστική ανάλυση εξετάστηκε χρησιμοποιώντας το

t

test του Student με ένα

σ

αξία των & lt? 0,05 θεωρείται σημαντική (*

σ

& lt? 0,05? **

p

& lt? 0,01? ***

σ

& lt?. 0.001), σύμφωνα με την οποία ποσοτικοποιημένες μετρήσεις από τρία ανεξάρτητα πειράματα κανονικοποιήθηκαν για τον έλεγχο φόρτωσης ακτίνη

Κυτταρική καλλιέργεια και siRNA νοκ ντάουν του

Dsg2

και

CSTA

Η

(επιδερμοειδούς καρκινώματος από την American Type Culture Collection, Bethesda, MD) Α431 κύτταρα διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (P /ΜΙΚΡΌ). Κύτταρα Α431 αναπτύχθηκαν σε ~ 60% συρροή σε δίσκους καλλιέργειας 6 φρεατίων, σε παντελή στέρηση ορού για 4 ώρες με 0.5% FBS και 1% Ρ /δ πριν από την επώαση με 100 ηΜ περιπλεγμένο ελέγχου siRNA (D-001810-10, Dharmacon, Thermo Scientific, Lafayette, CO) ή συγκεντρωμένων siRNA να

Dsg2

(L-011645-00, Dharmacon) και

CSTA

(L-010020-00, Dharmacon) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, CA) και μέσο Opti-ΜΕΜ (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα επέστρεψαν στα φυσιολογικά μέσο μετά από 18 ώρες και επωάστηκαν για 72 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν σε 9 Μ ουρία συνέχεια παρασκευάστηκε για ανάλυση στυπώματος Western όπως περιγράφεται παραπάνω. κύτταρα HaCaT υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA με αντίστροφη διαμόλυνση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMAX. Για ανοσοφθορισμό, καλλιεργημένα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε MeOH -20 ° C για 10 λεπτά και διαπερατά σε 1% ΤΧ-100 για 5 λεπτά. Μετά αποκλείστηκαν μη ειδικές θέσεις, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα 10D2 για Dsg2 ή αντισώματος CSTA (βλέπε παραπάνω).

Σε μερικά πειράματα, κύτταρα κατεργασμένα με scrRNA ή

CSTA

siRNA σπάρθηκαν σε BioFlex πλάκες 6-φρεατίων που περιέχουν μία εύκαμπτη ελαστική μεμβράνη επικαλυμμένη με pronectin (Flexplates, Flexcell International, Hillsborough, NC, USA). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ~ 80% συρροή, και οι μονοστιβάδες τόνισαν μηχανικά με ένα Flexcell FX-4000 σύστημα τεντώματος (Flexcell International, Hillsborough, NC, USA) όπως περιγράφεται προηγουμένως λεπτομερώς [17] (Blaydon et al., 2011). Τα κύτταρα τεντωμένο για 0-4 ώρες, και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για Dsg2 (1: 500? Rabbit AB10? [23]) και κεράτινη 14 (1: 100? Clone LL001? Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Τα κύτταρα επίσης λύθηκαν σε ρυθμιστικό Laemmli για κηλίδωση Western.

εξόντωση Dsg2 με shRNA

Α431 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με τον φορέα Retro-puro pSuper μεταφέρουν ειδικά νουκλεοτίδια που στοχεύουν shRNA στη GFP (shGFP) ή Dsg2 (shDsg2) καθορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως λεπτομερώς [24]. Εν συντομία, δύο ολιγονουκλεοτίδια ( «5-GAT CCC CGA GAG GAT CTG TCC AAG ΑΑΤ TCA AGA GAT TCT ΤΟΟ ACA GAT ΚΔ CTC ΤΤΤ ΤΤ-3» και «5-AGC ΤΤΑ ΑΑΑ AGA GAG GAT CTG TCC AAG ΑΑΤ CTC TTG ΑΑΤ TCT ΤΟΟ ACA GAT CCT CTC GGG-3 ‘) συντέθηκαν, ανόπτηση, και συνδέθηκε σε pSuper Retro-puro (ολιγο-Engine, Seattle, WA). παραγωγής ρετροϊού και η μόλυνση έγινε σε κύτταρα Φοίνιξ. Τα επιμολυσμένα κύτταρα Α431 διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS και πουρομυκίνη (2 μg /ml).

Dispase που βασίζεται διαχωρισμού κυττάρων δοκιμασία

Για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της κυστατίνης Α και Dsg2 στο κελί προσκόλληση, Mock και shDsg2 κύτταρα Α431 καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας έξι φρεατίων σε μια πυκνότητα 2 Χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 ηΜ περιπλεγμένο ελέγχου siRNA ή siRNA στο

CSTA

όπως περιγράφεται πάνω από. Μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με ισορροπημένο Διάλυμα Άλατος του Hank και επωάστηκαν με δισπάση (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) για 5 λεπτά. Οι αρθεί κύτταρο φύλλα υποβλήθηκαν σε δισπάση με βάση δοκιμασία διαχωρισμού με σιφωνισμό πέντε φορές με τη χρήση ενός σιφωνίου του 1 ml. θραύσματα κυττάρων μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα φορμόλης 3% και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές. Σημειώνουμε εδώ, ότι αυτά τα πειράματα διεξήχθησαν χωρίς την προσθήκη επιπλέον ασβέστιο.

Αποτελέσματα

ανάλυση μικροσυστοιχιών σύγκριση άγριου τύπου και Inv-Dsg2 διαγονιδιακό ποντίκι δέρμα

Εμείς πρόσφατα έδειξε ότι υπερέκφραση του Dsg2 υπό τον έλεγχο του υποκινητή ινβολουκρίνης στο δέρμα διαγονιδιακών ποντικών (Σχ-Dsg2) είχε σαν αποτέλεσμα υπερπλασία της επιδερμίδας και αυξημένη ευαισθησία σε επαγωγή όγκου [5]. Επιπλέον, Α.Μ.-Dsg2 διαγονιδιακά ποντίκια ανέπτυξαν επίσης καλοήθεις θηλώματα και ήταν πιο ευαίσθητα σε χημικά επαγόμενη δύο σταδίων καρκινογένεση του δέρματος. Αυτά τα ευρήματα μας ώθησε να εκτελέσει μια σύγκριση των προφίλ γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των διαγονιδιακών ποντικών και ελέγχου Inv-Dsg2. Για την αποφυγή των διακυμάνσεων φόντο και παραλλαγές, Dsg2 διαγονιδιακά ποντίκια μας διασταυρώθηκαν πίσω τουλάχιστον 5 γενιές να C57BL6 υπόβαθρο. Έχουμε επιλέξει να χρησιμοποιήσει πλήρους πάχους του δέρματος, προκειμένου να τηρούν τυχόν αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση στο χόριο που μπορεί να έχουν εισαχθεί από την επιδερμίδα υπερκείμενων. Έτσι, πίσω από το δέρμα νεογνά στις 6 εβδομάδες μετά τη γέννηση χρησιμοποιήθηκε

Η &?. Ε-χρώση τομών ιστού διαγονιδιακών δειγμάτων δέρματος εμφάνισαν εκτεταμένη υπερπλασία σε σύγκριση με εκείνη του άγριου τύπου του δέρματος (S1A Εικ.). Η έκφραση του διαγονιδίου επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδας Western με την οποία το αντίσωμα Flag ανιχνεύθηκε το 160 kDa Dsg2.Flag πρωτεΐνης στο διαγονιδιακό, αλλά όχι στο δέρμα ποντικού άγριου τύπου (S1B Εικ.). Επιπλέον, μικροσκοπία ανοσοφθορισμού επαλήθευσε την έκφραση της Flag-tagged Dsg2 πρωτεΐνη στις επιφανειακές επιδερμίδα του διαγονιδιακού, αλλά όχι τα ποντίκια άγριου τύπου (S1c Εικ.). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [5], ότι η έκτοπη έκφραση της Dsg2 επάγει επιδερμική υπερπλασία χωρίς να μεταβάλλει την ενδογενή έκφραση του Dsg2. Και στις δύο ποντικού και ανθρώπου ενδοφολιδωτά επιδερμίδα, Dsg2 εκφράζεται σε σημαντικά χαμηλό επίπεδο στη βασική στιβάδα κυττάρων, και ότι το επίπεδο έκφρασης μειώνεται περαιτέρω με την ανάπτυξη [5,25]. Σε ιστούς ενηλίκων, μόνο ένα σήμα λεπτά ανιχνεύεται όταν το επίπεδο έκθεσης ενισχύεται. Έγιναν προσπάθειες να συν-ανοσοχρώση για Dsg2 και CSTA χρησιμοποιώντας αντι-Dsg2 αντισώματα. Ωστόσο, λόγω της φύσης αυτών των αντισωμάτων, χαμηλή έκφραση ενδογενούς Dsg2, και του φόντου είναι υπερβολικά υψηλή (τα δεδομένα δεν φαίνονται), επιλέξαμε να χρησιμοποιούν αντισώματα αντι-Flag για την ανίχνευση της Flag-tagged Dsg2 διαγονιδίου. Dsg2-Flag εκφράζεται στις επιφανειακές επιδερμίδα κάτω από τον έλεγχο του υποκινητή ινβολουκρίνης των διαγονιδιακών ποντικών όπως περιγράφηκε προηγουμένως λεπτομερώς [5].

δείγματα ολικού RNA που απομονώνεται από το δέρμα δύο διαγονιδιακών και δύο άγριου-τύπου ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία επισημασμένο με βιοτίνη cRNA ανιχνευτές και στη συνέχεια υβριδοποιήθηκε με μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων που αντιπροσωπεύουν 21.619 γονίδια ποντικού (Σχ. 1Α). Μια σύγκριση του μέσου όρου των σημάτων γονίδιο αποκάλυψε κατά προσέγγιση 492 γονίδια μεταβάλλεται κατά περισσότερο από δύο φορές σε απόκριση προς έκφραση Dsg2 (Πίνακας 1 και S1 πίνακα). Ένα οικόπεδο ηφαίστειο αποκάλυψε ότι 275 μεταγραφήματα απορυθμίζεται και 217 ρυθμίζεται προς τα κάτω με στατιστική σημαντικότητα (ρ & lt? 0,05, εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα, Σχήμα 1Β.). Αυτά τα 492 γονίδια που διαμορφώνονται σε απάντηση Dsg2 αναλύθηκαν περαιτέρω από το Πρόγραμμα Ingenuity Ανάλυση (Qiagen), η οποία περιγράφει τις top 5 γονίδιο δίκτυα ανάλογα με το βαθμό σημαντικότητάς τους στο Δίκτυο Επιλέξιμες Μόρια στη δέσμη στοιχείων μας (S2 Πίνακας). Αυτή η ανάλυση έδειξε ισχυρή συσχέτιση με τον κύκλο των κυττάρων (S2A Εικ.) Και μονοπάτια του καρκίνου του κανονισμού (S2B Εικ.). Ένας σημαντικός αριθμός γονιδίων που εμπλέκονται σε διάφορες φάσεις της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω (κόκκινο) για την αντιμετώπιση Dsg2 (και περαιτέρω συνοψίζονται στον Πίνακα S3). Ομοίως, πολλά γονίδια που εμπλέκονται στην ογκογένεση επίσης ρυθμίζεται αυξητικά σε απόκριση προς Dsg2 συμπεριλαμβανομένου, ο μιτωτικός πρωτεΐνη σημείου ελέγχου κινάση (

BUB1

) (S1 Πίνακας) και το περιφερικό-λιγότερο 4-ομοιοακολουθίας (

DLX4

) και η πρωτεΐνη ευαισθησίας στον καρκίνο (

BRCA1

) (S2B Εικ.). Είναι ενδιαφέρον, ωστόσο, δύο μέλη της forkhead οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων,

FOXC1

(-9.0 φορές) και

FOXC2

(-11,7 φορές), τα μειωτικά στα διαγονιδιακά ποντίκια Inv-Dsg2. FOXC2, ειδικότερα, διεγείρει επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης και παίζει ένα ρόλο στην κλεισίματος των βλεφάρων [26,27]. Εξόντωση FOXC2 έκφρασης σε κύτταρα καρκίνου του μαστού καταργεί τους μεταστατικό δυναμικό [28], που εμπλέκουν το ρόλο της στην ανάπτυξη του καρκίνου. Ο ρόλος του FOXC2 στην ομοιόσταση του δέρματος και την ανάπτυξη του καρκίνου δεν είναι γνωστός.

(Α) Ολικό RNA απομονώθηκε από το δέρμα του 2 άγριου τύπου και 2 Ιην-Dsg2 διαγονιδιακά ποντίκια, αντίστροφη μεταγραφή, επισημασμένο με βιοτίνη και εφαρμόζεται σε μια μικροσυστοιχία cDNA ποντικού. Το δενδρόγραμμα (χάρτης θερμότητας) δείχνει ότι 492 γονίδια ήταν είτε πάνω ρυθμισμένα (κόκκινο /πορτοκαλί) ή προς τα κάτω ρυθμισμένα ποντίκια (μπλε /πράσινο) σε διαγονιδιακά (Τ1 και Τ2) και ελέγχου (W1 και W2). οικόπεδο (Β) ηφαίστειο δείχνει την log2 (πάσο αλλαγή) στο x-άξονα έναντι του-log10 (τιμή p) στο y-άξονα. Τα σημεία που έχουν πολλαπλή μεταβολή είναι μικρότερη από 2 (log2 = 1) εμφανίζονται σε γκρι. Οι κάθετες πράσινες γραμμές οριοθετούν όπου η πολλαπλή μεταβολή ισούται με 2 (δεξιά γραμμή) ή ισούται-2 (αριστερά γραμμή). Η οριζόντια πράσινη γραμμή οριοθετεί όπου η τιμή p είναι 0,05, με τα σημεία πάνω από τη γραμμή που έχει σ & lt? 0.05 και σημεία κάτω από το όριο που έχει p & gt? 0,05. Απεικονίζονται με κόκκινο χρώμα είναι τα γονίδια τα οποία εμφανίζουν μία μεταβολή μεγαλύτερη από 2 φορές με ένα ρ & gt? 0,05 σε διαγονιδιακά επιδερμίδα, σε σύγκριση με τον έλεγχο. Τα βέλη υποδεικνύουν γονίδια ενδιαφέροντος. (Γ) ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση αποκαλύπτει ένα μέσο όρο 34,33 ± 1,32 φορές αύξηση στην έκφραση RNA Dsg2 σε Ιην-Dsg2 διαγονιδιακά (Tg) σε σύγκριση με εκείνη του άγριου τύπου (WT). Επιπλέον, η έκφραση RNA για διαγονιδιακά σχέση με το μάρτυρα ήταν:

Csta1

, 113.24 ± 2.23?

Csta2

, 1227,04 ± 1,26?

Csta2l1

, 1,11 ± 0,47?

Csta3

, 26.97 ± 0.44 (Bar = μέση τιμή ± SD? (* Ρ & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001?. Για

t

test) Φοιτητής

η

ο Πίνακας 2 παραθέτει τις κορυφαίες δέκα γονίδια που διαμορφώνονται σε απάντηση Dsg2. Αυτή η λίστα αποτελείται από κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην καρκινογένεση, συμπεριλαμβανομένων αφυδρογονάσης L-θρεονίνη (

TDH

, 39,2 φορές ) και πλούσια σε κυστεΐνη εκκριτική πρωτεΐνη (

CRISP3

, 8,8 φορές) το πιο εκπληκτικό εύρημα ήταν η αυξημένη έκφραση του CSTA (

Csta1

, 18,4 φορές?.

Csta2

, 5,7 φορές? και

Csta3

, 12,4 φορές) και αρκετά μέλη της οικογένειας S100 πρωτεϊνών που δεσμεύουν ασβέστιο (

S100A8

, 7,9 φορές?

S100A9

, 4,1 φορές? και

S100A4

, 2,3 φορές) (Εικόνα 1Β?.. Πίνακας 3) Οι πρωτεΐνες S100A8 και S100A9 σχηματίζουν ένα σύμπλοκο γνωστό ως calprotectin, το οποίο παρουσιάζει αντιμικροβιακή δραστηριότητες και δείχνεται να προστατεύει τα επιθηλιακά κύτταρα κατά της εισβολής των παθογόνων [29]. Επιπλέον, η γονιδιακή έκφραση του τέσσερα μέλη της οικογένειας κυκλίνης πρωτεϊνών αυξήθηκαν επίσης, συμπεριλαμβανομένων κυκλίνη Α2 (

Ccna2

, 5,8 φορές), κυκλίνη Β2 (

Ccnb2

, 5,4 φορές), κυκλίνη Β1 (

Ccnb1

, 4,6 φορές), και η κυκλίνη Ε1 (

Ccne1

, 2,6 φορές), ενώ η έκφραση ενός μέλους, κυκλίνη Α1 (

Ccna1

, -2.0 φορές ) βρέθηκε να είναι μειωμένη (Πίνακας 3). Η οικογένεια των πρωτεϊνών κυκλίνης ρυθμίζει εξαρτώμενων από κυκλίνη κινασών και ελέγχει την πρόοδο των κυττάρων μέσω του κυτταρικού κύκλου [30]. Αυτό το εύρημα είναι συνεπές με τα προηγούμενα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι Dsg2 ενισχύει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. CSTA έχει αποδειχθεί ότι κατέχουν αντι-αποπτωτική δραστηριότητα [31], υπερεκφράζεται σε διάφορες κακοήθειες επιθηλιακών προερχόμενο συμπεριλαμβανομένων SCC [32], και είναι μεταλλαγμένο σε κληρονομικές προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου ελαττωματικός επιδερμικός διαταραχές [17-19]. Επιπλέον, CSTA αναστέλλει καθεψίνες [33,34], τα οποία επίσης απελευθερωθεί σε καρκίνο του δέρματος [35-37]. Για τους λόγους αυτούς, επικεντρώσαμε το υπόλοιπο της παρούσας μελέτης για CSTA. Η λειτουργική συνάφεια των πρωτεϊνών S100 και κυκλίνης θα εξεταστεί λεπτομερώς σε μια μελλοντική μελέτη.

Η

Επιβεβαίωση Dsg2 διαμόρφωσης της έκφρασης CSTA

επιβεβαιώθηκαν Τα αποτελέσματα μικροσυστοιχιών εξετάζοντας την έκφραση του mRNA CSTA ποντικού (1, 2, 2L1 και 3) με RT-PCR (S3 Εικ.) και σε πραγματικό χρόνο qPCR (Εικ. 1 C). Πρώτον, το ολικό RNA απομονώθηκε από το δέρμα δύο επιμέρους αντιπροσωπευτικών άγριου τύπου και Ιην-Dsg2 διαγονιδιακά ποντίκια, cDNA παράχθηκε και χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για PCR επιβεβαιώνοντας την προς τα πάνω ρύθμιση του

Dsg2

,

Csta1

,

Csta2

, και

Csta3

σε διαγονιδιακά σε σύγκριση με τους ποντικούς ελέγχου (S3 Εικ.). Καμία αλλαγή στην έκφραση RNA παρατηρήθηκε με

Csta2l1

και

GAPDH

. Csta2l1 εκφράζεται έντονα στο εμβρυϊκό ήπαρ, μυελό των οστών, και σπλήνα και χρησιμοποιήθηκε εδώ ως αρνητικός έλεγχος για το δέρμα [38]. Τα δεδομένα RT-PCR περαιτέρω επικυρωθεί με πραγματικού χρόνου qPCR χρησιμοποιώντας βιοψίες δέρματος από 3 άγριου-τύπου και 3 διαγονιδιακών ποντικών (Σχ. 1 C). Και πάλι, τα πάνω ρύθμιση του

Dsg2

(34,33 ± 1,32) παρατηρήθηκε στο δέρμα από διαγονιδιακά ποντίκια σε σύγκριση με το δέρμα από τα ζώα ελέγχου. Με πραγματικό χρόνο qPCR, παρατηρήσαμε μια αύξηση στο

Csta1

(113.24 ± 2.23),

Csta2

(1227,04 ± 1,39), και

Csta3

(26.97 ± 0.44) , αλλά όχι

Csta2l1

(1,11 ± 0,47). Με την εξαίρεση του

Csta2l1

, όλες οι αλλαγές από διαγονιδιακά σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου ήταν στατιστικά σημαντικές. Είναι ενδιαφέρον ότι η πλάσια διαφορά αλλαγή που λαμβάνονται με πραγματικού χρόνου qPCR ήταν σημαντικά διαφορετική από ό, τι λαμβάνονται από την ανάλυση μικροσυστοιχιών. Αυτό δεν είναι ασυνήθιστο και έχει παρατηρηθεί σε άλλα συστήματα [39]. Συνοπτικά, η ανάλυση qPCR επιβεβαίωσαν τα δεδομένα μικροσυστοιχιών αποδεικνύουν ότι η έκτοπη έκφραση της Dsg2 στην επιδερμίδα προκάλεσε αύξηση στην έκφραση RNA του ποντικού

CSTA

οικογένεια πρωτεϊνών και ότι αυτήν την ενισχυμένη έκφραση ρυθμίζεται από την υπερέκφραση του Dsg2 στο δέρμα.

στη συνέχεια, τα προϊόντα λύσης του δέρματος από ποντικούς νεογέννητα και ενήλικα ελέγχου (n = 3 το καθένα) ανοσοστυπώθηκαν για CSTA αποκαλύπτοντας υψηλού επιπέδου σε νεογέννητο δέρμα, αλλά μειώθηκε δραματικά σε ενήλικα δέρμα (Σχ. 2Α), που πιστοποιεί με προηγούμενες παρατηρήσεις [40]. Είναι ενδιαφέρον ότι, παρατηρήσαμε τόσο κυτταροπλασματική και πυρηνική χρώση για CSTA σε νεογέννητα δέρματος ποντικού με ανοσοφθορισμό (εικ. 2Β). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στο επίπεδο CSTA παρατηρήθηκε μεταξύ του άγριου τύπου και Ιην-Dsg2 διαγονιδιακά νεογέννητα ποντίκια (δεν δείχνεται). Ωστόσο, δεδομένου ότι CSTA ήταν χαμηλή στο δέρμα του ενήλικα ποντίκια, έκτοπη έκφραση της Dsg2 δραματικά ενισχυμένη επίπεδο CSTA (Σχ. 2C). Το αντίσωμα Flag ανιχνεύθηκε το Flag-tagged Dsg2 πρωτεΐνης στο διαγονιδιακό, αλλά όχι τα ποντίκια άγριου τύπου (σχ. 2C). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με τη χρήση της Dsg2 ειδικό αντίσωμα 10D2 αποδεικνύοντας ότι η έκτοπη έκφραση της Dsg2 στις επιφανειακές επιδερμίδα δεν μετέβαλε το ενδογενές επίπεδο Dsg2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Λόγω της φύσης των αντισωμάτων, ήμασταν σε θέση να εκτελέσει συν-ανοσοχρώση για Dsg2 και CSTA. Ωστόσο, οι συνθήκες βελτιστοποιήθηκαν για ανοσοχρώση για την Flag-tagged Dsg2 (αντισώματα αντι-Flag) και CSTA (Σχ. 2D). Στο δέρμα Dsg2 Tg, CSTA εκφράστηκε σε κύτταρα ανεξάρτητα από την έκφραση διαγονιδίου, γεγονός που υποδηλώνει ένα μη αυτόνομα αποτέλεσμα. Χρώση για CSTA ανιχνεύθηκε επίσης στα κερατινοκυττάρων ποντικών άγριου τύπου και αυξημένη στα διαγονιδιακά ποντίκια (Σχ. 2D). Παρόλο CSTA δεν ανιχνεύθηκε με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας ολικό λύματα δέρμα, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι στο κερατινοποιημένο φάκελλο, CSTA ενδέχεται να είναι ιδιαίτερα διασυνδεδεμένη και έτσι ανθεκτικά σε λύση σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης SDS /DTT.

(Α ) ανάλυση κηλίδας Western των προϊόντων λύσης δέρματος από 3 νεογέννητα και 3 ενήλικα ποντίκια C57BL6 δείχνει υψηλή έκφραση του CSTA στα νεογέννητα, αλλά σχεδόν ανιχνεύσιμα σε ενήλικες δέρμα. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για ίση φόρτωση. χρώση (Β) ανοσοφθορισμού επιβεβαιώνει τα κηλίδωση Western αποτελέσματα που δείχνουν υψηλό επίπεδο CSTA στα νεογέννητα δέρμα ποντικού άγριου τύπου. Μεγεθυμένη εικόνα στο ένθετο δείχνει κυτταροπλασματική καθώς και πυρηνική χρώση για CSTA. (Γ) Ανάλυση Western για Dsg2 και CSTA σε ενήλικες άγριου τύπου και Ιην-Dsg2 δέρμα διαγονιδιακών ποντικών. Τα αποτελέσματα έδειξαν έκφραση της Flag-tagged Dsg2 και CSTA στο διαγονιδιακό, αλλά όχι άγριου τύπου ποντίκια. Ακτίνη έδειξε ίση φόρτωση. (D) ανοσοφθορισμός πραγματοποιήθηκε σε ενήλικα δέρμα του άγριου τύπου και διαγονιδιακών ποντικών που αποκαλύπτουν αυξημένα επίπεδα CSTA σε διαγονιδιακά δέρμα. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με ϋΑΡΙ (μπλε).

Η

Σε αντίθεση με την ανθρώπινη με ένα μόνο

CSTA

γονίδιο, υπάρχουν πολλαπλές

CSTA

γονιδίων σε ποντικούς [41 ]. Ενώ η ανάλυση μικροσυστοιχιών εντοπιστεί τρεις

Csta1

,

Csta2

και

Csta3

, είναι άγνωστο ποια ισομορφή εκφράζεται στο δέρμα του ποντικιού. Επιπλέον, δεν είναι γνωστό ποιες ποντίκι CSTA αναγνωρίζεται από τα εμπορικά διαθέσιμα αντισώματα, δεδομένου ότι οι επίτοποι για αυτά δεν έχουν χαρτογραφηθεί. Ωστόσο, εμείς εικάζουν ότι τα αντισώματα μπορούν να αναγνωρίσουν όλα τα Cstas λόγω της υψηλής ομολογίας αλληλουχίας μεταξύ ανθρώπου και ποντικού και μεταξύ των διαφόρων ισομορφών του ποντικιού.

Dsg2 ρυθμίζει την έκφραση CSTA

Για να προσδιορίσετε αν Dsg2 διαμορφώνει την ανθρώπινη CSTA στα κερατινοκύτταρα, τα κύτταρα Α431 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με siRNA ειδικό για Dsg2 (siDsg2), CSTA (siCSTA) ή ως κωδικοποιημένο RNA (scrRNA). Τρεις ημέρες μετά την επιμόλυνση, με scrRNA και siCSTA, ανάλυση κηλίδος Western έδειξε ότι knockdown του CSTA δεν επηρέασε την έκφραση του Dsg2 (S4 Εικ.). Σε αντίθεση, μία δραματική μείωση της Dsg2 από siDsg2 αλλά όχι scrRNA, οδήγησε σε μικρή αλλά αναπαραγώγιμη μείωση του CSTA (Σχ. 3Α, Β). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η επίδραση της Dsg2 στην έκφραση CSTA, είχαν καθιερώσει σταθερές Α431 κυτταρικές σειρές με νοκ ντάουν της Dsg2 χρησιμοποιώντας σύντομο RNA φουρκέτας (shRNA) [24]. Η ανοσοκηλίδωση έδειξε ότι Dsg2 σημαντικά κάτω ρυθμίζονται σε κύτταρα shDsg2, σε σύγκριση με τα κύτταρα shGFP (Σχ. 3C, D). Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (μπλε).