Αφηρημένο

Η αυξημένη λιπογένεση είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα μιας ευρείας ποικιλίας καρκίνων και είναι υπό έντονη έρευνα ως εν δυνάμει αντινεοπλασματικών στόχο. Παρά το γεγονός ότι το γρήγορο λιπογένεση παρατηρείται στην παρουσία του εξωγενούς λιπιδίων, αποδείξεις ότι αυτά τα τοποθέτησης λιπίδια μπορεί να επηρεάσει αρνητικά την αποτελεσματικότητα των αναστολέων του lipogenic οδών. Ως εκ τούτου, για να αξιοποιηθεί πλήρως το θεραπευτικό δυναμικό των αναστολέων της σύνθεσης των λιπιδίων, μια καλύτερη κατανόηση της σχέσης μεταξύ

de novo

σύνθεση λιπιδίων και εξωγενή λιπίδια και τις αντίστοιχες του ρόλου τους στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και θεραπευτική ανταπόκριση σε αναστολείς λιπογένεση είναι κρίσιμης σπουδαιότητα. Εδώ, δείχνουμε ότι η διάδοση των διαφόρων καρκινικών κυτταρικών γραμμών (PC3M, HepG2, HOP62 και Τ24) εξασθενεί όταν καλλιεργούνται σε λιπίδια συνθήκες μειωμένου σε μια κυτταρική γραμμή που εξαρτάται από τον τρόπο, με PC3M είναι το λιγότερο επηρεάζονται. Είναι ενδιαφέρον ότι, όλες οι κυτταρικές σειρές – lipogenic (PC3M, HepG2, HOP62), καθώς και μη-lipogenic (Τ24) – έθεσε lipogenic δραστηριότητα τους σε αυτές τις συνθήκες, αν και σε διαφορετικό βαθμό. Τα κύτταρα που επιτυγχάνεται το υψηλότερο lipogenic δραστηριότητα κάτω από αυτές τις συνθήκες ήταν σε καλύτερη θέση να αντιμετωπίσει λιπιδίων μείωση της διάρκειας των πολλαπλασιαστική ικανότητα. Η συμπλήρωση του μέσου με λιποπρωτεΐνες πολύ χαμηλής πυκνότητας, ελεύθερα λιπαρά οξέα και χοληστερόλη αντιστραφεί αυτή την ενεργοποίηση, υποδεικνύοντας ότι η απλή έλλειψη λιπιδίων είναι αρκετή για να ενεργοποιήσει

de novo λιπογένεση

σε καρκινικά κύτταρα. Συνεπώς, τα καρκινικά κύτταρα που αναπτύσσονται σε συνθήκες-μείωση λιπιδίων έγινε περισσότερο εξαρτάται από

de novo

μονοπατιών σύνθεσης των λιπιδίων και ήταν πιο ευαίσθητα σε αναστολείς του lipogenic οδών, όπως soraphen Α και σιμβαστατίνη. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι ο περιορισμός της πρόσβασης σε εξωγενείς λιπίδια, όπως μπορεί να συμβεί σε άθικτα όγκους, ενεργοποιεί

de novo λιπογένεση

είναι τα καρκινικά κύτταρα, τους βοηθά να ευδοκιμούν κάτω από αυτές τις συνθήκες και τους καθιστά πιο ευάλωτους σε αναστολείς της λιπογένεσης. Αυτές οι παρατηρήσεις έχουν σημαντικές συνέπειες για το σχεδιασμό νέων αντινεοπλασματικών στρατηγικές που στοχεύουν στο μεταβολισμό των λιπιδίων του καρκίνου του κυττάρου

Παράθεση:. Daniëls VW, Smans Κ, Royaux Ι, Chypre Μ, Swinnen JV, Ζαΐντι Ν (2014) Cancer Cells διαφορικά ενεργοποιήσετε και να ευδοκιμούν σε

De Novo

λιπιδίων Σύνθεση Pathways σε ένα χαμηλό-λιπιδίων Περιβάλλοντος. PLoS ONE 9 (9): e106913. doi: 10.1371 /journal.pone.0106913

Επιμέλεια: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Πανεπιστήμιο, Γαλλία

Ελήφθη: 11 Απριλίου του 2014? Αποδεκτές: 3 Αυγούστου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Σεπτεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Daniëls et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από: Επιστημονικό Ίδρυμα Ερευνών και Μελετών-Φλάνδρα (FWO, https://www.fwo.be/en/) G.0691.12 (JVS), KU Leuven Συντονισμένες Δράσεις Έρευνας (GOA, https://www.kuleuven.be/onderzoek/kernprojecten/goa.htm) GOA /11/2009 (JVS), και οι Πολωνοί Διαπανεπιστημιακού έλξης – βελγική Ομοσπονδιακή Επιστήμη Γραφείο πολιτικής (IAP Belspo, https://www.belspo.be/belspo/index_en.stm) IAP7-32 (JVS). VWD είναι βοηθός έρευνας της επιστημονικής Ίδρυμα Ερευνών και Μελετών-Φλάνδρα (FWO) και τη φλαμανδική Λιγκ κατά του καρκίνου (VLK, https://www.tegenkanker.be/home). Τα συν-συγγραφείς KS, IR, MC, και της Νέας Ζηλανδίας που απασχολούνται από την Janssen Pharmaceutica NV. Janssen Pharmaceutica NV παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους συγγραφείς KS, IR, MC και της Νέας Ζηλανδίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι αυτών των συγγραφέων αρθρωτά στο τμήμα «συγγραφέας εισφορές»

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι Συν-συγγραφείς Karine Smans, Ines Royaux, Melanie Chypre και Nousheen Ζαΐντι που απασχολούνται από την Janssen Pharmaceutica NV. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

ταχέως πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά κύτταρα απαιτούν μια σταθερή παροχή των λιπιδίων για βιογένεση μεμβράνη και τροποποιήσεις πρωτεϊνών. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι, προκειμένου να αντιμετωπίσουν αυτές τις αυξημένες απαιτήσεις, τα καρκινικά κύτταρα είτε να αυξήσουν την πρόσληψη τους από λιπίδια ή να ενεργοποιήσετε

de novo

λιπιδίων σύνθεση [1] – [5]. σύνθεση Ενισχυμένη λιπαρό οξύ βρίσκεται σε 20% έως 90% των όγκων πολλών διαφορετικών τύπων και αντανακλάται στο πάνω ρύθμιση των βασικών ενζύμων που εμπλέκονται σε αυτή την οδό [1]. Αυτές περιλαμβάνουν συνθάση λιπαρού οξέος (FASN), ακετυλ-ΟοΑ καρβοξυλάση άλφα (ACACA) και ΑΤΡ-κιτρική λυάση (ακυλ). Πολυάριθμες εκθέσεις δείχνουν ότι η ενεργοποίηση αυτών των ενζύμων παρουσιάζεται κατάντι του αυξητικού παράγοντα σηματοδότησης και άλλες εκδηλώσεις ογκογόνο, ανεξάρτητα από την παρουσία εξωκυτταρικών λιπιδίων [1], [6] – [12]. Επίσης σύνθεση της χοληστερόλης, μέσω του mevalonate οδού, δραστηριοποιείται σε πολλά καρκινικά κύτταρα. Είναι σημαντικό ότι, η αναστολή των οδών σύνθεσης λιπαρού οξέος ή σύνθεση χοληστερόλης με παρεμβολή RNA ή χημικών αναστολέων καταλήγει σε αύξηση σύλληψη lipogenic κύτταρα όγκου, τόσο

in vitro

και

in vivo

, καθιστώντας αυτά τα ένζυμα ενδιαφέροντα στόχων για αντινεοπλασματική θεραπεία [1], [13] – [19]. Δυστυχώς, οι κυτταροτοξικές επιδράσεις που προκαλούνται από την αναστολή της

de novo

λιπιδίων μονοπατιών σύνθεσης φαίνεται να αποφευχθεί με την παρουσία του εξωγενούς λιπίδια ή ενδιάμεσοι μεταβολίτες [13], [20], [21]. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι είναι η εξάρτηση από την

de novo

λιπιδίων σύνθεση που καθορίζει την απόκριση των καρκινικών κυττάρων στην αναστολή αυτών των οδών και ότι εξωκυττάρια λιπίδια μπορεί να θέσει σε κίνδυνο τα θεραπευτικά οφέλη αυτών των αναστολέων.

εδώ, να αποκτήσουν μεγαλύτερη κατανόηση της πολύπλοκης αλληλεπίδρασης μεταξύ εξωγενή λιπίδια και

de novo

πορείες σύνθεσης λιπιδίων σε καρκινικά κύτταρα και να διερευνήσει πώς αυτή η αλληλεπίδραση μπορεί να επηρεάσει την αποτελεσματικότητα των λιπιδίων στόχευση αντινεοπλασματικών θεραπειών, εξετάσαμε την επίδραση της λιπίδιο στέρηση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και η απόκριση σε lipogenic αναστολή σε μια ποικιλία καθιερωμένων μοντέλων lipogenic και λιγότερο lipogenic καρκινικής κυτταρικής γραμμής. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι μια-μείωση λιπιδίων περιβάλλον ανάπτυξης επηρεάζει διαφορικά την ανάπτυξη των καρκινικών κυτταρικών γραμμών και είναι αρκετό για να ενεργοποιήσει

de novo

οδούς λιπογένεση ακόμη και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές που θεωρούνται μη-lipogenic. Αυτή η ενεργοποίηση βοηθά τα καρκινικά κύτταρα να διατηρήσουν ρυθμό πολλαπλασιασμού τους σε μια χαμηλή λιπιδίων περιβάλλον και καθιστά πιο ευαίσθητα σε αναστολείς λιπογένεσης. Τα δεδομένα αυτά τονίσει εκ νέου την ετερογένεια των καρκινικών κυττάρων από την άποψη των μεταβολικών αναγκών τους, τονίζουν τη σημασία της εξωκυττάριας προϋποθέσεις και έχουν σημαντικές συνέπειες για τη βελτίωση του σχεδιασμού των θεραπευτικών στρατηγικών που βασίζονται στο χειρισμό των απαιτήσεων των λιπιδίων των κυττάρων του όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια και θεραπείες

Όλες οι κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). αντιδραστήρια κυτταρικής καλλιέργειας αγοράσθηκαν από την Invitrogen εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Η PC3M κυτταρική γραμμή καλλιεργήθηκε σε μέσο HyClone ΜΕΜ /EBSS (Thermo Scientific), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 10 mM μη-απαραίτητα αμινοξέα, 2 mM L-γλουταμίνη, 50 μg /ml γενταμικίνη και 1Χ ΒΜΕ Βιταμίνες (Sigma). HOP62 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, 2 mM L-γλουταμίνη και 50 μg /ml γενταμικίνη. Κύτταρα HepG2 καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS, 2 mM L-γλουταμίνη, 50 μg /ml γενταμικίνη, 100 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 0.37 g /L διττανθρακικό νάτριο, 10 mM μη-απαραίτητα αμινοξέα. Η κυτταρική σειρά Τ24 καλλιεργήθηκε σε μέσο DMEM, συμπληρωμένο με 10% FBS, 2 mM L-γλουταμίνη, 50 μg /ml γενταμικίνη. Όλες οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε ατμόσφαιρα 5% CO

2 και 37 ° C. Για τις συνθήκες-μείωση λιπιδίων τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% HyClone-μείωση λιπιδίων FBS (Thermo Scientific). Οι διαφορές στα επίπεδα των λιπιδίων και συναφών στοιχείων στην κανονική έναντι-μείωση λιπιδίων FBS που περιλαμβάνονται στο συμπληρωματικό πίνακα S1. Σιμβαστατίνη αγοράστηκε από τη Merck Sharp. Soraphen Α ελήφθη από το Δρ R. Jansen, Helmholtz-Zentrum f. Infektionsforschung, Mikrobielle Wirkstoffe, Braunschweig, Γερμανία [22], [23]. Υδατοδιαλυτό χοληστερόλης, γλυκερύλ τριλινολικός και γλυκερύλιο trilinolenate αγοράστηκαν από την Sigma. λιποπρωτεϊνών πολύ χαμηλής πυκνότητας (VLDL) ελήφθησαν από τη Merck Millipore. Για την καλλιέργεια των κυττάρων υπό την παρουσία διαφόρων μιγμάτων λιπαρών οξέων, παλμιτικό (16:00), ελαϊκό (18:01), λινολεϊκό (18:02), α-λινολενικό (18:03), αραχιδονικό (20:04) και δοκοσαεξανοϊκό (22:06) οξύ (Sigma) σε σύμπλοκο με λιπαρό οξύ χωρίς BSA (Sigma) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18], πριν από την προσθήκη στο μέσο καλλιέργειας. Τα τριγλυκερίδια επωάστηκαν σε κανονικό ή FBS για 30 λεπτά στους 37 ° C πριν από την προσθήκη στο μέσο καλλιέργειας μειώνεται σε λιπίδια.

ανάλυση ανοσοκηλίδωσης

Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών φορτώθηκαν σε προκατασκευασμένα πηκτώματα (NuPAGE, Invitrogen), μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF και επωάζονται με αντισώματα έναντι ακυλ (μονοκλωνικά κουνέλι, ab40793, Abcam), FASN (μονοκλωνικό κουνέλι, 3180, Cell Signaling) και β-ακτίνη (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, Sigma). Οι μεμβράνες πλύθηκαν και ανιχνεύθηκαν με αντι-κουνελιού συζευγμένο με Alexa Fluor 680 (Invitrogen) δευτερεύοντα αντισώματα. Φθορίζον σήμα μετρήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας το σύστημα Οδύσσεια Licor (LI-COR Biosciences).

Δοκιμασία πολλαπλασιασμού

PC3M και HOP62 κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 × 10

4 κύτταρα ml

-1 σε πλάκες 24 φρεατίων ιστοκαλλιέργειας (Nunc). κύτταρα Τ24 σπάρθηκαν σε 2 × 10

4 κύτταρα ml

-1 σε μια 24 φρεατίων πλάκα καλλιέργειας ιστού. κύτταρα HepG2 σπάρθηκαν σε 2.5 × 10

4 κύτταρα ml

-1 σε πολυ-D-λυσίνη 96-φρεατίων, μαύρο /σαφείς (BD Bioscience). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε κανονική ή μειωμένη λιπίδια μέσο. καμπύλες ανάπτυξης κατασκευάστηκαν με πλάκες απεικόνισης χρησιμοποιώντας το

Incucyte σύστημα

(Έσσεν Instruments), όπου οι καμπύλες ανάπτυξης χτίστηκαν από μετρήσεις συμβολή που αποκτήθηκαν κατά τη διάρκεια του όλο το εικοσιτετράωρο κινητική απεικόνισης. Για τον προσδιορισμό τα κύτταρα αριθμούν τα κύτταρα που επιπλέει στο μέσο καλλιέργειας συνενώθηκαν μαζί με τα προσκολλημένα κύτταρα μετά θρυψινοποίηση. Κυττάρων βάφτηκαν με κυανούν του τρυπανίου και μετρήθηκαν με Countess αυτοματοποιημένο μετρητή κυττάρων (Invitrogen).

απομόνωση RNA και πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR (qPCR)

Ολικό RNA από καλλιεργημένα κύτταρα εκχυλίστηκε και DNaseI αντιμετωπίζονται χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy Mini (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 3 μg ολικού RNA χρησίμευσε ως μήτρα για σύνθεση cDNA χρησιμοποιώντας ολίγο dT πριμοδότες και Superscript III ανάστροφης μεταγραφάσης σε έναν όγκο 20 μΐ επί 1 ώρα στους 50 ° C. Αυτό ακολουθήθηκε από απενεργοποίηση του ενζύμου στους 70 ° C για 15 λεπτά, σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ποσοτική PCR (qPCR) εκτελέστηκε σε έναν ΑΒΙ Prism 7900-ΗΤ Sequence Detection System (Applied Biosystems) με τη χρήση ενός πυρήνα κιτ qPCR w /o dUTP (Eurogentec). Οι συνθήκες θερμικής κυκλοποίησης ήταν 10 λεπτά στους 95 ° C, που ακολουθείται από 45 κύκλους των 15s στους 95 ° C και 1 λεπτό στους 60 ° C. Οι επικυρωμένες προσχεδιασμένες Taqman Gene Expression δοκιμασίες (Applied Biosystems) που αντιστοιχεί στην γονίδια οικοκυρική TFRC (Hs00951083_m1) και PGK1 (Hs00943178_g1) χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία προτύπων καμπυλών σε σειριακές αραιώσεις cDNA. Η σχετική τυπική μέθοδος καμπύλη χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των τιμών έκφρασης. Μετά την κανονικοποίηση από TFRC ή PGK1 υπολογίστηκαν οι τιμές σχετικής έκφρασης. Οι άλλες δοκιμασίες Έκφραση Taqman γονίδιο που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη είναι: ακυλ (Hs00982738_m1), ACSS2 (Hs00218766_m1), FASN (Hs01005622_m1), ACACA (Hs01046047_m1), HMGCR (Hs00168352_m1)

Το συνολικό RNA από κύτταρα Τ24 παρασκευάστηκε. χρησιμοποιώντας PureLink RNA Mini Kit (Ambion). Η καθαρότητα και η συγκέντρωση του RNA αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop DM-1000 (Nanodrop Technologies). 3 μg RNA από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για τη σύνθεση cDNA με τη χρήση τυχαίων εξαμερών εκκινητών και ανάστροφης μεταγραφάσης Superscript II, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Invitrogen). Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν με λογισμικό Primer-BLAST του NCBI, όπου επιλέχθηκαν δυνατόν ενάρκτες που εκτείνονται μία σύνδεση εξονίου-εξονίου. Η ειδικότητα των εκκινητών ελέγχθηκε με ανάλυση αλληλουχίας στο λογισμικό Primer-BLAST και να λιώσει ανάλυση καμπύλης. Ποσοτική PCR πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε 7500 Fast σύστημα Real-Time PCR (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας το Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). Οι συνθήκες θερμικής κυκλοποίησης ήταν 20 δευτερόλεπτα στους 95 ° C, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 3 δευτερολέπτων στους 95 ° C και 30 δευτερόλεπτα στους 60 ° C. Οι ληφθείσες Ct τιμές ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 18S ως γονίδιο καθαριότητας.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε κανονική ή μειωμένη λιπίδια συνθήκες ανάπτυξης και επωάζονται και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 72 ώρες με soraphen Α ή σιμβαστατίνη. Η απόπτωση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το

γκουάβα νεξίνη

κιτ και το

γκουάβα PCA σύστημα

(γκουάβα Techinnologies). Η δοκιμασία Γκουάβα νεξίνη χρησιμοποιεί δύο κηλίδες (αννεξίνη V και 7-αμινο ακτινομυκίνη D [7-AAD)] για την ποσοτικοποίηση του ποσοστού των αποπτωτικών κυττάρων. Τα κύτταρα που χρωματίζονται θετικά για τις δύο βαφές είναι στα τελευταία στάδια της απόπτωσης, πριν σε κυτταρικό θάνατο. Η δοκιμασία νεξίνη διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με ανάλυση προσωπικών κυττάρων Γκουάβα (PCA) κυτταρόμετρο ροής με χρήση του λογισμικού CytoSoft (γκουάβα Technologies). Περίπου 2000 κύτταρα αναλύθηκαν.

καλλιέργεια 3D κυτταρική

HepG2 κύτταρα εμβολιάστηκαν σε εξαιρετικά χαμηλή προσκόλληση 96-φρεατίων (Corning Costar) σε πυκνότητα 750 κύτταρα /φρεάτιο /200 μΐ μέσου . Τα κύτταρα σπάρθηκαν και διατηρήθηκαν σε φυσιολογική ή μειωμένη λιπίδια μέσο ανάπτυξης και παρακολουθήθηκαν για 20 ημέρες. Μετά το σχηματισμό σφαιροειδές, 50% μέσο όγκο αντικαταστάθηκε κάθε 3-4 ημέρες. Τα σφαιροειδή αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το

στο κελί Analyzer

(GE Healthcare).

ΑΤΡ δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων που περιλαμβάνει τα σφαιρίδια προσδιορίστηκε με μέτρηση της περιεκτικότητας των κυττάρων ΑΤΡ χρησιμοποιώντας CellTiter- Glo Luminescent Βιωσιμότητας κυττάρων Δοκιμασία (Promega) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 100 μΙ ‘CellTiterGlo-αντιδραστήριο »προστέθηκαν στα φρεάτια που περιέχουν σφαιροειδή. Πριν από την προσθήκη του CellTiterGlo-αντιδραστήριο 100 μΙ μέσου απομακρύνθηκε από κάθε φρεάτιο. Τα σφαιροειδή λύονται με ανακίνηση για 10 λεπτά που ακολουθείται από σιφωνισμό. 100 μΙ κυτταρικού εναιωρήματος από κάθε φρεάτιο μεταφέρονται σε ένα λευκό Optiplate 96 (Perkin Elmer). Η φωταύγεια μετράται.

Lipid σύνθεση

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε κανονική ή μειωμένη λιπίδια μέσο. Μετά από 72 ώρες [

14C] -επισημασμένο αιθυλεστέρα (56 mCi /mmol, 0,2 μΟί /φρεάτιο, Amersham Biosciences) προστέθηκε στα κύτταρα. Μετά από 4 ώρες επώασης τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση. Τα λιπίδια εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη μέθοδο Bligh Dyer, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19].

14C-ενσωμάτωση σε κυτταρικά λιπίδια ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση σπινθηρισμού, χρησιμοποιώντας ένα Packard 1600 CA.

Tri-Carb μετρητή υγρού σπινθηρισμού

(Packard Instrument Company). Τα ληφθέντα μετρήσεις κανονικοποιήθηκαν για περιεκτικότητα δείγματος DNA, να λαμβάνει υπόψη τις διαφορές στον αριθμό των κυττάρων μετά από 72 ώρες σε συνθήκες-μείωση λιπιδίων μέσο.

Nanofluidic πρωτεομική ανάλυση

Η έκφραση του προδρόμου και η δραστική μορφή του SREBP1 και SREBP2 διερευνήθηκε με ένα μέγεθος που βασίζεται Απλό Western ανοσοπροσδιορισμό, χρησιμοποιώντας μια συσκευή Peggy NANOPRO (Protein Simple). Η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης των δειγμάτων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν BCA Protein Assay (Pierce). Ίση ποσότητα δείγματος που παρασκευάστηκε στο Απλό ρυθμιστικό Δυτική αραίωσης, μειώνεται και μετουσιωμένη πριν από τη φόρτωση πάνω στην πλάκα. Οι πλάκες παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τη διαδικασία του κατασκευής, χρησιμοποιώντας όλα τα αντιδραστήρια από την Protein απλή. SREBP1 και αντισώματα SREBP2 (Active Motif, # 39939 και # 39941) χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:25, αντίσωμα α-τουμπουλίνης (Cell Signaling, # 2125) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:500. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Simple Western πυξίδα. έκφραση της πρωτεΐνης (περιοχή κάτω από την καμπύλη, AUC) διορθώθηκε για τον έλεγχο φόρτωσης α-τουμπουλίνης (AUC SREBP /AUC α-τουμπουλίνης).

Η στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με Students’t -τεστ (Excel) ή μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από δοκιμή του Tukey πολλαπλής σύγκρισης (GraphPad Prism Software), ανάλογα με την περίπτωση. P-τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν μέσο ± S.D. όπως αναφέρεται στα αντίστοιχα θρύλους σχήμα.

Αποτελέσματα

-μείωση λιπιδίων συνθήκες ανάπτυξης διαφορικά μετριάσει το ρυθμό πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυτταρικών σειρών

Για να μελετηθεί η επίδραση της μείωσης των λιπιδίων στον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων που επιλέγονται PC3M, HOP62, κυτταρικές σειρές Τ24 HepG2 και. Οι τρεις πρώτες γραμμές κυττάρων αναφέρεται ότι έχει lipogenic φαινότυπο σε πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων με πλήρη ορό. Παρατηρήσαμε σε προηγούμενη μελέτη μας ότι αυτές οι κυτταρικές σειρές που επηρεάζονται από τις περιβαλλοντικές λιπιδίων [24]. Αυτό ήταν απροσδόκητο, καθώς οι lipogenic κυτταρικές σειρές πιστεύεται ότι είναι εξαρτάται κυρίως από

de novo λιπογένεση

για την εκπλήρωση τους απαίτηση λιπαρά οξέα. Τα κύτταρα Τ24 εμφανίσει ένα χαμηλό lipogenic φαινότυπο υπό αυτές τις συνθήκες και ενσωματώθηκαν ως κυτταρική γραμμή ελέγχου [14], [24] – [26]. Όλες αυτές οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν υπό κανονικές συνθήκες σε μέσο με 10% πλήρη ορό ή με 10%-μείωση λιπιδίων ορού. Incucyte απεικόνιση σε πραγματικό χρόνο και κυανού ανιχνεύσεις αποκλεισμού αποκάλυψε ότι η καλλιέργεια σε λιπίδια συνθήκες μειωμένου εξασθενημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων των διαφόρων κυτταρικών γραμμών σε διαφορετικό βαθμό. HOP62 έδειξε μία δραματική μείωση των ρυθμών ανάπτυξης κατά την καλλιέργεια υπό συνθήκες ανάπτυξης-μείωση λιπιδίων, που ακολουθείται από HepG2 (σχήμα 1a-b). κύτταρα Τ24 ήταν πολύ λιγότερο επηρεάζονται και τα κύτταρα PC3M δεν επηρεάστηκαν καθόλου (Σχήμα 1α-β). Ωστόσο, το χαμηλό-λιπιδίων περιβάλλον δεν προκάλεσε απόπτωση στην PC3M και κυτταρικές γραμμές HepG2 (Συμπληρωματική Εικόνα S1).

(α) οι καμπύλες διάδοσης για PC3M, HOP62, HepG2 και τα κύτταρα Τ24. Τα κύτταρα σπάρθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε κανονική ή μειωμένη λιπίδια μέσης και κυτταρικός πολλαπλασιασμός παρακολουθήθηκε με

Incucyte πραγματικό χρόνο απεικόνισης.

Τα πάνελ στη δεξιά πλευρά του κάθε γραφήματος πολλαπλασιασμού δείχνουν την εικόνα αντίθεσης φάσης της αντίστοιχης κυτταρικής γραμμής και στις δύο συνθήκες. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Ο αριθμός των ζώντων κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας trypan blue μέθοδο αποκλεισμού χρώματος, μετά από 72 ώρες καλλιέργειας σε κανονική (Ν) ή μέσο LR. * Σημαντικά διαφορετική (* p≤0,05? ** P≤0,01? *** P≤0,001), N.S. δεν είναι σημαντική (p & gt? 0,05).

Η

Για HepG2, τα οποία έχουν προηγουμένως αποδειχθεί για να σχηματίσουν συμπαγή σφαιροειδή 3D σε συστήματα κυτταρικής καλλιέργειας 3D [27] – [30], μελετήσαμε επίσης η επιδράσεις των λιπιδίων αναγωγικές συνθήκες σε ένα 3-διαστάσεων (3D) σύστημα κυτταροκαλλιέργειας που μιμείται την φυσική ιστούς και τα όργανα πιο στενά από 2-διαστάσεων σύστημα καλλιέργειας (2D) κυττάρων. Σε κανονικές συνθήκες ανάπτυξης μια χρονο-εξαρτώμενη αύξηση του μεγέθους του σφαιροειδή παρατηρήθηκε (Σχήμα 2α). Ωστόσο, σε συνθήκες λιπίδια μειωμένη ανάπτυξη HepG2-σφαιροειδές συνελήφθη τελείως (Σχήμα 2α). Την ημέρα 20, 5-πλάσια μεγαλύτερη σφαιροειδή παρατηρήθηκαν σε κανονικές συνθήκες ανάπτυξης σε σύγκριση με συνθήκες ανάπτυξης-μείωση λιπιδίων (Σχήμα 2α). Αυτό αντανακλάται επίσης στον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων, όπως αποκαλύπτεται από ΑΤΡ μετρήσεις [31] (Σχήμα 2β).

(α) μικροσκοπία αντίθεσης φάσης που δείχνει τον σχηματισμό HepG2-σφαιροειδές. κύτταρα HepG2 σπάρθηκαν σε κανονική και LR μέσου σε πλάκες εξαιρετικά χαμηλής προσκόλλησης σε πυκνότητα 750 κύτταρα /φρεάτιο και το σχηματισμό συμπλέγματος παρακολουθήθηκε πάνω από είκοσι ημέρες όπως υποδεικνύεται. Τα σφαιροειδή αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα

Στο κελί Αναλυτής 2000

οργάνου. Περιφέρεια του σφαιροειδή μετρήθηκε χρησιμοποιώντας

IN αναλυτή κυττάρων 2.000 λογισμικού.

(Β) Βιωσιμότητα των κυττάρων η οποία περιλαμβάνει τα σφαιροειδή προσδιορίστηκε με μέτρηση της περιεκτικότητας κυτταρικής ΑΤΡ χρησιμοποιώντας δοκιμασία φωταύγειας.

Η

Τα καρκινικά κύτταρα ενεργοποιήσετε

de novo

μονοπατιών σύνθεσης των λιπιδίων σε συνθήκες ανάπτυξης-μείωση λιπιδίων

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων στις συνθήκες-μείωση λιπιδίων αναμένεται να εξαρτάται από την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να συνθέσουν τις απαιτούμενες λιπίδια

de novo

. Ωστόσο, παραπάνω στοιχεία πολλαπλασιασμό μας δεν ταιριάζει με το lipogenic δραστηριότητα των καρκινικών κυτταρικών σειρών που καλλιεργούνται υπό κανονικές συνθήκες, όπως ο ρυθμός αύξησης των χαμηλών λιπογόνων κύτταρα Τ24 επηρεάστηκε λιγότερο από ό, τι εκείνες του λιπογόνων HOP62 και τα κύτταρα HepG2. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε την ικανότητα των κυτταρικών γραμμών να ενεργοποιήσει αυτή την οδό σε συνθήκες-μείωση λιπιδίων. Πρώτον, ελέγξαμε την επίδραση της κανονικής και μειωμένη λιπιδίων συνθήκες ανάπτυξης για προφίλ έκφρασης mRNA μεγάλων γονιδίων σε

de novo

οδούς λιπογένεση: ΑΤΡ-κιτρική λυάση (ακυλ), ένα κυτοσολικό ένζυμο που καταλύει την παραγωγή του ακετυλίου -CoA τόσο για λιπαρό οξύ και τη σύνθεση της χοληστερόλης, συνθετάση ακυλο-ΟοΑ μικρής αλυσίδας μέλος της οικογένειας 2 (ACSS2), το οποίο καταλύει τη σύνθεση του ακετυλο-CoA από οξικό, συνθάσης λιπαρού οξέος (FASN), το κλειδί ένζυμο που εμπλέκεται στη σύνθεση των λιπαρών οξέων και υδροξυμεθυλ γλουταρυλ-CoA (HMGCR), το περιοριστικό του ρυθμού ένζυμο στη σύνθεση της χοληστερόλης. Οι Ct τιμές των δοκιμαζόμενων γονιδίων που αναφέρονται στο συμπληρωματικό πίνακα S2. Είναι ενδιαφέρον ότι η έκφραση αυτών των ενζύμων αυξήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων των μη-λιπογόνου κυτταρική σειρά Τ24, αν και σε κάπως διαφορετικό βαθμό, με HepG2 είναι η λιγότερο ανταποκρίνεται (Σχήμα 3a-d). Η ανάλυση στυπώματος Western των FASN και ακυλ έδειξαν ότι τα ένζυμα αυτά ήταν πιο εντυπωσιακά πάνω ρυθμισμένα σε λιπίδια μειώνεται μέσο PC3M και τουλάχιστον σε HepG2 (σχήμα 3e). Σύμφωνα με αυτά τα ευρήματα, στερόλες ρυθμιστική πρωτεΐνη δέσμευσης 1 (SREBP1) και SREBP2, που είναι οι κύριοι ρυθμιστές της έκφρασης των γονιδίων της σύνθεσης των λιπαρών οξέων και mevalonate οδό αντίστοιχα, παρουσίασαν επίσης αυξημένη έκφραση (Συμπληρωματική Εικόνα S2) και ήταν περαιτέρω ενεργοποιημένα στο πρωτεϊνικό επίπεδο σε λιπίδια συνθήκες μειωμένου σε HOP62, PC3M και τα κύτταρα Τ24 αλλά όχι σε HepG2 (σχήμα 4 διαφήμισης και συμπληρωματικό σχήμα S3). Ο υδατάνθρακας-αποκριτικού στοιχείου δέσμευσης πρωτεΐνης (ChREBP), ένα άλλο σημαντικό ρυθμιστής της έκφρασης του λιπογόνου γονιδίων [32], εκφράστηκε μόνο σε ανιχνεύσιμα επίπεδα στα κύτταρα HepG2 (ήπαρ κυτταρική γραμμή καρκίνου) (Συμπληρωματική Εικόνα S4A) και σε αυτή την κυτταρική σειρά , δεν θα μπορούσαμε να παρατηρήσουμε μια ενεργοποίηση και πυρηνική μετατόπιση του παράγοντα μεταγραφής, όταν καλλιεργείται σε συνθήκες χαμηλού λιπιδίων (Συμπληρωματική Εικόνα S4b). Στην PC3M, ο οι καρκινικές κυτταρικές γραμμές Τ24 κυτταρικές γραμμές, του προστάτη, των πνευμόνων και των νεφρών αντιστοίχως HOP62 και, δεν μπορέσαμε να ανιχνεύσει ChREBP συνολικά κυτταρικά εκχυλίσματα ή στις πυρηνικές κλάσματα, όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες ανάπτυξης-μείωση λιπιδίων (Συμπληρωματικές Εικόνα S4b). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι ChREBP δεν παίζει καίριο ρόλο στην αυξημένη έκφραση του γονιδίου lipogenic σε συνθήκες-μείωση λιπιδίων.

Η γονιδιακή έκφραση FASN, ακυλ, ACSS2 και HMGCR αναλύθηκε με ανάλυση qPCR στο (α) HOP62 ( β) HepG2 (γ) PC3M (δ) Τ24 κύτταρα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε φυσιολογικά ή LR μέσο για 48 ώρες. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± Τ.Α τριπλών δειγμάτων, κανονικοποιημένη για TFRC για HOP62, HepG2 και PC3M ή να 18S για Τ24. * Σημαντικά διαφορετική (* p≤0,05? ** P≤0,01? *** P≤0,001), N.S. δεν είναι σημαντική (p & gt? 0,05). (Ε) FASN και έκφραση ακυλ στο επίπεδο της πρωτεΐνης αναλύθηκε με ανάλυση Western blot σε HOP62, HepG2, PC3M και κυττάρων Τ24 καλλιεργούνται υπό κανονικές (Ν) ή LR μέσο για 72 ώρες. Βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

(α) Αντιπροσωπευτική εικονική στυπώματος Απλή ανάλυση Western των προδρόμων και δραστικών έκφραση SREBP1 σε HepG2, PC3M, HOP62 και κυττάρων Τ24 μετά από 72 ώρες καλλιέργεια σε κανονικό (Ν) ή LR μέσο συνθήκες. Άλφα-τουμπουλίνης χρησιμοποιείται ως έλεγχος φόρτωσης. Οι διαφορετικές εκθέσεις των πρόδρομων και ενεργό SREBP1 εμφανίζονται, προκειμένου να έχουν μια ακριβή έκθεση για τις δύο μορφές. Για τα αρχικά δεδομένα δείτε Συμπληρωματική Εικόνα S3a-d. (Β) Η ποσοτική ανάλυση των Simple Western. δεδομένα, που εκφράζεται ως περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC). Η έκφραση του SREBP1 διορθώθηκε για τον έλεγχο φόρτωσης αλφα-τουμπουλίνης. Γράφημα αντιπροσωπεύει μέση ± S.D. (N = 2-3). (Γ) Εκπρόσωπος εικονική κηλίδα των Απλή ανάλυση Western των προδρόμων και την ενεργό έκφραση SREBP2 σε HepG2, PC3M, HOP62 και τα κύτταρα Τ24 μετά από καλλιέργεια 72 ώρες σε κανονική (Ν) ή LR συνθήκες μέσου. Άλφα-τουμπουλίνης χρησιμοποιείται ως έλεγχος φόρτωσης. Οι διαφορετικές εκθέσεις των πρόδρομων και ενεργό SREBP2 εμφανίζονται, προκειμένου να έχουν μια ακριβή έκθεση για τις δύο μορφές. Για τα αρχικά δεδομένα δείτε Συμπληρωματική Εικόνα S3E-h. (Δ) ανάλυση των Quantificative Simple Western. δεδομένα, που εκφράζεται ως περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC). Η έκφραση του SREBP2 διορθώθηκε για τον έλεγχο φόρτωσης αλφα-τουμπουλίνης. Γράφημα αντιπροσωπεύει μέση ± S.D. (N = 2-3).

Η

Για να επιβεβαιωθούν τα ευρήματα μας για αυξημένη έκφραση γονιδίων σε lipogenic συνθήκες-μείωση λιπιδίων, σύνθεση λιπιδίων προσδιορίστηκε με μέτρηση της ενσωμάτωσης του ραδιοσημασμένου οξικού σε κυτταρικό λιπίδια. Σύμφωνα με άλλες παρατηρήσεις μας,

14C-acetetate ενσωμάτωση αυξήθηκε σημαντικά στο PC3M, τα κύτταρα HOP62 και Τ24, όταν καλλιεργούνται σε χαμηλό λιπιδίων περιβάλλον (Σχήμα 5). κύτταρα HepG2, τα οποία δείχνουν ήδη μια υψηλή βασική lipogenic δραστηριότητα, δεν εμφανίζει σημαντική αυξητική ρύθμιση της σύνθεσης των λιπιδίων τους, όταν καλλιεργούνται σε λιπίδια μειώνεται μέσο ανάπτυξης. Παρά το γεγονός ότι, HOP62 και T24 μπορούσε πλειορύθμιση τους

de novo

λιπογένεση, θα μπορούσε να φθάσει μόνο το ίδιο επίπεδο lipogenic δραστηριότητας των κυττάρων HepG2. Σε αντίθεση, τα κύτταρα θα μπορούσαν να PC3M πλειορύθμιση lipogenic δραστηριότητα τους σε ένα πολύ υψηλότερο επίπεδο από ό, τι τα άλλα κύτταρα γραμμές. Αυτό δίνει μια ένδειξη γιατί αυτά αργότερα τα κύτταρα θα μπορούσε να κρατήσει ένα φυσιολογικό ρυθμό ανάπτυξης σε συνθήκες-μείωση λιπιδίων και τις άλλες τρεις κυτταρικές σειρές δεν θα μπορούσε. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι σε λιπίδια στερούνται συνθήκες καρκινικά κύτταρα, ανεξάρτητα από το αν είναι lipogenic ή μη lipogenic σε πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας, έχουν την ικανότητα να ρυθμίζουν

de novo

οδούς λιπογένεση, να είναι σε διαφορετική έκταση. Ο βαθμός στον οποίο τα κύτταρα ρυθμίζουν lipogenic διαδρομής τους σε ένα-μείωση λιπιδίων περιβάλλον καθορίζει την ικανότητά τους να κρατήσουν πολλαπλασιάζονται υπό αυτές τις συνθήκες.

HepG2, PC3M, HOP62 και τα κύτταρα Τ24 αναπτύσσονται σε κανονική ή LR μέσο για 72 ώρες, επωάστηκαν για τις τελευταίες 4 ώρες με

14C-οξικό. Τα κυτταρικά λιπίδια αφαιρέθηκαν και η ενσωμάτωση

14C στα κυτταρικά λιπίδια προσδιορίστηκε με απαρίθμηση σπινθηρισμού. μετρήσεις σπινθηρισμού κανονικοποιήθηκαν για περιεκτικότητα DNA του δείγματος. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Σημαντικά διαφορετική (* p≤0,05? ** P≤0,01? *** P≤0,001), N.S. δεν είναι σημαντική (p & gt? 0,05).

Η

Up-ρύθμιση του

de novo

λιπιδίων σύνθεση που προκαλούνται από χαμηλές λιπιδίων περιβάλλον μπορεί να αναστραφεί με VLDL και μπορεί να αποδοθεί σε μια έλλειψη των λιπαρών οξέων και χοληστερόλης

Στη συνέχεια, επιδιώξαμε να επιβεβαιωθεί ότι η επαγωγή του

de novo λιπογένεση

υπό συνθήκες-μείωση λιπιδίων ήταν λόγω της ειδικής εξάντληση των λιπιδίων από το μέσο ανάπτυξης. Ως-μείωση λιπιδίων ορού παρασκευάζεται με απομάκρυνση των λιποπρωτεϊνών όπως οι λιποπρωτεΐνες πολύ χαμηλής πυκνότητας (VLDL) [33], τα οποία αποτελούν μια πλούσια πηγή των τριγλυκεριδίων και της χοληστερόλης, εξηγώντας την ισχυρή μείωση αυτών των δύο λιπιδίων σε λιπίδια μειώνεται μας FBS ( συμπληρωματικό πίνακα S1), κύτταρα Τ24 καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες-μείωση λιπιδίων και το μέσο συμπληρώθηκε με VLDL. Εκτός των VLDL μείωσε την έκφραση της SREBP1a, SREBP1c και SREBP2 (Συμπληρωματική Εικόνα S5A). Κατά συνέπεια, η έκφραση του FASN, ACACA, ακυλ, ACSS2 και HMGCR επίσης μειώθηκε σημαντικά (Σχήμα 6α). Αυτή η μείωση στην έκφραση των γονιδίων lipogenic συνοδευόταν από μειωμένη δραστηριότητα του λιπογόνου οδού, όπως προσδιορίζεται με

δοκιμασία ενσωμάτωσης 14C-οξική (Σχήμα 6δ). Για να ορίσετε αν τα τριγλυκερίδια ή χοληστερόλη που υπάρχει στο σωματίδιο VLDL προκάλεσε αυτή τη λιπογένεση-ανασταλτική δράση, θα συμπληρώνονται τα κύτταρα με τριγλυκερίδια ή χοληστερόλη και μόνο. Εκτός των τριγλυκεριδίων δεν μπορούσε να αντιστρέψει τη αυξημένα λιπογένεση παρατηρείται στο Τ24 καλλιεργούνται σε συνθήκες χαμηλού λιπιδίων ανάπτυξης (Συμπληρωματική Εικόνα S6). Ελεύθερα λιπαρά οξέα, όμως, είχε ως αποτέλεσμα σημαντική διάσωσης. Διαφορετικές μίγματα κορεσμένων, μονο- και πολυ-ακόρεστα λιπαρά οξέα μείωσε την έκφραση του SREBP1a, SREBP1c και SREBP2 (Συμπληρωματική Εικόνα S5B). Κατά συνέπεια, η έκφραση του FASN, ACACA, ακυλ, ACSS2 και HMGCR ήταν επίσης σημαντικά μειωμένη προσθήκη μετά λιπαρού οξέος (Σχήμα 6b) και συνοδευόταν από μειωμένη δραστηριότητα του λιπογόνου οδού, όπως προσδιορίζεται με

δοκιμασία ενσωμάτωσης 14C-οξική ( Εικόνα 6ε). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι εξωγενή λιπαρά οξέα μπορεί να επηρεάσει τη ρύθμιση του

de novo λιπογένεση

και σε καρκινικά κύτταρα. Σε αντίθεση με την προσθήκη λιπαρών οξέων, η συμπλήρωση του λιπιδίου μειωμένες μέσο ανάπτυξης με τη χοληστερόλη δεν οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα mRNA του SREBP1a, SREBP1c ή SREBP2 (Συμπληρωματική Εικόνα S5c), όμως ακόμα επηρεάζονται τα επίπεδα mRNA των κατάντη lipogenic γονίδια, FASN, ακυλ, ACSS2 και HMGCR (Σχήμα 6γ). Αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές που δείχνουν τη χοληστερόλη να ρυθμίζουν δραστικότητα SREBP στο μετα-μεταφραστικό επίπεδο, αντί στο μεταφραστικό επίπεδο [34]. Η χοληστερίνη που προκαλείται ελάττωση στην έκφραση της λιπογόνου ενζύμων συνοδεύτηκε από μια μειωμένη δραστικότητα της λιπογόνου οδού (Σχήμα 6f), υποδεικνύοντας ότι επίσης εξωγενής χοληστερόλη επηρεάζει την δραστηριότητα της πορείας λιπογένεση σε καρκινικά κύτταρα.

Η γονιδιακή έκφραση του FASN, ακυλ, HMGCR και ACSS2 αναλύθηκε με qPCR σε κύτταρα Τ24 καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες σε κανονική (Ν) ή συνθήκες ανάπτυξης LR με την παρουσία ή απουσία της VLDL (α), διαφορετικά μίγματα λιπαρών οξέων (β) και διαφορετικές συγκεντρώσεις χοληστερόλης (γ). VLDL προστέθηκε σε μια συγκέντρωση των 607 μg τριγλυκεριδίων /ml ορού (που αντιστοιχούν στα τριγλυκερίδια συγκέντρωση σε φυσιολογικά FBS). Λιπαρό οξύ (FA) μείγματα ως εξής, FA Mix 1: 20 μΜ λινολεϊκό (18:02), 20 μΜ α-λινολενικό (18:03), 5 μΜ αραχιδονικό (20:04), 5 μΜ δοκοσαεξανοϊκό οξύ (22: 6), FA Mix 2: 10 μΜ 18:02, 15 μΜ 18:03, 10 μΜ 20:04, 15 μΜ 22:06 και FA Mix 3: 20 μΜ 18:02, 20 μΜ 18:03, 5 μΜ 20 :4, 5 μΜ 22:06, 30 μΜ ελαϊκό οξύ, 30 μΜ παλμιτικό οξύ. Διαφορετικές συγκεντρώσεις χοληστερόλης (Ch) είναι όπως φαίνεται στις εικόνες (25 μΜ, 50 μΜ ή 100 μΜ). Τα δεδομένα κανονικοποιούνται σε 18S και παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± Τ.Α. (Εις τριπλούν ανά πείραμα και η = 3). Η σημαντικότητα προσδιορίστηκε με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Tukey. * Σημαντικά διαφορετική (* p≤0,05? ** P≤0,01? *** P≤0,001? **** P≤0,0001) από την κανονική του ελέγχου μέσο.

#Significantly διαφορετικά (

# p≤0,05?

## p≤0,01?

### p≤0,001?

#### p≤0,0001 ) από τον έλεγχο LR.