Αφηρημένο

προδιγιοσίνες (PG) είναι μια οικογένεια φυσικών κόκκινες χρωστικές ουσίες με αντικαρκινική δράση, και ένα μέλος της οικογένειας έχει εισέλθει κλινικές μελέτες φάσης ΙΙ. Ωστόσο, οι αντικαρκινικές μηχανισμοί PGs παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ασαφής. Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να διερευνήσει την μοριακή βάση αντικαρκινική δράση του UP, ένα παράγωγο των PGs, σε κύτταρα Ρ388. Με την εισαγωγή φαρμακολογικές αναστολείς και χρησιμοποιώντας μια ποικιλία αναλυτικών προσεγγίσεων, συμπεριλαμβανομένων κηλίδωση Western, κυτταρομετρία ροής και συνεστιακή μικροσκοπία λέιζερ, βρήκαμε ότι UP ανέστειλε πολλαπλασιασμό του Ρ388 μέσω σύλληψη κυττάρων σε G2 /M φάση και κύτταρα επαγωγής απόπτωσης, η οποία σχετίζεται με την ενεργοποίηση του P38, JNK και όχι ERK1 /2 σηματοδότησης. ROS αναγέννηση και οξίνιση σε κύτταρα δεν εμφανίζονται εμπλέκονται στην απόπτωση που επάγεται UP. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας, κλασματοποίηση βαθμίδωσης πυκνότητας σακχαρόζης και χρώση ανοσοφθορισμού, ανακαλύψαμε ότι UP προφανώς βρίσκεται στο ριβόσωμα. Αυτά τα αποτελέσματα μαζί δείχνουν ότι ριβόσωμα μπορεί να είναι ο πιθανός στόχος των UP στα καρκινικά κύτταρα, τα οποία άνοιξε ένα νέο δρόμο για τη σκιαγράφηση της αντικαρκινικής μηχανισμό της ΡΟ

Παράθεση:. Liu P, Wang Yy, Qi Χ, Gu Q, Geng Μ, Li J (2013) Undecylprodigiosin επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα Ρ388 συνδέεται με τη δέσμευση του σε ριβόσωμα. PLoS ONE 8 (6): e65381. doi: 10.1371 /journal.pone.0065381

Επιμέλεια: Yves St-Pierre, INRS, Καναδάς

Ελήφθη: 5 Νοέμβρη, 2012? Αποδεκτές: 24 Απριλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 14, Ιουνίου, 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τις επιχορηγήσεις από το Εθνικό υψηλής τεχνολογίας Ε & amp? Α Προγράμματος (2011AA09070104) της Κίνας και του Προγράμματος για Changjiang μελετητές και τα καινοτόμα ερευνητική ομάδα του Πανεπιστημίου (IRT0944). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

προδιγιοσίνες (PG) είναι μία οικογένεια φυσικών κόκκινες χρωστικές ουσίες, δομικά χαρακτηρίζονται από ένα κοινό σκελετό pyrrolylpyrromethene με ποικίλες πλευρικές αλυσίδες. Οι PGs, αρχικά απομονώθηκε από Serratia με Amak το 1929, που αποτελείται από προδιγιοσινών (PG), προδιγιοσινών 25-C (PG 25-C), metacycloprodigiosin (ΜΡ), cycloprodigiosin (CPRG) και undecylprodigiosin (UP), κλπ PGs είναι ο δευτερογενείς μεταβολίτες διαφόρων βακτηριδίων με διάφορες βιολογικές δράσεις, όπως η αντι-μικροβιακή, αντι-ελονοσίας, ανοσοκατασταλτικές και αντικαρκινικές. Οι δομές των PG και UP φαίνεται στο Σχήμα 1 [1], [2].

Η

Αύξηση μελέτες έχουν δείξει την αντικαρκινική δράση των PGs. Έχει αναφερθεί ότι οι PG επάγει απόπτωση σε κύτταρα αιμοποιητικής, γαστρεντερικό, του μαστού και τον καρκίνο του πνεύμονα, ενώ μη-τοξικά σε μη-κακοήθη κύτταρα [3] – [5]. Επί του παρόντος, ένα ΡΟ παράγωγο GX15-070 έχει εισέλθει σε κλινικές δοκιμές φάσης ΙΙ για την αντικαρκινική δράση της [6].

Οι αυξανόμενες μελέτες που έχουν διεξαχθεί για να αποκαλύψει τους μοριακούς στόχους της ΡΟ για να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με αντικαρκινική αποτελεσματικότητά του, αλλά η ευρήματα αποκάλυψαν μεγάλες διαφορές στις διάφορες κυτταρικές πλαίσιο ή με τη χρήση μεμονωμένων ενώσεων. Οι PGs έχουν αναφερθεί ότι ενεργοποιούν οδούς σηματοδότησης πιθανώς μέσω επαγωγής ΟΝΑ δίκλωνα σπασίματα ή /και εξουδετέρωση του κλίσεις ρΗ, η οποία οδηγεί σε εναλλαγές του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Janus κινάση τυροσίνης 3 (ΙΑΚ3) ότι συνδέεται με IL-2R κατά την ενεργοποίηση Προτάθηκε επίσης να είναι ο μοριακός στόχος για PGs σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα [7]. Πρόσφατα, Μ Espona-Fiedler εντοπιστεί το στόχο της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) ως μοριακός στόχος υποψήφιος των PGs σε μελάνωμα κύτταρα [8]. Παρ ‘όλα αυτά, ο μοριακός μηχανισμός της PG που παραμένει σε μεγάλο βαθμό ασαφής.

Έχουμε εξάγεται UP από το ζωμό ζύμωσης του ένα σφουγγάρι Μυκάλης φτερωτά που προέρχονται από ακτινομύκητες

Saccharopolyspora sp.Nov

, και διαπίστωσε ότι αυτή η ένωση εμφάνισε σημαντική κυτταροτοξική δραστικότητα έναντι πέντε κυτταρικών γραμμών καρκίνου, μεταξύ των οποίων οι επιπτώσεις στην Ρ388 λευχαιμίας ποντικού ήταν η πιο προφανής [9]. Στην παρούσα μελέτη, επιχειρήσαμε να αποκαλύψει τη μοριακή βάση UP για αντικαρκινική δράση της στα κύτταρα Ρ388. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι UP αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των Ρ388 επάγοντας G2 /M φάση σύλληψης και απόπτωσης, η οποία σχετίζεται με την ενεργοποίηση των ρ38, JNK και όχι ERK1 /2 σηματοδότησης. Το ριβόσωμα εμφανίζεται το πιθανό στόχο του UP. Αυτή η μελέτη παρέχει μοριακή βάση για την περαιτέρω διαλεύκανση της αντικαρκινικής μηχανισμό της ΡΟ στο μέλλον.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

UP και PG δόθηκαν από τον καθηγητή Gu (Σχολή ιατρικής και Φαρμακευτικής, Ocean Πανεπιστήμιο της Κίνας, Qingdao, Κίνα). καθαρότητες τους ήταν & gt? 99,5%. 4,6-διαμιδινο-2-phenyllindile (DAPI), ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) αγοράστηκε από GIBCO (Gaithersburg, MD). Ένα κιτ ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) αγοράστηκε από την Pierce (Holmdel, NJ) .U0126, SP60012, SB203580, SRB, DCFH-DA, BCECF AM, AO ήταν όλοι αγοράζονται από Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας (Jiangsu, Κίνα). PARP, Cyt C, κασπάση-3, Caspse-8, κασπάση-9, β-ακτίνη, ρ-ΑΚΤ, ΑΚΤ, ρ-ΕΚΚ, ERK, ρ-ΙΝΚ, JNK, ρ-Ρ38 και αντίσωμα P38 αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling (Beverly, ΜΑ). Ριβοσωμική πρωτεΐνη S3 αντίσωμα αγοράστηκε από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

Γραμμές κυττάρων και Πολιτισμού

κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από το Ινστιτούτο Βιοχημείας και Κυτταρικής Βιολογίας (Σαγκάη, Κίνα) και συντηρούνται σύμφωνα με τις οδηγίες των προμηθευτών. Εν συντομία, τα κύτταρα Ρ388 διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο ελάχιστο βασικό μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM)? κύτταρα Α459 καλλιεργήθηκαν σε μέσο F12K. Αμφότερα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε 5% CO2 στους 37 ° C.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία SRB. κύτταρα Ρ388 καλλιεργήθηκαν στους 8 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων και στη συνέχεια κατεργάζεται με UP για 72 ώρες. Σε μερικά πειράματα τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με NAC, iminazole ή αναστολέα ΜΑΡΚ για 1 ώρα. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 16% τριχλωροξικό οξύ (TCA) στους 4 ° C για 1 ώρα, μετά την οποία, οι πλάκες πλύθηκαν πέντε φορές με κρύο νερό, η περίσσεια νερού αποστραγγίστηκε και οι πλάκες αφήνονται να στεγνώσουν στον αέρα. SRB κηλίδα (100 μΙ, 0,4% σε 1% οξικό οξύ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και αφήνονται σε επαφή με τα κύτταρα για 30 λεπτά, στη συνέχεια τα κύτταρα πλύθηκαν με 1% οξικό οξύ για πέντε φορές. Οι πλάκες ξηραίνονται και 150 μΐ 10 mM Tris βάση (ρΗ 10.5) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για τη διαλυτοποίηση της χρωστικής επί 30 λεπτά. Η απορροφητικότητα (OD) κάθε φρεατίου αναγνώστηκε σε ένα Microplate Reader (Tecan, Austria) σε μήκος κύματος 490 nm. Η% βιωσιμότητα των κυττάρων = (OD επεξεργασμένων κυττάρων /OD κυττάρων ελέγχου) χ 100%.

Περιεχόμενο DNA Ανάλυση

Ρ388 κύτταρα επιστρώθηκαν σε 100 mm δίσκου καλλιέργειας σε 2 × 10

5 κύτταρα /δίσκο, 24 ώρες αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με UP για 24 ώρες. Μετά από αυτό, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, σταθεροποιήθηκαν με 70% ψυχρή αιθανόλη στους 4 ° C για 12 ώρες, επωάστηκαν με RNase Α (30 μg /ml) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια χρωματίζονται με ιωδιούχο προπίδιο (50 μg /ml ) στους 4 ° C για 30 λεπτά. Cellular DNA αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής (Vantage, Becton Dickinson, San Jose, CA).

Ανάλυση Western Blot

Μετά την UP (0,05 μΜ) αγωγή για 1 ώρα ή 24 ώρες, 1 × 10

6 κύτταρα πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια λύθηκαν με RIPA (50 mM Tris, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% SDS) για 30 λεπτά σε πάγο. Το προϊόν λύσης κυττάρου φορτώθηκε επί ηλεκτροφόρηση σε 10% SDS-PAGE. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες ηλεκτροφορητικώς στυπώθηκαν σε μεμβράνη NC (Millipore, USA). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% άπαχο γάλα αραιωμένο σε TBS-T για 2 h σε RT, στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα με αντισώματα για την PARP, Cyt C, κασπάση-8, 9, 3, ρ-ΑΚΤ, ΑΚΤ, ρ- ERK, ERK, ρ-ΙΝΚ, JNK, ρ-Ρ38 και Ρ38. Goat αντι-κουνελιού IgG συζευγμένο με υπεροξειδάση (1:3000 αραίωση) επωάστηκαν για 1 ώρα σε RT. Μεταξύ κάθε επώαση, οι μεμβράνες πλύθηκαν 3 χ 5 λεπτά σε ΤΒδ-Τ. Η σύνδεση αντισώματος ανιχνεύθηκε με ενισχυμένη αντιδραστήριο χημειοφωταύγειας.

Εντοπισμός του στα κύτταρα

Ρ388 κύτταρα αναπτύσσονται σε καλυπτρίδες σε επεξεργασία με UP (0,05 μΜ) .at 37 ° C για 1 ώρα. Μετά από τρεις πλύσεις με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν στη συνέχεια με DAPI. Οι καλυπτρίδες εξετάσθηκαν με σάρωση με λέιζερ συνεστιακό μικροσκόπιο (LSM 510-Meta, Zeiss, Γερμανικά) [10].

AO χρώσης

Οι ζουν καλλιεργημένα κύτταρα βάφτηκαν με πορτοκαλί της ακριδίνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],11], [12]. Εν συντομία, κύτταρα Ρ388 σε ένα φορείο θαλάμου εκτέθηκαν σε UP για 1 ώρα. Στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν με 5 μg /ml πορτοκαλί ακριδίνης για 30 λεπτά στους 37 ° C στο σκοτάδι. Τα πλακίδια θαλάμου πλύθηκαν με διάλυμα Hanks ‘και στη συνέχεια εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία laser.

Ανίχνευση των ενδοκυτταρικών pH (pHi)

Ρ388 κύτταρα εκτέθηκαν σε 0,05 μΜ UP για 1 ώρα. Τα καλλιεργημένα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, φυγοκεντρήθηκαν και φορτώθηκαν με 10 μΜ 29, 79-δις- (καρβοξυαιθυλο) -5 (69) -καρβοξυφλουορεσκεϊνη ακετοξυμεθυλ εστέρα (ΒΟΕΟΡ-ΑΜ) στους 37 ° C για 30 λεπτά σε PBS. Μετά από φυγοκέντρηση, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε PBS και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής [4].

Ανίχνευση των ενδοκυτταρικών δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS)

εκτιμήθηκε Ενδοκυτταρική οξειδωτικό στρες με μέτρηση ενδοκυτταρικής οξείδωση του 2 ‘, 7’-dichlorofluorescin (DCFH). Το υπόστρωμα είναι DCFH-DA, που διαχέεται εύκολα εντός του κυττάρου και την επόμενη αποακετυλιώνεται από κυτταρικές εστεράσες στο περισσότερο υδρόφιλο, μη φθορίζον DCFH. γενεά ROS στο κύτταρο οξειδώνει DCFH στην φθορίζουσα 2 ‘, 7’-διχλωροφθορεσκεϊνης (DCF). κύτταρα Ρ388 ήταν seeded, και επωάστηκαν με UP (0.05 μΜ) για 1 ώρα, στη συνέχεια συλλέγονται τα κύτταρα, πλύθηκαν, και φορτώθηκαν με DCFH (10 μΜ) στους 37 ° C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν και φορτωμένο με DCFH (10 μΜ) στους 37 ° C για 30 λεπτά. Τέλος τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, και κυτταρικού φθορισμού αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής με διέγερση στα 488 nm και εκπομπή στα 530 nm [13], [14].

Native-PAGE και Ανάλυση φασματομετρίας μάζας

Μετά την επώαση με UP (0.05 μΜ) για 1 ώρα στους 37 ° C τα κύτταρα, Ρ388 συλλέχθηκαν και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20 mM Tris, ρΗ 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton Χ-100) για 30 min στον πάγο, φυγοκεντρήθηκε στα 12.000 g για 20 λεπτά στους 4 ° C. Ένας ίσος όγκος ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης (50 mM trisbase, 30% γλυκερόλη, 0,01% κυανούν βρωμοφαινόλης) προστέθηκε στο υπερκείμενο. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε 8% Εγγενής-PAGE, και η λωρίδα αποκόπηκε σύμφωνα με το χρώμα του UP. Οι πρωτεΐνες που δεσμεύονται με UP αναλύθηκαν με LC-ESI-LTQ (Thermo Finnigan LTQ) κατά NCBI βάσης δεδομένων πρωτεϊνών του ποντικιού [15].

κλίσης πυκνότητας σακχαρόζης κλασματοποίηση

Για την προετοιμασία κυτταροπλασματικό εκχύλισμα για ριβοσωμική κλασματοποίηση , κύτταρα Ρ388 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,05 μΜ UP για 1 ώρα, στη συνέχεια πλύθηκε με παγωμένο PBS δύο φορές και λύθηκαν σε παγωμένο RIPA για 30 λεπτά, στη συνέχεια φυγοκεντρείται στα 10.000 χ g για 15 λεπτά για να καθαρίσει το προκύπτον υπερκείμενο των πυρήνων, μιτοχονδρίων και υπολείμματα. διάλυμα πρωτεΐνης Lysate επιστρώθηκε πάνω από 9 ml γραμμική βαθμίδωση σακχαρόζης διάλυμα (10-50%) σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης Sorvall 11,5 ml και φυγοκεντρήθηκε στα 35.000 χ g για 3 ώρες στους 4 ° C σε υπερφυγόκεντρο (Beckman Optima ΤΜ L-100 XP). Μόνο UP χωρίς λύμα στην κορυφή της γραμμικής διάλυμα βαθμίδωση σουκρόζης χρησιμοποιήθηκε σαν έλεγχος [16].

ανοσοφθορισμού χρώσης

Ρ388 κύτταρα εμβολιάστηκαν σε μια έξι-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε UP (0.05 μΜ) για 1 ώρα. Τα κύτταρα ξεπλένονται δύο φορές με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και σταθεροποιήθηκαν για 10 λεπτά με 4% φορμαλδεΰδη. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και στη συνέχεια καθίστανται διαπερατά για 10 λεπτά με 0.1% Triton Χ-100, τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με PBS που περιέχει 1% BSA για 20-30 λεπτά και χρωματίστηκαν με ριβοσωμική πρωτεΐνη S3 αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C, που ακολουθείται από επώαση με αντι-ποντικού IgG-FITC για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπια συνεστιακό λέιζερ σάρωσης [17].

Αποτελέσματα

UP αναστέλλει την ανάπτυξη του Ρ388 κύτταρα

Για να προσδιορισθεί η κυτταροτοξική δράση του UP επί κυττάρων Ρ388, δοκιμασία SRB χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μετά αγωγή 72 ώρες. Σε ένα εύρος συγκέντρωσης από 0,0048 να 15

μ

Μ, θεραπεία UP ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης των κυττάρων Ρ388. Το IC

20 και IC

50 στα κύτταρα Ρ388 ήταν 0,0049

μ

Μ και 0,042

μ

Μ, αντίστοιχα (Εικ. 2).

Τα κύτταρα κατεργάζεται με ενδεικνυόμενη συγκέντρωση μέχρι και PG για 72 ώρες. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν τα ποσοστά κυτταρικής βιωσιμότητας των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με τρεις προσδιορισμούς σε κάθε μία. **

σ

& lt? 0,01 και ***, σ & lt?. 0.001 έναντι ελέγχου

Η

UP Προκαλεί G2 /M φάση Σύλληψη και απόπτωση σε κύτταρα Ρ388

Η καταστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων έχει γίνει γνωστό ότι διαμεσολαβείται κυρίως από απόπτωση και κύκλου κυττάρου. Εμείς επόμενη εφαρμόζεται κυτταρομετρία ροής για να αναλύσουν τη διανομή φάση του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης κατά την κατεργασία UP. κύτταρα Ρ388 σε επεξεργασία με UP (0.05 μΜ) για 24 ώρες έδειξε συσσώρευση σε G2 /M (40,73%) με ταυτόχρονη μείωση σε κύτταρα G1 φάση G0 /, γεγονός που υποδηλώνει μια διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε G2 /M φάση. UP επάγεται επίσης ένα υψηλότερο ποσοστό των επιμέρους πληθυσμού G0 /G1, ενδεικτική της εμφάνισης απόπτωσης. Περίπου 8.23% κυττάρων ήταν αποπτωτικά όταν θεραπεύτηκαν με UP για 24 ώρες σε αντίθεση με & lt (Σχήμα 3Α).? 1% αποπτωτικών κυττάρων στην ομάδα ελέγχου χωρίς θεραπεία. Περαιτέρω, εξετάσαμε UP διάσπασης πολυμεράσης προκαλείται από πολυ (ADP-ριβόζη), ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης που δείχνει την ενεργοποίηση των κασπασών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υδρόλυση της πρωτεΐνης πολυμεράσης 116 KD πολυ (ADP-ριβόζη) προς την 85 KD ανιχνεύθηκε στο UP επεξεργασμένα κύτταρα μετά από έκθεση 24 ωρών σε 0,05 μΜ. Για να εξεταστεί αν κασπάσες εμπλέκονται σε απόπτωση που επάγεται UP, ανάλυση στυπώματος western διεξήχθη για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η συμμετοχή της κασπάσης-3, κασπάσης-8 και κασπάσης-9. Οι cleavaged ζώνες procaspase-3, procaspase-8 και procaspase-9 ανιχνεύθηκαν μετά από θεραπεία με UP για 24 ώρες, υποδεικνύοντας την ενεργοποίηση της κασπάσης-3, κασπάσης-8 και κασπάσης-9.

A. ιστογράμματα DNA των κυττάρων Ρ388 καλλιεργήθηκαν σε μέσο μόνο, ή σε DMSO (1:1000) ή με την παρουσία 0,05 μΜ PG και UP για 24 ώρες. B. Η έκφραση πρωτεϊνών απόπτωσης που σχετίζονται προσδιορίσθηκε με ανοσοστύπωση με ειδικά αντισώματα μετά από έκθεση σε επάνω για 24 ώρες. Η έκφραση προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το μηχανογραφικό ImageQuant σύστημα ανάλυσης εικόνας. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει εκείνα σαρωθεί εις διπλούν από τρία φρεάτια που εκφράζεται ως ποσοστό του μάρτυρα ± τυπική απόκλιση. *,

P

& lt? 0,05, UP εναντίον Blank. Γ Αντιπροσωπευτικά προφίλ κυτταρομετρίας ροής με Rhodamine χρώση 123, αφού τα κύτταρα επωάστηκαν με 0,05 μΜ UP για 24 ώρες. ένα, DMSO? β, 0,05 μΜ PG? c, 0,05 μΜ UP.

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε την μιτοχονδριακή απελευθέρωση του Cyt C, ανάντη μονοπάτι της κασπάσης 9. Μετά την επεξεργασία 24 ωρών με UP, την κυκλοφορία του Cyt C στο κυτταρόπλασμα ήταν σημαντικά αυξάνεται, ενώ Cyt C στα μιτοχόνδρια μειώθηκε προφανώς (Σχ. 3Β). Έχει γνωρίζουμε ότι η απελευθέρωση των intermembrane πρωτεϊνών όπως Cyt C εμφανίζεται μετά την ακεραιότητα της μιτοχονδριακής μεμβράνης ήταν μειωμένη, γεγονός που οδηγεί σε διατάραξη της εσωτερικής διαμεμβρανικό δυναμικό (ΔΨm). Ο αντίκτυπος των UP για μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό (ΔΨm) αξιολογήθηκε περαιτέρω χρήση ροδαμίνης 123, ένα ειδικό φθορίζοντα ανιχνευτή. Φθορισμού ένταση ήταν σημαντικά μειωμένη σε UP κατεργασμένα κύτταρα, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχ. 3C). Αυτά τα αποτελέσματα μαζί υποδηλώνουν ότι η ενδογενής μιτοχονδριακό αποπτωτικό μονοπάτι, με τη συμμετοχή της κασπάσης-9 και -3, εμπλέκεται στην UP-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα Ρ388.

UP Τονίζει τους κυρίως στην κυτταρόπλασμα

UP εκπέμπει κόκκινο φθορισμός στα 488 nm διέγερση, η οποία μπορεί να απεικονιστεί σε ζωντανά κύτταρα. κύτταρα Ρ388 βάφτηκαν με το DNA δεσμευτική βαφή ϋΑΡΙ μετά από έκθεση 1 ώρα έως 0.05 μΜ για την εξέταση της υπο-κυτταρικό εντοπισμό του UP. Τα κύτταρα απεικονίστηκαν υπό ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, UP ήταν κυρίως εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, αλλά δεν μεμβράνη ή στον πυρήνα.

Το μπλε αντιπροσωπεύει την χρώση πυρήνα και το κόκκινο αντιπροσωπεύει UP.

Η

ΠΑΝΩ Ενεργοποιεί ΜΑΡΚ αλλά όχι ΑΚΤ Σηματοδοσίας

για να προσδιοριστεί η πιθανή εμπλοκή των οδών κινάσης πρωτεΐνης σε G2 /M σύλληψη και την απόπτωση που επάγεται από το UP, θα διερευνάται η κατάσταση φωσφορυλίωσης των τεσσάρων μεγάλων πρωτεϊνικών κινασών που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα Ρ388 μετά εκτίθενται σε UP για 1 ώρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, UP προφανώς αύξησε τα επίπεδα της φωσφο-ERK1 /2, φωσφο-p38MAPK, και φωσφο-JNK1 /2, ενώ ΑΚΤ κατάσταση φωσφορυλίωσης επηρεάστηκε ελάχιστα. Συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη των αντίστοιχων πρωτεϊνικών κινασών δεν άλλαξε.

A. Επιπτώσεις της έκθεσης των κυττάρων Ρ388 έως 0,05 μΜ UP για 1 ώρα για την κατάσταση φωσφορυλίωσης και το επίπεδο έκφρασης των πρωτεϊνικών κινασών. Η έκφραση προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το μηχανογραφικό ImageQuant σύστημα ανάλυσης εικόνας. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει εκείνα σαρωθεί εις διπλούν από τρία φρεάτια που εκφράζεται ως ποσοστό του μάρτυρα ± τυπική απόκλιση. ***

P

& lt? 0.001, UP έναντι του ελέγχου. B. Επίδραση των αναστολέων ΜΑΡΚ επί UP-επαγόμενη αναστολή ανάπτυξης Ρ388, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με U0126 (10 μΜ), SP60012 (20 μΜ) ή SB203580 (20 μΜ) για 1 ώρα, στη συνέχεια συν-θεραπεία με UP για 72 ώρες. U0126, αναστολέα ΕΚΚ? SP60012 (SP), αναστολέα JNK? SB203580 (SB), αναστολέα Ρ38. ** P & lt? 0,01, PG εναντίον (PG + αναστολέας), UP εναντίον (UP + αναστολέας)

Η

Για την αντιμετώπιση των περαιτέρω αν ERK1 /2, JNK1 /2 ή Ρ38 είχε εμπλακεί σε UP. -inhibited κυτταρική ανάπτυξη, τα κύτταρα επωάστηκαν με ή χωρίς τον αναστολέα της ERK1 /2, JNK1 /2 και Ρ38, αντίστοιχα, και στη συνέχεια συν-επεξεργάζονται με 0,05 μΜ UP για 72 ώρες. πολλαπλασιασμός κυττάρων εκτιμήθηκε με τη μέθοδο SRB. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β, κανένας από αυτούς τους αναστολείς επηρεάζεται ο πολλαπλασιασμός κυττάρων per se. SP και SB, αλλά όχι U0126 αντιστραφεί προφανώς το ανασταλτικό αποτέλεσμα UP επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων Ρ388, υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση JNK1 /2 και Ρ38 είχε εμπλακεί σε UP-επαγόμενη απόπτωση. Μόνο ενεργοποίηση Ρ38 βρέθηκε να σχετίζεται με PG-επαγόμενη απόπτωση, η οποία ήταν σε συμφωνία με αναφορές στη βιβλιογραφία [18].

NAC αποτυγχάνει να διασώσει UP προκάλεσε αναστολή της κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Έχει αναφερθεί ότι PGs θα μπορούσε να προκαλέσει την παραγωγή ROS στα κύτταρα [19]. Να εξετάσει την πιθανή τη συμμετοχή των ROS στο UP-επαγόμενη απόπτωση και G2 /M σύλληψη φάση στα κύτταρα Ρ388, έχουμε κατ ‘αρχάς μετριέται γενιά ROS στα κύτταρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η παραγωγή ROS αυξήθηκε ήδη από 1 ώρα μετά τη θεραπεία UP (Σχ. 6Α). Να αποκαλύψει εάν οι λογαριασμοί γενιά ROS για UP-επαγόμενη απόπτωση, μια ROS οδοκαθαριστής NAC είχε χρησιμοποιηθεί πριν από τη θεραπεία UP. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, NAC απέτυχε να σώσει την αναστολή της ανάπτυξης που προκαλείται από UP και PG, όπου σε αντίθεση H

2O

2 κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ήταν σαφώς αντιστρέφεται με αγωγή NAC. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η παραγωγή ROS είναι πιο πιθανό να μην εμπλέκονται σε UP-επαγόμενη απόπτωση.

Α. κύτταρα Ρ388 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,05 μΜ UP για 1 ώρα, και χρωματίστηκαν με DCFH (10 μΜ). Ο φθορισμός μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. α, DMSO + DCFH? β, 0,05 μΜ PG? γ, 0.05 μΜ PG + DCFH? δ, 0.05 μΜ UP? e, 0,05 μΜ UP + DCFH. κύτταρα Β Ρ388 ήταν προεπεξεργασία με ή χωρίς NAC (0.5 mM) για 1 ώρα, στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν με συγ- PG (0,05 μΜ), UP (0.05 μΜ) και H

2O

2 (0,4 mM) για 72 ώρες. *, P & lt?. 0.05, H

2O

2 vs (H

2O

2 + NAC)

Η

Η αύξηση της οξύτητας δεν συμμετέχει στο UP Προκαλείται Αναστολή Ανάπτυξης

ακριδίνης πορτοκαλί είναι ένα «οξύ- tropic» ασθενής βάση, η οποία παραλαμβάνεται από τα ζωντανά κύτταρα και συσσωρεύεται εντός οξινισμένου διαμερίσματα όπως λυσοσώματα [17], [20]. Ο φθορισμός του πορτοκαλί ακριδίνης είναι πράσινο σε χαμηλές συγκεντρώσεις, ενώ σε υψηλές συγκεντρώσεις οι αλλαγές φθορισμού πορτοκαλί [17]. Παρατηρήσαμε προφανής εξαφάνιση σε πορτοκαλί κόκκους σε κύτταρα μετά την σύντομη κατεργασία (1 ώρα) με 0,05 μΜ PG και UP (Εικ. 7Α). Οι αλλαγές του pHi αναλύθηκαν επίσης με κυτταρομετρία ροής με BCECF-ΑΜ, έναν φθορίζοντα δείκτη μεμβράνη διαπερατή για τη μέτρηση της κυτταροπλασματικής ρΗ. Βρήκαμε ότι η pHi μειώθηκε σημαντικά σε PG ή UP-επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 7Β), σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα.

Α. Ακριδίνης πορτοκαλί χρώση των κυττάρων Ρ388, PG και ΜΡ ήταν 0,05 μΜ, AO ήταν 5 μg /ml. Πορτοκαλί κόκκους οξυνίστηκαν διαμερίσματα. Β αντιπροσωπεύουν δεδομένα της ροής-κυτομετρική ανάλυση pHi χρησιμοποιώντας 10 μΜ χρώση BCECF-ΑΜ μετά τα κύτταρα επωάστηκαν με 0,05 μΜ PG ή επάνω για 24 ώρες με ή χωρίς ιμιδαζολίου (0,5 mM) προεπεξεργασία επί 1 ώρα. ένα, ελέγχου? β, PG? γ, PG + ιμιδαζόλιο? d, UP? e, UP + ιμιδαζόλιο C. Επίδραση του αναστολέα οξίνισης στο UP-επαγόμενη αναστολή ανάπτυξης Ρ388, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με ιμιδαζόλιο (0.5 mM) για 1 ώρα, στη συνέχεια συν-κατεργασία με PG (0.05 μΜ) και UP (0.05 μΜ) για 72 h.

η

Αντίθετα, κύτταρο-διαπερατό βάσεις ιμιδαζολίου θεραπεία εμπόδισε σημαντικά την μείωση του pHi. Στη συνέχεια εξετάστηκε εάν UP-προκάλεσε αναστολή της ανάπτυξης θα μπορούσε να διασωθεί από ιμιδαζόλη. Ταυτόχρονη με την έκθεση UP, δεν ήμασταν σε θέση να εντοπίσει τυχόν σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με κύτταρα που κατεργάζονται, περίπου μόνο το 3% ανάκτηση (Εικ. 7C), γεγονός που υποδηλώνει ότι η οξίνιση του κυτταροπλάσματος, δεν θα πρέπει να είναι ο κύριος λόγος της απόπτωσης που προκαλείται από UP. PG είχε παρατηρήσει ότι έχουν παρόμοια αποτελέσματα με UP.

UP συνδέεται με το ριβόσωμα σε Ρ388 κύτταρα

Προχωρήσαμε για τον εντοπισμό των μοριακών στόχων των UP στα κύτταρα Ρ388, εντοπίζοντας UP δέσμευσης πρωτεϊνών με χρήση φασματομετρίας μάζας ανάλυση. UP μετανάστευση μπορεί εύκολα να παρατηρηθεί με γυμνό μάτι ως μπάντα σε πορτοκαλί χρώμα στη μητρική PAGE (Εικ. 8Α). Η ζώνη γέλη αποκόπηκε και υποβλήθηκε σε ανάλυση φασματομετρία μάζας. Ένα σύνολο 951 πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν, μεταξύ των οποίων 171 πρωτεΐνες, προς έκπληξή μας, ήταν ριβοσωμικές πρωτεΐνες με υψηλότερη CoverPercent (Πίνακας 1), γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να δεσμεύσει UP κυρίως σε ριβόσωμα.

A. Η ταινία της σε Native-PAGE. Β κλίση πυκνότητας σουκρόζης κλασματοποίηση του UP-κατεργασμένων κυττάρων Ρ388 και UP μόνο. Γ και Δ υποκυτταρικός εντοπισμός της Rps3 και σε κύτταρα Ρ388 (C) και τα κύτταρα Α549 (D) που ανιχνεύεται με συνεστιακή. UP φθορισμού εμφανίζεται με κόκκινο χρώμα, Rps3 φθορισμού σε πράσινο και το colocalization (συγχωνεύονται) σε κίτρινο.

Η

Για την περαιτέρω επικύρωση, κύτταρα Ρ388 επωάστηκαν με UP στα 0,05 μΜ για 1 ώρα και ριβοσώματος απομονώθηκε με κλασμάτωση βαθμίδωσης πυκνότητας σακχαρόζης. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, όπου UP εμπλουτίστηκε στο πάνω μέρος της λύσης πυκνότητας σακχαρόζης, προφανές στρώσεις χρώματος ζώνες βρέθηκαν στην UP επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 8Β), υποστηρίζοντας μια αντίληψη ότι UP συνδέεται με ριβόσωμα. Διαπιστώσαμε επίσης την colocalization μεταξύ UP και ριβοσώματος χρησιμοποιώντας συνεστιακό μικροσκόπιο και στις δύο κύτταρα Ρ388 (Εικ. 8C) και κύτταρα Α549 (Σχ. 8D). χρώση ανοσοφθορισμού έδειξε ότι μέχρι colocalized να ριβοσώματος αταξινόμητους από ενδογενή Rps3 στις δύο κυτταρικές σειρές.

Συζήτηση

Μέχρι σήμερα, η αντικαρκινική μηχανισμός της PG που ακόμα δεν έχουν διευκρινιστεί σε λεπτομέρειες. Για παράδειγμα, Francisco R αναφερθεί PG κρούση μιτοχόνδρια, εξασκείται μία αποσύζευξη επίδραση στην ηλεκτρονική αλυσίδα, η πυρήνα του κυττάρου διατηρήθηκε από προδιγιοσινών πρόσβαση [17]. Ωστόσο, τα ευρήματα της Montaner Β αναφέρεται ότι η απόπτωση που επάγεται από προσταγλανδίνες ήταν χαλκού μεσολάβηση διάσπαση του DNA [21]. Jing Zhang et al. Αναφέρεται επίσης ότι οι PG αυξημένη μεσοκυττάρια ROS, η οποία οδήγησε σε κυτταροτοξικά αποτελέσματα [19]. Οι μοριακοί στόχοι των PGs είναι αντιφατικά αναφερθεί συμπεριλαμβανομένων ΙΑΚ3, mTOR και NAG-1 [7], [8], [22]. Στη μελέτη μας, πιστεύουμε ότι UP επαγόμενη απόπτωση στα κύτταρα Ρ388 συνδέεται με δεσμευτικό το UP-ριβόσωμα.

Βρήκαμε ότι μέχρι ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, συνέλαβαν τον κυτταρικό κύκλο στο G2 /M φάση, οδήγησε στην ενεργοποίηση της κασπάσης 3, 8, 9, μετατροπές του δυναμικού της μεμβράνης μιτοχονδρίων, η απελευθέρωση του Cyt C και διάσπαση της PARP. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι UP έχει κυτταροτοξικότητα σε Ρ388 και Ρ388 επάγει απόπτωση κυττάρων που περιλαμβάνουν στα μιτοχόνδρια αποπτωτική παθολογική οδό τουλάχιστον. Προκειμένου να διαλευκανθεί ο μηχανισμός υποκείμενη απόπτωση που προκαλείται από UP, αξιολογήσαμε για πρώτη φορά την κατανομή των κυττάρων των UP με αυτόματη φθορισμού του, το αποτέλεσμα έδειξε ότι UP διανέμονται σε κυτταρόπλασμα, αλλά δεν μεμβράνη ή πυρήνα, η οποία μας δείχνει ότι UP μπορούν να αλληλεπιδρούν με μόρια σε κυτταρόπλασμα να επάγει απόπτωση.

Η PI3K /Akt μονοπατιού ρυθμίζει βασικές κυτταρικές λειτουργίες, όπως η κυτταρική ανάπτυξη, την επιβίωση, και την κίνηση. Υπερβολικό ενεργοποίηση της οδού ΡΙ3Κ /Akt έχει αναφερθεί ότι συνδέεται με την ανάπτυξη του καρκίνου. Akt μπορεί επίσης να ρυθμίζουν άμεσα την αποπτωτική μηχανήματα με φωσφορυλίωση και αδρανοποιώντας προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών όπως BAD, επιπροσθέτως, η δραστικότητα Akt απαιτείται για G2 /M μετάπτωσης φάσης και η αναστολή της ΑΚΤ συχνά επάγει G2-M σύλληψης [23]. Ωστόσο, στα πειράματα μας, UP δεν φάνηκε να επηρεάζει την ενεργοποίηση ΑΚΤ του Ρ388.

Οι MAP κινάσες αποτελείται από πρωτεϊνικές κινάσες σερίνης /θρεονίνης, συμπεριλαμβανομένων των εξωκυτταρικών κινάσες σήματος ρυθμίζεται (ΕΚΚ), της ΜΑΡΚ p38, οι c-Jun-ΝΗ2-τερματικό κινασών (JNK) και κινάσες ΜΑΡ μονοπάτια σηματοδότησης ρυθμίζουν ουσιαστικά όλες τις πτυχές της κακοήθους κυτταρικής συμπεριφοράς, τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, τη μετανάστευση και εισβολή [24]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι μέχρι ενεργοποιεί Ρ38, ERK και JNK εντυπωσιακά. Οι εκλεκτικοί αναστολείς της Ρ38 και ΙΝΚ αντί αναστολέα ΕΚΚ, εμπόδισαν τα καρκινικά κύτταρα Ρ388 από την κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από UP. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η απόπτωση που επάγεται από UP σχετίζεται με την ενεργοποίηση του Ρ38 και JNK, η οποία είναι διαφορετική από PG με την οποία μόνο η φωσφορυλίωση της ρ38 περιλαμβάνει στη δραστηριότητα της.

ROS παράγεται ενδοκυτταρικά ως παραπροϊόντα του φυσιολογικού αερόβιου μεταβολισμού ή ως δεύτεροι αγγελιαφόροι σε διάφορες οδούς μεταγωγής σήματος ή σε απόκριση σε περιβαλλοντικό στρες [25], [26]. Ως ειδικά δεύτεροι αγγελιοφόροι σε καταρράκτες που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση των κυττάρων σηματοδότησης, ROS έχει ενοχοποιηθεί στη ρύθμιση διαφόρων κυτταρικών λειτουργιών συμπεριλαμβανομένης ενδοκυτταρικής σηματοδότησης μεταγραφική ενεργοποίηση, πολλαπλασιασμό και την απόπτωση [27]. Τα τελευταία χρόνια, πολλές ερευνητικές έμφαση στη σχέση μεταξύ των ROS και μιτογόνο ενεργοποιημένη πρωτεΐνη κινάση-ΜΑ

PK

μονοπάτια σηματοδότησης. Ling Liu et al ανέφεραν ότι NG-επαγόμενη απόπτωση κυττάρων HepG2 ήταν χαρακτηριστικό της ενδοκυτταρικής παραγωγής ROS. Ταυτόχρονα NG θεραπεία θα μπορούσε να οδηγήσει στην ενεργοποίηση της φωσφορυλίωσης της JNK και ρ38, αλλά όχι ERK1 /2. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι UP προκαλείται από ενδοκυτταρική παραγωγή ROS στα κύτταρα Ρ388. Ωστόσο, μια ROS οδοκαθαριστής NAC δεν μπορούσε να αντιστρέψει την αναστολή του πολλαπλασιασμού που προκαλείται από UP, αν και είναι προφανές ότι ανταγωνίζεται την παραγωγή ROS από H

2O

2. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η παραγωγή του ROS δεν εμπλέκεται στην απόπτωση που επάγεται από UP.

Η pHi εντός όξινων οργανίδια είναι υπεύθυνοι για μία ευρεία ποικιλία σημαντικών κυτταρικών λειτουργιών, όπως ενδοκυττάρωση, εξωκυττάρωση και ενδοκυτταρική διακίνηση, καθώς και κυτταρική διαφοροποίηση, την κυτταρική ανάπτυξη και τον κυτταρικό θάνατο. Η pHi σε μετασχηματισμένα ή καρκινικά κύτταρα γενικά παραμένει ουδέτερο ή ακόμα και ελαφρώς περισσότερο αλκαλικό από τα φυσιολογικά κύτταρα [28], που ρυθμίζεται από μια ποικιλία pHi ομοιοστατικών μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης Na

+ /H

+, Na

+ – εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από Cl

– /ΟΠΕΠ

3

– εναλλάκτες, κενοτοπικής τύπου H

+ – ΑΤΡάσης (V-ΑΤΡ) και άλλοι. Daigo Ya mamoto ανέφεραν ότι η ενδοκυτταρική οξίνιση του KPL-1 με επεξεργασία cPrG.HCl επαγόμενη απόπτωση και τον κύκλο σύλληψης, το οποίο ήταν έντονα καταστέλλεται από ιμιδαζόλιο, ένα κύτταρο-διαπερατό βάσης. Έχει αποδειχθεί ότι η βαφιλομυκίνη Α1, ένας ισχυρός εκλεκτικός αναστολέας της κενοτοπικής H

+ – ΑΤΡάσης [29] προκαλεί επίσης μια μείωση του ενδοκυτταρικού ρΗ και αναστέλλει την ανάπτυξη των διαφόρων γραμμών καρκινικών κυττάρων [30]. Βρήκαμε επίσης ότι UP θα μπορούσε να μειώσει ενδοκυτταρικά pHi ανιχνεύεται από συνεστιακή και κυτταρομετρία ροής, αντίστοιχα. Ωστόσο, ιμιδαζόλη, ένας αναστολέας της οξίνισης απέτυχε να σώσει την αναστολή της ανάπτυξης του UP. Αυτά τα αποτελέσματα να αποκλείσει το ενδεχόμενο της οξίνισης στην απόπτωση που επάγεται από UP.

Αξιοποιώντας το χαρακτηριστικό αυτοφθορισμού του, παρατηρήσαμε ότι UP διανέμεται κυρίως σε κυτταρόπλασμα. Απομονώσαμε περαιτέρω τις πρωτεΐνες δέσμευσης για UP στη μητρική-PAGE γέλης και υποβλήθηκαν σε ανάλυση φασματομετρία μάζας. 171 πρωτεΐνες από 951 ανιχνεύσιμες πρωτεΐνες ριβοσώματος που σχετίζονται, υποδηλώνοντας ότι UP μπορεί πιθανόν δεσμεύεται με ριβόσωμα. Εμείς επικυρωθεί περαιτέρω την υπόθεση με τη μέθοδο κλασματοποίησης κλίση πυκνότητας σουκρόζης, μια συμβατική προσέγγιση για την απομόνωση και τη μελέτη του ριβοσώματος και με χρώση ανοσοφθορισμού να παρατηρούν συνεντόπισης των UP και ριβοσώματος στα κύτταρα Ρ388 και τα κύτταρα Α549. Ριβοσωμικές πρωτεΐνες παίζουν πολλαπλούς ρόλους στο συντονισμό βιοσύνθεση πρωτεϊνών για τη διατήρηση της ομοιόστασης των κυττάρων και την επιβίωση. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι ένας αριθμός ριβοσωμικές πρωτεΐνες έχουν δευτερεύουσες λειτουργίες ανεξάρτητα από τη συμμετοχή τους στη βιοσύνθεση πρωτεϊνών. Αυτές οι πρωτεΐνες λειτουργούν ως ρυθμιστές του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και σε μερικές περιπτώσεις ως επαγωγείς κυτταρικού θανάτου [31], [32]. Johnson CR βρέθηκε ότι η παρεμβολή με 28S-rRNA από BCS ξεκίνησε απόπτωση σε κύτταρα REH μέσω πρόσληψης SAPK-JNK σηματοδότησης [33]. Bae HK ανέφερε ότι SG αλληλεπιδρούν ειδικά με 40S και 60S ριβοσωματικές υπομονάδες το νωρίτερο 5 λεπτά σε RAW 264.7 κυττάρων και προκαλείται από φωσφορυλίωση της p38 και JNK [16]. Λαμβάνοντας υπόψη ότι UP θα μπορούσε να επάγει τα κύτταρα Ρ388 απόπτωση που περιλαμβάνει την ενεργοποίηση του Ρ38 και JNK σε προηγούμενη μελέτη μας, εικάζουν ότι η απόπτωση των επάγεται από UP μπορεί να σχετίζεται με UP-δέσμευσης ριβοσώματος, η οποία με τη σειρά του επηρεάζει τη λειτουργία μερικών πρωτεϊνών ριβοσώματος και οδηγεί σε απόπτωση. Ήταν, επίσης, αξίζει να αναφέρουμε ότι μόνο δύο μιτοχόνδρια πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με φασματομετρία μάζας με coverprecent της πρωτεΐνης & lt?. 10%, η οποία αποκλείει σε μεγάλο βαθμό τη δυνατότητα της άμεσης στόχευσης με μιτοχονδριακές πρωτεΐνες μέχρι

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας που παρουσιάζονται στη μελέτη αυτή αποκλείει τη συμμετοχή των ROS και μείωση της οξύτητας στις UP επαγόμενη απόπτωση, παρά την τεράστια λογοτεχνίες. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι αντί UP συνδέεται με ριβόσωμα, το οποίο μπορεί, τουλάχιστον εν μέρει, να προκαλέσει την P38, σηματοδότησης JNK και της μιτοχονδριακής απόπτωσης μονοπατιού, οδηγώντας τελικά στην αναστολή της κυτταρικής proliferation.The στοχευμένες μόρια ριβοσωμικού πρέπει να μελετηθεί περαιτέρω. Παρ ‘όλα αυτά, ριβόσωμα θα μπορούσε ενδεχομένως να ανοίξει ένα νέο δρόμο για την εξερεύνηση αντικαρκινικά μηχανισμό της ΡΟ στο μέλλον.