Abstract

22Rv1 είναι μια κοινή γραμμή κυττάρων καρκίνου του προστάτη που χρησιμοποιούνται σε πειράματα ξενομοσχεύματος ποντικού καθώς επίσης και in vitro αναλύσεις κυτταρικής καλλιέργειας για τη μελέτη πτυχών της ογκογένεσης καρκίνου του προστάτη. Πρόσφατα, αυτή η κυτταρική σειρά δείχθηκε να φιλοξενούν πολλαπλά αντίγραφα ενός gammaretrovirus, που ονομάζεται XMRV, ενσωματωμένο στο γονιδίωμά του. Ενώ η αρχική του καρκίνου του προστάτη ξενομόσχευμα CWR22 είναι απαλλαγμένα από κάθε ρετροϊό, στη συνέχεια δημιουργούνται κυτταρικές σειρές 22Rv1 και CWR-R1, μεταφέρουν τον ιό και, επιπλέον, να ρίξει μολυσματικών gammaretroviral σωματιδίων στο υπερκείμενο τους. Αν και XMRV πιθανότατα δημιουργήθηκε από τα γεγονότα ανασυνδυασμού σε καλλιέργεια κυττάρων αυτός ο ιός έχει αποδειχθεί ότι μολύνουν ανθρώπινα κύτταρα in vitro και 22Rv1 καθώς επίσης κύτταρα CWR-R1 θεωρούνται πλέον βιοασφάλεια 2 αντιδραστηρίων. Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι 22Rv1 κύτταρα με μειωμένη ρετροϊικής μεταγραφής εμφανίζουν μειωμένη αγγειογένεση όγκου και αυξημένη νέκρωση του πρωτογενούς όγκου που προέρχεται από ξενομόσχευμα κύτταρα σε ποντίκια SCID όταν συγκρίθηκαν με το γονικό κυτταρική γραμμή. Η παρουσία των μεταγραφών XMRV αυξάνει σημαντικά την έκκριση της οστεοποντίνης (OPN), CXCL14, IL13 και Timp2 σε 22Rv1 κύτταρα. Επιπλέον, τα δεδομένα αυτά υποστηρίζονται από in vitro εισβολή κυττάρων και δοκιμασίες διαφοροποίηση. Συλλογικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η παρουσία μεταγραφημάτων XMRV συμβάλλει τουλάχιστον εν μέρει να 22Rv1 χαρακτηριστικά παρατηρήθηκε in vitro και in vivo σε σχέση με τη μετανάστευση, εισβολή και αγγειογένεση όγκου. Προτείνουμε ότι τα δεδομένα που λαμβάνονται με 22Rv1 κύτταρα ή ισοδύναμα κύτταρα που φέρουν ξενοτροπικά gammaretroviruses θα πρέπει να ελέγχεται προσεκτικά, συμπεριλαμβανομένων άλλων καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν για ιικών αλληλουχιών

Παράθεση:. Stieler K, Schumacher U, Horst AK, Fischer Ν (2012 ) XMRV Προκαλεί μετανάστευση των κυττάρων, έκφραση κυτοκινών και όγκου αγγειογένεση: Είναι 22Rv1 κύτταρα ενός κατάλληλου Καρκίνος του προστάτη μοντέλο; PLoS ONE 7 (7): e42321. doi: 10.1371 /journal.pone.0042321

Επιμέλεια: Peter Sommer, Institut Pasteur Κορέα, Δημοκρατία της Κορέας

Ελήφθη: 23 του Απριλίου του 2012? Αποδεκτές: 2 Ιούλη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 27, Ιουλίου 2012

Copyright: © 2012 Stieler et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PC) είναι ο πιο κοινός τύπος του καρκίνου στους άνδρες στις δυτικές κοινωνίες με περισσότερα από 350.000 νέα διάγνωση καρκίνου και πάνω από 90.000 πραγματική θανάτους ετησίως, μόνο στην Ευρώπη, αντιπροσωπεύοντας έτσι ένα σοβαρό κοινωνικο-οικονομικό πρόβλημα. Ο καρκίνος του προστάτη αντανακλά μια ετερογενή και πολυ στάδιο της νόσου η οποία παρέχει μια πρόκληση για την ανάπτυξη κατάλληλων in vitro και in vivo μοντέλα

In vitro μοντέλα βασίζονται σε λίγες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη διαθέσιμα [1], που είναι επιθηλιακής προέλευσης.: οι πιο κοινές κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται είναι LNCaP [2], PC3 [3], DU145 [4] και ως κοινό μοντέλο ξενομοσχεύματος επίσης 22Rv1 κυττάρων [5]. Αυτές οι κυτταρικές σειρές που σερβίρεται στο παρελθόν, και εξακολουθούν να εφαρμόζονται συνήθως, ως μοντέλα για τη διερεύνηση της προόδου του όγκου, εισβολή, μετάσταση, νέες θεραπευτικές στρατηγικές, καθώς και της αντίστασης στα φάρμακα. Μεταμοσχεύθηκαν σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια Αυτές οι κυτταρικές σειρές παράγουν όγκους τα οποία είναι παρόμοια με το γονικό του όγκου [5]. Τέτοιες in vivo μοντέλα ξενομοσχεύματος έχουν τεκμηριωθεί χρησιμοποιώντας κύτταρα LNCaP, 22Rv1 ή κύτταρα PC3 μεταμοσχευμένων σε ανοσοανεπαρκείς SCID, γυμνό ή NOD-SCID ποντικούς. Σε περίπτωση απουσίας ενός ιδανικού μοντέλου ποντικού που εμφανίζουν υπερπολλαπλασιασμού και υπερπλασία σε επιθηλιακά κύτταρα (προστάτη ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία, PIN), ΡΙΝ υψηλού βαθμού (HGPIN), τα αδενοκαρκινώματα και διηθητικά καρκινώματα του προστάτη (ποντίκια φυσικά δεν αναπτύσσουν PC), τα πειράματα ξενομοσχεύματος ποντικού χρησιμοποιώντας ιστό οι φέτες ή ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη που χρησιμοποιείται ευρέως.

22Rv1 προέρχεται από μία υποτροπή ξενομόσχευμα CWR22 όγκου που έχει σειριακά μεταμοσχεύθηκαν σε γυμνούς ποντικούς [5]. Το 2009, τα κύτταρα 22Rv1 αποδειχθεί ότι φέρουν πολλαπλά ολοκληρωμένα αντίγραφα του XMRV gammaretrovirus (ξενοτροπικά ιό που σχετίζονται με τον ιό της λευχαιμίας των ποντικών)? Αυτά τα κύτταρα παράγουν υψηλής τίτλους του ιού στο υπερκείμενο καλλιέργειας [6]. Πρόσφατη εργασία παρέχει ενδείξεις ότι δύο κυτταρικές σειρές που δημιουργούνται από ένα CWR22 ξενομόσχευμα όγκου, 22Rv1 (CWR22Rv1) και CWR-R1, παράγουν μολυσματικά σωματίδια XMRV σε υπερκείμενο τους [7].

XMRV έχει ταυτοποιήθηκε αρχικά σε ιστό προστάτη από ασθενείς με οικογενή καρκίνο του προστάτη [8]? μεταγενέστερες εργασίες προσκόμισε αποδεικτικά στοιχεία της πρωτεϊνικής έκφρασης XMRV σε ποσοστό έως 23% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του προστάτη [9]. Ωστόσο, οι πολλαπλές μελέτες απέτυχαν να ανιχνεύσουν XMRV σε δείγματα καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιώντας PCR ή μεθόδων IHC [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [ ,,,0],18], [19] Λόγω της έλλειψης αλληλουχίας μεταβλητότητα των θραυσμάτων γονιδίου XMRV σε απομονώσεις των ασθενών σε σύγκριση με μεταβλητότητα αλληλουχίας προσδιορίζονται σε μια XMRV θετική κυτταρική γραμμή 22Rv1 έγινε η υπόθεση ότι XMRV θα μπορούσε να είναι ένα εργαστήριο μολυντή και όχι ένα πραγματικό εξωγενές ανθρώπινο ιό [20]. Τα στοιχεία αυτά ενισχύονται από τα πρόσφατα στοιχεία της Paprotka και οι συνεργάτες του αναλύοντας διαφορετικά περάσματα των CWR22 ξενομοσχευμάτων: XMRV είναι παρούσα σε κύτταρα 22Rv1 και τα κύτταρα CWR-R1, όμως, πρώτα περάσματα του ξένου μοσχεύματος CWR δεν φέρουν καμία ανιχνεύσιμη ακολουθίες XMRV. Αυτά τα δεδομένα είναι υπέρ μιας συμβάν ανασυνδυασμού κατά τη διάρκεια πέρασμα του ξενομοσχεύματος CWR22, δημιουργώντας έτσι XMRV [7].

22Rv1 κύτταρα είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη προκλινικό μοντέλο καρκίνου του προστάτη [21], [22], [23] . Μόνο πρόσφατα, αυτή η κυτταρική σειρά είχε χαρακτηριστεί ως ένα βιοασφάλεια κυτταρική σειρά επιπέδου 2. Αυτή η κυτταρική γραμμή παράγει υψηλούς τίτλους ξενοτροπικών gammaretroviral σωματίδια τα οποία μπορούν να μολύνουν ανθρώπινα κύτταρα [6], [7]? αμιγή κύτταρα ποντικών συνήθως φέρουν μια μετάλλαξη στον υποδοχέα αυτών των ιών, που ονομάζεται Xpr1, και δεν είναι ανεκτικό για αυτή την ομάδα των ιών. Ωστόσο, ορισμένα κύτταρα ποντικού (άγριους ποντικούς και κάποιες αμιγή στελέχη που φέρουν τον κατάλληλο υποδοχέα αλληλόμορφο [24], [25]) μπορεί να έχουν μολυνθεί με τον ιό. Προσοχή για την ερμηνεία των δεδομένων αποκλειστικά προκύπτουν από κύτταρα 22Rv1 που μεταφέρουν τον ιό έχουν συζητηθεί νωρίτερα [26], ωστόσο, δεν απευθύνεται άμεσα σε in vivo ή in vitro πειράματα.

Σε αυτήν την τρέχουσα μελέτη αναλύσαμε την αιτιώδη συνάφεια μεταξύ της gammaretrovirus XMRV και το μετασχηματισμένο φαινότυπο των κυττάρων 22Rv1 χρησιμοποιώντας ίη vitro δοκιμασίες συνήθως χρησιμοποιούνται για τη μελέτη του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, μετανάστευση και διαφοροποίηση, συγκρίνοντας 22Rv1 κύτταρα και κύτταρα 22Rv1 με μειωμένη ιικούς τίτλους σε πειράματα ποντικού ξενομοσχεύματος, in vitro μετανάστευση, εισβολή και δοκιμασίες σχηματισμού σωλήνα. Παρέχουμε αποδείξεις ότι η XMRV gammaretrovirus συμβάλλει σημαντικά στην ογκογένεση του 22Rv1 ξενομοσχευμάτων σε ποντίκια. Οι παρατηρήσεις αυτές υποστηρίζονται από in vitro αποτελέσματα καταδεικνύουν διαφορές στην απελευθέρωση κυτοκινών σε κύτταρα μολυσμένα με 22Rv1 XMRV και 22Rv1 κύτταρα με μειωμένη ιική μεταγραφές. Επιπλέον, παρέχουν αποδεικτικά στοιχεία ότι η μόλυνση XMRV σε ινοβλάστες στρωματικά προστάτη προκαλεί σημαντικά αλλαγές στην απελευθέρωση κυτοκινών. Παρατηρούμε διαφορές στην κυτταρική μετανάστευση των κυττάρων LNCaP όταν χρησιμοποιείται σε in vitro αναλύσεις κυτταρική μετανάστευση και εισβολή μαζί με υπερκείμενο καλλιέργειας στρωματικών κυττάρων που έχουν μολυνθεί με XMRV? υπερκείμενο κυττάρων μολυσμένων με αμφότροπο gammaretroviruses ή XMRV ιό ψευδοτυποποιημένοι env σαν σωματίδια δεν επηρεάζει την κυτταρική μετανάστευση των κυττάρων LNCaP υποδεικνύοντας ότι αυτό επηρεάζει είναι ειδικό για XMRV και δεν εξαρτάται από την αλληλεπίδραση του υποδοχέα ή σηματοδότηση υποδοχέα.

Εν ολίγοις, μας τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ικανότητα μετασχηματισμού των κυττάρων 22Rv1 εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την παρουσία XMRV. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται σε πειράματα χρησιμοποιώντας 22Rv1 κύτταρα σε σχέση με προστάτη ογκογένεση του καρκίνου πρέπει να επικυρωθεί σε άλλες κυτταρικές σειρές καρκίνου του ιού αρνητική προστάτη.

Αποτελέσματα

Η επιθηλιακή κυτταρική σειρά του προστάτη 22Rv1, που προέρχεται από ένα ξενομόσχευμα ανθρώπινου καρκινώματος του προστάτη σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς, περιέχει αρκετά αντίγραφα του XMRV gammaretrovirus ενσωματωμένη στο DNA του κυττάρου ξενιστή. XMRV αντιγράφεται ενεργά σε αυτή την κυτταρική σειρά με αποτέλεσμα ιό που περιέχει μολυσματικές υπερκείμενο [6], [7]. Οι 22Rv1 κύτταρα έχουν χρησιμοποιηθεί σε πειράματα ξενομοσχεύματος ποντικού στο παρελθόν χωρίς να γνωρίζει ότι ένας μολυσματικός ιός αποβάλλονται από αυτή την κυτταρική γραμμή. Παρά το γεγονός ότι XMRV πιθανότατα δεν είναι ένας ιός που κυκλοφορεί στον ανθρώπινο πληθυσμό αναλύσαμε τη συμβολή αυτού του ιού με τα χαρακτηριστικά κυτταρικής γραμμής:. Μετανάστευση των κυττάρων και την απελευθέρωση κυτοκινών, καθώς και την εξέλιξη του όγκου σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς

ξενομοσχεύτηκε 22Rv1 οι όγκοι σε ποντίκια SCID με μείωση του ιικού μεταγραφές είναι πολύ νεκρωτικές και Εμφάνιση λιγότερο δοχείο σχηματισμού

Έχουμε δημιουργήσει μια κυτταρική γραμμή 22Rv1 με μειωμένη XMRV μεταγραφή ποσά που προκύπτουν σε λιγότερο μολυσματικά ιικά σωματίδια στο υπερκείμενο της καλλιέργειας. Δύο διαφορετικές Τα siRNAs που στοχεύουν δύο διαφορετικές περιοχές στην περιοχή XMRV LTR (Σχήμα 1Α) συνενώθηκαν. Σταθερό φουρκέτες που περιέχει τις αλληλουχίες shLTR1 και shLTR2 (Πίνακας S1) κλωνοποιήθηκαν ξεχωριστά στον φορέα λεντοϊού LEGO G-puro [27]. Ψευδοτυποποιημένου ιικά σωματίδια που περιέχουν το υπερκείμενο των δύο Τα siRNAs που περιέχει λεντοϊού RNAs χρησιμοποιήθηκαν για τη μόλυνση κυττάρων 22Rv1, τα οποία στη συνέχεια κατεργάζεται με πουρομυκίνη για την επιλογή κυττάρων που εκφράζουν shRNA. Για να αποκλειστεί συγκεκριμένη επιλογή των επιμέρους εκδηλώσεις ολοκλήρωσης, χύμα επιλογή αντί του ενιαίου επιλογής κλώνου διεξήχθη, καθώς και υπερκείμενο ελέγχου που περιέχουν ψευδοτυποποιημένοι ιικά σωματίδια με τη γονική λεντοϊού πλασμίδιο Lego G-puro χωρίς shRNA ένθετο δημιουργήθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β Gag ρ30 /CA (καψίδιο) Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης ήταν σημαντικά μειωμένα καθώς και το ποσό των μολυσματικών σωματιδίων ρίξει στο υπερκείμενο ήταν σημαντικά μειωμένη σε shLTR1 + 2 που εκφράζουν 22Rv1 κύτταρα (Σχήμα 1 C). Χρησιμοποιώντας αυτά τα κύτταρα σε ξενομοσχεύματος σε in vivo πειράματα, συνολικά έξι ποντίκια SCID ανά ομάδα shRNA εγχύθηκαν υποδορίως με 2 χ 10

6 κύτταρα σε Matrigel σε κάθε πλευρικό τοίχωμα. Tumor εμφάνιση και το βάρος παρακολουθήθηκε για 36δ. Δεν παρατηρήσαμε σημαντικές διαφορές στην έναρξη της ανάπτυξης του όγκου μεταξύ των κυττάρων ελέγχου και κυττάρων 22Rv1 22Rv1 εκφράζουν shLTR1 + 2 όπως κρίνεται από την καθημερινή οπτική επιθεώρηση και έλεγχο του βάρους των ποντικών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μετά 36d, τα ποντίκια θανατώθηκαν και το βάρος του όγκου, νέκρωση καθώς και σχηματισμού αιμοφόρων αναλύθηκε. Το βάρος του 22Rv1 shLTR1 + 2 όγκους ήταν σημαντικά μειωμένη (Σχήμα 2Α αριστερό πάνελ) σε σύγκριση με τους όγκους ελέγχου. Οι όγκοι αυτοί εμφανίζονται μεγάλες νεκρωτικές περιοχές (όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β αριστερό πλαίσιο, το Σχήμα S2A (κύτταρα ελέγχου) και S2B (22Rv1 shLTR1 + 2)) και έδειξαν σημαντικά λιγότερους αριθμούς σκάφους κατά την εκτέλεση ανοσοϊστοχημική χρώση εφαρμογή ένα μονοκλωνικό αντίσωμα CD34 σε τμήματα ιστού όγκου ( Σχήμα 3Α άνω πλαίσια και Σχήμα 3Β) σε σύγκριση με τους μάρτυρες.

(Α) Σχηματική αναπαράσταση του XMRV περιοχή LTR και 5 ‘UTR του Gag. Εντοπισμός των Τα siRNAs χρησιμοποιούνται για τη μείωση μεταγραφές XMRV στο 22Rv1 κύτταρα εμφανίζεται ως βέλη. Τρεις διαφορετικές αλληλουχίες, shLTR1 (περιοχή R), shLTR2 (περιοχή U5) και shLTR3 (βρίσκεται λίγο κατάντη της θέσης δότη ματίσματος (SD)) επιλέχθηκαν με τη χρήση siRNA Finder Target online εργαλείο του Ambion του. (Β) 22Rv1 κύτταρα σε μεταγωγή με λεντοϊού υπερκείμενο που περιείχε την υποδεικνυόμενη Τα siRNAs και πουρομυκίνη επιλέξει: 22Rv1 shLTR1 + 2 κύτταρα εμφανίζουν σημαντικά μειωμένη πρωτεΐνη Ρ30 (CA) σε ανάλυση Western Blot σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C) σε πραγματικό χρόνο PCR προσδιορισμό της σχετικής ποσότητας των μολυσματικών σωματιδίων στο υπερκείμενο του shRNA μετατραπέντων 22Rv1 κυττάρων.

Η

SCID ποντίκια (η = 6) ήταν s.c. ένεση με 22Rv1 shLTR1 + 2, shLTR3 ή με 22Rv1 κύτταρα ελέγχου. Για κάθε κυτταρική σειρά το τελικό ποσό του όγκου ήταν n = 12. 36δ ρ.ί. τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι όγκοι αναλύθηκαν για το βάρος (Α) και νέκρωση (Β).

Η

(Α) χρώση ανοσοϊστοχημείας για CD34 αποκάλυψαν σχηματισμό στοιχειώδης αιμοφόρων αγγείων στον XMRV γκρεμίζω όγκους, ενώ οι όγκοι ελέγχου 22Rv1 απεικόνιση προέκυψε δομές της αγγειογένεσης. (Β) CD34

+ περιοχών σε όγκους προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε έλεγχο και όγκους shLTR3 (n = 10 το καθένα). Τα ποσοστά των CD34

+ περιοχές εκφράζονται σε σχέση με τις συνολικές εκτάσεις που αναλύθηκαν.

Η

Για να αποκλείσει το γεγονός ότι οι παρατηρούμενες διαφορές είναι συνέπεια των λεγόμενων off επιπτώσεις στόχος Τα siRNAs που στοχεύουν μεταγραφές XMRV ή κλωνική επιλογή ενός ατόμου γεγονός ολοκλήρωσης, μια τρίτη shRNA με συμπληρωματικές αλληλουχίες προς την περιοχή 5’GAG (229-250, NC_007815) (Σχήμα 1Α) κλωνοποιήθηκε σε πλασμίδιο LEGO G-puro. Παρόμοια με τα κύτταρα 22Rv1 επιμολυσμένα με shLTR1 + 2, κύτταρα 22Rv1 εκφράζουν shLTR3, έδειξαν σημαντικά μειωμένη ρ30 CA /gag επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης (Εικόνα 1Β, λωρίδα 3 και 4) και μέχρι 80% λιγότερο μολυσματικά ιικά σωματίδια στο υπερκείμενο της καλλιέργειας (Εικόνα 1C) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Ένεση αυτών των κυττάρων σε κάθε πλευρά του έξι ποντίκια SCID δεν μείωσε το χρονικό σημείο της ανάπτυξης του όγκου, καθώς δεν υπήρχε σημαντική μεταβολή στο βάρος του όγκου όπως παρατηρείται για shLTR1 + 2 (Σχήμα 2Α, δεξί πλαίσιο). Ωστόσο, παρατηρήσαμε μεγάλες νεκρωτικές περιοχές σε όγκους 22Rv1 shLTR3 (Σχήμα 2Β, δεξιό πλαίσιο). Ενώ οι όγκοι του 22Rv1 shLTR1 + 2 έδειξε μόνο μικρές διαφορές στο μέγεθος των νεκρωτικές περιοχές, αυτές οι διαφορές ήταν στατιστικώς σημαντικές σε όγκους που επάγεται με κύτταρα 22Rv1 shLTR3. Παρομοίως, CD34 χρώση αποδεικνύεται μειωμένο σχηματισμό σκάφος με βάση CD34 θετική χρώση IHC σε όγκους που επάγεται από τα κύτταρα 22Rv1 shLTR3 συγκριτικά με όγκους ελέγχου (Σχήμα 3).

Αυτά τα πειράματα δείχνουν ότι τα χαρακτηριστικά του 22Rv1 ξενομοσχεύματα σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς εξαρτηθεί εν μέρει σχετικά με την παραγωγή του XMRV gammaretrovirus σε αυτά τα κύτταρα.

22Rv1 κυττάρων που εκφράζουν shLTR1 + 2 διαφέρουν σε Cytokine Expression Pattern σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα

υπερκείμενα καλλιέργειας από τα κύτταρα ελέγχου 22Rv1, μολύνθηκαν με υπερκείμενο ψευδοτυποποιημένοι λεντοϊού που περιέχει το κενό πλασμίδιο puro LEGO G και από 22Rv1 shLTR1 + 2 κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για κυτοκίνες χρησιμοποιώντας μια διαδικασία στερεάς φάσης ανοσοκηλιδώσεως (RayBio Human Cytokine Antibody Array 5? RayBiotech) (Σχήμα S3). Τα υπερκείμενα εφαρμόστηκαν σε μεμβράνες που περιέχουν αντισώματα σε 80 ανθρώπινες κυτοκίνες. Μικρές διαφορές στην απελευθέρωση κυτοκινών από αυτά τα κύτταρα ανιχνεύθηκαν (Σχήμα S3). Σε 22Rv1 κυττάρων με μειωμένα επίπεδα XMRV μεταγραφής, οστεοποντίνη (ΟΡΝ), αναστολέα ιστού matrixmetalloproteinase Timp2 και IL13 ήταν ελαφρώς μειωμένη ενώ αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων (HGF) αυξήθηκε.

Χρησιμοποιώντας ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR για την υποδεικνυόμενη mRNA μεταγραφές επιβεβαιώσαμε τα ευρήματα αυτά: OPN, Timp2 και την έκφραση IL13 είναι σημαντικά μειωμένη σε 22Rv1 κύτταρα που εκφράζουν shLTR1 + 2 ενώ η έκφραση HGF αυξάνεται σημαντικά (Σχήμα 4). Επιπλέον, εξετάσαμε την έκφραση του μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας ΜΜΡ9 και έκφραση σε κύτταρα CXCL14 22Rv1 και 22Rv1 shLTR1 + 2 κύτταρα. Ενώ εμείς δεν βρήκε καμία διαφορά στην έκφραση του mRNA ΜΜΡ9 σε αυτές τις κυτταρικές σειρές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), η έκφραση CXCL14 μειώθηκε σημαντικά στα 2 κύτταρα 22Rv1 shLTR1 +.

Το συνολικό RNA του ελέγχου 22Rv1 και 22Rv1 shLTR1 + 2 αναλύθηκε για τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των κυτοκινών από υποδεικνύονται qRT-PCR. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν έναντι τριών γονιδίων καθαριότητα (GAPDH, TBP, RLP13).

Η

De Novo Μόλυνση του προστάτη στρωματικά ινοβλαστών με αναπαραγωγή αρμόδιες XMRV Induced διαφορές στην έκφραση κυτοκίνης

Για να αναλύσει κατά πόσο το παρατηρούμενες διαφορές στην έκφραση κυτοκινών και απελευθέρωση είναι εξαρτώμενη από τον κυτταρικό τύπο, αναλύσαμε την έκφραση της κυτοκίνης και απελευθέρωσης σε ινοβλάστες στρωματικά προστάτη (pRSC) μολυσμένα με αρμόδιες XMRV αντιγραφής που προέρχεται από κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με XMRV VP62 προϊικό DNA. PRSC απομονώθηκαν από ιστό προστάτη από κολλαγενάση χώνευση και καλλιέργεια σε εκλεκτικά μέσα, όπως περιγράφεται πρόσφατα [28], [29]. Ξεπέρασμα κύτταρα επεκτάθηκαν και επιβεβαιώθηκε με χρώση FACS για την έκφραση της α-SMA (λείου μυός ακτίνη) και βιμεντίνης (δείκτες για ενεργοποιημένων ινοβλαστών στρωματικά) και η έλλειψη κυτοκερατίνης έκφρασης [28]. Μόνο χαμηλοί αριθμοί πέρασμα αυτών των κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα μόλυνσης XMRV. 2d παρελθόν υπερκείμενο μόλυνση του XMRV μολυνθεί pRSC ή ψευδο-μολυσμένα κύτταρα εφαρμόστηκε σε μια εμπορική συστοιχίες μεμβράνη αντίσωμα (RayBio? Βλέπε σχήμα S4). λοίμωξη XMRV των κυττάρων επιβεβαιώθηκε με XMRV gag ειδική PCR (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Από τις 60 κυτοκίνες αναλύθηκαν από συστοιχίες μεμβράνη αντίσωμα οκτώ (GRO, GROa, TIMP1, Timp2? HGF, IGFBP2, IGFBP4, IL13) εκφράστηκαν διαφορικά από XMRV μολυσμένη σε σύγκριση με ψευδο-μολυσμένα κύτταρα. Ενώ GRO και ΟΚΟα μεταγραφές μέχρι ρυθμίζονται στο υπερκείμενο από pRSC XMRV κύτταρα μολυσμένα, HGF, IGFBP2, IGFBP4, IL13, TIMP1 και Timp2 έκφραση μειώθηκε.

Για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται με συστοιχίες αντισωμάτων κυτοκινών και να αποκλείσει τις διαφορές σε παρασκεύασμα κυττάρων πρωτογενών ινοβλαστών στρωματικών προστάτη, πραγματοποιήσαμε ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας πειράματα δύο διαφορετικές γραμμές στρωματικών ινοβλαστών pRSC λαμβάνονται από διαφορετικούς ασθενείς (Σχήμα 5). Τα κύτταρα μολύνθηκαν με υπερκείμενο καλλιέργειας που περιέχει αρμόδια XMRV αντιγραφής που προέρχεται από κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με XMRV VP62 προϊικό DNA [30], [31]? ολικού RNA εξήχθη, DNaseI επεξεργασία και στη συνέχεια αναλύθηκαν με qRT-PCR για διαφορές στην έκφραση κυτοκίνης. Ενώ ήμασταν σε θέση να επιβεβαιώσει τα αποτελέσματά μας που λαμβάνονται με σειρά Ab για GROa, IL13 και TIMP1, ήμασταν σε θέση να επιβεβαιώσει τα προκαταρκτικά στοιχεία μας για Timp2, HGF και IGFBP4. Timp2 και IGFBP4 έκφραση αυξήθηκε σε απόκριση σε μόλυνση XMRV και επαγωγή της έκφρασης HGF παρατηρήθηκε μόνο σε κύτταρα PrSc29, ενώ τα κύτταρα PRSC5 έδειξε το αντίθετο αποτέλεσμα.

Πρωτογενής προστάτη ινοβλάστες στρωματικών (pRSC) μολύνθηκαν με XMRV περιέχουν υπερκείμενο LNCaPi κύτταρα ή με πλαστή υπερκείμενο. Ολικό RNA αναλύθηκε για τα επίπεδα έκφρασης του mRNA διαφόρων κυτοκινών από qRT-PCR. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν ενάντια σε τρεις διαφορετικές γονίδια καθαριότητας και απεικονίζεται ως σχετική έκφραση του γονιδίου σε σύγκριση με κοροϊδεύει μολυσμένα κύτταρα σε κάθε χρονικό σημείο.

Η

Ανάλογα κυτοκίνης Τύπου για XMRV Replication Επιρροές της διεισδυτικότητας και Tube Σχηματισμός in vitro

Για να αποκτήσετε μια μηχανιστική κατανόηση των διαφορών που παρατηρούνται στην απελευθέρωση κυτοκινών των επιθηλιακών ή στρωματικά κύτταρα του προστάτη που έχουν μολυνθεί με XMRV, αρκετές in vitro μελέτες διεξήχθησαν. Δεν παρατηρήσαμε διαφορές στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό μεταξύ μολυσμένων (έλεγχος 22Rv1 shRNA και 22Rv1 shLTR1 + 2 ή pRSC μολυσμένα και μη-μολυσμένα κύτταρα pRSC εφαρμόζοντας μία δοκιμασία ΜΤΤ (Σχήμα S1). Στη συνέχεια, διερευνήσαμε κατά πόσον XMRV μολυσμένα κύτταρα θα μπορούσε να προωθήσει τη μετανάστευση LNCaP κύτταρα σε ένα παρακρινή τρόπο. Πρωτοβάθμια προστάτη ινοβλάστες στρωματικά είτε παρωδία ή XMRV μολυνθεί σπάρθηκαν στο κάτω διαμέρισμα ενός πιάτου θάλαμο 24-φρεατίων. Μέσα από μια ανεκτική μεμβράνης απελευθερώνονται κυτοκίνες επηρεάζουν άμεσα εισβολής των κυττάρων LNCaP. Χρησιμοποιώντας αυτή τη δοκιμασία πραγματοποιήσαμε μια σειρά μαθημάτων σε μια μόλυνση XMRV, που φαίνεται στο Σχήμα 6Α. μόλυνση XMRV των στρωματικών ινοβλαστών οδηγεί σε στατιστικά σημαντική αύξηση του μεταναστευτικά κύτταρα LNCaP που είναι επιπλέον αυξημένη σε κύτταρα μολυσμένα για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα (28δ). η αύξηση αυτή είναι ειδική για XMRV αφού ένα σχετικό MLV (MoMCF, ένα αμφοτροπικό MLV χρησιμοποιώντας ρΙΤ2 ως υποδοχέας) δεν οδήγησε σε υψηλότερες ποσότητες μεταναστευτικά κύτταρα LNCaP (Σχήμα 6Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, η αντιγραφή ανίκανος ιό σωματίδια τύπου ψευδοτυποποιημένοι με XMRV env δεν οδήγησε σε αύξηση της κυτταρικής μετανάστευσης LNCaP (Σχήμα 6Β ) γεγονός που υποδηλώνει ότι τα γεγονότα ανεξάρτητα από σύνδεση με τον υποδοχέα και σηματοδότηση συμβάλλουν στην παρατηρούμενη φαινότυπο.

(Α) Δημοτικό ινοβλάστες στρωματικά (pRSC) 8δ ή 28δ pi με XMRV σπάρθηκαν στο κάτω διαμέρισμα του θαλάμου εισβολή. Διηθητικότητα κυττάρων LNCaP υπολογίστηκε σε τρία ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν. (Β) pRSC κύτταρα μολυσμένα με ξενοτροπικών MLVs (XMRV) επάγουν εισβολή των καρκινικών κυττάρων του προστάτη in vitro, ενώ τα στρωματικά κύτταρα μολυσμένα με αμφότροπο MoMCF ή ιό ψευδοτυποποιημένοι XMRV env σαν σωματίδια δεν αυξάνουν εισβολή των κυττάρων LNCaP. (Γ) και (Δ) λοίμωξη XMRV επάγει σχηματισμό αυλών των κυττάρων HMEC. Τα κύτταρα σπάρθηκαν επί matrigel επωάστηκαν με υπερκείμενο είτε XMRV ή ψευδο μολυσμένα ινοβλάστες στρώματος και σχηματισμός σωλήνα παρακολουθήθηκε για 5 ώρες. Αντιπροσωπευτική εικόνα του σχηματισμού σωλήνα παρατηρήθηκαν φαίνεται στο (C). (Δ) Ποσοτικοποίηση των δύο ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Φωτογραφίες από τρία διαφορετικά οπτικά πεδία ανά πηγάδι αναλύθηκαν για το μήκος του σωλήνα (20 σωλήνες ανά τομέα) με το εργαλείο χάρακα Adobe Photoshop

Η

Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε in vitro δοκιμασίες αγγειογένεσης:. Σχηματισμός σωλήνα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας υπερκείμενα είτε από XMRV ή ψευδο-μολυσμένα κύτταρα ως διεγερτικό καθώς περιείχαν εκφράζονται διαφορικά /ή διαφορετικά επίπεδα προ-αγγειογενετική κυτοκίνες. Υπερκείμενο καλλιέργειας από ινοβλάστες στρωματικά προστάτη προστέθηκε σε κύτταρα HMEC επί του σχηματισμού matrigel και σωλήνα παρακολουθήθηκε για 5 ώρες. Αλλαγές στην απελευθέρωση κυτοκινών σε απόκριση σε μόλυνση XMRV αύξησε σημαντικά το μήκος του τριχοειδούς δικτύου που σχηματίζεται από τα κύτταρα HMEC (Σχήμα 6C και D), η οποία είναι σύμφωνη με μας in vivo ευρήματα.

Συζήτηση

η μελέτη μας δείχνει ότι ξενοτροπικά gammaretroviruses, οι οποίες έχουν συχνά εντοπιστεί σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, που ιδρύθηκε με το πέρασμα εκείνων αν και γυμνά ποντίκια, όχι μόνο να φέρει τον κίνδυνο μόλυνσης, αλλά επίσης θα μπορούσε να επηρεάσει σημαντικά τα πειραματικά δεδομένα που λαμβάνονται με αυτές τις κυτταρικές γραμμές. Ειδικότερα, η κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη 22Rv1 που χρησιμοποιούνται συνήθως στον καρκίνο του προστάτη in vitro μελέτες, καθώς και in vivo μοντέλα ξενομοσχεύματος φέρει πολλαπλά αντίγραφα του XMRV ολοκληρωμένες και ενεργά υπόστεγα λοιμογόνου ιού στο υπερκείμενο της.

XMRV αρχικά προσδιορίζονται στην ανθρώπινο ιστό καρκίνου του προστάτη και η σύνδεσή της με την ανθρώπινη παθολογίες έχει προταθεί κατά τα τελευταία χρόνια. Πρόσφατα δεδομένα υποδηλώνουν μια ανασυνδυασμό των αλληλουχιών XMRV ποντίκι δύο πρόγονο, που ονομάζεται προ-XMRV1 και Pre-XMRV2, σε κυτταρική καλλιέργεια δημιουργώντας έτσι XMRV [7] μαζί με πολλαπλές μελέτες δεν ανίχνευση αλληλουχιών XMRV σε ανθρώπινα δείγματα [11], [12], [ ,,,0],14], [17], [18], [20], [32], [33], [34], [35], [36], [37] αμφισβητούν τη σύνδεση των XMRV με ανθρώπινες ασθένειες.

Ακόμα, η ανάλυση των πιθανών μετασχηματισμού XMRV είναι σημαντικό ενδιαφέρον από το 22Rv1 κύτταρα και κύτταρα CWR22-R1 παράγουν μολυσματικό ιό και είναι μια γενικά αποδεκτή in vitro μοντέλο, καθώς και το μοντέλο ξενομοσχεύματος να μελετήσει ογκογένεση του καρκίνου του προστάτη, της εξέλιξης, βιοδείκτες και η ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών.

σε αυτήν την τρέχουσα μελέτη δημιουργήσαμε μια κυτταρική γραμμή 22Rv1 με μειωμένη μεταγραφές XMRV και τα επίπεδα του ιού της πρωτεΐνης από την εφαρμογή Τα siRNAs που στοχεύουν δύο διαφορετικές περιοχές στην περιοχή XMRV LTR. in vivo πειράματα έδειξαν ότι οι όγκοι που επάγονται από 22Rv1 κυττάρων με μειωμένη μεταγραφές XMRV ήταν εξαιρετικά νεκρωτικές και έδειξε σημαντικά μικρότερη αγγειοποίησης όπως κρίθηκε με χρώση CD34 (Σχήμα 3) και χρώση CEACAM-1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να εξαιρέσετε την επιλογή του τόπου ολοκλήρωσης, καθώς και shRNA εκτός στόχου επηρεάζει αυτά τα πειράματα επαναλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ανεξάρτητα πειράματα λοίμωξη 22Rv1 Lego-shXMRV LTR, καθώς και με τη χρήση διαφορετικών αλληλουχιών shRNA στοχεύει σε μια τρίτη περιοχή στην XMRV (shLTR3). Σε αντίθεση με τα πειράματα που χρησιμοποιούν 2 κύτταρα 22Rv1 shLTR1 +, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στο μέγεθος του όγκου που θα μπορούσε να οφείλεται στο μικρό αριθμό των ζώων ανά ομάδα. Εναλλακτικά, οι διαφορές που παρατηρούνται στο μέγεθος του όγκου στην πρώτη ομάδα πειραμάτων ξενομοσχεύματος χρησιμοποιώντας shRNA αλληλουχίες στόχευσης τις περιοχές LTR 59-79 και 103-125 μπορεί να είναι συνέπεια των λεγόμενων εκτός στόχου επιδράσεις στα κύτταρα. Επισημαίνουμε ότι αντί του shRNA έναντι λουσιφεράσης ή άλλες αλληλουχίες γενικά δεν βρέθηκε στο ανθρώπινο γονιδίωμα, ένα άδειο φορέα λεντοϊού χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει το υπερκείμενο λεντοϊού ελέγχου που χρησιμοποιείται στη συνέχεια για τη μεταγωγή 22Rv1 κύτταρα. Έτσι, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε έναν κορεσμό των συστατικών της μηχανής siRNA με αποτέλεσμα μη ειδικά αποτελέσματα. Ωστόσο, δεν παρατηρήσαμε καμία φαινότυπο, τα αυξημένα επίπεδα απόπτωσης, μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων, που έχει περιγραφεί ότι συσχετίζεται με μη ειδικά αποτελέσματα που προκαλούνται από τον κορεσμό του μονοπατιού siRNA [38]. Off-στόχος επιδράσεις απέκλεισε επαναλαμβάνοντας τα πειράματα σε ζώα με ένα τρίτο, διαφορετική περιοχή στο γονιδίωμα XMRV ως αλληλουχία shRNA.

αριθ σχηματισμού μετάστασης στον πνεύμονα, σπλήνα και το ήπαρ, καθώς και μετάσταση στα οστά ανιχνεύθηκε σε ποντίκια ελέγχου, καθώς και ποντίκια shLTR (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, οι όγκοι δεν διαφέρουν σε κατάσταση διαφοροποίησης, στρωματικά οργάνωση των κυττάρων ούτε οι όγκοι εμφανίζουν διαφορές στην διήθηση των λευκοκυττάρων, η οποία αντικατοπτρίζεται από τη σχετική παρουσία του CD18

+ λευκοκύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Είναι ενδιαφέρον ότι, και τα δύο σετ πειραμάτων ξενομοσχεύματος (shLTR1 + 2, καθώς και shLTR3) αποκάλυψαν μειωμένη αγγείωση και αυξημένη περιοχές νέκρωσης. Από τη στιγμή που δεν δημιούργησε έναν ιό XMRV με ένα αλλαγμένο θέση-στόχο των εφαρμοζόμενων Τα siRNAs που θα μπορούσαμε να χρησιμοποιήσουμε για να συμπληρώσει 22Rv1 κύτταρα μεταδιεγείρονται με shLTR3, είναι πιθανό ότι η παρατηρούμενη in vivo και in vitro διαφορές αυτών των κυττάρων είναι συνέπεια διαβάστε ή ανασυνδυασμένο XMRV και κυτταρικό μεταγραφές.

Πρόσφατες μελέτες έχουν προτείνει σημαντικές λειτουργίες των κυτοκινών σε διάφορες πτυχές της ανάπτυξης του όγκου. Οι περισσότερες από τις κυτοκίνες που προσδιορίζονται στις δοκιμασίες μας έχουν περιγραφεί να επηρεάσει τη διαμόρφωση μικροπεριβάλλον του όγκου κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης του προστάτη. GRO /ΟΚΟα (CXCL1), ένα μέλος της οικογένειας χημειοκίνης CXC, προάγει την αγγειογένεση και στρατολογεί ουδετερόφιλα και ενδοθηλιακά κύτταρα κατά τη διάρκεια κακοήθη εξέλιξη σε καρκίνο του προστάτη. Η ανώμαλη έκφραση του HGF (αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων) και του υποδοχέα του, c-Met, συχνά συσχετίζονται με προχωρημένα στάδια καρκίνου του προστάτη. Ομοίως, IGFBP2 και 4 (ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα πρωτεΐνες σύνδεσης 2 και 4) είναι βιοδείκτες για προχωρημένα στάδια καρκίνου του προστάτη. ιστοαναστολείς matrixmetalloproteinases (ΤΙΜΡ) έχουν ανεξάρτητα από τη λειτουργία τους – αναστολής της δραστικότητας πρωτεϊνάσης της ΜΜΡ (matrixmetalloproteinases) έχουν περιγραφεί ως παράγοντες που εμπλέκονται εις την πρόοδον των όγκων: ΤΙΜΡ 1 και 2, και τα δύο αναστέλλουν την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων? ΤΙΜΡ 1 προάγει την αγγειογένεση όγκων και ΤΙΜΡ 2 επιταχύνει την εξέλιξη του όγκου

XMRV προκαλούμενη απελευθέρωση κυτοκίνης δεν φαίνεται να είναι όγκου ειδικό επιθηλιακό κύτταρο, αλλά μπορεί επίσης να παρατηρηθεί με χρήση ινοβλαστών στρωματικά προστάτη (Σχήματα 5? S4).. Θα ήθελα να επισημάνω ότι σε αυτά τα πειράματα XMRV ιογενή αποθέματα που προέρχονται από κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με προϊικό XMRV VP62 DNA χρησιμοποιήθηκαν. Δεν αλληλουχία του πληθυσμού του ιού που προέρχεται από de novo μολυσμένα κύτταρα LNCaP να αποκλείσει οξεία μετατροπή παραλλαγές XMRV προέρχονται από τα γεγονότα ανασυνδυασμού όπως δημοσιεύθηκε πρόσφατα [39].

μόλυνση XMRV στρωματικών ινοβλαστών οδήγησε σε στατιστικά σημαντική αύξηση του μεταναστεύουν LNCaP κύτταρα τα οποία ήταν επιπλέον αυξημένη σε κύτταρα μολυσμένα για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα (28d). Η αύξηση αυτή θα μπορούσε να είναι ειδικό για XMRV και εξαρτώνται από την αντιγραφή XMRV: ένα σχετικό MLV (MoMCF, ένα αμφοτροπικό MLV χρησιμοποιώντας ρΙΤ2 ως υποδοχέας) δεν οδήγησε σε υψηλότερες ποσότητες κυττάρων LNCaP που μεταναστεύουν (Σχήμα 6Β). Είναι ενδιαφέρον, υπερκείμενο από κύτταρο μολυσμένο με σωματίδια ψευδοτυποποιημένοι αντιγραφή ελαττωματικού XMRV-env δεν οδήγησε σε αλλαγές της κυτταρικής μετανάστευσης υποδηλώνοντας ότι η δεσμευτική δεν συμβάλλει στις παρατηρούμενες αλλαγές υποδοχέα.

Σε γενικές γραμμές, οι παρατηρήσεις μας είναι σε συμφωνία με κάποια πτυχές της πρόσφατα δημοσιευμένα στοιχεία δείχνουν ότι η μόλυνση XMRV των LNCaP κυττάρων προάγει τον πολλαπλασιασμό, τη μετατροπή και διηθητικότητα των κυττάρων αυτών in vitro [40], καθώς και δείχθηκε πρόσφατα ότι η μόλυνση XMRV μπορεί να διεγείρει απόπτωση σε μερικές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές [41]. Ενώ έχουμε επίσης παρατηρήσει μια αύξηση στην ικανότητα εισβολής των κυττάρων όταν επωάστηκαν με υπερκείμενο καλλιέργειας των XMRV μολυσμένα κύτταρα, εμείς δεν παρατηρούμε μια αύξηση του πολλαπλασιασμού που οφείλεται σε λοίμωξη XMRV, ούτε 22Rv1 κύτταρα μετάγονται με Τα siRNAs μεταγραφές που στοχεύουν XMRV (Σχήμα S1), ούτε κύτταρα LNCaP ή στρωματικά κύτταρα μολυσμένα με XMRV (τα δεδομένα δεν δείχνονται) έδειξαν μια μείωση ή αύξηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού

δεν παρατηρήσαμε διαφορές στα επίπεδα MMP9 mRNA ως αποτέλεσμα της μόλυνσης XMRV όπως δημοσιεύθηκε πρόσφατα [40].? αν και παρατηρήθηκε μείωση της απελευθέρωσης Timp2 κυττάρων pRSC μολυνθεί με XMRV. Δεδομένου ότι η ΜΜΡ ρυθμίζονται κυρίως για τα επίπεδα της πρωτεΐνης δεν μπορούμε να αποκλείσουμε διαφορά στη δραστικότητα ΜΜΡ9. συστοιχίες κυτοκίνης αντίσωμα που χρησιμοποιείται εδώ δεν περιλαμβάνει MMP9 ή ΜΜΡ2, καθώς εμείς δεν περιλαμβάνουν τεχνικές ενζυμογραφία για τη δοκιμή για τις διαφορές στη δραστηριότητα της πρωτεΐνης MMP9 ή ΜΜΡ2. Είναι κατανοητό ότι ο ρυθμός και η έκταση της αγγειογένεσης είναι ένα κρίσιμο συστατικό της εξέλιξης του όγκου. Ο ακριβής μηχανισμός μέσω του οποίου μπορεί να επηρεάσει XMRV αγγειογένεση, ο σχηματισμός των πλοίων και οι διαφορές στην απελευθέρωση κυτοκίνης δεν είναι κατανοητός.

μόλυνση ρετροϊού φαίνεται να είναι συχνή μεταξύ ευρέως χρησιμοποιούμενο κυτταρικές γραμμές [11], [42], [43], [44], [45], [46], [47]. Η άγνωστη παρουσία των ρετροϊών σε κυτταρικές σειρές δίπλα από τον κίνδυνο βιολογικού κινδύνου θα μπορούσαν να επηρεάσουν τα αποτελέσματα των πειραμάτων. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν σαφώς ότι ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές φέρουν συνήθως gammaretroviral αλληλουχίες [6], [20], [48]. Για ορισμένα από αυτά σχηματισμό μολυσματικών σωματιδίων έχει αποδειχθεί: ανθρώπινη γραμμή Τ-κυττάρων Jurkat J6, λεμφοβλαστοειδή κυτταρική γραμμή A3.0 /F7 [47], Β-κυτταρική γραμμή DG75 [45] και οι καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές LAPC4, VCAP και EKVX [6], [48]? Ωστόσο, μόνο λίγα παραδείγματα η συνέπεια σε πειραματικά αποτελέσματα έχει αποδειχθεί [44], [47], [49]. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι τα πειραματικά αποτελέσματα που λαμβάνονται in vitro ή in vivo διεξάγονται με ρετροϊό θετικές κυτταρικές σειρές (ιδίως 22Rv1 ή CWR-R1) μπορεί να αντανακλά μοριακές ιδιότητες του ιού αντί για ειδικά χαρακτηριστικά του τύπου του κυττάρου. Ως εκ τούτου, θα πρέπει να παρέχονται ρετροϊικοί κατάσταση των κυτταρικών σειρών που χρησιμοποιούνται σε πειράματα, καθώς και μελέτες (συμπεριλαμβανομένων των ξενομοσχευμάτων σε in vivo πειράματα) θα πρέπει να επικυρωθεί χρησιμοποιώντας πολλαπλές κυτταρικές σειρές.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων

Ο καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη LNCaP (ATCC # CRL-1740) και 22Rv1 (ATCC # CRL-2505) αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco) συμπληρωμένο με 10% FCS, 5% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και L- γλουταμίνη. Παρόμοιες συνθήκες ισχύουν για shRNA αντιμετωπίζονται 22Rv1 κύτταρα. ΤΕ671 (ATCC # CRL-8805) και κύτταρα 293Τ (ATCC # CRL-11268) καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ Glutamax (Gibco) συμπληρωμένο με 10% FCS, 5% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. κύτταρα HMEC (Lonza) καλλιεργήθηκαν σε αύξησης των ενδοθηλιακών κυττάρων Medium MV2 (Promocell). Στρωματικών κυτταρικών σειρών (pRSC) καθορίστηκαν όπως περιγράφεται [29], [50], [51].