Αφηρημένο

Εισαγωγή

Η χημειοθεραπεία -σχετικών ενδοθηλιακή βλάβη συμβάλλει στην πρώιμη ανάπτυξη της καρδιαγγειακής νοσηρότητας σε ασθενείς με καρκίνο των όρχεων. Έχουμε ως στόχο να προσδιορίσει σχετικούς μηχανισμούς και την αναζήτηση των υποψηφίων βιοδεικτών για αυτήν την ενδοθηλιακή βλάβη.

Μέθοδοι

Ανθρώπινο μικρο-αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (HMEC-1) εκτέθηκαν σε βλεομυκίνη ή σισπλατίνη με μη επεξεργασμένα δείγματα ως έλεγχος. χρησιμοποιήθηκαν 18k μικροσυστοιχίες cDNA. διαφορές γονιδιακής έκφρασης αναλύθηκαν σε επίπεδο μόνο γονίδιο και σε σετ γονιδίων συγκεντρωμένα σε βιολογικά μονοπάτια και επικυρώνονται από qRT-PCR. Τα επίπεδα πρωτεΐνης ενός υποψηφίου βιοδείκτη μετρήθηκαν του καρκίνου των όρχεων πλάσμα του ασθενούς πριν, κατά και μετά τη βλεομυκίνη ετοποσίδη-σισπλατίνη χημειοθεραπεία, και συνδέονται με ενδοθηλιακά βιοδείκτες βλάβη (παράγοντα von Willebrand (vWF), υψηλής ευαισθησίας C-αντιδρώσα πρωτεΐνη (hsCRP)) .

Αποτελέσματα

δεδομένα μικροσυστοιχιών εντοπιστεί αρκετά γονίδια με υψηλή διαφορική έκφραση? π.χ. Ανάπτυξη Διαφοροποίηση Factor 15 (

GDF-15

), ενεργοποιώντας μεταγραφή Factor 3 (

ATF3

) και αμφιρεγουλίνη (

AREG

). ανάλυση οδός αποκάλυψε ισχυρές ενώσεις με «p53 και του γονιδίου σύνολα« Σακχαρώδης διαβήτης ». Με βάση την γνωστή λειτουργία, μετρήσαμε GDF-15 επίπεδα πρωτεΐνης σε 41 ασθενείς κατά τη διάρκεια των όρχεων κλινικής παρακολούθησης. Προ-χημειοθεραπεία GDF-15 επίπεδα ισοφάρισε ελέγχους. Καθ ‘όλη τη χημειοθεραπεία GDF-15, τα επίπεδα του vWF και hsCRP αυξημένη, και συσχετίστηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία.

Συμπέρασμα

Μια αμερόληπτη προσέγγιση σε ένα προκλινικό μοντέλο αποκάλυψε γονίδια που σχετίζονται με τη χημειοθεραπεία που προκαλείται από ενδοθηλιακή βλάβη , όπως

GDF-15

. Οι αυξήσεις στο πλάσμα των επιπέδων GDF-15 σε ασθενείς με καρκίνο των όρχεων κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας και τη σύνδεσή της με vWF και hsCRP υποδηλώνουν ότι η GDF-15 είναι ένα δυνητικά χρήσιμο βιοδείκτη που σχετίζονται με την ενδοθηλιακή βλάβη

Παράθεση:. Altena R, Fehrmann RSN, Boer Η, de Vries ΕΟΔ, Meijer C, Gietema JA (2015) Growth Factor Διαφοροποίηση 15 (GDF-15) Επίπεδα στο πλάσμα αυξάνονται κατά τη διάρκεια Bleomycin- και Cisplatin-Based Θεραπεία των όρχεων Καρκινοπαθών και αφορούν την ενδοθηλιακή βλάβη. PLoS ONE 10 (1): e0115372. doi: 10.1371 /journal.pone.0115372

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Ramon Andrade de Mello, Πανεπιστήμιο του Algarve, Πορτογαλία

Ελήφθη: May 27, 2014? Αποδεκτές: 21 του Νοεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 15 Γενάρη 2015

Copyright: © 2015 Altena et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Υποστήριξη παρέχεται από RUG 2009-4365 από την ολλανδική Αντικαρκινική Εταιρεία. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η εισαγωγή με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία στα τέλη της δεκαετίας του εβδομήντα είχε ως αποτέλεσμα υψηλά ποσοστά ίασης σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο των όρχεων. Ωστόσο, αυτή η χημειοθεραπεία προκαλεί παρενέργειες, με αποτέλεσμα την νοσηρότητα σε αντιμετωπιστεί επιτυχώς επιζώντες [1]. Σχετικά θέματα είναι οι αυξημένοι κίνδυνοι για τη δεύτερη κακοήθειες και τα καρδιαγγειακά νοσήματα (CVD) [2-5]. CVD μπορεί να προκύψουν κατά τη διάρκεια ή αμέσως μετά τη θεραπεία [6, 7], καθώς και χρόνια να δεκαετίες αργότερα [3-5, 8-11].

Ένας από τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην ανάπτυξη αυτής της θεραπείας που σχετίζονται CVD είναι η άμεση ενδοθηλιακή βλάβη. Εκτός από την επαγωγή ενδοθηλιακών κυττάρων θανάτου [12-14], και τα δύο μπλεομυκίνη [14-16] και σισπλατίνη [14, 17-19] έμμεσα επηρεάζουν τη λειτουργία των ενδοθηλιακών κυττάρων, π.χ. μέσω παρεμβολής με φλεγμονώδεις και ινωδολυτικά. Τελικά, αυτή η χημειοθεραπεία που προκαλείται κυτταρική ενεργοποίηση μπορεί να εξελιχθεί σε ενδοθηλιακή δυσλειτουργία, επιταχυνόμενη αθηροσκλήρωση και απροκάλυπτη CVD.

Η έγκαιρη αναγνώριση και, ενδεχομένως, την πρόληψη των επιπλοκών αυτών σχετίζονται με τη θεραπεία είναι κρίσιμης σημασίας να διατηρήσει μια βέλτιστη κατάσταση της υγείας των όρχεων επιζώντες του καρκίνου. Η ανάπτυξη της καρδιαγγειακής νόσου είναι μια σταδιακή διαδικασία, και έγκαιρες παρεμβάσεις ή ενταθεί η εξέταση μπορεί να επιβραδύνει ή να σταματήσει την πρόοδο προς την κατεύθυνση εμφανή κλινικά νοσηρότητας. Βιοδείκτες για τη θεραπεία που σχετίζονται με ενδοθηλιακή βλάβη μπορεί να εντοπίσει εκείνους τους ασθενείς σε αυξημένο κίνδυνο για καρδιαγγειακή νόσο.

Σε αυτή τη μελέτη πίσω μεταφραστεί το κλινικό εύρημα ότι η βλεομυκίνη και η σισπλατίνη επάγουν ενδοθηλιακή βλάβη. Χρησιμοποιήσαμε μια αμερόληπτη προσέγγιση από την ανάλυση των αποτελεσμάτων cDNA μικροσυστοιχιών για τον εντοπισμό νέων γονιδίων που σχετίζονται με τη χημειοθεραπεία που σχετίζονται με ενδοθηλιακή βλάβη. προφίλ γονιδιακής έκφρασης παράχθηκαν από την μικροαγγειακή κυτταρική σειρά ανθρώπινων ενδοθηλιακών (HMEC-1) πριν και μετά την αγωγή με μπλεομυκίνη και σισπλατίνη σε διαφορετικά χρονικά σημεία και οι συγκεντρώσεις. Ποσοτική Real Time PCR (qRT-PCR) διεξήχθη για να επιβεβαιωθεί γονιδίων με σημαντικές διαφορές έκφραση σε διάφορες πειραματικές ρυθμίσεις. Στη συνέχεια, με βάση τον γνωστό λειτουργία αυτών των γονιδίων στη βιβλιογραφία, επιλέξαμε ένα από αυτά τα υποψήφια γονίδια για περαιτέρω επικύρωση ως απόδειξη της αρχής στο επίπεδο πρωτεΐνης σε ένα όρχεων κοόρτη ασθενή με καρκίνο. Με αυτή την μεταγραφική προσέγγιση που αποσκοπούσε στον εντοπισμό των μηχανισμών της και των πιθανών βιοδεικτών για τη χημειοθεραπεία που σχετίζονται με ενδοθηλιακή βλάβη.

Υλικά και Μέθοδοι

μοντέλο γραμμή κυττάρων

είναι απαθανάτισε

HMEC-1 ανθρώπινων δερματικών μικρο-αγγειακών ενδοθηλιακών κυτταρική σειρά που διατηρεί μορφολογική και λειτουργικά χαρακτηριστικά των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά τη διάρκεια πολλών περασμάτων [20]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν ως μονοστιβάδα σε μέσο MCDB-131 (Invitrogen, Merelbeke, Belgium) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Bodinco, Alkmaar, Κάτω Χώρες), 10 mM L-γλουταμίνη (Invitrogen, Merelbeke, Βέλγιο), 1 μg /mL υδροκορτιζόνη (Sigma-Aldrich, Άμστερνταμ, Ολλανδία) και 10 ng /mL ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (R &? D Systems, Abingdon, UK), και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Τα πειράματα διεξήχθησαν μεταξύ των χωρίων 15-30.

Σε μια «οξεία» ρύθμιση -έκθεση, HMEC-1 αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ως μάρτυρες, ή υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 0,3 (IC

50 (συγκέντρωση που αναστέλλει την κυτταρική επιβίωση από 50%)) ή 1,5 μg /mL (IC

90) μπλεομυκίνη και 2.6 (IC

50) ή 12,9 μΜ (IC

90) cisplatin επί 6, 24, και 48 ώρες (S1A Σχ.) . Οι τιμές IC50 για αμφότερα βλεομυκίνη και την πτώση σισπλατίνης εντός των φυσιολογικών συγκεντρώσεων αυτών των φαρμάκων στο πλάσμα σε ασθενείς κατά τη διάρκεια της δραστικής θεραπείας [14, 21-22]. Επιπλέον, σε μία «χρόνια» ρύθμιση -έκθεση, χαμηλότερες δόσεις χορηγήθηκαν (IC

10? Μπλεομυκίνη 0,06 μg /mL ή σισπλατίνη 0,52 μΜ) δύο φορές την εβδομάδα? κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση κατά την ημέρα 30 (S1B Εικ.). Χορήγηση σισπλατίνης έπρεπε να παρακρατηθεί στο 7

ου διοίκηση, λόγω της σημαντικής κυτταρικό θάνατο, αλλά συνεχίστηκε σε πλήρη δόση στη συνέχεια. Βλεομυκίνη θα μπορούσε να χορηγηθεί χωρίς διακοπή.

πειράματα cDNA μικροσυστοιχιών

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από HMEC-1 με ένα κιτ RNeasy (Qiagen, Venlo, Κάτω Χώρες) και συγκεντρώθηκαν για κάθε χρονικό σημείο και φάρμακο από 2 ανεξάρτητα πειράματα. Μετά τον καθαρισμό (Qiaquick PCR κιτ καθαρισμού, Qiagen, Venlo, Κάτω Χώρες), ενισχυμένο RNA (cRNA) δείγματα μετασχηματίστηκαν σε cDNA με αντίστροφη μεταγραφάση, ανεξάρτητα σημασμένο με Cy3 (πράσινη) και Cy5 (κόκκινη), και τυχαία υβριδοποιείται στη προσαρμοσμένου έκανε μικροσυστοιχίες cDNA 18Κ. Φθορίζουσες εικόνες από τις διαφάνειες μικροσυστοιχιών ελήφθησαν με το σαρωτή Affymetrix GMS428 (Affymetrix, Santa Clara, CA) και για τα δύο φθοροφόρα, εντάσεις σήματος για κάθε κηλίδα ήταν ποσοτικά με ειδικό ImaGene 5.6 του λογισμικού (Biodiscovery, Μαρίνα Ντελ Ρέι, Καλιφόρνια).

ποσοστημόριο ομαλοποίηση εφαρμόστηκε σε log2 μετατραπεί Cy3 και Cy5 εντάσεις. Οπερόνιο v2.0 (Human Genome Ολίγο Set V2) αναγνωριστικά ανιχνευτή μετετράπησαν σε επίσημα σύμβολα γονίδιο HUGO. Οι τιμές έκφρασης του πολλαπλοί ανιχνευτές που στοχεύουν ένα μόνο γονίδιο υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο, με αποτέλεσμα ένα σύνολο 15.950 μοναδικά γονίδια. Στη συνέχεια, τα δεδομένα έκφρασης που λαμβάνεται από πολλαπλές υβριδοποιήσεις (

n

= 4) της ίδιας δείγματος HMEC-1 ελήφθη ο μέσος όρος.

Τα στοιχεία έχουν κατατεθεί στο Gene Expression NCBI του Omnibus (GEO) και προσβάσιμο μέσω GEO Series αριθμό προσχώρησης GSE62523 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE62523).

σύγκριση Class

η «οξεία» ρύθμιση έκθεσης, διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια μεταξύ HMEC-1 ακατέργαστα δείγματα και τα δείγματα εκτίθενται στους διαφορετικές δοσολογίες φαρμάκου (δηλ IC

50 και IC

90) εξετάστηκαν με τη μη παραμετρική δοκιμή Cuzick για γραμμική τάση , με αποτέλεσμα μια

Z

σκοράρει και

P

αξία. Αυτή η δοκιμή έγινε για κύτταρα συλλέγονται μετά από 6 (

t

= 6), 24 (

t

= 24) και 48 (

t

= 48) ώρες. Για τα τρία χρονικά σημεία, η

Z

βαθμολογία που προκύπτει από την Cuzick δοκιμές για γραμμική τάση αυτή αθροίζονται (π.χ.

σZ

=

Z

t = 6

+

Z

t = 24

+

Z

t = 48

)? επιλέγοντας έτσι τα γονίδιά με τον περιορισμό ότι αλλαγές στην έκφραση με συνεπή κατεύθυνση με αυξανόμενες συγκεντρώσεις πάροδο του χρόνου. Γονίδια κατατάχθηκαν σύμφωνα με τους

σZ

βαθμολογίας.

Στο «χρόνια» ρύθμιση έκθεσης, ένα Τ-τεστ διεξήχθη σε επίπεδα γονιδιακής έκφρασης που λαμβάνονται από τα δείγματα που εκτίθενται στα φάρμακα (IC

10 σισπλατίνη ή IC

10 bleomycin) έναντι των μη κατεργασμένων δειγμάτων ελέγχου που συλλέχθηκαν μετά από 30 ημέρες επώασης. Τα αποτελέσματα αυτών των γονιδίων κατατάχθηκαν σύμφωνα με

P-

αξία.

Γονιδιακή Ρύθμιση Εμπλουτισμός Ανάλυση

Γονιδιακή Ρύθμιση Ανάλυση εμπλουτισμού (GSEA) [23] εκτελέστηκε με το λογισμικό GSEA 2.0 πακέτο (Broad Institute, Cambridge, ΜΑ). δεδομένα Έκφραση όλων 15.950 γονίδια συγκρίθηκαν έναντι λειτουργικού γονιδίου ρυθμίζει να προσδιοριστεί αν κάποια από αυτά τα σύνολα εμπλουτίστηκαν σε HMEC-1 υποστεί κατεργασία με μπλεομυκίνη ή σισπλατίνη σε «οξεία», καθώς και η «χρόνια» ρύθμιση έκθεσης. Η σύγκριση έγινε με τη χρήση 169 γονίδιο σύνολα από το Κιότο Εγκυκλοπαίδεια των γονιδίων και των βάσεων δεδομένων γονιδιώματος (KEGG? https://www.genome.jp/kegg/). Η στατιστική σημαντικότητα των εμπλουτισμού προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μία εμπειρική δοκιμή μετάθεση γονιδίου που βασίζεται σε χρήση 1000 μεταθέσεις. Ένα ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) υπολογίστηκε για κάθε λειτουργικό σετ γονιδίων, τα οποία αντιπροσωπεύουν την εκτιμώμενη πιθανότητα ότι μια δεδομένη βαθμολογία εμπλουτισμό αντιπροσωπεύει ένα ψευδώς θετικό εύρημα. Αναφέρουμε γονίδιο σύνολα με έναν FDR ≤ 0,10 και

P

≤ 0,025.

Ποσοτική Real Time PCR

Η διαφορική έκφραση των τριών γονιδίων επικυρώθηκε από qRT-PCR. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν τα δείγματα RNA που περιλαμβάνονται στην ανάλυση cDNA μικροσυστοιχιών. Επιπλέον, δύο ανεξάρτητα πειράματα στα οποία HMEC-1 εκτέθηκε σε σισπλατίνη και βλεομυκίνη, σύμφωνα με την «οξεία» ρύθμιση -έκθεση. RNA δείγματα απομονώθηκαν μετά από 6, 24 και 48 ώρες έκθεσης σε φάρμακα (S1A Εικ.). Όλα τα δείγματα RNA ήταν DNase επεξεργασία για την εξάλειψη γενωμικού DNA-μόλυνση, και στη συνέχεια, το RNA μεταγράφηκε ανάστροφα σε cDNA. qRT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας Applied Biosystems προσδιορισμούς TaqMan, σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών. Master Mix, εκκινητές και ανιχνευτές TaqMan αγοράστηκαν από την Applied Biosystems (Nieuwerkerk a /d IJssel, Κάτω Χώρες). Τρία γονίδια, με εξαιρετικά διαφορική έκφραση σε τρεις από τις τέσσερις πειραματικές ρυθμίσεις, θεωρήθηκαν εύλογες υποψήφιοι για επικύρωση qRT-PCR. Τα γονίδια και οι αριθμοί τους δοκιμασία γονιδιακής έκφρασης των αντίστοιχων Taqman ήταν Ανάπτυξης Διαφοροποίησης Factor 15 (

GDF-15?

Hs00171132_m1), ενεργοποιώντας μεταγραφή Factor 3 (

ATF3?

Hs00231069_m1), αμφιρεγουλίνη (

AREG?

Hs00155832_m1)? στην έκφραση της προσθήκης του γονιδίου γλυκεραλδεΰδη housekeeping 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (

GAPDH

? Hs02758991_g1) προσδιορίστηκε. Όλα τα πειράματα εκτελέστηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας ΑΒΙ PRISM 7900 ΗΤ Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας, με τις ακόλουθες συνθήκες κύκλων: 2 λεπτά στους 50 ° C, 10 λεπτά στους 95 ° C, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 15 sec στους 95 ° C και 1 λεπτό στους 60 ° C. Σχετική ποσότητα των γονιδίων-στόχων υπολογίζεται διαιρώντας το όριο μέση του κύκλου (CT) για το γονίδιο του ενδιαφέροντος από τη μέση CT-τιμής για το γονίδιο καθαριότητας

GAPDH

. Σχετική έκφραση-διαφορές υπολογίστηκαν με σύγκριση της έκφρασης με τη γραμμή βάσης χρονικό σημείο (t = 6, S1A Σχ.). Δύο όψεων t-test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις διαφορές στην έκφραση. P-τιμές & lt? 0.05 θεωρήθηκαν για να υποδείξει μια σημαντική διαφορά.

GDF-15 επίπεδα της πρωτεΐνης στον καρκίνο των όρχεων πλάσμα του ασθενούς κατά τη διάρκεια και μετά bleomycin- και σισπλατίνη χημειοθεραπεία με βάση την

Για την κλινική επικύρωση των πορισμάτων από την κυτταρική σειρά μοντέλο, χρησιμοποιήσαμε μια ομάδα από 41 ασθενείς με καρκίνο των όρχεων οι οποίοι συμμετείχαν σε μια προοπτική μελέτη για την πρόωρη χημειοθεραπεία που σχετίζονται με καρδιαγγειακές μεταβολές κατά τη διάρκεια της bleomycin- και σισπλατίνη βασίζεται σχήματα. Οι ασθενείς που είναι επιλέξιμες για τη μελέτη είχαν μεταστατικό καρκίνο των όρχεων, ήταν 18-50 ετών και λάμβαναν πρώτη γραμμή σισπλατίνη χημειοθεραπεία με βάση το Πανεπιστήμιο του Ιατρικού Κέντρου Γκρόνινγκεν, στην Ολλανδία. Τα κριτήρια αποκλεισμού ήταν τα προηγούμενα χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία, η παρουσία της καρδιαγγειακής νόσου, η χρήση της ερυθροποιητίνης και του ρυθμού σπειραματικής διήθησης & lt? 60 ml /min. Η τοπική επιτροπή δεοντολογίας ενέκρινε τη μελέτη, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες. Ανάλογα με το Διεθνές γεννητικών τους καρκίνο του Collaborative Group (IGCCCG) ομάδα πρόγνωσης, οι ασθενείς έλαβαν είτε τρεις ή τέσσερις ΒΕΡ μαθήματα διάρκειας 3 εβδομάδων η κάθε μία (βλεομυκίνη-30 USP, ημέρες 2, 8 και 15? Ετοποσίδη-100 mg /m

2 , ημέρες 1-5) και σισπλατίνη 20 mg /m

2, ημέρες 1-5). Κατά τις πρώτες 6 ημέρες ασθενείς ενυδατώνονται με 4 L NaCl 0,9% /ημέρα και έλαβαν ημερήσιες αντιεμετική θεραπεία (δεξαμεθαζόνη, ονδανσετρόνη). Ελήφθησαν δείγματα αίματος την ημέρα 1, 8 και 15 του πρώτου κύκλου χημειοθεραπείας, ημέρα 1 και 8 του δεύτερου και του τρίτου φυσικά, (c1d1 (= βασική γραμμή), c1d8, c1d15, c2d1, κλπ), ένα μήνα μετά την ολοκλήρωση και ένα χρόνο μετά την έναρξη της χημειοθεραπείας. EDTA πλάσμα σειριακά συλλέγονται και αποθηκεύονται σε -20 ° C μέχρι την ανάλυση. Τα δεδομένα αναφοράς ελήφθησαν από υγιείς άνδρες αδέλφια του ενήλικα επιζώντες του καρκίνου της παιδικής ηλικίας, ο οποίος είχε συμμετάσχει ως υποκείμενα ελέγχου σε μια συγχρονική μελέτη για τις καθυστερήσεις καρδιαγγειακά συμβάματα της θεραπείας για τον καρκίνο της παιδικής ηλικίας [24]. Από αυτές τις υγιείς άρρενες αδέλφια, επιλέχθηκε μια ομάδα ελέγχου με μια συγκρίσιμη μέση ηλικία των ασθενών ως καρκίνο των όρχεων. Μετρήσεις στους ελέγχους διεξήχθησαν όπως περιγράφεται παραπάνω

Plasma GDF-15 επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με sandwich ενζυμικό ανοσοπροσροφητικό προσδιορισμό (ELISA) με ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ (R &? D Systems, Abingdon, UK).. Επιπλέον, αυτές οι GDF-15 επίπεδα πρωτεΐνης που σχετίζονται με δείκτες πλάσματος για ενδοθηλιακή βλάβη (παράγοντα von Willebrand (vWF), μετρούμενο όπως περιγράφηκε νωρίτερα) [25] και της συστημικής φλεγμονής (υψηλής ευαισθησίας C-αντιδρώσα πρωτεΐνη (hsCRP), όπως περιγράφηκε νωρίτερα ) [26]. Για την ανάλυση των αλλαγών στην αυτούς τους δείκτες, τα μη κανονικά κατανεμημένα δεδομένα παρουσιάζονται ως διάμεση τιμή (εύρος). Για συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων εφαρμόστηκε το μη παραμετρικό Mann-Whitney U? υπέγραψε δοκιμών κατάταξης του Wilcoxon χρησιμοποιήθηκε για ζεύγη αλλαγές. Δύο όψεων P-τιμές ≤ 0,05 θεωρήθηκαν για να δείξει τη σημασία, SPSS έκδοση του πακέτου λογισμικού 22 (SPSS Inc., Chicago, IL) χρησιμοποιήθηκε.

Αποτελέσματα

cDNA μικροσυστοιχιών

σύγκριση Class. Η κορυφή 50 του πλέον διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων στην «οξεία» και «χρόνια» ρύθμιση έκθεσης για βλεομυκίνη και σισπλατίνη συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Το Σχ. 1 δείχνει ένα διάγραμμα Venn των επικαλυπτόμενων γονιδίων στην κορυφή των 50 από τις τέσσερις διαφορετικές ρυθμίσεις έκθεσης. Από αυτή την ανάλυση των τριών γονιδίων, π.χ.

GDF-15

,

ATF3

και

AREG

, βρέθηκαν στο top 50 των τριών από τις τέσσερις ρυθμίσεις έκθεσης. Λόγω αυτής της επικάλυψης σε διαφορετικές ρυθμίσεις έκθεσης θεωρήσαμε αυτά τα τρία γονίδια εύλογο οι υποψήφιοι, και τις επιλόγες για την επικύρωση από qRT-PCR.

Η

cDNA μικροσυστοιχιών-GSEA. Μονοπάτια εμπλουτισμένο σε FDR ≤ 0,10 και

P

≤ 0.025 στο GSEA συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Στον «οξεία» -έκθεση ρύθμιση για βλεομυκίνη, έξι μονοπάτια εμπλουτίστηκαν (όλα τα up-ρύθμιση), ενώ δεν οδοί εμπλουτισμένο στο «χρόνιο» ρύθμιση με τα καθορισμένα κριτήρια για FDR. έκθεση Σισπλατίνη οδήγησε σε 12 εμπλουτισμένο πορείες στην «οξεία» Ρύθμιση -έκθεση (up-ρυθμίζεται η = 3, ρυθμίζεται προς τα κάτω η = 9), ενώ έξι οδοί εμπλουτισμένο στο «χρόνια» ρύθμιση -έκθεση (όλα ρυθμισμένα προς τα κάτω). Η «p53 και του γονιδίου σύνολα του« τύπου Ι Σακχαρώδης Διαβήτης »εμπλουτίστηκαν σε τρεις από τις τέσσερις ρυθμίσεις έκθεσης? Τα γονίδια που περιλαμβάνονται σε αυτό το σύνολο γονιδίων συνοψίζονται στον Πίνακα S1.

Η

qRT-PCR

Για να επικυρώσετε τις αλλαγές στην έκφραση του

GDF-15

,

ATF3

και

AREG

qRT-PCR. Στο «οξεία» ρύθμιση -έκθεση, mRNA έκφραση και των τριών γονιδίων αυξήθηκε στο χρόνο μετά την έκθεση σε μπλεομυκίνη και σισπλατίνη, σε συμφωνία με τα δεδομένα μικροσυστοιχίας. Μετά από 48 ώρες έκθεσης σε αμφότερα τα φάρμακα, η έκφραση του mRNA και των τριών γονιδίων ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Καμία αλλαγή στην έκφραση του mRNA από αυτά τα τρία γονίδια εμφανίστηκαν σε μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου στο χρόνο (Σχ. 2).

Η

GDF-15 στο πλάσμα τα επίπεδα πρωτεΐνης σε ασθενείς με καρκίνο των όρχεων που έλαβαν θεραπεία με ΒΕΡ-χημειοθεραπεία

με βάση τα στοιχεία από τη βιβλιογραφία που επιλέξαμε GDF-15 για περαιτέρω επικύρωση σχετικά με το επίπεδο της πρωτεΐνης στο πλάσμα των όρχεων ασθενή με καρκίνο κατά τη διάρκεια και μετά τη θεραπεία, και τα συναφή επίπεδα GDF-15 σε βιοδείκτες ενδοθηλιακή βλάβη είναι γνωστό πλάσμα (vWF, hsCRP) [25 , 26]. Τα βασικά χαρακτηριστικά των ασθενών συνοψίζονται στον Πίνακα 3. Αν και μικρή από σημασία (ρ = 0.06), την αρχική τιμή (δηλαδή πριν από την έναρξη της χημειοθεραπείας) επίπεδα GDF-15 πρωτεΐνης σε ασθενείς με καρκίνο των όρχεων δεν ήταν διαφορετικά από υγιείς ίδιας ηλικίας άνδρες (Σχ. 3Α). Οι ασθενείς στην ομάδα IGCCCG καλή πρόγνωση είχαν ελαφρώς χαμηλότερα επίπεδα βασικής γραμμής GDF-15 πρωτεΐνη από τους ασθενείς σε ενδιάμεσα ή φτωχές ομάδες πρόγνωση (καλή πρόγνωση: διάμεση 362,9 pg /mL (εύρος 197,6 έως 1059,5? N = 33), ενδιάμεση /κακή πρόγνωση: διάμεση 689.1 pg /mL (εύρος 186,8 έως 1935,0? n = 8)?

P

= 0.04). Η διάμεση τιμή του GDF-15 επίπεδο δεν είχε σχέση με το στάδιο του όγκου (στάδιο 2 της νόσου: διάμεση 373,0 pg /mL (εύρος 197,6 έως 1935,0? N = 30), το στάδιο 3 & amp? 4 νόσου: διάμεση 486,4 pg /mL (εύρος 186,8 έως 1875,9? n = 11)?

P

= 0,40). Προ-χημειοθεραπεία GDF-15 επίπεδα πρωτεΐνης που δεν είχαν σχέση με την ηλικία (r

s = 0,08?

P

= 0,61).

Η

Α. επίπεδα πρωτεΐνης στο πλάσμα GDF-15 σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο των όρχεων (n = 41) πριν την έναρξη της bleomycin- και σισπλατίνη χημειοθεραπεία με βάση, σε σύγκριση με υγιή ίδιας ηλικίας άνδρες (n = 10)? Β Plasma GDF-15 επίπεδα πρωτεΐνης πριν, κατά τη διάρκεια και μετά την ολοκλήρωση της bleomcyin- και σισπλατίνη βασίζεται σε χημειοθεραπεία για τον καρκίνο των όρχεων. Το δείγμα σε c1d1 έχει συνταχθεί πριν από την έναρξη της χημειοθεραπείας. (*) P & lt? 0,05 σε σύγκριση με την αρχική τιμή ή υποδεικνύονται χρονικό σημείο.

Η

Κατά τη διάρκεια της ΒΕΡ-χημειοθεραπεία, η GDF-15 επίπεδα πρωτεΐνης αυξήθηκαν σε σύγκριση με την αρχική τιμή, με σημαντικά υψηλότερα επίπεδα 1 μηνών και 1 έτους μετά τη χημειοθεραπεία ( Σχ. 3Β, Πίνακας 4). Σε σύγκριση με προ-χημειοθεραπείας, τα επίπεδα του vWF και hsCRP πλάσμα μεταβληθεί σημαντικά κατά τη διάρκεια της θεραπείας (Πίνακας 4). Μετά την ολοκλήρωση της χημειοθεραπείας, vWF-επίπεδα παρέμειναν επίμονα αυξημένα, ενώ hsCRP επέστρεψε στα προ της χημειοθεραπείας τιμές. Κατά την έναρξη, τα επίπεδα του GDF-15 είχαν σχέση με τα επίπεδα του vWF (r

s = 0,35?

P

= 0,03) και hsCRP (r

s = 0,39?

P

= 0.014). Κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας, τα επίπεδα του GDF-15 σχετίζεται με hsCRP σε c1d8 (r

s = 0,44?

P

= 0,01) και με vWF στο c3d8 (r

s = 0,40?

P

= 0,017). Κατά την επίσκεψη παρακολούθησης, ένα μήνα μετά την ολοκλήρωση της χημειοθεραπείας, τα επίπεδα του GDF-15 και vWF συσχετίστηκαν ισχυρά (r

s = 0,56?

P

= 0,001), ενώ αυτή η σχέση δεν βρέθηκε για GDF-15 και hsCRP (r

s = 0,18?

P

= 0,28). Ένα χρόνο μετά την έναρξη της χημειοθεραπείας, καμία σχέση μεταξύ GDF-15 επίπεδα και vWF ή hsCRP (r

s = 0,28?

P

= 0,12? R

s = 0,10?

P

= 0.57) βρέθηκε.

η

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε μια αμερόληπτη μεταφραστική προσέγγιση με cDNA μικροσυστοιχιών ως εργαλείο για να βρουν νέους μηχανισμούς που σχετίζονται με και επιλέξτε υποψήφιο βιοδεικτών που εμπλέκονται σε προκαλούμενη από χημειοθεραπεία ενδοθηλιακή βλάβη. Με αυτό το

in vitro

στρατηγική, βρήκαμε αρκετές μεμονωμένων γονιδίων με σημαντικές αλλαγές στην έκφραση κατά την έκθεση σε μπλεομυκίνη και σισπλατίνη. Τρία γονίδια με ισχυρές διαφορές έκφρασης σε τρεις από τις τέσσερις πειραματικές ρυθμίσεις,

GDF-15

,

ATF3

και

AREG

, επικυρώθηκαν από qRT-PCR. Επιπλέον, GSEA αποκάλυψε συστάδες γονιδίων που εμπλέκονται σε αρκετές οδούς, συμπεριλαμβανομένων των «ρ53» και γονίδιο σύνολα «σακχαρώδης διαβήτης τύπου Ι, οι οποίες επηρεάστηκαν σε αυτό το μοντέλο. Επιπλέον, δείξαμε ότι ΒΕΡ-χημειοθεραπεία. (Βλεομυκίνη? Etoposide? Σισπλατίνη) επηρέασε πράγματι πλάσμα GDF-15 επίπεδα πρωτεΐνης σε ασθενείς με καρκίνο των όρχεων, και ότι αυτά τα επίπεδα που σχετίζονται με γνωστά ενδοθηλιακά βιοδείκτες βλάβη όπως vWF και hsCRP

στην ανάλυση μοναδικού γονιδίου αρκετά γονίδια ήταν σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο σε διαφορετικές πειραματικές ρυθμίσεις στο HMEC-1

in vitro

μοντέλο. Τα γονίδια

GDF-15

,

ATF3

και

AREG

ήταν στην κορυφή των 50 από τα πιο διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε τρεις ή τέσσερις ρυθμίσεις έκθεσης.

Η κυτοκίνη GDF-15 (επίσης γνωστή ως μακροφάγων Ανασταλτική Cytokine 1 (MIC-1) ή NSAID ενεργοποιημένο γονίδιο (NAG-1)) είναι ένα μέλος της οικογένειας β αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού (ΤΟΡβ). GDF15 προκαλείται από όλα τα είδη των ερεθισμάτων, συμπεριλαμβανομένων των κυτοκινών, χημειοθεραπεία ή /και ακτινοθεραπεία και η ζημία σε όλα τα είδη των διαφορετικών κυττάρων και ιστών [27-30]. Απελευθέρωση του GDF-15 μπορεί να επάγει αντι-φλεγμονώδη, αντι-αποπτωτική και αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα, ασκώντας vasculoprotective μηχανισμούς. Ως εκ τούτου, οι αυξήσεις των GDF-15 επίπεδα στο πλάσμα σε ομάδα μας ασθενής μπορεί επίσης να προκύψει από την αυξημένη παραγωγή από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και /ή μακροφάγα, για να αντισταθμίσει προκαλούμενη από χημειοθεραπεία βλάβη. Σε μια μελέτη αξιολόγησης αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης σε δείγματα καρκίνου του προστάτη πριν και μετά τη θεραπεία με ντοσεταξέλη /μιτοξαντρόνη,

GDF-15

ήταν ένα από τα υψηλότερα γονιδίων up-ρυθμίζεται μετά τη θεραπεία [31], δείχνουν ότι κυτταροστατικά μπορεί να επηρεάσει

GDF-15

έκφραση τόσο κακοήθη και μη κακοήθη κύτταρα.

αυξημένα επίπεδα του GDF-15 έχουν συσχετιστεί με αυξημένο κίνδυνο ασθενειών υποτίθεται ότι προκύπτει από τη χρόνια φλεγμονή [29, 32] και πολυάριθμες μελέτες έδειξαν ότι η GDF-15 είναι ένα πολύτιμο βιοδείκτης για καρδιαγγειακή νόσο [29, 30, 32-34]. GDF-15 πιστεύεται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην καρδιαγγειακή απαντήσεις βλάβης [35], ενδεχομένως μέσω ενός προ-αγγειογενετική απόκριση όπως αποδείχθηκε σε ένα προ-κλινικό μοντέλο με HUVEC [36]. GDF-15 περιγράφεται επίσης ως βιοδείκτη /προγνωστικό της λευκωματουρία, που είναι γνωστό ότι αντανακλά ιδρύθηκε μικρο-αγγειακή βλάβη [37]. Επιπλέον, διάφορες μελέτες εμπλέκουν GDF-15 σε θέματα μεταβολικών διαταραχών π.χ. αντίσταση στην ινσουλίνη και την παχυσαρκία [30, 38, 39]. Πρόσφατα, τα υψηλότερα επίπεδα κυκλοφορούντων MIC-1 /GDF-15 επίσης συνδέεται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου που υποστηρίζουν έναν ρόλο της χρόνιας φλεγμονής στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου [40].

ATF3

είναι μεταγενέστερος μέλος της ΜΑΡ κινάσης σηματοδοτικό μονοπάτι που κωδικοποιεί για ένα πυρηνικό παράγοντα που διεγείρει την μεταγραφή από τον κυτταρικό στρες. Fast πάνω ρύθμιση του

ATF3

είναι ένα κεντρικό απόκριση στρες σε διαφορετικά μοντέλα των ενδοθηλιακών κυττάρων, που προκαλείται από διάφορους βλαβερούς παράγοντες διέγερσης [41-46]. Παρεμβολή με

ATF3

-levels προστατεύονται τα κύτταρα από την επαγωγή της απόπτωσης, π.χ. που προκαλείται από ΤΝΡα σε HUVEC [47], με σισπλατίνη σε έναν άνθρωπο κυτταρική γραμμή γλοιοβλαστώματος [42], ή σε σχέση με δοξορουβικίνη σε καρδιομυοκύτταρα [48]. Είναι ενδιαφέρον, ανοσοϊστοχημικά μετριέται

ATF3

-έκφραση αυξάνεται σε αθηρωματικές τομείς της ανθρώπινης λαγονίων αρτηριών [43]. Λίγες μελέτες απευθύνονται

AREG

, ένα μέλος των υποδοχέων του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα που παίζει σημαντικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση. κύτταρα καρκίνου του μαστού εκτέθηκαν σε σισπλατίνη εκκρίνεται το AREG-πρωτεΐνη επί παρατεταμένες χρονικές περιόδους, δηλαδή μέχρι και 72 ώρες μετά την έκθεση [49].

Με βάση τα διαθέσιμα δεδομένα αποφασίσαμε να μελετήσουμε τα επίπεδα πρωτεΐνης στο πλάσμα του GDF-15 σε ασθενείς με καρκίνο των όρχεων πριν, κατά και μετά τη θεραπεία με ΒΕΡ-χημειοθεραπεία, και αφορούν αλλαγές στα επίπεδα των γνωστών βιοδεικτών ενδοθηλιακή βλάβη [25, 26]. Οι αυξήσεις στο GDF-15 τη διάρκεια της θεραπείας, καθώς και μετά τη χημειοθεραπεία μπορεί εν μέρει να αφορούν τους μηχανισμούς σχετίζονται με τον καρκίνο, όπως το επίπεδο της πρωτεΐνης GDF-15 wasslightly υψηλότερη σε ασθενείς με πιο προχωρημένο στάδιο της νόσου, όπως μετράται με βάση τη βαθμολογία IGCCCG, η οποία μπορεί να σχετίζεται με την απελευθέρωση του GDF-15 από αποπτωτικά κύτταρα όγκου. Ωστόσο, ο ρόλος του στην ενδοθηλιακή βλάβη υποστηρίζεται από το γεγονός ότι η GDF-15 επίπεδα συσχετίστηκαν με πρωτεΐνες που είναι γνωστό ότι αντανακλά τη χημειοθεραπεία που σχετίζονται με ενδοθηλιακή βλάβη σε ασθενείς καρκίνου των όρχεων, vWF και hsCRP [25, 26]. Ως εκ τούτου, είναι κατανοητό ότι η παρατηρούμενη αύξηση των GDF15 πλάσμα εμπλέκεται σε χημειοθεραπεία που σχετίζονται με ενδοθηλιακή βλάβη, ωστόσο μάλλον δεν οφείλεται σε ενδοθηλιακά τραυματισμού και μόνο. Καθώς αυτή η πρωτεΐνη μηχανιστικά σχετίζεται με τη χημειοθεραπεία που σχετίζονται με ενδοθηλιακή βλάβη μπορεί να είναι ένα δυνητικά ευαίσθητες βιοδείκτης για τον εντοπισμό αυτή τη βλάβη. Περαιτέρω εκτεταμένη ανάλυση των επιπέδων GDF15 σε συνδυασμό με την φαινοτυπική των καρδιαγγειακών παραγόντων κινδύνου σε μια μεγαλύτερη ομάδα των ασθενών. Παρά το γεγονός ότι σε αυτή τη μελέτη δεν διαπιστώθηκε σχέση μεταξύ των επιπέδων προθεραπείας των GDF15 και την ηλικία, είναι γνωστό ότι αυτή είναι η περίπτωση στο φυσιολογικό πληθυσμό και θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την ανάλυση των επιπέδων GDF15 στο χρόνο. Επιπλέον, το γεγονός ότι ο TGFβ-μονοπάτι εμπλέκεται σε αυτή τη ζημιά μπορεί να είναι μια ένδειξη για τις παρεμβάσεις που μειώνουν την ποσότητα της ενδοθηλιακής βλάβης που σχετίζονται με τη θεραπεία με βλεομυκίνη και σισπλατίνη.

GSEA έδειξαν σημαντικά εμπλουτισμένη από πολλές οδούς, συμπεριλαμβανομένων «ρ53» και «σακχαρώδης διαβήτης τύπου Ι ‘σε» οξεία «έκθεση σε μπλεομυκίνη και σισπλατίνη, και» χρόνια «έκθεση σε σισπλατίνη. Το εύρημα ότι τα γονίδια ρ53 που σχετίζονται με επηρεάστηκαν από βλεομυκίνη όπως και η σισπλατίνη απεικονίζει την εγκυρότητα της προσέγγισης μας, καθώς και οι δύο φάρμακα εξασκούν κλειδί θεραπευτική τους δράση με επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης. Το εμπλουτισμένο σετ γονίδιο «τύπου Ι σακχαρώδη διαβήτη» περιλαμβάνει πολλά γονίδια που εμπλέκονται σε φλεγμονώδεις διαδικασίες, π.χ. Ανθρώπινων Λευκοκυττάρων Antigen-μόρια, ιντερλευκίνες και ΤΝΡ, υποδεικνύοντας ότι η βλεομυκίνη και η σισπλατίνη επάγουν μία φλεγμονώδη απόκριση στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η διαπίστωση αυτή είναι απολύτως σύμφωνη με τις μελέτες σε ασθενείς με καρκίνο των όρχεων που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη σχήματα, τα οποία έδειξαν υψηλότερα ποσοστά συστηματικής φλεγμονής και ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας [25, 26, 50]. Όπως κυκλοφορεί πλατίνα παραμένει ανιχνεύσιμο στα χρόνια κυκλοφορίας για δεκαετίες μετά τη θεραπεία με σισπλατίνη [51-52], μακροχρόνια επιζώντες του καρκίνου των όρχεων μπορεί να έχει συνεχή αγγειακή βλάβη και χρόνια χαμηλού βαθμού ενδοθηλιακή φλεγμονή. Όταν χρόνιες φλεγμονώδεις αποκρίσεις αποδειχθεί ότι είναι ένας σημαντικός παθογόνος παράγοντας για την ανάπτυξη της επαγόμενης από χημειοθεραπεία ενδοθηλιακή βλάβη, παρέμβαση με αντι-φλεγμονώδη φάρμακα είναι μια προσέγγιση λογική για την ανακούφιση αυτών των επιδράσεων.

Εν κατακλείδι, χρησιμοποιήσαμε μικροσυστοιχιών cDNA για να ανίχνευση με αμερόληπτο τρόπο τα γονίδια και τα μονοπάτια που σχετίζονται με τη χημειοθεραπεία που σχετίζονται με ενδοθηλιακή βλάβη, να βρει βιοδείκτες για και τους μηχανισμούς που εμπλέκονται σε αυτή τη ζημιά. Σε HMEC-1 εκτίθενται σε μπλεομυκίνη και σισπλατίνη, αρκετά γονίδια έντονα εκφράζονται διαφορικά, π.χ.

GDF-15

,

ATF3

και

AREG

. Σε GSEA, επηρεάστηκαν συστάδες γονιδίων που εμπλέκονται στον κυτταρικό θάνατο και τη φλεγμονή. Οι παρατηρούμενες αλλαγές στο πλάσμα GDF-15 επίπεδα πρωτεΐνης σε ασθενείς με καρκίνο των όρχεων που προκαλείται από τη σισπλατίνη και περιέχουν βλεομυκίνη χημειοθεραπεία δείχνουν ότι αυτό πληροφοριακό προ-κλινική προσέγγιση μπορεί να μεταφραστεί σε ένα κλινικό περιβάλλον, και ότι η GDF-15 μπορεί να είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης του ενδιαφέρον που μηχανιστικά εμπλέκεται σε υγιή βλάβη ιστού χημειοθεραπεία που σχετίζονται όπως ενδοθηλιακή βλάβη. Περαιτέρω

in vitro

και

in vivo

εξερεύνηση είναι δικαιολογημένη. Αυτό διευκολύνει το σκεπτικό για την επιλογή των στόχων για την παρέμβαση, με την πρώιμη υποκατάστατο βιοδεικτών για τη χημειοθεραπεία που σχετίζονται με ενδοθηλιακή βλάβη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Πειραματικό σχεδιασμό.

Α «Οξεία» ρύθμιση έκθεσης: αθανατοποιημένα HMEC-1 εκτέθηκαν σε μπλεομυκίνη (0,3 μg /ml (IC50), 1,5 μg /mL (IC90)) ή σισπλατίνη (2,6 μΜ (IC50), 12,9 μΜ (IC90)) για 6, 24 και 48 ώρες? Β «χρόνια» ρύθμιση έκθεσης: κατά τη διάρκεια των 30 ημερών HMEC-1 εκτέθηκε σε 0.06 μg /mL bleomycin (IC10) ή 0,52 μΜ cisplatin (IC10) δύο φορές την εβδομάδα). Και στα δύο πειράματα ακατέργαστα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. (*) ΚΝΑ-απομόνωση και μικροσυστοιχιών cDNA πειράματα? (†) απομόνωση RNA και qRT-PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115372.s001

(ΔΕΘ)

S1 πίνακα. Γονίδια που περιλαμβάνονται στο «p53 και του γονιδίου σύνολα« σακχαρώδης διαβήτης τύπου Ι »στη βάση δεδομένων KEGG, κατατάσσονται με αλφαβητική σειρά

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115372.s002

(DOC)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Kevin Bouma, Gert Jan Meersma, Haukeline Βόλντερς και Nynke Zwart για τεχνική βοήθεια και για τη συλλογή των δειγμάτων των ασθενών.