Αφηρημένο

αδενοϊό γονιδιακή θεραπεία και ογκόλυσης θα επωφεληθούν κριτικά από στοχευμένες είσοδο των κυττάρων από γενετικά τροποποιημένους κοψίδια. Αυτό απαιτεί τόσο την κατάλυση των ιθαγενών αδενοϊό τροπισμού και τον προσδιορισμό των υποκαταστατών που παραμένουν σε λειτουργία στο πλαίσιο του ιού. Εδώ, έχουμε καθιερώσει τον κυτταρικό τύπο εισόδου φορέων HAdV-5 που βασίζεται σε εισαγωγή γενετικού συνδέτη σε ένα χιμαιρικό ίνα με άξονα και λαβή τομέων της μικρής HAdV-41 ινών (Ad5T /41sSK). Αυτή η μορφή ινών αναφέρθηκε για την εκτομή μεταγωγή

in vitro

και βιοκατανομή στο συκώτι

in vivo

. Δείχνουμε ότι το πεπτίδιο YSA, δέσμευση στο EphA2 δείκτη παν-καρκίνου, μπορεί να εισαχθεί σε τρεις θέσεις του χιμαιρικού ίνας, με αποτέλεσμα ισχυρή μεταγωγή EphA2-θετικά αλλά όχι με EphA2-αρνητικά κύτταρα ανθρώπινης βιοψίες μελανώματος και των ξενομοσχευμάτων όγκου μετά εντός του όγκου ένεση. Μεταγωγή μπλοκαρίστηκε από διαλυτό πεπτίδιο YSA και να αποκατασταθεί για EphA2-αρνητικά κύτταρα μετά την ανασυνδυασμένη έκφραση της EphA2. Το πεπτίδιο YSA θα μπορούσε επίσης να τοποθετηθεί σε τρεις θέσεις ενός CAR δέσμευση-αφαιρεθεί HAdV-5 ίνες επιτρέπουν ειδική μεταγωγή? Ωστόσο, η Ad5T μορφή /41sSK ήταν ανώτερη

in vivo

. Εν κατακλείδι, έχουμε καθιερώσει ένα αδενοϊό καψίδιο διευκόλυνση της λειτουργίας εισαγωγής στόχευσης πεπτίδια και ένα μυθιστόρημα αδενοϊό χρησιμοποιώντας το ΕρίιΑ2 δείκτη όγκου ως υποδοχέα με υψηλό δυναμικό για γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου και την ιογενή ογκόλυσης

Παράθεση:. Behr Μ, Kaufmann JK, Ketzer P, Engelhardt S, Muck-Häusl Μ, Okun PM, et al. (2014) Οι αδενοϊοί Χρησιμοποιώντας το Cancer Marker EphA2 ως υποδοχέων in vitro και in vivo με Genetic Ligand Εισαγωγή σε διαφορετικές Καψιδικής σκαλωσιές. PLoS ONE 9 (4): e95723. doi: 10.1371 /journal.pone.0095723

Επιμέλεια: Ilya Ulasov, σουηδική Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 του Δεκέμβρη 2013? Αποδεκτές: 30, Μαρτίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 23, Απρ, 2014

Copyright: © 2014 Behr et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την επιχορήγηση Helmholtz Πανεπιστημίου Νέων Ερευνητών Ομάδα VH NG 212 και η Deutsche Krebshilfe (γερμανικά Καρκίνο Aid) χορηγεί 10-7946. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η ανασυνδυασμένη αδενοϊοί (ΚΕΠ) σε προ-κλινικές και κλινικές ανάπτυξη ως ογκολυτικούς πράκτορες και φορείς για τον εμβολιασμό και τη γονιδιακή θεραπεία [1], [2] .uch φάρμακα Ad-βάση μπορεί να επωφεληθεί σημαντικά από ή ακόμα και εξαρτώνται από ένα κύτταρο λειτουργία ειδικού τύπου της δράσης με σκοπό τον περιορισμό παρενέργειες, ενώ διατηρούν θεραπευτική δραστικότητα. Κυττάρου τύπου ειδικότητα των φορέων και ογκολυτικά Ad-βάση έχει καθιερωθεί σε επίπεδο μετα-είσοδο μεταγραφική στόχευση και τη ρύθμιση microRNA [3], [4] .Σε αντίθεση, η στόχευση της εισόδου των κυττάρων διαφήμισης, η οποία θα μπορούσε να αποφευχθεί καλύτερη παρενέργειες και της απομόνωσης του ιού, εξακολουθεί να αποτελεί πρόκληση. Γενετική στρατηγικές για την είσοδο στόχευση διαφημίσεων διευκολύνει την απλή παραγωγή κλινικής ποιότητας (δεν χημικές τροποποιήσεις ή τις χωριστές προσαρμογείς απαιτείται) και να εξασφαλίσει ότι οι απόγονοι ογκολυτικού αγγελίες που παράγονται σε όγκους των ασθενών διατηρούν τις βελτιωμένες ιδιότητες. Ωστόσο, οι στρατηγικές για την γενετική είσοδο στόχευση των διαφημίσεων παρεμποδίζεται από την άκαμπτη δομή του καψιδίου διαφήμισης, την αδυναμία των μορίων αντισώματος, όπως προτιμώμενα τμήματα στόχευσης, για να διπλώσετε σωστά μετά την συγχώνευση με εκφράζεται cytosolically πρωτεΐνες του καψιδίου διαφήμισης, και οι πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις των παραγόντων υποδοχής διαμόρφωσης διαφήμισης είσοδος κυττάρων σε ασθενείς (βλέπε παρακάτω)

έναρξη στόχευση των διαφημίσεων απαιτεί δύο βήματα: α. εκτομή της φυσικής τροπισμό για υγιή κύτταρα και την εκ νέου στόχευση ενός υποδοχέα που εκφράζεται ειδικά στα κύτταρα-στόχους με εισαγωγή ενός αντίστοιχου προσδέματος σε ο καψίδιο ad. είσοδο των κυττάρων των ιθαγενών αγγελίες ξεκινά με τη δέσμευση της ίνας πρωτεΐνη καψιδίου με τον υποδοχέα προσκόλλησης, που είναι υποδοχέας Coxsackie-Ad (CAR) για το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο ορότυπο HAdV-5 [5] .Virus εσωτερίκευση στη συνέχεια ενεργοποιείται με τη δέσμευση του πεντονίου βάση σε κυτταρικό ιντεγκρίνες [6] .Για θεραπευτικές εφαρμογές των διαφημίσεων που δεν προορίζονται για τη στόχευση ηπατικό ιστό, το ήπαρ de-στόχευση είναι καίριας σημασίας για την αποφυγή τοξικών παρενεργειών. Ωστόσο, εκτομής δεσμευτικός μεταλλάσσοντας την ίνα δεν μείωσε τη μεταγωγή ήπατος μετά από συστηματική ένεση ιός [7] .Additional διαγραφή δέσμευση ιντεγρίνης μεταλλάσσοντας το πεντονίου βάση CAR είχε ως αποτέλεσμα μειωμένες ήπαρ μεταγωγή σε μερικές αλλά όχι όλες τις μελέτες [7] · επιπλέον, τα πεντονίου μεταλλάξεις βάσης θα μπορούσε να είναι αντιπαραγωγική, στο πλαίσιο της στόχευσης διαφημίσεων, όπως βήματα είσοδο του ιού και μετά την είσοδο των ιών εκ νέου στόχευση μπορεί να τεθεί σε κίνδυνο [8] .Liver μεταγωγή από HAdV-5, ανεξάρτητα από την αλληλεπίδρασή τους με ΚΑΔ και ιντεγκρίνες, αποδόθηκε παραγόντων πήξης του αίματος δεσμεύεται να εξονίου και φυτικές ίνες [9] – [11] οποία υποδοχέα μεσολαβεί μεταγωγή ηπατοκυττάρων από HAdV-5

in vivo

εξακολουθεί να συζητείται [12], [13]

.

η προσέγγισή μας για την είσοδο στόχευση HAdV-5 που προέρχονται από ιούς είναι να αντικαταστήσει τα πεδία άξονα ινών και πόμολο με τα αντίστοιχα πεδία του HAdV-41 βραχείες ίνες (Ad5T /41sSK) και να εισάγετε συνδέτες πεπτίδιο σε αυτό το χιμαιρικό καψιδίου. HAdV-41 συνδέεται οδικώς μέσω μιας δεύτερης μακρές ίνες, ενώ καμία δραστηριότητα δέσμευσης κυττάρων έχει αποδοθεί στην βραχείες ίνες. Αντίστοιχα, ισχυρά μειωμένη μεταγωγή

in vitro

και μεταγωγή ήπατος

in vivo

έχουν αποδειχθεί από διάφορες ομάδες για φορείς HAdV-5 που βασίζεται περιέχει κοντές ίνες του HAdV-41 ή του συνδέονται στενά HAdV -40 [14] – [19] Εμείς έδειξαν προηγουμένως ότι η μολυσματικότητα του διαφημίσεις με χιμαιρικά Ad5T /ινών 41sSK (τότε ονομάζονται F5 /41s) μπορεί να αποκατασταθεί με εισαγωγή συνδέτη γενετική πεπτιδίου χρησιμοποιώντας την πρόσδεση RGD4C-πεπτιδίου ως πρότυπο πεπτίδιο ιντεγκρίνης [14] .Στην πραγματικότητα, ταυτοποιήσαμε διάφορες λειτουργικές θέσεις εισαγωγής, καθιερώνοντας έτσι την χιμαιρική Ad5T /41sSK ίνα ως ευέλικτη ικρίωμα ίνας για εισαγωγή συνδέτη: το HI και EG θηλιές στην πλευρά του κομβίου και για το βρόχο IJ στην κορυφή του , με αποτέλεσμα την ανώτερη αποτελεσματικότητα μεταγωγής σε σύγκριση με Ο-τερματικές συντήξεις. Ωστόσο, όπως ιντεγκρίνες εκφράζονται παντού, το πεπτίδιο RGD4C δεν ήταν κατάλληλη για να αποδειχθεί το δυναμικό της μορφής Ad5T /41sSK για είσοδο κυτταρικό τύπο κυττάρου και μεταγωγή. Ως εκ τούτου, ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να καθορίσει την είσοδο των κυττάρων στόχευση από την Ad5T στρατηγική /41sSK χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο-επιλεκτικό πεπτίδιο συνδετήρα και να συγκρίνουν τη στρατηγική αυτή με μια προσέγγιση που στοχεύει HAdV-5 ίνες.

Η YSA πεπτίδιο, ένα 12-μερές που προσδιορίζονται με εμφάνιση φάγου, συνδέεται επιλεκτικά με τους EphA2 υποδοχέα τυροσίνης κινάσης, αλλά όχι να σχετίζονται κινάσες [20] Εμείς επικεντρώθηκε μελέτη μας σχετικά με αυτό το πεπτίδιο συνδέτη επειδή, σε αντίθεση με πολλές άλλες δοκιμάστηκαν πεπτίδια διατήρησε σε κύτταρα δραστικότητα σύνδεσης στο πλαίσιο της ίνας Ad. Σημαντικά, EphA2 κερδίζει αυξανόμενη προσοχή ως στόχος για θεραπεία του καρκίνου, διότι είναι (i) ρυθμίζεται αυξητικά στις περισσότερες συμπαγείς όγκους και στο ενδοθήλιο του όγκου, (ii) καλύτερη πρόσβαση από όγκους που συχνά στερούνται συνδετήρες κυττάρου σχετιζομένου, (iii) λειτουργικά συνδέεται με όγκο εξέλιξη, και (iv) αναφέρθηκε πρόσφατα ότι είναι ένας δείκτης του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων [21], [22] .Several EphA2 στοχευμένες θεραπευτικές μεθόδους έχουν δείξει απόδειξη της έννοιας σε προ-κλινικές μελέτες, συμπεριλαμβανομένων των αναστολέων της κινάσης, αντισώματα, ανοσοτοξίνες, μηχανικής Τ κύτταρα, διαλυτών υποδοχέων, και τα εμβόλια [22] – [24].

Εδώ, ερευνήσαμε με στόχο την είσοδο διαφήμισης

in vitro

και

in vivo

από γενετικά εισάγοντας το EphA2 δεσμευτική YSA πεπτιδίου σε διαφορετικά ικριώματα ινών Ad υποδοχέα-τυφλή. Συγκεκριμένα, ερευνήσαμε χώρους για τη λειτουργική εισαγωγή πεπτίδιο YSA στα πεδία κουμπί της μικρής HAdV-41 ινών και των ινών HAdV-5. Εκτός από την παραγωγή του ιού με τη συνδυασμένη ίνα επιμόλυνση διαμόλυνση /ιού όπως κάναμε πριν από την [14], ερευνήσαμε την άμεση μηχανική γονιδίων ινών στα γονιδιώματα του ιού, το οποίο είναι πλεονέκτημα ή που απαιτούνται για την ευκολία κατασκευής του ιού και για ιική ογκόλυσης, αντίστοιχα . Επιλεκτικότητα και την αποτελεσματικότητα της εισόδου των κυττάρων Ad διαμεσολαβείται από το πεπτίδιο YSA διερευνήθηκε σε κυτταρική καλλιέργεια, η ανθρώπινη μεταστάσεις βιοψίες, και τα μοντέλα ξενομοσχεύματος σε ζώα συγκρίνοντας τρεις μορφές ινών: (i) το χιμαιρικό Ad5T /41sSK ίνα, (ii) ένα μακράς shafted χιμαιρική ίνα που περιέχει το HAdV-5 ουρά ινών και domains άξονα και το σύντομο HAdV-41 λαβής της ίνας, και (iii) ένα μακράς shafted αλλά CAR δέσμευσης αποκόπτεται HAdV-5 ίνα.

Αποτελέσματα

Ειδικά μεταγωγή της EphA2-θετικών κυττάρων από διαφημίσεις με πεπτίδιο YSA εισαχθεί σε χιμαιρικά ίνες που περιέχει το κουμπί του HAdV-41 βραχείες ίνες

Ερευνήσαμε την είσοδο στόχευση των διαφημίσεων με γενετική εισαγωγή ενός πεπτιδίου που στοχεύουν σε χιμαιρικά ίνες με HAdV -41 κουμπί ως de-στοχευμένη ικρίωμα. Για το σκοπό αυτό, έχουμε τοποθετήσει την 12-μερές EphA2 δέσμευσης πεπτιδίου YSA [20] που πλαισιώνεται από σύντομο συνδετών στο ΗΙ, IJ ή EG βρόχους αυτού του τομέα ρυθμιστή. Να διερευνήσει τη σημασία του μήκους του άξονα για YSA μεσολάβηση μεταγωγή διαφήμισης, συνδυάσαμε αυτά YSA περιέχουν πόμολα με το σύντομο HAdV-41 άξονα ινών (Ad5T /41sSK ιούς, Εικ. 1Α) ή μακροπρόθεσμη HAdV-5 άξονα ινών (Ad5TS /41sK ιούς, Σχ. 1Β). Σε ένα τρίτο σετ ινών, ενσωματώσαμε τη βαθιά HAdV-5 άξονα ίνας με πρωτεογλυκάνη θειικής ηπαρίνης μεταλλαγμένο (HSPG) -σύνδεση μοτίβο (Ad5TS * /41sK ιούς, Σχ. 1C). Αυτή η μετάλλαξη έχει αναφερθεί για να προσδώσει βελτιωμένη de-στόχευση [17], [25], [26] .Μετά πλασμιδίου διαμολύνσεως, όλα τα κατασκευάσματα εκφράστηκαν και διέθετε χωρητικότητα τριμερισμού, αλλά τριμερισμού ήταν σαφώς λιγότερο αποτελεσματική για τις μεγάλες shafted κατασκευάσματα, ιδιαίτερα εκείνα που περιέχει το πεπτίδιο στο βρόχο HI (Εικ. 2Α). Χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμένο πρωτόκολλο επιμόλυνσης /επιμόλυνση (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι), ήμασταν σε θέση να παράγει υψηλό τίτλο ψευδοτυποποιημένοι LacZ φορείς δημοσιογράφος διαφήμισης με όλες τις μορφές ινών. Ενσωμάτωση των μορίων ινών σε ιικά σωματίδια ήταν αποτελεσματική για την βραχυπρόθεσμη shafted ινών και, παρά την μειωμένη ικανότητα τριμερισμού, για τις μεγάλες shafted ίνες IJ-YSA (Εικ. 2Β). Long-shafted ίνες EG-YSA και HI-YSA έδειξαν μειωμένη ή δεν διέθεταν την ενσωμάτωση ινών σε σωματίδια του ιού, αντιστοίχως.

(α) Βραχυπρόθεσμες shafted χιμαιρικό ίνες με την HAdV-5 ουρά συγχωνευμένο με τον άξονα και το κουμπί της η HAdV-41 βραχείες ίνες. (B, C) Long-shafted χιμαιρικό ίνες που περιέχουν την ουρά HAdV-5 και άγριου τύπου (Β) ή μεταλλαγμένου (C) άξονα συγχωνευμένο με τη μικρή λαβή ίνα HAdV-41. (D) CAR δέσμευση-αφαιρεθεί HAdV-5 ίνες. Οι YSA θέσεις εισαγωγής πεπτίδιο που υποδεικνύεται από βρόχους. Παρεμβολή της ακολουθίας συνδέτη σε διάφορες θέσεις του HAdV-5 κομβίο ίνα IJ βρόχος οδήγησε σε απώλεια της ικανότητας τριμερισμού (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και οι ιοί δεν παρήχθησαν για αυτή τη θέση εισαγωγής.

Η

(Α) Ανοσοστύπωμα λύματα άβραστος κυττάρων μετά από παροδική επιμόλυνση της έκφρασης ίνας πλασμιδίων σε κύτταρα 293Τ. (Β) Ανοσοστύπωμα καθαρισμένα σωματίδια ιού των ιών ρεπόρτερ ψευδοτυποποιημένοι LacZ που παράγεται από το πρωτόκολλο διαμόλυνσης /επιμόλυνση. (Γ) Μεταγωγή EphA2-θετικών και EphA2-αρνητικά κύτταρα με ιούς ψευδοτυποποιημένοι ανταποκριτή LacZ. SK-MEL-28 κύτταρα μετατράπηκαν σε τετραπλούν, όλες οι άλλες κυτταρικές γραμμές υπέστησαν μεταγωγή εις τριπλούν. Στήλες και οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν μέσες τιμές και τυπικές αποκλίσεις της δραστηριότητας της β-Gal, αντίστοιχα. RLU, σχετικές μονάδες φωταύγειας? * Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt?. 0.001 έναντι 5T41sSK στο αντίστοιχο κυτταρική γραμμή

Η

Στη συνέχεια, αναλύσαμε την έκφραση της EphA2 σε ένα πάνελ παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, κύτταρα μελανώματος , ενδοθηλιακά κύτταρα, και μια ηπατική κυτταρική γραμμή. Διαπιστώσαμε ισχυρή έκφραση της EphA2 για παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα, και για 4 από τα 6 κυτταροκαλλιέργειες μελανώματος (Εικ. S1). EphA2 δεν ανιχνεύθηκε για τις δύο κυτταρικές γραμμές μελανώματος SK-MEL-28 και Mel624 και η ηπατική κυτταρική σειρά HepG2. Πειράματα Η μεταγωγή με EphA2-θετικές κυτταρικές σειρές PANC-1, ΜΙΑ PaCa-2, Capan-1 (καρκίνος του παγκρέατος) και C8161 (μελάνωμα) έδωσε αποτελέσματα που ήταν παρόμοια για τις αντίστοιχες κυτταρικές σειρές: οι τρεις ιοί ψευδοτυποποιημένοι με βραχυπρόθεσμο shafted YSA ίνες έδειξε μεταγωγή, η οποία ήταν σημαντικά ισχυρότερη από για τους ιούς ελέγχου χωρίς πεπτίδιο YSA (Σχήμα 2C?. 10-πλάσια έως 35-πλάσια αύξηση στην δραστικότητα β-Gal). Για τους ιούς με μη τροποποιημένο HAdV-5 άξονα, η εισαγωγή YSA εντός των βρόχων HI, IJ και EG έδειξαν ασθενή, ισχυρή, και το ενδιάμεσο αποτελεσματικότητα μεταγωγής, αντίστοιχα. Η μακρά-shafted ιό IJ-YSA ήταν ακόμη ανώτερη από τις σύντομες-shafted ιούς (p & lt? 0,05 για όλες τις κυτταρικές σειρές.). Για όλους τους ιούς με το μεταλλαγμένο μακρύ άξονα, παρατηρήσαμε αναποτελεσματική μεταγωγή (φαίνεται στο PANC-1 και C8161 κύτταρα). Σε EphA2-αρνητικά SK-MEL-28 κύτταρα, ο ιός EG-YSA και ειδικά ο ιός IJ-YSA με μη τροποποιημένο μακρύ άξονα έδειξε μεταγωγή σημαντικά υψηλότερο από τους ιούς ελέγχου. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η βραχυπρόθεσμη shafted ιούς Ad5T /41sSK με πεπτίδιο YSA εισαχθεί στο EG, HI ή IJ βρόχου τη μεταγωγή επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα EphA2-θετικό, ενώ οι μεγάλες shafted Ad5TS /41sK-IJ-YSA ιού έδειξε ακόμη πιο ισχυρή, αλλά λιγότερο επιλεκτική μεταγωγή .

στη συνέχεια, μελετήσαμε το πώς η απόδοση μεταγωγής των ψευδοτυποποιημένοι ιών YSA συγκρίνει με ιούς που περιέχουν την καθιερωμένη, ιντεγκρίνη RGD πεπτίδιο σε καρκινικά και ενδοθηλιακά κύτταρα. Οι περισσότερες προηγούμενες μελέτες σχετικά με την παρεμβολή συνδέτη γενετική πεπτίδιο που χρησιμοποιείται πεπτίδια που περιέχουν RGD και απέδειξαν βελτιωμένη, αλλά όχι στοχευμένη εισαγωγή κυττάρου [27] – [29] .Indeed, HAdV-5 ιοί με RGD πεπτίδιο στο βρόχο HI διερευνώνται σε κλινικές μελέτες, λόγω της βελτιωμένη απόδοση εισόδου κελί τους [30] Εμείς διαπίστωσε ότι, στο πλαίσιο της Ad5T /41sSK YSA χιμαιρικό ίνα μέσω πεπτιδίου μεταγωγή EphA2-θετικών κυττάρων ήταν παρόμοιες ή ακόμη και ανώτερες προς μεταγωγή που διαμεσολαβείται από το πεπτίδιο RGD4C εισάγεται στο HI βρόχο (Εικ. 3Α και Β), η πιο αποτελεσματική θέση εισαγωγής για αυτό το πεπτίδιο [14] .Στην EphA2-αρνητικών SK-MEL-28 κύτταρα, μόνο το RGD ιός είχε ως αποτέλεσμα μεταγωγή σημαντικά υψηλότερες από τον ιό μάρτυρα χωρίς πεπτίδιο. Τέλος, θα μπορούσαμε να δείξουμε ότι η μεταγωγή της EphA2-θετικών κυττάρων από Ad5T /41sSK-HI-YSA και Ad5T /41sSK-IJ-YSA αλλά δεν Ad5T /41sSK-HI-RGD αποτελεσματικά αποκλειστεί από διαλυτό πεπτίδιο YSA, ενώ ένα πεπτίδιο ελέγχου με τυχαιοποιημένη αλληλουχία δεν μπλοκάρουν τη μεταγωγή (Σχ. 3Β). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ισχυρή YSA-μεσολαβούμενη μεταγωγή ειδικά της EphA2-θετικών κυττάρων με διαφημίσεις με YSA πεπτίδιο εισάγεται εντός του χιμαιρικού Ad5T /41sSK ίνα.

(Α) Μεταγωγή EphA2-θετικών και αρνητικών EphA2 κύτταρα με ψευδότυποι Ad φορείς που περιέχουν βραχείας shafted χιμαιρικό ίνες με γενετική εισαγωγή του πεπτιδίου YSA σε σύγκριση με αντιστοιχία φορέων με γενετική ένθεση του πεπτιδίου RGD4C. Τα κύτταρα μετάγονται εις τετραπλούν. (Β) μεταγωγή των κυττάρων EphA2-θετικών PANC-1 μετά από ανταγωνισμό με διαλυτό πεπτίδιο YSA ή με πεπτίδιο ελέγχου των τυχαιοποιημένων αλληλουχιών. Τα κύτταρα μετάγονται με ψευδοτυποποιημένοι αγγελίες εις τριπλούν. Στήλες και οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν μέσες τιμές και τυπικές αποκλίσεις της δραστηριότητας της β-Gal, αντίστοιχα. RLU, σχετικές μονάδες φωταύγειας? *

/# p & lt? 0,05, **

/## p & lt? 0,01 *** ρ & lt?. 0.001 έναντι 5T /41sSK (*) ή 5T /41sSK-HI-RGD (

#)

ειδικές μεταγωγή της EphA2-θετικών κυττάρων από διαφημίσεις με πεπτίδιο YSA τοποθετηθεί στο αυτοκίνητο δέσμευση-αφαιρεθεί HAdV-5 ίνες

Για ειδικές εφαρμογές, π.χ. εκείνα που απαιτούν όγκο συγκεκριμένη γονιδιακή μεταφορά αλλά όχι στο ήπαρ de-στόχευσης (βλέπε συζήτηση), Διαφημίσεις με ίνες HAdV-5-βάση μπορεί να είναι επαρκής ή συμφέρουσα σε σύγκριση με πιο εκτεταμένα τροποποιημένους ιούς χιμαιρικό ινών που περιέχουν. Για το λόγο αυτό και για να συγκρίνουν τη μορφή μας χιμαιρικό ινών με τη μητρική μία, ερευνήσαμε την οποία θέσεις εισαγωγής επιτρέπουν τη γενετική σύσταση του πεπτιδίου YSA στο αυτοκίνητο δέσμευση-αφαιρεθεί HAdV-5 κουμπί ινών KO1 (S408E και P409A μεταλλάξεις, Ref [31], Σχ. 1D). Βρήκαμε ότι το πεπτίδιο YSA μπορεί να εισαχθεί στο CD, EG και ΗΙ βρόχους της ικανότητας συγκράτησης ινών τριμερισμού (κάπως λιγότερο αποτελεσματική για τον βρόχο CD) και ικανότητα ενσωμάτωση σε σωματίδια του ιού που παράγονται από το πρωτόκολλο διαμόλυνσης /υπερμόλυνση (Εικ. 4Α και ΣΙ). Διερευνήσαμε επίσης το βρόχο IJ ως πιθανή θέση για την εισαγωγή πεπτίδιο συνδέτη λαμβάνοντας υπόψη την ευνοϊκή θέση στην κορυφή του τομέα ρυθμιστή. Ωστόσο, παρατηρήσαμε απώλεια τριμερισμού ινών μετά την εισαγωγή ενός συνδετήρα στις θέσεις G560 /H561 ή I564 /N565 (δεν φαίνεται). Ψευδοτυποποιημένοι διαφημίσεις με το πεπτίδιο YSA εισάγεται στην EG, HI ή CD βρόχο του κουμπιού KO1 μεσολάβηση αποδοτική μεταγωγή της EphA2-θετικών κυττάρων, τα οποία ήταν 8 φορές σε 230-φορές ανώτερη από την Ad5KO1 ιό ελέγχου χωρίς παρεμβολή του πεπτιδίου (Εικ. 4C ). Ο ιός Ad5KO-HI-YSA ήταν πιο αποτελεσματική από τους ιούς Ad5KO-EG-YSA και Ad5KO-CD-YSA σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν, καθώς και ανώτερη Ad5T /41sSK-EG-YSA. Επιπλέον, ο ιός Ad5KO-HI-YSA έδειξε παρόμοια ή ανώτερη αποτελεσματικότητα μεταγωγής σε σύγκριση με τον ιό Ad5WT, που περιέχει την άγριου τύπου HAdV-5 ίνα. Σε EphA2-αρνητικά κύτταρα, κανένας από τους ιούς με πεπτίδιο YSA εισάγεται μέσα στην ίνα KO1 αυξημένη αποτελεσματικότητα μεταγωγής σε σύγκριση με τον γονικό ιό (Σχ. 4C), επιδεικνύοντας έλλειψη μεταγωγής εκτός στόχου. Συμπερασματικά, η αποτελεσματικότητα μεταγωγής των διαφημίσεων με YSA πεπτίδιο εισαγωγή μέσα στην ίνα HAdV-5 εξαρτάται από την θέση εισαγωγής με την εισαγωγή HI δείχνει την καλύτερη αποτελεσματικότητα μεταγωγής και ειδικότητα.

(Α) Ανοσοστύπωμα των προϊόντων λύσης κυττάρων μετά από άβραστος παροδική επιμόλυνση της έκφρασης ίνας πλασμιδίων σε κύτταρα 293Τ. (Β) Ανοσοστύπωμα καθαρισμένα σωματίδια ιού των ιών ρεπόρτερ ψευδοτυποποιημένοι LacZ. (Γ) Μεταγωγή EphA2-θετικών και EphA2-αρνητικά κύτταρα με ιούς ψευδοτυποποιημένοι ανταποκριτή LacZ. Τα κύτταρα μετάγονται εις τετραπλούν, στήλες και οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν τις μέσες τιμές και οι τυπικές αποκλίσεις της δραστικότητας β-Gal, αντίστοιχα. RLU, σχετικές μονάδες φωταύγειας? *

/# p & lt? 0,05, **

/## p & lt? 0,01, ***

/### p & lt? 0.001 έναντι 5T /41sSK (*) ή 5KO1 (

#) .

η

EphA2 μεσολάβηση μεταγωγή των καρκινικών και ενδοθηλιακών κυττάρων από γονιδίωμά ινών τροποποιημένου αγγελίες

επόμενο αναπτύξει ιούς EphA2 στοχευμένες με τροποποιημένες ίνες που κωδικοποιούνται από το γονιδίωμα τους παρά ψευδοτυποποιημένοι με επιμόλυνση . Γονιδιωματικά τροποποιημένοι ιοί θα απλοποιήσει διαδικασίες κατασκευής και διευκολύνουν την παραγωγή σε μεγάλη κλίμακα των ιών. Επίσης, η εισαγωγή γονιδιωματική ινών που απαιτούνται στο πλαίσιο των ιικών ογκόλυσης. Ωστόσο, δεν είναι σαφές πώς αντικατάσταση γονιδιωματικού ίνα επηρεάζει την παραγωγή μολυσματικών ιών. Στην πραγματικότητα, μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ελαττώματα ανάπτυξης και /ή ελαττωματικά σωματίδια για Ad φορείς με το γονίδιο φυσικής ίνας αντικατασταθεί από ένα γονίδιο που κωδικοποιεί το σύνολο της μικρής HAdV-41 ινών με πεπτίδιο ενθέσεις [32] τεχνολογία recombineering .Using BAC, κλωνοποιήσαμε έξι γονιδιώματα της GFP πρώτης γενιάς /ιών δημοσιογράφος Luc. Σε τρία γονιδιώματα η ίνα HAdV-5 αντικαταστάθηκε από ένα YSA που περιέχουν φυτικές ίνες που αντιπροσωπεύουν κάθε μία από τις μορφές ινών (Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5TS /41sK-IJ-YSA και Ad5KO1-HI-YSA). Τα άλλα τρία γονιδιώματα αντιπροσώπευε τους ιούς ελέγχου Ad5T /41sSK, Ad5wt και Ad5KO1. Όλοι οι ιοί θα μπορούσαν να παραχθούν σε υψηλό τίτλο και έδειξε αποτελεσματική ενσωμάτωση των ινών (Εικ. 5Α). Τα αποτελέσματα των πειραμάτων μεταγωγής με αυτά τα γενετικά τροποποιημένους ιούς αναπαράγονται αυτά που λαμβάνονται με τους ιούς ψευδοτυποποιημένοι που παράγεται από το πρωτόκολλο διαμόλυνσης /υπερμόλυνση, αποδεικνύοντας ότι η εισαγωγή γονιδιωματικού ινών ήταν επιτυχής (Σχήμα 5Β-D.): Σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα EphA2-θετικό, κύτταρα μελανώματος και τα ενδοθηλιακά κύτταρα, παρατηρήσαμε πάλι μια δραματική αύξηση στην αποτελεσματικότητα μεταγωγής για YSA περιέχουν ιούς σε σύγκριση με τους ιούς ελέγχου υποδοχέα-τυφλή (15-πλάσια έως 236-πλάσια). Η εισαγωγή του πεπτιδίου YSA στην ίνα KO1 είχε ως αποτέλεσμα την υψηλότερη αύξηση στην αποτελεσματικότητα μεταγωγής. Η ίνα χιμαιρικό ιό IJ-YSA με μακρύ άξονα ήταν και πάλι κάπως ισχυρότερη από τον ιό που ταιριάζουν με μια σύντομη άξονα. Αξίζει να σημειωθεί, YSA ιούς οδήγησε σε ισχυρότερη μεταγωγή ακόμη και σε σύγκριση με τον ιό που περιέχει το άγριου τύπου HAdV-5 ίνες σε EphA2-θετικά κύτταρα. Αυτή ήταν η περίπτωση όχι μόνο για κύτταρα ασθενώς μεταγωγή με ιούς που περιέχουν την ίνα HAdV-5, κύτταρα δηλαδή C8161 (36-πλάσια έως 220-πλάσια), αλλά και στο EphA2- και [33], [34] κύτταρα CAR-θετικών ΜΙΑ PaCa-2, PANC-1 και HUVEC. Σε EphA2 αρνητικά SK-MEL-28 κύτταρα και HepG2, Ad5T /41sSK-IJ-YSA και Ad5KO1-HI-YSA δεν έδειξαν σημαντική αύξηση στην απόδοση μεταγωγής σε σύγκριση με τους αντίστοιχους ελέγχους, χωρίς την εισαγωγή πεπτιδίου, ενώ Ad5TS /41sK-IJ-YSA και πάλι έδειξε κάπως αυξημένη μεταγωγή. Οπτικοποίηση της έκφρασης GFP επιβεβαίωσε ότι οι διαφημίσεις με πεπτίδιο YSA οδήγησε στη μεταγωγή του σημαντικά αυξημένα ποσοστά της EphA2-θετικών κυττάρων σε σύγκριση με ιούς ελέγχου χωρίς πεπτίδιο, αλλά και σε σύγκριση με Ad5wt (Εικ. S2). Σε EphA2-αρνητικά κύτταρα, αποδοτικότητα μεταγωγής όπως καθορίζεται από αυτό το GFP-based read-out ήταν έντονα μειωμένη για Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5KO1-HI-YSA, Ad5T /41sSK και Ad5KO1 σε σύγκριση με Ad5wt, αλλά λιγότερο για Ad5TS /41sK-IJ-YSA. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι Ad5T /41sSK-IJ-YSA και Ad5KO1-HI-YSA ιοί διαθέτουν τη μεγαλύτερη ικανότητα στόχευσης εισόδου για EphA2-θετικά κύτταρα. Αξίζει να σημειωθεί, η μεταγωγή SK-MEL-28 κύτταρα με ιούς YSA αλλά όχι από τους ιούς ελέγχου χωρίς παρεμβολή του πεπτιδίου θα μπορούσε να αποκατασταθεί με υπερέκφραση του ανασυνδυασμένου EphA2 (Εικ. 6, Σχ. S3), καταδεικνύοντας ότι η EphA2 διαμεσολαβεί είσοδο κύτταρο YSA πεπτίδια που περιέχουν ιούς.

(Α) Ανοσοστύπωμα σωματιδίων καθαρισμένου ιού που παράγεται από γενωμική ένθεση ανασυνδυασμένου ινών. (Β-D) Μεταγωγή της EphA2-θετικών καρκινικών κυττάρων (Β), EphA2-αρνητικά κύτταρα (C) και ενδοθηλιακά κύτταρα EphA2-θετικό (D) με γονιδιωματικά ίνα-τροποποιημένους ιούς /GFP ρεπόρτερ Luc. κύτταρα C8161 υπέστησαν μεταγωγή εις τριπλούν, όλα τα άλλα κυτταρικές γραμμές υπέστησαν μεταγωγή εις τετραπλούν. Στήλες και οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν μέσες τιμές και τυπικές αποκλίσεις του Luc έκφρασης, αντίστοιχα. RLU, σχετικές μονάδες φωταύγειας? *

/# p & lt? 0,05, **

/## p & lt? 0,01, ***

/### p & lt? 0.001 έναντι 5T /41sSK (*) ή 5KO1 (

#) .

Η

SK-MEL-28 κύτταρα επιμολυσμένα με πλασμίδιο έκφρασης EphA2 (ροϋΝΑ-EphA2) ή το πλασμίδιο ελέγχου (pcDNA) μετήχθησαν με γονιδιωματικά ίνα-τροποποιημένους ιούς /GFP ρεπόρτερ Luc. Τα κύτταρα μετάγονται εις τετραπλούν, στήλες και οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν τις μέσες τιμές και οι τυπικές αποκλίσεις της έκφρασης Luc, αντίστοιχα. RLU, σχετικές μονάδες φωταύγειας? ** P & lt? 0,01, *** p & lt? 0,001 για υποδεικνύεται συγκρίσεις. Για την ανίχνευση της EphA2 έκφραση των επιμολυσμένων κυττάρων βλ. S3.

Η

YSA μέσω πεπτιδίου αδενοϊική μεταγωγή του καρκίνου του παγκρέατος και το μελάνωμα ξενομοσχευμάτων

in vivo

Η

Η παραγωγή υψηλών παρασκευασμάτων τίτλου της γονιδίωμά τους ιούς καψιδίου τροποποιημένων μας επέτρεψε να εκτελέσει μελέτες σε ζώα για να εξερευνήσετε YSA μέσω πεπτιδίου αδενοϊική μεταγωγή

in vivo

. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε NOD-SCID ποντικών με υποδόριους όγκους ξενομοσχεύματος του PANC-1 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα ή κύτταρα μελανώματος C8161. η έκφραση της EphA2

in vivo

επαληθεύθηκε σε δύο μοντέλα όγκου (Σχ. S4). Σε ένα πρώτο πείραμα, ενέθηκαν ζώων που φέρουν PANC-1 ή C8161 όγκους εντός του όγκου (ε.τ.) με Ad5T /41sSK-IJ-YSA ή Ad5T /41sSK (Εικ. 7Α). Σε δύο μοντέλα όγκων παρατηρήσαμε σημαντικά ισχυρότερη μεταγωγή με Ad5T /41sSK-IJ-YSA (2.9-φορές για PANC-1 και 5,9 φορές για C8161), αποδεικνύοντας ότι YSA-πεπτίδιο-μεταγωγή είναι λειτουργικό

in vivo

. Σε ένα δεύτερο πείραμα με ένεση C8161 όγκους i.t. με τα YSA που περιέχουν διαφημίσεις που αντιπροσωπεύουν κάθε μία από τις μορφές ινών (Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5TS /41sK-IJ-YSA και Ad5KO1-HI-YSA) ή με ιούς ελέγχου (Εικ. 7Β). Αυξημένη μεταγωγής για Ad5T /41sSK-IJ-YSA έναντι Ad5T /41sSK επιβεβαιώθηκε. Ad5TS /41sK-IJ-YSA έδειξε κάπως υψηλότερη από ό, τι μεταγωγή Ad5T /41sSK-IJ-YSA. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με τις

in vitro

αποτελέσματα μεταγωγή. Ωστόσο, σε αντίθεση με το

in vitro

δεδομένα Ad5KO1 έδειξε παρόμοια αποτελεσματικότητα μεταγωγής από Ad5wt μετά ε.τ. ένεση σε ξενομοσχεύματα C8161 αποκαλύπτοντας απώλεια de-στόχευση. Κατά συνέπεια, η αύξηση στην μεταγωγή με ένθεση πεπτιδίου YSA ήταν ανήλικος (1,6 φορές), αλλά έφτασε σημασία. Ως εκ τούτου, απο- και εκ νέου στόχευση των διαφημίσεων για συγκεκριμένες είσοδο μέσω της EphA2 μετά την ε.τ. ένεση

in vivo

ήταν καλύτερη σε εφαρμογή με τη μορφή ινών Ad5T /41sSK. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το πεπτίδιο μεσολάβηση εισόδου στόχευση χρησιμοποιώντας τη Ad5T /41sSK μορφή ινών είναι λειτουργική

in vivo

μετά ε.τ. ένεση του ιού.

(Α, Β) 2 × 10

10 νρ από γονιδιωματικά ινών τροποποιημένου, EphA2 στόχευση Luc /αναφοράς GFP και τον έλεγχο των ιών εγχύθηκαν εντός του όγκου σε NOD-SCID ποντίκια που φέρουν ξενομοσχεύματα όγκου ( n = 6 έως 9 όγκους ανά ομάδα). Λουσιφεράσης έκφραση γονιδίου ανταποκριτή στους όγκους προσδιορίστηκε ποσοτικά 3 ημέρες μετά την ένεση του ιού. Στήλες και οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν μέσες τιμές και τυπικές αποκλίσεις, αντίστοιχα. RLU, σχετικές μονάδες φωταύγειας. * P & lt? 0,05 έναντι 5T /41sSK,

# p & lt? 0,05 και

### p & lt?. 0.001 έναντι 5KO1

Η

YSA μέσω πεπτιδίου αδενοϊική μεταγωγή σε βιοψίες των ανθρώπινων μεταστάσεις μελανώματος

επόμενο διερευνηθεί αν EphA2 στοχοθετημένες διαφημίσεις ως αποτέλεσμα την αυξημένη μεταγωγή όχι μόνο σε κυτταρικές καλλιέργειες καρκινικών μονοστοιβάδας και ξενομοσχεύματα κυττάρων όγκου, αλλά επίσης σε προσφάτως υλικό βιοψίας όγκων από τους ασθενείς. Αυτά αντιπροσωπεύουν κλινικώς πιο σχετικό υποστρώματα σε σχέση με κύτταρο όγκου φυσιολογία και την παρουσία του μικροπεριβάλλον του όγκου. Βιοψίες των μεταστάσεων μελανώματος κόπηκαν σε ζωντανό φέτες ιστού αμέσως μετά την επέμβαση και στη συνέχεια σε μεταγωγή με γονιδίωμά, YSA που περιέχουν διαφημίσεις καψιδίου τροποποιημένων αντιπροσωπεύουν κάθε μία από τις μορφές ινών ή με ιούς ελέγχου. η έκφραση της EphA2 ανιχνεύθηκε σε ζωντανό ιστό φέτες όλες τις βιοψίες ελήφθησαν από 5 ασθενείς. Ωστόσο, η έκφραση κυμαίνονταν μεταξύ των ασθενών και ήταν ασθενέστερη από ό, τι για καλλιέργειες μονοστοιβάδας (Εικ. S5A). Αυτό ήταν αναμενόμενο καθώς οι βιοψίες περιέχουν ένα μίγμα κυττάρων από τα οποία μόνο ένα κλάσμα είναι καρκινικά κύτταρα. Παρατηρήσαμε ισχυρότερο αποτελεσματικότητα μεταγωγής, όπως προσδιορίζεται με έκφραση GFP για ιούς με πεπτίδιο YSA και για τον ιό ελέγχου με φυσική HAdV-5 ίνες, επιβεβαιώνοντας YSA πεπτίδιο-μεσολαβούμενη μεταγωγή (Εικ. S5B). Όπως σήματα GFP σε 2D εικόνες δεν ποσοτικά αντιπροσωπεύουν αποτελεσματικότητα μεταγωγής, εν μέρει λόγω της ζαρωμένο σχήμα των φετών μετά από 3 ήμερη καλλιέργεια, εμείς ποσοτικοποιηθεί η έκφραση λουσιφεράσης για αυτές τις φέτες (Εικ. 8Α) και για βιοψίες από τέσσερις επιπλέον ασθενείς (Σχ. 8Β-Ε, μια βιοψία απέδωσε μόνο αρκετά φέτες για τη μεταγωγή με Ad5T /41sSK-IJ-YSA και Ad5T /41sSK). Σημειώστε ότι λουσιφεράσης αναγνώσεις είναι υψηλές, επειδή πραγματοποιήσαμε μεταγωγές υψηλό τίτλο για να καταστεί δυνατή η παρακολούθηση της έκφρασης GFP. Παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση των μεταγωγής για Ad5T /41sSK-IJ-YSA σύγκριση με Ad5T /41sSK σε 5 5 βιοψιών (σημαντικότητα επιτεύχθηκε σε 3 βιοψίες με 4,3-έως 576-φορές διαφορές, όχι στα υπόλοιπα βιοψίες λόγω της περιορισμένης υλικό) . Η μεγαλύτερη αύξηση στην μεταγωγή παρατηρήθηκε για τη βιοψία που έδειξε ισχυρότερη έκφραση της EphA2. Ad5TS /41sK-IJ-YSA έδειξε υψηλότερη μεταγωγή από Ad5T /41sSK σε 4 από 4 βιοψίες, αλλά ήταν χαμηλότερη από ό, τι για Ad5T /41sSK-IJ-YSA σε 3 από 4 βιοψίες, το οποίο ήταν σε αντίθεση με τα αποτελέσματα σε καλλιέργειες μονοστιβάδας. Τέλος, μεταγωγή του μελανώματος που ζουν φέτες ιστού από Ad5KO1-HI-YSA έντονα αυξημένη σε σύγκριση με Ad5KO1 σε 4 από 4 βιοψίες (2,1 φορές σε 17,1 φορές, σημαντική σε 2 βιοψίες). Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν εκ νέου στοχευμένη αδενοϊική μεταγωγή που διαμεσολαβείται από το εισαχθέν πεπτίδιο YSA για Ad5T /41sSK-IJ-YSA και Ad5KO1-HI-YSA επίσης σε κλινικά σχετικό υλικό βιοψίας του όγκου.

(Α-Ε) φέτες ζωντανούς ιστούς του μελανώματος μεταστάσεις από 5 διαφορετικούς ασθενείς μετήχθησαν με 10

10 νρ /φέτα γονιδίωμά ινών-τροποποιημένο, EphA2 στοχευμένες Luc /GFP δημοσιογράφος και ελέγχου ιών. Ο αριθμός των μετατραπέντων φετών ανά ιός ήταν εξαρτάται από το μέγεθος της βιοψίας και ήταν η = 4 (Α, Β), η = 3 (C), η = 2 (D) και n = 5 (Ε). Λουσιφεράσης έκφρασης του γονιδίου αναφοράς προσδιορίστηκε ποσοτικά 3 ημέρες μετά την μεταγωγή. Στήλες (Α-Ε) και οι ράβδοι σφάλματος (Α, Β, C, E) δείχνουν μέσες τιμές και τυπικές αποκλίσεις, αντίστοιχα. RLU, σχετικές μονάδες φωταύγειας. *

/# p & lt? 0,05 έναντι 5T /41sSK (*) ή 5KO1 (

#)

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη έχουμε καθιερώσει τον κυτταρικό τύπο. καταχώρηση των κυττάρων διαφήμιση από την εισαγωγή λειτουργικό πεπτίδιο συνδέτη σε ένα χιμαιρικό ικρίωμα ινών de στοχευμένες περιέχει το σύντομο HAdV-41 άξονα ινών και επιλογέα (Ad5T /41sSK). Επιπλέον, περιγράφουμε Ad φορείς entry-στόχευση στο εξαιρετικά συναφείς EphA2 παν-καρκίνος δείκτη επιφάνειας με γονιδιωματική ένθεση του γονιδίου που κωδικοποιεί την χιμαιρική ίνα ή δεσμευτικό-αποκόπτεται HAdV-5 ίνα με YSA πεπτίδιο συνδέτη CAR. Μεταγωγή EphA2-θετικών κυττάρων

in vitro

αυξήθηκε δραματικά με ένθεση συνδέτη πεπτιδίου και για τις δύο μορφές ινών (έως και 236 φορές), υπογραμμίζοντας την δραστικότητα του πεπτιδίου YSA για την εκ νέου στόχευση των ιικών δέσμευσης κυττάρων και την είσοδο . Έχουμε προηγουμένως προσδιορίσει το EG, HI και IJ βρόχους του Ad5T /41sSK ως θέσεις για τη λειτουργική ένθεση του πεπτιδίου RGD4C, το οποίο συνδέεται προς εκφράζονται ευρέως ιντεγκρίνες [14]. Εδώ επιβεβαίωσε τη σκοπιμότητα αυτών των χώρων εισαγωγής χρησιμοποιώντας την EphA2 δεσμευτικό YSA πεπτιδίου. Σε αντίθεση με το πεπτίδιο RGD, η οποία έδειξε ανώτερη δραστικότητα στο βρόχο HI, παρατηρήσαμε παρόμοια δραστικότητα σε καθεμία από τις τρεις θηλιές για το πεπτίδιο YSA (Σχ. 2), αποκαλύπτοντας ότι θέσεις εισαγωγής επηρεάζουν τις αλληλεπιδράσεις πεπτιδίου-υποδοχέα που εξαρτάται διαφορετικά επί του πεπτιδίου . Με το πεπτίδιο YSA, θα μπορούσαν να αποδείξουν για πρώτη φορά ότι το χιμαιρικό Ad5T /41sSK ινών διευκολύνει ειδικά για τον τύπο μεταγωγής Ad κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα πάνελ EphA2-θετικών και αρνητικών EphA2 κύτταρα (Σχ. 2 και 5). ανταγωνισμός πεπτίδιο και ανασυνδυασμένο μελέτες έκφρασης υποδοχέα αποδείξει σαφώς ότι μεταγωγή είναι ειδικό για το πεπτίδιο και διαμεσολαβείται από EphA2 (Σχ. 3 και 6). Τα αποτελέσματα αυτά αποδεικνύουν ένα σκεπτικό για μελλοντικές μελέτες που θα πρέπει να διερευνήσει κατά πόσον απαιτούνται περαιτέρω συνδέτη πεπτίδια είναι λειτουργική στο ικρίωμα ινών Ad5T /41sSK, επιτρέποντας την είσοδο του ιού που στοχεύουν μέσω άλλων δεικτών επιφάνεια.

Έχουμε αποδείξει ότι η εισαγωγή των τροποποιημένων ινών σε γονιδιώματος του ιού, αντικαθιστώντας έτσι την φυσική ίνα, είναι εφικτή (Εικ. 5) εκτός από ψευδοτυποποίηση μέσω του πρωτοκόλλου δύο σταδίων διαμόλυνση /υπερμόλυνση, όπως χρησιμοποιείται επίσης σε προηγούμενη μελέτη μας ([14], τα Σχ. 2-4). Παρατηρήσαμε αποτελεσματική τριμερισμού ινών, την παραγωγή του ιού και την ενσωμάτωση των ινών σε σωματίδια ιού για την γονιδιωματικά τροποποιημένους ιούς με 5T /41sSK ίνες (και KO1 ίνες, βλέπε παρακάτω).