Αφηρημένο

Ιστορικό

MUC 1 είναι μια τύπου Ι διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη έκτροπα υπερεκφράζεται σε διάφορα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος. Το κυτοσολικό τέλος του MUC1 (MUC1-c) είναι εκτενώς εμπλέκονται σε μια σειρά από μονοπάτια σηματοδότησης. MUC1-c έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει την απόπτωση σε ένα αριθμό καρκινικών κυττάρων, αλλά ο μηχανισμός της αναστολής δεν είναι σαφής.

Μέθοδος

Η έκφραση της MUC 1-c μελετήθηκε σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικής γραμμής MIAPaCa -2 σε επίπεδο RNA χρησιμοποιώντας qRTPCR και στο επίπεδο πρωτεΐνης με κηλίδωση Western. έκφραση MUC1-c ανεστάλη είτε με siRNA είτε με ειδικό αναστολέα πεπτίδιο, GO-201. Επίδραση της αναστολής MUC1-γ για τη βιωσιμότητα και τον πολλαπλασιασμό και λυσοσωμικών διαπερατότητας μελετήθηκαν. Σύνδεσμος MUC1-c με HSP70 ανιχνεύθηκε με συν-ανοσοκαταβύθιση MUC1-c και HSP70. Εντοπισμός των MUC1-γ σε κυτταρικά οργανίδια παρακολουθήθηκε με ανοσοφθορισμό και με ανοσοκαθήλωση από το αντίσωμα MUC1-γ μετά υποκυτταρική κλασματοποίηση.

Αποτελέσματα

Αναστολή της MUC1-γ από έναν αναστολέα (GO- 201) ή siRNA είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη βιωσιμότητα και μειωμένη πολλαπλασιασμό των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, GO-201, ο αναστολέας πεπτίδιο της MUC1-c, ήταν αποτελεσματική στη μείωση του φορτίου του όγκου σε παγκρεατικά μοντέλο ποντικού καρκίνου. MUC1-c βρέθηκε επίσης να σχετίζεται με HSP70 στο κυτταρόπλασμα, αν και μία σημαντική ποσότητα MUC1 παρατηρήθηκε επίσης να είναι παρόντες στα λυσοσώματα. Η αναστολή της έκφρασης ή δραστικότητας MUC1 έδειξαν μία ενισχυμένη δράση της καθεψίνης Β στην κυτοσόλη, υποδεικνύοντας λυσοσωμική διαπερατοποίηση. Ως εκ τούτου, αυτή η μελέτη δείχνει ότι MUC1-c αλληλεπίδρασε με HSP70 στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος και εντοπισμένες στα λυσοσώματα σε αυτά τα κύτταρα. Περαιτέρω, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η MUC1-C προστατεύει τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα από τον κυτταρικό θάνατο με τη σταθεροποίηση λυσοσώματα και την πρόληψη της απελευθέρωσης της Καθεψίνης Β στο κυτταρόπλασμα

Παράθεση:. Banerjee S, Mujumdar Ν, Dudeja V, Mackenzie Τ, Krosch TK, Sangwan V, et al. (2012) MUC1c Ρυθμίζει την επιβίωση των κυττάρων στον καρκίνο του παγκρέατος με την πρόληψη Λυσοσωμική διαπερατότητα. PLoS ONE 7 (8): e43020. doi: 10.1371 /journal.pone.0043020

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14η Απριλίου του 2012? Αποδεκτές: 16, Ιουλίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 13 Αυγούστου 2012

Copyright: © Banerjee et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας R21 5R21CA131663-02, R01 5R01CA124723-05 και η Κάθριν και ο Robert Goodale θεμέλιο για AKS. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος είναι η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες και στις γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες. Οι περισσότεροι καρκίνοι του παγκρέατος είναι πόρου αδενοκαρκίνωμα. Το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για ασθενείς με εντοπισμένη ασθένεια μετά από χειρουργική εκτομή είναι 20% και για τα άτομα με μεταστατική νόσο, το ποσοστό επιβίωσης είναι εξαιρετικά χαμηλή. Παρά το γεγονός ότι σημαντικοί πόροι έχουν δεσμευτεί για τη βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος κατά τις τελευταίες δεκαετίες, δεν υπήρξε σημαντική βελτίωση σε αυτούς τους αριθμούς [1]. Το χαμηλό ποσοστό επιβίωσης αποδίδεται στην καθυστερημένη διάγνωση του καρκίνου του παγκρέατος και την ακραία αντίσταση των καρκινικών κυττάρων σε οποιαδήποτε χημειοθεραπευτική στρατηγικές. Για το λόγο αυτό, διαλεύκανση του μηχανισμού της αντίστασης των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος είναι μια πρωταρχική ερευνητική εστίαση, καθώς μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μεθόδων.

Οι βλεννίνες είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες, που υπάρχει στην επιφάνεια των διαφόρων βλεννογόνου επιθηλιακών και αιμοποιητικά κύτταρα, και έχει αναφερθεί ότι υπερεκφράζεται σε έναν αριθμό αδενοκαρκινωμάτων [2]. MUC 1 είναι μία από τις βλεννινών που σχετίζεται με κακή πρόγνωση, κακοήθη μετασχηματισμό των κυττάρων του όγκου, και αντοχή σε γενοτοξικό αντικαρκινικών παραγόντων [3], [4]. MUC1 συνδέεται επίσης με εισβολή [5] – [7], [8], τον έλεγχο αρκετών κυτταρικών μονοπατιών σηματοδότησης [9] και την εξέλιξη του όγκου [10]. Έλλειψη MUC1 έχει συσχετιστεί με μειωμένο πολλαπλασιασμό, εισβολή, και μιτωτική ποσοστά τόσο

in vivo

και

in vitro

σε παγκρεατικού καρκίνου [11].

MUC1 συντίθεται ως ένα μονό πεπτίδιο που υφίσταται διάσπαση σε δύο υπομονάδες, στη συνέχεια σχηματίζοντας ένα σταθερό μη ομοιοπολικό ετεροδιμερές που αποτελείται από ένα εξωκυτταρικό πεδίο και μια κυτταροπλασματική ουρά [12], [13]. Η εξωκυτταρική περιοχή του MUC 1 αποτελείται από μεταβλητό αριθμό επαναλήψεων tandem (VNTR) τροποποιημένη με εκτεταμένη Ο-γλυκάνες, και δρα ως φυσικό φράγμα ενάντια στο εξωκυτταρικό περιβάλλον. Η κυτταροπλασματική ουρά του MUC1 (MUC1-c) αποτελείται από ένα 58 αμινοξέων εξωκυτταρικό τομέα, ένα 28 αμινοξέων διαμεμβρανική περιοχή οξύ και κυτταροπλασματική περιοχή 72 αμινοξέων. Αυτό κυτταροπλασματική περιοχή, (χαρακτηρισμένο MUC1-c) αλληλεπιδρά με β-κατενίνη, τον μείζονα τελεστή της κανονικής Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι [14], [15], και επάγει ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και ογκογονικότητα [16], [17]. Αλληλεπίδραση με β-κατενίνης προωθεί εντοπισμός του MUC1 στον πυρήνα, όπου MUC1-c αλληλεπιδρά με διάφορους παράγοντες μεταγραφής και ενεργοποιεί έναν αριθμό οδών ανάπτυξης και επιβίωσης [18] – [24], καταστέλλοντας έτσι αρκετές οδούς κυτταρικού θανάτου [25] – [ ,,,0],29].

Η υπερέκφραση της MUC1, όπως διαπιστώθηκε σε ανθρώπινους όγκους, συνδέεται με τον εντοπισμό του MUC1-c στα μιτοχόνδρια [3]. Η λειτουργική σημασία του μιτοχονδριακού εντοπισμού MUC1-c υποστηρίζεται από την απόδειξη ότι MUC1 εξασθενεί DNA βλάβη προκαλούμενη απελευθέρωση των μιτοχονδριακών apoptogenic παραγόντων και την αποπτωτική απόκριση [3]. Επειδή MUC1 δεν έχει το κλασικό μιτοχονδριακό υπογραφή εντοπισμού, η μιτοχονδριακή στόχευση της MUC1-C διαμεσολαβείται από την αλληλεπίδραση του με κυτοσολικό συνοδούς όπως HSP70 και HSP90 [30]. Καθώς η πρόσφατα συντεθεί και -cleaved MUC 1-c είναι στο κυτταρόπλασμα με μία εκτεθειμένη υδρόφοβη διαμεμβρανική περιοχή [31], [30], οι συνοδοί είναι σε θέση να συνδέονται με αυτό και να παραδώσει το να μιτοχόνδρια [32]. Σύνδεσμος MUC1-c με πρωτεΐνες θερμικού σοκ μετά από ενεργοποίηση με ερεγουλίνη και την επακόλουθη της στόχευσης στην μιτοχονδριακή εξωτερικής μεμβράνης έχει αναφερθεί [33]. Ως συστατικό της μιτοχονδριακής εξωτερικής μεμβράνης, MUC1-c εξασθενεί απώλεια του δυναμικού διαμεμβράνης σε απόκριση σε γενοτοξικό στρες [34], [3], και προσδίδει αντίσταση σε θάνατο στην κυτταρική απόκριση σε βλάβη του DNA, αντιδραστικά είδη οξυγόνου, υποξία, ή ενεργοποίηση του υποδοχέα θανάτου υπεροικογένεια [34].

Αν και οι κατάντη οδούς κυτταρικού θανάτου, ως συνέπεια της αναστολής MUC1 μελετηθεί σε έναν αριθμό καρκίνων, ο μηχανισμός για την έναρξη του μιτοχονδριακού αποπόλωσης (μετά την αναστολή MUC1 ), οδηγώντας σε ενεργοποίηση των αποπτωτικών οδών δεν είναι σαφές σε καρκίνο του παγκρέατος. Μιτοχονδριακή εκπόλωση της μεμβράνης μπορεί να είναι το αποτέλεσμα ενός αριθμού γεγονότων. Βλάβη του πυρηνικού DNA ή ενδοπλασματικό δίκτυο και τα δύο επάγουν αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που εξαρτάται από μιτοχονδριακή αποπόλωση και την ενεργοποίηση της κασπάσης [35]. Παρόμοια εκπόλωση και την έναρξη των οδών κυτταρικού θανάτου μπορεί επίσης να προκληθεί από τα λυσοσώματα. Οι λυσοσωμικές βλάβη σε απόκριση γονοτοξικούς παράγοντες έχει αναφερθεί να κινήσει κυτταρικό θάνατο από απελευθέρωση των υδρολυτικών ενζύμων από αυτό το οργανίδιο μέσα στο κυτταρόπλασμα [36], [37]. Τα λυσοσώματα περιέχουν πολλούς διαφορετικούς τύπους υδρολυτικών ενζύμων περιλαμβανομένων των πρωτεασών, λιπασών, νουκλεάσες, γλυκοσιδάσες, φωσφολιπάσες, φωσφατάσες και σουλφατάσες που συνήθως ασκούν μέγιστη ενζυματική δραστηριότητα τους σε χαμηλό ρΗ. λυσοσωματικές πρωτεάσες που έχουν ενοχοποιηθεί σε κυτταρικό θάνατο είναι αυτά καθεψίνες που παραμένουν ενεργές σε ουδέτερο ρΗ, όπως καθεψίνη Β, καθεψίνη D και η καθεψίνη L. Οι πρωτεάσες αυτές ενεργοποιήσουν αποπτωτικό τελεστές όπως τα μιτοχόνδρια ή /και κασπασών, πυροδοτώντας έτσι την απόπτωση [38] . [39],

Ένας από τους τύπους πρωτεϊνών προαγωγή επιβίωσης των παγκρεατικών κυττάρων είναι η οικογένεια των πρωτεϊνών θερμικού σοκ, ιδιαίτερα HSP70 [37], [40] – [42]. Έχει αναφερθεί ότι προς τα κάτω ρύθμιση της HSP70 αποτελέσματα σε παγκρεατικά θάνατο των καρκινικών κυττάρων μέσω επαγωγής διαπερατότητας λυσοσωματική, [37], αλλά ο ακριβής μηχανισμός προστασίας δεν έχει μελετηθεί.

Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι HSP70 συνεργάτες με το ο-τερματικό άκρο της πρωτεΐνης MUC1 (MUC1-γ) και το μεταφέρει στο λυσόσωμα, εμποδίζοντας έτσι λυσοσωμική διαπερατότητας και την προώθηση της κυτταρικής επιβίωσης σε αυτά τα κύτταρα όγκου. Δείχνουμε επίσης ότι το πεπτίδιο αναστολέας της MUC1 (GO-201) αναστέλλει τη δραστικότητα της MUC1-c και οδηγεί σε μειωμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων, τόσο

in vivo

και

in vitro.

Αποτελέσματα

καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση της MUC1 σύγκριση με το κανονικό πάγκρεας

Έκφραση

της MUC1 μελετήθηκε σε αρκετές παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές, τόσο σε επίπεδο RNA και πρωτεϊνών . Η έκφραση του MUC 1 mRNA βρέθηκε να είναι σημαντικά υψηλότερη σε όλους τους παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές από ό, τι στα μη ογκογονικά ανθρώπινα κύτταρα παγκρεατικού πόρου (HPDEC) (Σχ. 1Α). Παρόμοια αυξημένη έκφραση πρωτεΐνης MUC1-c παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές γραμμές όγκου σε σύγκριση με τα μη ογκογόνα HPDECs. Ένας συσχετισμός διαπιστώθηκε μεταξύ επιθετικότητα της κυτταρικής γραμμής και την έκφραση του MUC 1 σε παγκρεατικό καρκίνο (Εικ. 1Β). Υψηλότερη έκφραση της MUC 1 παρατηρήθηκε σε πιο επεμβατικές και μεταστατικές κυτταρικές σειρές S2-013 και S2-VP10 ή AsPC1 (που προέρχεται από ασκίτη) από ό, τι σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από πρωτογενείς όγκους (MIAPaCa-2, BxPC3 και Hs776T).

επίπεδα έκφρασης του mRNA του MUC 1 σε διάφορες καρκίνου του παγκρέατος κυτταρικές σειρές συγκριτικά με μη ογκογόνα HPDEC (Α). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή +/- SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt? 0,05 (

t

test) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης MUC1-γ σε διαφορετικές παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική σειρά και μη ογκογόνων HPDEC (Β).

Η

Αναστολή της MUC1 οδηγεί σε μείωση της διάδοσης και θάνατο των κυττάρων

Για να μελετήσουμε αν MUC1 ήταν ένα ουσιαστικό πρωτεΐνη που ελέγχει την κυτταρική επιβίωση στον καρκίνο του παγκρέατος, η έκφραση του αναστέλλεται χρησιμοποιώντας siRNA έναντι MUC1 σε MIAPaCa-2 (Σχ. 2Α-C) και AsPC1 κύτταρα (Σχ. 2G-I). Παράλληλα χρησιμοποιήσαμε επίσης GO-201, ένα πεπτιδικό θραύσμα που αναστέλλει δραστικότητα του MUC1-c, οδηγώντας έτσι σε απορρύθμιση του κατάντη δραστηριότητα σηματοδότηση και η ενεργοποίηση θάνατο κυττάρου σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές MIAPaCa-2 (Σχ. 2D-F) και AsPC1 ( Σχ. 2J-L). Τόσο η αναστολή της έκφρασης MUC 1 με siRNA (Σχ. 2 Α, G), καθώς και η αναστολή της δραστικότητας MUC1-c με GO-201 οδήγησε σε μείωση του πολλαπλασιασμού και αύξηση κυτταρικού θανάτου σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. κύτταρα MIAPaCa-2 παρατηρήθηκαν να ανταποκριθεί περισσότερο σε αναστολή της MUC1 είτε με siRNA είτε με GO-201 (Σχ. 2Α-F) σε σύγκριση με κύτταρα AsPC1 (Σχ. 2G-L). Όπως αναμενόταν, GO-201, τον αναστολέα πεπτιδίου για MUC1-C, δεν άλλαξε το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης (Σχ. 2D, J). Ο κυτταρικός θάνατος θεωρήθηκε ότι είναι κασπάσης με τη μεσολάβηση (Σχήμα S1).

έκφραση MUC 1 αναστάλθηκε από siRNA σε MIAPaCa-2 (Α) λωρίδες ελέγχου 1-3 δείχνουν MIAPaCa-2, MIAPaCa-2 κύτταρα με μη ειδικά siRNA και MUC1 siRNA αντίστοιχα. Τόσο πολλαπλασιασμό (Β) και η βιωσιμότητα (Γ) μειώθηκαν με μειωμένη έκφραση του MUC 1 σε κύτταρα MIAPaCa-2. Σε θεραπεία με αναστολέα της δραστικότητας MUC1-C GO-201, η οποία αναστέλλει την δραστικότητα σηματοδότησης της πρωτεΐνης αυτής, καμία αλλαγή παρατηρήθηκε στα επίπεδα έκφρασης του MUC 1 σε MIAPaCa-2 κύτταρα (D). Η λωρίδα 1 ήταν ακατέργαστα κύτταρα MIAPaCa-2 και η λωρίδα 2 ήταν MIAPaCa-2 υποβάλλεται σε επεξεργασία με GO-201. Πολλαπλασιασμό (Ε) και η βιωσιμότητα (F) παρατηρήθηκαν να μειωθεί. Ομοίως, σε μία άλλη κυτταρική σειρά, AsPC-1, επιμόλυνση με siRNA έδειξαν μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης (G) όπου Γραμμή 1 είναι ελέγχει AsPC-1, Λωρίδα 2: μη-ειδική siRNA επιμολυσμένα AsPC-1 και λωρίδα 3 είναι MUC1 siRNA επιμολυσμένα AsPC1 . Τόσο πολλαπλασιασμό (H) και η βιωσιμότητα (Ι) έχουν μειωθεί. Στη θεραπεία με τον αναστολέα GO-201, δεν υπήρξε καμία μεταβολή στα επίπεδα πρωτεΐνης (J): Λωρίδα 1 ακατέργαστα κύτταρα AsPC-1 και η λωρίδα 2 ήταν AsPC-1 υποβάλλεται σε επεξεργασία με GO-201. Πολλαπλασιασμός (Κ) και η βιωσιμότητα (L) παρατηρήθηκαν να μειωθεί. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή +/- SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt?. .05 (

t

test) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Η

MUC1 Associates με HSP70 στο κυτταρόπλασμα και Τονίζει τους στα λυσοσώματα

πρωτεΐνη θερμικού σοκ 70 (HSP70) είναι ιδιαίτερα υπερεκφράζεται σε καρκίνο του παγκρέατος και προς τα κάτω ρύθμιση της από τους αναστολείς και siRNA έχει δει να επάγει καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικό θάνατο [37]. Ωστόσο, ο ακριβής ρόλος που παίζεται από HSP70 σε επιβίωση των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων είναι άγνωστος. Ταυτόχρονα, MUC1 είναι γνωστό ότι υπερεκφράζεται σε καρκίνο του παγκρέατος και παίζουν ένα ρόλο στην επιβίωση των κυττάρων σε έναν αριθμό κυτταρικών σειρών καρκίνου, αλλά ο ακριβής μηχανισμός δεν ήταν εφικτή [11], [43], [44]. Δεδομένου ότι HSP70 είναι ένας συνοδός, έχει την ικανότητα να προσδένονται και απομονώνουν το κυτοσολικό MUC1-c αυτό στόχευσης έτσι σε διαφορετικά κυτταρικά οργανίδια, όπου MUC1-c θα μπορούσε να ρυθμίσει τις διάφορες αντι-αποπτωτικών οδών για την προστασία παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα από τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Έχει αποδειχθεί στο παρελθόν ότι MUC1 προσδένεται σε HSP70 και HSP90 και στοχεύει την μιτοχονδριακή εξωτερικής μεμβράνης [33]. Για να δούμε αν MUC1-c σχετίζεται με HSP70 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, ελέγξαμε για συν-κατακρήμνιση της MUC1 και HSP70 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. MUC1-c και HSP70 βρέθηκε να συν-ανοσοκαθιζάνουν, onfirming ότι HSP70 και MUC1 πράγματι αλληλεπιδρούν σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (Σχ. 3Α).

Ανοσοκαταβύθιση με MUC1 και HSP70 έδειξαν οι δύο πρωτεΐνες να συνδέονται (Α) . Οι διαδρομές 1, 2 και 3 δείχνουν τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης, HSP70 και MUC1 στο έκλουσμα και οι δύο πρωτεΐνες ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντίσωμα HSP70 αντίστοιχα. Οι διαδρομές 4 και 5 δείχνουν έκλουσμα και ανοσοϊζήματα με MUC1 αντίσωμα. MUC1-c βρέθηκε να είναι εντοπισμένη στα λυσοσώματα σε κύτταρα MIAPaCa-2, αν και σχεδόν ίσες ποσότητες MUC1-c ήταν επίσης κυτοσολική (Β). Lamp2, κάτοικος λυσοσωματικής πρωτεΐνης, και η ακτίνη, ένα κυρίως κυτοσολικό πρωτεΐνη, χρησιμοποιήθηκαν ως δείκτες κλασμάτωση. Η λωρίδα 1 είναι το κυτοσολικό κλάσμα. Η λωρίδα 2 είναι ένα ακατέργαστο κλάσμα λυσοσωματικής, το οποίο περαιτέρω εμπλουτισμένο σε Lane 3. HSP70, αν και συνδέεται με MUC1, θεωρήθηκε να είναι παρούσα κυρίως στην κυτοσόλη. Ανοσοφθορισμού επιβεβαιώθηκε συν-εντοπισμό των MUC1-c και Lamp2 σε λυσοσώματα (C).

Η

MUC 1 είναι σε μεγάλο βαθμό παρούσα στην κυτταρική επιφάνεια των κυττάρων του παγκρέατος. Ωστόσο, το οξύ C-τερματικό άκρο 72 αμινοξέων της πρωτεΐνης υφίσταται αυτόματη διάσπαση και εντοπίζεται σε διαφορετικά κυτταρικά οργανίδια σε απόκριση σε ένα μηχανισμό διαφορικού σηματοδότησης. Για να δείτε αν MUC1-γ όντως μεταφέρονται με HSP70 σε διάφορα κυτταρικά διαμερίσματα, πραγματοποιήσαμε ανοσοφθορισμό με οργανίδιο ειδικούς δείκτες, μαζί με υποκυτταρική κλασματοποίηση ακολουθούμενη από ανοσοστύπωμα με αντι-MUC 1 αντισώματος να ψάξουν για τον εντοπισμό του. Η ακεραιότητα των διαφορετικών κλασμάτων και η καθαρότητα των παρασκευασμάτων οργανιδιακά επιβεβαιώθηκαν με τη χρησιμοποίηση διαφορετικών δεικτών (Lamp2 για λυσοσώματα και Actin για κυτοσόλιο). Αν και HSP70 θεωρήθηκε να συν-καθιζάνουν με MUC1-c (Σχ. 3Α), θεωρήθηκε ότι εντοπίζεται στο κυτοσόλιο και όχι στα λυσοσώματα, ενώ MUC1-c βρέθηκε να εντοπίζεται και στα δύο κυτοσόλιο και λυσοσώματα (Σχ. 3Β). Εντοπισμός του MUC 1 σε λυσοσώματα επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με συν-χρώση παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με τη Lamp2 δείκτη λυσοσωμικού (Σχ. 3C). Ανοσοφθορισμού έδειξε ότι MUC1 και Lamp2 συν-εντοπίζεται με συσχέτισης ενός Pearson του 0,75 (Σχ. 3C). Αυτό έδειξε ότι MUC1-c σχετίζεται με HSP70 στο κυτταρόπλασμα και εντοπισμένη στα λυσοσώματα. Μερικά MUC1-c παρατηρήθηκε επίσης να εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια, επιβεβαιώνοντας έτσι την προηγούμενη μελέτη από Ren et al ότι MUC1-c στοχεύει στα μιτοχόνδρια από HSP70 [3] (Εικόνα S2).

Αναστολή της MUC1- γ ή HSP70 Αποτελέσματα σε λυσοσωματικά διαπερατότητα οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο

Οι λυσοσωμικές διαπερατότητας θεωρείται συχνά να προηγείται θάνατο κυττάρου σε απόκριση σε ένα ερέθισμα με την απελευθέρωση ενός αριθμού υδρολυτικών ενζύμων στο κυτταρόπλασμα, μειώνοντας έτσι το ρΗ του κυτοσολίου και προκαλεί οξέωση [45]. Απελευθέρωση λυσοσωμικών ενζύμων όπως Καθεψίνη Β και την Καθεψίνη D με τη σειρά τους επάγουν μιτοχονδριακή αποπόλωση με αποτέλεσμα την απελευθέρωση του κυτοχρώματος C και ενεργοποίηση των αποπτωτικών οδών [45]. Δεδομένου ότι ένα σημαντικό κλάσμα του MUC 1 ήταν εντοπισμένη σε λυσοσώματα, ψάξαμε για ένα αποτέλεσμα επί λυσοσωματικής διαπερατότητας με μέτρηση της απώλειας της Καθεψίνης Β-Lamp2 συν-εντοπισμό στα λυσοσώματα μετά την αναστολή της MUC1. Επιβεβαιώσαμε περαιτέρω αυτό το φαινόμενο με τη μέτρηση της κυτοσολικής δραστικότητα της καθεψίνης Β σε κύτταρα μετά από αναστολή της MUC1 με siRNA. μελέτες ανοσοφθορισμού μας έδειξαν μια ξεχωριστή απώλεια στην συν-εντοπισμό των CathepsinB και Lamp2 συν-χρώση σε MUC1-σιγήσει κύτταρα (Σχ. 4Α). βιοχημικές μελέτες μας έδειξαν ότι η αναστολή της έκφρασης του MUC 1 έδειξαν αύξηση του κυτοσολικού δράση της καθεψίνης Β που δείχνει ότι η ακεραιότητα της λυσοσωμικής μεμβράνης ήταν σε κίνδυνο (Εικ. 4Β). Ένα σχεδόν ίσο μέγεθος του κυτταροπλάσματος δραστηριότητας Καθεψίνης Β παρατηρήθηκε όταν HSP70 ανεστάλη με τη χρήση siRNA (Σχήμα S3). Αυτό ήταν παρόμοιο με μια προηγούμενη μελέτη [37] στο εργαστήριό μας αναφέρουν ότι προς τα κάτω ρύθμιση της HSP70 στον καρκίνο του παγκρέατος οδήγησε σε κυτταρικό θάνατο από λυσοσωμικές διαπερατότητας. Αυτό έδειξε ότι η αναστολή της HSP70 είτε ή MUC1 οδήγησε σε λυσοσωμική διαπερατοποίηση. Για να καθοριστεί εάν αυτή η διαπερατοποίηση είχε άμεση σχέση με τον κυτταρικό θάνατο, χρησιμοποιήσαμε έναν αναστολέα κύτταρο διαπερατό Καθεψίνη Β (CA-074-Me) και μετρήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων με την παρουσία ενός αναστολέα MUC1 (Εικ. 5C). Ενώ η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε σε σχεδόν το 40% των μη επεξεργασμένων κυττάρων παρουσία του GO-201, κύτταρα κατεργασμένα με CA-074Me μαζί με GO-201 παρατηρήθηκαν για την ανάκτηση και έδειξε μία βιωσιμότητα σχεδόν το 98% των μη κατεργασμένων κυττάρων ( Σχ. 4C). Παρατηρήθηκε ότι τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με GO-201 μόνο έδειξαν μειωμένη ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό μετά από 3 ημέρες θεραπείας, ενώ αυτά που υποβλήθηκαν σε αγωγή με τον αναστολέα Καθεψίνη Β έδειξαν πολλαπλασιασμό και ανάπτυξη παρόμοιες με εκείνες των ελέγχων. Παρόμοια αποκατάσταση της βιωσιμότητας των κυττάρων MIAPaCa-2 παρατηρήθηκε επίσης όταν η έκφραση MUC 1 αναστέλλεται από siRNA (Σχήμα S4). Αυτό έδειξε ότι η επίδραση της GO-201 επί της απελευθέρωσης Καθεψίνη Β θα μπορούσε να αναστραφεί με τη χρήση ενός αναστολέα Καθεψίνης Β (Εικ. 4D). Αυτό επιβεβαιώθηκε βιοχημικά, στην οποία MUC1 siRNA και GO201 τόσο έδειξαν αυξημένη δραστηριότητα του κυτταροπλάσματος Καθεψίνης Β, αλλά η θεραπεία με CA-074Me έδειξε μια αντιστροφή αυτής της δραστηριότητας. Αυτό έδειξε ότι η αναστολή MUC1 πράγματι οδηγήσει σε λυσοσωματική διαπερατοποίηση, το οποίο με τη σειρά του προκάλεσε την έναρξη της οδούς κυτταρικού θανάτου σε αυτά τα κύτταρα.

Αναστολή της MUC1 με siRNA οδήγησε στην λυσοσωμική διαπερατότητας όπως εκδηλώνεται από την απελευθέρωση Καθεψίνη Β στο κυτοσόλιο ( ΈΝΑ). Απώλεια συνεντόπισης της Καθεψίνης Β και Lamp2 στα κύτταρα MUC1-σιγήσει παρατηρήθηκε σε σύγκριση με τους μη φίμωση ελέγχου. Βιοχημική δοκιμασία για τη δραστηριότητα Καθεψίνης Β σε κυτταρόπλασμα έδειξε αυξημένη δραστηριότητα στο σιγήσει κύτταρα και τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με GO-201 (Β) τόσο MUC1. Η διαδικασία κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από GO-201 συνελήφθη σχετικά με τη χρήση ενός αναστολέα της Καθεψίνης Β CA-O74Me (C). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή +/- SEM από 3 ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt?. .05 (

t

test) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Η

ορθοτοπική μοντέλο ποντικού για καρκίνο του παγκρέατος με κύτταρα AsPC-1 έδειξε τεράστια παγκρέατος όγκου σε ποντίκια χωρίς θεραπεία (Α), ενώ GO-201 είχε πολύ λίγο καθόλου όγκο στο πάγκρεας τους. Μείωση του βάρους του όγκου (Γ) και τον όγκο (D) παρατηρήθηκε μετά από θεραπεία με GO-201. * Παριστά π & lt? 0,05, σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Αντιπροσωπευτικές τομές ιστού από ποντίκια με παγκρεατικά καρκινικά (ορθοτοπικό μοντέλο με κύτταρα AsPC1) στην ομάδα ελέγχου βάφονται με Ki-67 έδειξαν εκτεταμένη χρώση υποδεικνύοντας ενεργά πολλαπλασιαζόμενα καρκινικά κύτταρα (Ε), σε σύγκριση με λιγότερο χρώσης σε GO-201 διαφάνειες που δείχνει την απώλεια του πολλαπλασιασμού (ΦΆ). Ο συνολικός αριθμός των κυττάρων που βάφονται με Ki-67 μετρήθηκε σε τουλάχιστον 10 πεδία και στα δύο δείγματα και ο μέσος αριθμός των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων σε δύο σειρές απεικονίσθηκαν (G) *

P

& lt? 0,05 (

t

test) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου.

η

Αναστολή της MUC1 έκφρασης σε ένα

in vivo

Mouse Μοντέλο του καρκίνου του παγκρέατος Μειώνει την εξέλιξη του όγκου

GO -201, ένας αναστολέας πεπτίδιο αναφερθεί ότι αναστέλλει τη δραστικότητα της MUC1-c, έχει δοκιμαστεί για την υποχώρηση του όγκου σε έναν αριθμό μοντέλων καρκίνου όπως ο καρκίνος του προστάτη, ο καρκίνος του μαστού και CML [46] – [48]. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητά του δεν έχει δοκιμαστεί σε παγκρεατικά καρκινικά μοντέλα. Χρησιμοποιήσαμε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού παγκρεατικό καρκίνο με την επιθετική κυτταρική γραμμή AsPC1 για να δοκιμαστεί η αποτελεσματικότητα της GO-201. Είκοσι ποντίκια χωρίς θύμο αδένα nu /nu δόθηκαν ενδο-παγκρέατος ενέσεις 2 × 10

5 κύτταρα. Η θεραπεία με ενδοπεριτοναϊκή GO-201 (30 mg /kg σωματικού βάρους) ξεκίνησε στις 10 τυχαιοποιημένων ποντίκια, ξεκινώντας την ημέρα 4 μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων. Τα υπόλοιπα 10 ποντίκια ενέθηκαν με φυσιολογικό ορό. Το πείραμα τερματίστηκε την ημέρα 30 μετά την ένεση των κυττάρων. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία και το φορτίο του όγκου και στις δύο ομάδες εκτιμήθηκε. Την ημέρα 30, όλα τα αλατούχο ζώα είχαν όγκους (n = 10) (Σχ. 5Α), ενώ στην ομάδα που έλαβε η = 10 ποντίκια, μόνο 3 από 10 είχαν όγκους (Σχ. 5Β). Το βάρος του όγκου στην ομάδα άνευ αγωγής κυμαίνονταν από 0.6-1.6 g, ενώ η αγωγή ομάδες είχαν όγκους βάρους 0,1 g-0,3 g (Εικ. 5C). Ο μέσος όγκος του όγκου από τα ποντίκια στην ομάδα φυσιολογικού ορού ήταν 0,9 cm

3 ενώ αυτά που έλαβαν θεραπεία με GO-201 είχαν ένα μέσο όγκο του όγκου κατά 0.1 cm

3 (Σχ. 5D). Η ομάδα με φυσιολογικό ορό επίσης έδειξε εκτεταμένη μεταστατική εξάπλωση των όγκων σε έναν αριθμό οργάνων (Πίνακας 1). Οι ιστοί από τους όγκους βάφτηκαν με Ki-67 να συγκρίνουν τα ποσοστά πολλαπλασιασμού και στις δύο ομάδες. Το μη επεξεργασμένο ομάδα βάφονται εκτενώς με Ki-67, δείχνοντας ενεργά κύτταρα πολλαπλασιάζονται (Σχ. 5Ε). Σε σύγκριση, τα κύτταρα που υπέστησαν κατεργασία GO-201 χρωματίστηκαν πολύ ασθενώς με Ki-67 (Εικ. 5F). Αυτό υποδηλώνει ότι η λειτουργική αναστολή της MUC1-γ από GO-201 οδήγησε σε σημαντική μείωση της επιβάρυνσης του όγκου σε ποντίκια.

Η

Συζήτηση

Heat-σοκ (HSP) 70 πρωτεΐνες λειτουργούν ως ΑΤΡ -εξαρτώμενη chaperones που ρυθμίζουν την αναδίπλωση των άρτι συντεθούν πρωτεΐνες, το συγκρότημα των συμπλοκών πολλαπλών πρωτεϊνών και τη μεταφορά των πρωτεϊνών κατά μήκος κυτταρικών μεμβρανών [49]. HSP70 συχνά υπερεκφράζεται σε κακοήθεις όγκους, και αυτή η υπερέκφραση συνδέεται με κακή θεραπευτικό αποτέλεσμα σε έναν αριθμό ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του μαστού και τον καρκίνο του παγκρέατος [50], [37], [40], [41]. HSP70 έχει έντονη κυτταροπροστατευτικό αποτέλεσμα και αναστέλλει αποπτωτική σηματοδότηση μέσω αναστολής της μιτοχονδριακής διαπερατότητας, με τη μείωση ή την ενεργοποίηση της κασπάσης με εξουδετέρωση επαγωγής απόπτωσης παράγοντες [51]. HSP70 εντοπίζεται επίσης να λυσοσωμικών μεμβρανών [52], [53] και μπορεί να προστατεύσει λυσοσωμικών μεμβρανών έναντι LMP που προκαλείται από διάφορα ερεθίσματα όπως ετοποσίδη, TNF-α και το οξειδωτικό στρες [54]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι HSP70 υπερεκφράζεται σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και ότι η προς τα κάτω ρύθμιση της είτε με siRNA

in vitro

ή με τη χρήση ενός αναστολέα

in vivo

επάγει την ενεργοποίηση της κασπάσης και κυτταρικού θανάτου με απόπτωση [ ,,,0],37], [42], [55]. Αυτό υποδηλώνει ότι HSP70 είναι σημαντική για την επιβίωση των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Πολλές πιθανές μηχανισμοί έχουν προταθεί για την λειτουργία προ-επιβίωσης των HSP70.

In vitro

μελέτες έχουν δείξει ότι HSP70 μπορεί να επηρεάσει άμεσα με το μηχανήματα απόπτωση σηματοδότησης καθοδικά των μιτοχονδρίων εμποδίζοντας αποπτωσώματος ενεργοποίηση σχηματισμού και της κασπάσης [56]. Πρόσφατες μελέτες με τη χρήση κυτταρικών μοντέλων θανάτου έχουν επισημάνει ότι η HSP70 μεσολάβηση αναστολή της κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση συμβαίνει ανάντη της μιτοχονδριακής διαπερατότητας της εξωτερικής μεμβράνης (ΜΟΜΡ) και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c [57], [58]. Προηγούμενες μελέτες από την ομάδα μας δείχνουν επίσης ότι η αναστολή της έκφρασης HSP70 από διαφορετικούς αναστολείς ή HSP70 siRNA οδηγεί σε ενεργοποίηση της κασπάσης και απόπτωση, υποδηλώνοντας ότι HSP70 αναστέλλει κασπάση-εξαρτώμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος επηρεάζοντας κυτοσολικού αποθέματα ασβεστίου και προκαλώντας λυσοσωματικής διαπερατότητας. Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός του φαινομένου αυτού έχει παραμείνει απροσδιόριστη [37].

MUC1-C έχει δειχθεί ότι είναι ένας ογκοπρωτεΐνη υπεύθυνος για μετασχηματισμό και ογκογονικότητα σε έναν αριθμό των καρκινικών κυττάρων. MUC1-γ παίζει επίσης έναν έντονο ρόλο στην κυτταρική σηματοδότηση μετά από μια σειρά γεγονότων φωσφορυλίωσης. Αρκετές αναφορές δείχνουν επίσης μια συσσώρευση του MUC1-c στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων. Έχει αποδειχθεί στο παρελθόν ότι οι MUC1-c συνδέεται με πρωτεΐνες θερμικού σοκ και στοχεύει την μιτοχονδριακή εξωτερικής μεμβράνης [33], [59]. Έτσι, μια στενή συνεργασία των HSP70 και MUC1 υπάρχει στα καρκινικά κύτταρα.

Σε μια προσπάθεια να κατανοήσουμε τον μοριακό μηχανισμό της επιβίωσης των κυττάρων και ο ρόλος της HSP70 και MUC1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, εξετάσαμε τη συσχέτιση της HSP70 και MUC1. Δεδομένου ότι η κυρίαρχη λειτουργία της HSP70 σε οποιοδήποτε κύτταρο είναι συνοδός της δραστηριότητα, υποθέσαμε ότι HSP70 δρά ως φορέας της MUC1-c σε διαφορετικά κυτταρικά διαμερίσματα όπως λυσοσώματα και μιτοχόνδρια, με αποτέλεσμα την προστασία των εν λόγω διαμερισμάτων και την πρόληψη του κυτταρικού θανάτου. τρέχουσα μελέτη μας έδειξε ότι HSP70 συνδέθηκε με MUC1 και ότι συν-καθιζάνουν με MUC1-c (Σχ. 3Α). Επίσης έδειξε ότι αν και MUC1-C ήταν κυρίως εντοπισμένη στο κυτταρόπλασμα, μια σημαντική ποσότητα ήταν επίσης παρούσα στα λυσοσώματα και μιτοχόνδρια (Σχ 3 Β, Γ?. Εικόνα S2). Η αναστολή της έκφρασης MUC 1-c με siRNA ή μια αναστολή της δραστηριότητας με τη χρήση του αναστολέα πεπτίδιο GO-201 οδήγησε σε μείωση του πολλαπλασιασμού και της βιωσιμότητας των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων (Σχ. 2) και επαγόμενη δραστικότητα της κασπάσης σε αυτά τα κύτταρα, υποδεικνύοντας μια ενεργοποίηση των αποπτωτικών οδών (Σχήμα S1). Αυτή η αναστολή προκαλείται επίσης λυσοσωματική διαπερατοποίηση των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων που οδηγεί σε απελευθέρωση Καθεψίνη Β και υψηλό κυτοσολική Καθεψίνη Β δραστικότητα (Σχ. 4Β, C). έκφραση Καθεψίνης Β σε κύτταρα επιμολυσμένα με μη ειδικό siRNA δείχνουν διακριτή χρώση στα διαμερίσματα λυσοσωμική (Σχήμα 4 Α). Αυτή η ξεχωριστή πρότυπο χρώσης φαίνεται να διαχέεται μια φορά τα κύτταρα επιμολυσμένα με MUC1 siRNA. Αυτό οφείλεται στην απελευθέρωση των πρωτεϊνών Καθεψίνης Β στο κυτοσολικό διαμέρισμα, όπως προσδιορίστηκε βιοχημικά (Σχήμα 4Β). Παρόμοια διαπερατότητας λυσοσωματικής παρατηρήθηκε επίσης όταν η έκφραση HSP70 ανεστάλη από siRNA (Σχήμα S3). Η επίδραση της αναστολής της έκφρασης MUC 1 ή δραστηριότητα παρατηρήθηκε να αντιστραφεί όταν τα κύτταρα συν-επωάστηκαν με τον αναστολέα Καθεψίνης Β CA-074Me. Αυτό έδειξε ότι η απελευθέρωση της καθεψίνης Β από λυσοσώματα των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων οδήγησε σε ενεργοποίηση των οδών κυτταρικού θανάτου. Προηγούμενες εκθέσεις από την ομάδα μας δείχνουν ότι η αναστολή της HSP70 από έναν αναστολέα, είτε τριπτολίδης ή κερκετίνη, οδήγησε επίσης σε παρόμοιες λυσοσωμική διαπερατότητας και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο [37]. Στην ίδια μελέτη έγινε επίσης φανεί ότι ένας αναστολέας Καθεψίνης Β ήταν σε θέση να αναστρέψει τα αποτελέσματα της αναστολής της HSP70 στις παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι λυσοσωμική διαπερατότητας είναι μία από τις προηγούμενες βαθμίδες αποπτωτικό θάνατο σε αυτά τα κύτταρα.

Κλασικά, διαπερατότητας λυσοσωμικής μεμβράνης (LMP) έχει θεωρηθεί ότι εμπλέκεται σε μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου, αν και οι ακριβείς διαδοχική γεγονότα από LMP σε κυτταρικό θάνατο, δεν έχουν χαραχθεί. Ανάλογα με το θανατηφόρο ερέθισμα, η έκταση της LMP, η ποσότητα και το είδος των καθεψίνες απελευθερώνονται στο κυτταρόπλασμα, όπως επίσης και της αφθονίας των αναστολέων καθεψίνης, LMP μπορεί να προκαλέσει μια ποικιλία του θανάτου που σχετίζεται με μορφολογίες που κυμαίνονται από την κλασική απόπτωση σε νέκρωση. Έτσι, LMP συνδέονται με την Καθεψίνη μετατόπιση μπορεί να ενεργοποιεί άμεσα καλπαΐνες και κασπάσες, αλλά LMP μπορεί επίσης να προκαλέσει την κλασική οδό ΜΟΜΡ-κασπάσης, καθώς MOMP- και κασπάσης-ανεξάρτητη απόπτωση. Οι οποίες είναι θανατηφόρες οδοί διεγείρονται από LMP εξαρτάται από τον τύπο του κυττάρου, το καθεστώς αθανατοποίηση και το γενετικό υπόβαθρο των κυττάρων.

Στην παρούσα μελέτη, προτείνουμε ένα μοντέλο επιβίωσης κυττάρου στο οποίο HSP70 δρα ως φορέας του MUC1-c συσχετίζοντας με αυτό φυσικά και μεταφορά στα λυσοσώματα (και τα μιτοχόνδρια) σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Η παρουσία του MUC 1-c στα λυσοσώματα αποτρέπει LMP και διατηρεί τα λυσοσώματα άθικτο. Ωστόσο, όταν HSP70 ή MUC1 αναστέλλεται είτε με siRNA ή με έναν αναστολέα πεπτιδίου της MUC 1 (η οποία εμποδίζει δραστικότητα της MUC1 και έτσι η σύνδεσή της με οποιοδήποτε άλλο μόριο), η προστασία των λυσοσωμάτων έχει χαθεί, και δεν υπάρχει εκτεταμένη LMP, που οδηγεί σε μια απελευθέρωση της καθεψίνης Β και την ενεργοποίηση του κυτταρικού θανάτου. Είτε επαγωγή της ΠΑΕ και την απελευθέρωση της Καθεψίνης Β ενεργοποιεί επιπλέον αποπτωτικά μονοπάτια που αφορούν την μιτοχόνδρια πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω.

Από μια κλινική προοπτική, μια πιο εξειδικευμένη προσέγγιση στην αξιοποίηση MUC1-γ-μεσολάβηση επιβίωση των κυττάρων είναι η ανάπτυξη θεραπευτικών παράγοντες που αλληλεπιδρούν άμεσα με MUC1-c και να μπλοκάρει τη λειτουργία του. MUC1-c σχηματίζει ολιγομερή μέσω του μοτίβου CQC αμινοξέων στην κυτταροπλασματική περιοχή του, και η δραστηριότητα είναι απαραίτητη για MUC1-C πυρηνικής μεταφοράς [60], [61]. Ο αναστολέας πεπτίδιο GO-201, το οποίο περιέχει το μοτίβο CQC, έχει σχεδιαστεί και δοκιμαστεί σε έναν αριθμό καρκινικών κυττάρων να εμποδίσει ολιγομερισμού MUC1 και έτσι αναστέλλουν τη δραστικότητα σηματοδότησης του και τη λειτουργία [18], [46] – [48]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε GO-201 σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού παγκρεατικό καρκίνο να δοκιμαστεί η αποτελεσματικότητά του στην παγκρεατικού όγκου. Η επιθετική παγκρεατικού καρκίνου κυτταρική γραμμή AsPC1 χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία ορθοτοπική παγκρεατικών όγκων. GO-201 (30 mg /kg) εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκώς καθημερινά για 26 ημέρες και το πειραματίστηκαν τερματίστηκε στο 30. Η αναστολή της λειτουργίας MUC1 από GO-201 ημέρας παρατηρήθηκε για την πρόληψη της ανάπτυξης του όγκου και της εξέλιξης στην ομάδα θεραπείας σημαντικά σε σύγκριση με την ομάδα άνευ αγωγής. Σε προηγούμενες μελέτες GO-201 έχει δειχθεί ότι είναι ένας ειδικός αναστολέας MUC1 που δεν έχει καμία επίδραση σε οποιαδήποτε πρωτεΐνη, εκτός MUC1 [47]. προηγούμενες μελέτες μας είχαν δείξει ότι με τη χρήση αναστολέων της HSP70, του παγκρέατος μπορεί να υποχώρησαν

in vivo

[60]. Σε συνέχεια των ερευνών αυτών, η μελέτη αυτή έδειξε επίσης ότι η αναστολή της MUC1

in vivo

θα μπορούσε να μειωθεί το φορτίο του όγκου σε ποντίκια, επιβεβαιώνοντας έτσι ότι η ένωση MUC1-HSP70 αποτελεί ουσιαστικό παράγοντα για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος. Περαιτέρω, η αναστολή αυτής της ένωσης με αναστολή είτε έκφρασης HSP70 ή δραστηριότητα MUC1 θα μπορούσαν να έχουν σημαντική θεραπευτική αξία για τον καρκίνο του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλες οι διαδικασίες