Αφηρημένο

Η ανώμαλη έκφραση του miR-196a έχει συχνά αναφερθεί σε διαφορετικές μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος. Ωστόσο, η λειτουργία του σε καρκίνο του παγκρέατος δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως. Εδώ, ερευνήσαμε το μοτίβο έκφρασης και του βιολογικού ρόλου του miR-196a σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, όπως επίσης και την αλληλεπίδρασή του με ένα γονίδιο μετάστασης που σχετίζονται με πυρηνικό παράγοντα-kappa-Β-αναστολέα άλφα (NFKBIA). Έχουμε αποδείξει ότι miR-196α ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές σε σύγκριση με αθανατοποιημένη παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κύτταρα μέσω microRNAs μικροσυστοιχιών και qRT-PCR. Επιπλέον, προς τα κάτω ρύθμιση του miR-196a σε PANC-1 κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση του με μια αύξηση στην G

0 /G

1 μετάβαση και μειωμένη έκφραση της κυκλίνης D1 και CDK4 /6. Εν τω μεταξύ, μια αυξημένη έκφραση σε Ε-καδερίνης και μειωμένη έκφραση σε Ν-καδερίνης και βιμεντίνης παρατηρήθηκαν επίσης. Εντοπίσαμε ένα νέο στόχο miR-196a, NFKBIA, και προς τα κάτω ρύθμιση του miR-196a ενίσχυσε την έκφραση της πρωτεΐνης NFKBIA. Λουσιφεράσης δοκιμασία επιβεβαίωσε ότι NFKBIA ήταν άμεση και συγκεκριμένο στόχο του miR-196a. Αποσιώπηση NFKBIA στα κύτταρα PANC-1 ενισχυμένο πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση του. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι miR-196α εκφράζεται έντονα σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, και μπορεί να παίζει έναν κρίσιμο ρόλο σε παγκρεατικά πολλαπλασιασμό του καρκίνου και τη μετανάστευση, πιθανόν μέσω προς τα κάτω στόχος του, NFKBIA. Έτσι, miR-196a μπορεί να χρησιμεύσει ως πιθανό θεραπευτικό στόχο για τον καρκίνο του παγκρέατος

Παράθεση:. Huang F, Tang J, Zhuang Χ, Υ Zhuang, Cheng W, Chen W, et al. (2014) MiR-196α Προωθεί καρκίνο του παγκρέατος Εξέλιξη από Στόχευση Nuclear Factor Κάππα-Β-αναστολέα άλφα. PLoS ONE 9 (2): e87897. doi: 10.1371 /journal.pone.0087897

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9, Αυγ 2013? Αποδεκτές: 3 Ιανουαρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: τέταρτης Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30973505), το Ίδρυμα Επιστήμης και Τεχνολογίας της επαρχίας Γκουανγκντόνγκ (2009B030801005), το Ίδρυμα της Guangzhou Επιστήμης και Τεχνολογίας του Προεδρείου (2009Y-C011-1) και το Ίδρυμα του Υπουργείου εκπαίδευση της Κίνας (20120171110075) σε H. Γιάο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια επιθετική κακοήθεια με μία από τις χειρότερες εκβάσεις μεταξύ όλων των καρκίνων. Για όλα τα στάδια σε συνδυασμό, το ποσοστό σχετικής επιβίωσης 5 ετών είναι μόλις 5% [1]. Η υψηλή θνησιμότητα του καρκίνου του παγκρέατος θα μπορούσε να οφείλεται εν μέρει στην ικανότητα των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος να αποκτούν επεμβατικές χαρακτηριστικά κατά τα πρώτα στάδια της καρκινογένεσης. Έτσι, είναι πιθανό ότι ακόμη και στο στάδιο της μια φαινομενικά εντοπισμένη ασθένεια, μικρομεταστάσεις μπορούν να είναι ήδη παρούσες σε απομακρυσμένες θέσεις οργάνων [2]. Συμβατική χημειοθεραπεία σπάνια είναι θεραπευτική για τον μεταστατικό καρκίνο του παγκρέατος. θεραπευτικές στρατηγικές που στοχεύουν ειδικά και την πρόληψη των μεταστάσεων θα μπορούσε, επομένως, να έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει σημαντικά την πρόγνωση της νόσου μελαγχολική.

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι τα microRNAs (miRNAs) παίζουν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση των διαφόρων βιολογικών και παθολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της μετάστασης [3]. Αυτά τα μικρά, μη κωδικοποιητική μόρια ασκούν ρυθμιστικές επιδράσεις τους με δέσμευση σε 3 ‘αμετάφραστη περιοχή του mRNA στόχου, προκαλώντας είτε αποικοδόμηση του mRNA ή αναστολή της μετάφρασης τους σε λειτουργικές πρωτεΐνες. Η έκφραση των miRNAs έχει αναγνωριστεί ως αναπόσπαστα συστατικά πολλών φυσιολογικών βιολογικών διεργασιών που περιλαμβάνουν κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση, και αντοχή στο στρες [4]. Το πιο σημαντικό, έχει πρόσφατα προταθεί ότι παρεκκλίνουσα προς τα πάνω ρύθμιση ή προς τα κάτω ρύθμιση των συγκεκριμένων miRNAs και τους στόχους τους σε διάφορους τύπους καρκίνου που σχετίζονται με την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του [5]. Η παρεκκλίνουσα έκφραση κάποιων miRNAs έχει δειχθεί ότι εμπλέκεται σε παγκρεατικά καρκινογένεση του καρκίνου [6], [7]. Επιπλέον, miR-196α έχει βρεθεί ότι υπερεκφράζεται σε καρκίνο του παγκρέατος, και σχετίζεται σημαντικά με κακή ποσοστό επιβίωσης [8]. Ωστόσο, ο μηχανισμός της λειτουργίας του σε καρκίνο του παγκρέατος παραμένει ασαφής.

Ο πυρηνικός παράγων κΒ (ΝΡ-κΒ) παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης [9] και της φλεγμονής [10]. Περιλαμβάνει μια οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στην ρύθμιση μιας ευρείας ποικιλίας βιολογικών διαδικασίας και αυξανόμενη αποδείξεις απέδειξε τη συμμετοχή της στην ογκογένεση [11] – [14]. Έχει εμπλακεί σε αρκετά τεκμήρια της ανάπτυξης και της εξέλιξης του καρκίνου, περιλαμβανομένου του παράγοντα ανάπτυξη ανεξάρτητη πολλαπλασιασμό [15], η αναστολή της απόπτωσης [16], και εισβολή ιστού και μετάσταση [17]. Επίσης, οι αναδυόμενες ενδείξεις υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του παγκρέατος [11], [18] – [20]. Η αναστολή της ΝΡ-κΒ ευαισθητοποιεί ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε απόπτωση [21]. NFKBIA, επίσης γνωστή ως ΙκΒα, είναι ένα από τα μέλη της οικογένειας των κυτταρικών πρωτεϊνών που αναστέλλουν τον παράγοντα μεταγραφής ΝΡ-κΒ. NFKBIA αναστέλλει NF-κΒ συγκαλύπτοντας τα σήματα πυρηνικού εντοπισμού (NLS) του NF-κΒ πρωτεΐνη και κρατώντας το απομονωμένο σε μια ανενεργή κατάσταση στο κυτταρόπλασμα [22]. Επιπλέον, μπλοκ NFKBIA η ικανότητα του ΝΡ-κΒ να δεσμεύεται με DNA, το οποίο είναι απαραίτητο για τη λειτουργία του ΝΡ-κΒ [23]. Έχει αποδειχθεί ότι υπάρχει ένας εμπλουτισμός ειδικών πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου και απλότυποι του NFKBIA σε λέμφωμα Hodgkin, καρκίνο του παχέος εντέρου και του πολλαπλού μυελώματος, δείχνει ότι NFKBIA μπορούσε να είναι ένα ογκοκατασταλτικό [24] – [26].

σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι miR-196α υπερεκφράζεται σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές και έχουν διερευνήσει την επίδραση της προς τα κάτω ρύθμιση miR-196a σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικής γραμμής, PANC-1. Έχουμε διευκρινιστεί ότι NFKBIA είναι ένας στόχος της miR196a, και miR-196α παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του παγκρέατος πιθανόν με τη στόχευση NFKBIA.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές σειρές

Τέσσερις ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές PANC-1, Capan-2, BxPC-3 και SW1990 αγοράστηκαν από την κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, PR China), και απαθανάτισε παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κυτταρική σειρά H6C7 ήταν ευγενική που παρέχεται από τον καθηγητή Ming-sound Tsao (Institute Ontario Cancer, Πανεπιστήμιο του Τορόντο, Καναδάς), και επωάστηκε σε αυτή τη μελέτη, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [27]. Τέσσερα ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (Κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Σαγκάη, PR China) καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Gibco, Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, Hyclone, Logan, UT), 100 ενώνει /ml πενικιλλίνη G, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. H6C7, που λαμβάνεται από Prof.Ming-ήχος Tsao του Οντάριο Ινστιτούτου Καρκίνου (Ontario, Canada), καλλιεργήθηκε στους 37 ° C σε μέσο ελεύθερο ορού κερατινοκυττάρων (K-SFM) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) που περιέχει 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 U /ml στρεπτομυκίνη, 0,2 ng /ml ανασυνδυασμένου ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (rEGF) και 20 ng /ml εκχύλισμα υποφύσεως βοοειδούς (ΒΡΕ). Σε όλα τα πειράματα, τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα αέρα.

GeneChip Microarray του miRNAs

Το προφίλ γονιδιακής έκφρασης miRNA των τεσσάρων ανθρωπίνων καρκίνου του παγκρέατος κυτταρικές σειρές και H6C7 προσδιορίστηκε με ανάλυση μικροσυστοιχιών GeneChip (Affymetrix, Σάντα Clare, CA, USA). Σύνθεση του cDNA, υβριδοποίηση σε τσιπ, και εκπλύσεις διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. GeneChips σαρώθηκαν σε πυκνότητα 3 χιλιοστών με GeneArray Scanner (Affymetrix). Εικόνες επιθεωρήθηκαν για να εξασφαλιστεί ότι όλες οι μάρκες είχαν χαμηλό υπόβαθρο, αλλά φωτεινά σήματα υβριδοποίησης. Η μέση ένταση φθορισμού του σήματος για κάθε ανιχνευτή ήταν τεταρτημόριο κανονικοποιημένη. Ο μέσος όρος των τριών μέσης σήματα για κάθε ανιχνευτή miRNA ομαλοποιήθηκε με εκείνη για μια προστιθέμενη ολιγονουκλεοτίδιο ελέγχου και ήταν log

2 μεταμορφωθεί. Κάθε ανιχνευτής miRNA αξιολογήθηκε για έκφραση με βάση μια δοκιμή Wilcoxon Rank-Sum των σετ ανιχνευτή σημάτων miRNA σε σύγκριση με την κατανομή των σημάτων από το φόντο. Η Φοιτητών

t-test

αυτή χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό σημαντικές διαφορές στην έκφραση των miRNAs μεταξύ ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου κυτταρική γραμμή και την απαθανάτισε παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κυτταρική σειρά H6C7, όπου

P

& lt? 0,05 ερμηνεύτηκε ως σημαντική.

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR (qRT-PCR)

Για να αναλυθεί η έκφραση του miR-196α, qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε τέσσερις ανθρώπινες παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (PANC- 1, Capan-2, BxPC-3 και SW1990) και ένα αθανατοποιημένο παγκρεατικού πόρου επιθηλιακή κυτταρική γραμμή H6C7. Εν συντομία, ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας TRIZOL (Invitrogen, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. U6 ελέγχθηκε ως normalizer. Ολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το αντίστοιχο RT Primer και το TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Το έναυσμα PCR για τις ώριμες miR-196a σχεδιάστηκε ως εξής: αίσθηση miR-196a, 5′-GCT CTG GCT CCG TGT CTT CAC TCC C-3 ‘, αντίστροφη, 5’-TGC CCC AGC ACA GCC CCC GTC ΚΔ C-3 ‘. Η έκφραση του miR-196a και U6 ελέγχου ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας σύστημα δοκιμασίας TaqMan miRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Η επιμόλυνση των PANC-1 κύτταρα

Δύο ζευγάρια συνθετικά, χημικά τροποποιημένο σύντομο μονής ή διπλής έλικας RNA ολιγονουκλεοτίδια: αντι-miR-196a και του κατάλληλου αρνητικού ελέγχου (αντι-miR-NC), micmics miR-196a και την κατάλληλη αρνητικού ελέγχου του (miR-NC) αγοράστηκαν από GenePharma (Σαγκάη, PR China). NFKBIA-siRNA (si-NFKBIA) και σχετική αρνητική ελέγχου (si-NC) αγοράστηκαν από GeneChem (Σαγκάη, Λαϊκή Δημοκρατία της Κίνας). Η διαμόλυνση εκτελέστηκε με Lipofectamine 2000 αντιδραστήριο (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για την επιμόλυνση, 2 × 10

5 κύτταρα PANC-1 σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας 6-φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα. Τα επίπεδα έκφρασης ποσοτικοποιήθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ανιχνεύθηκε με τη μέθοδο WST-8. Αντι-miR-196atransfected κύτταρα PANC-1 και τα κύτταρα αντι-miR-NCtransfected PANC-1 συλλέχθηκαν και διαχωρίστηκαν σε εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων, 1.2 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων ανά φρεάτιο. Επίσης, si-NFKBIA επιμολυσμένα κύτταρα PANC-1, si-NC επιμολυσμένα PANC-1 κύτταρα, si-NFKBIA + αντι-miR-196a επιμολυσμένα κύτταρα PANC-1 και Si-NC + αντι-NC κύτταρα PANC-1 συλλέχθηκαν και διαχωρίστηκαν σε εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων, 2 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων ανά φρεάτιο. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εξετάσθηκε σε διαφορετικές ώρες (24 ώρες, 48 ώρες, 72 ώρες). WST-8 αντιδραστήριο (10 μΐ ανά φρεάτιο) από την Cell Μετρώντας Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) προστέθηκε, επωάστηκε για 4 ώρες, και η απορρόφηση προσδιορίστηκε με πολλές εκβαθύνσεις φασματοφωτόμετρο (BioTek, VT, USA) στα 450 nm και 630 nm.

η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων διεξήχθη χρησιμοποιώντας Transwell θάλαμο (Corning, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) με μέγεθος πόρων 8,0 μm. 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, σύνολο 10

5 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό και σπείρονται στο ανώτερο διαμέρισμα του θαλάμου. Το κάτω διαμέρισμα φορτώθηκε με πλήρη μέσα καλλιέργειας που περιείχε 10% FBS. Αφού επωάστηκε στους 37 ° C για 8 ωρών, ο θάλαμος στερεώθηκε, 0.1% κρυσταλλικό ιώδες-χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν.

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Για να ανιχνευθεί η επίδραση ρύθμισης προς τα κάτω του miR -196a επί του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης, κυτταρομετρία ροής ανάλυση εκτελέσθηκε. Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, αντι-miR-196a-επιμολυσμένα PANC-1cells συλλέχθηκαν σε διαφορετικές ώρες (24 ώρες, 48 ώρες, 72 ώρες) μετά την επιμόλυνση, και θρυψινοποιήθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με παγωμένη αιθανόλη 70% επί 18 ώρες στους 4 ΝΤΟ. Τα σταθεροποιημένα κύτταρα βάφτηκαν με 50 mg mL /ιωδιούχου προπιδίου (BD Pharmingen, San Diego, CA) και 50 mg /mL RNase και στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής (BD Pharmingen, San Diego, CA). Για την ανάλυση απόπτωσης, αντι-miR-196a-επιμολυσμένα PANC-1cells επίσης συλλέχθηκαν σε διαφορετικές ώρες (24 ώρες, 48 ώρες, 72 ώρες) μετά την επιμόλυνση, χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-αννεξίνης V και ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) και στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής (BD Pharmingen, San Diego, CA). Anti-miR-NC-επιμολυσμένα PANC-1cells πραγματοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

ανοσοφθορισμού ανάλυση

Για να διερευνήσει τις αλλαγές φαινοτύπου των PANC-1 επιμολυσμένα με αντι-miR-196a, ανάλυση ανοσοφθορισμού διεξήχθη . Παρατήρηση της μορφολογίας των Λευκά, αντι-miR-NC και η ομάδα αντι-miR-196a διεξήχθη από το μικροσκόπιο. Η έκφραση της Ε-καδερίνης και βιμεντίνης, δείκτες ΕΜΤ, ανιχνεύθηκαν με ανοσοφθορισμό επί 3

rd ημέρες μετά την επιμόλυνση. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμ για 15 λεπτά σε πάγο. Μετά από δύο περισσότερο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) πλύση, τα κύτταρα καλύφθηκαν με 0.5% Triton 100 για 15 λεπτά σε πάγο, μετά πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 5% άπαχο γάλα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου για να εμποδίσει μη ειδικής σύνδεσης IgG. Τα κύτταρα επωάστηκαν με το ποντίκι πρωτογενές αντίσωμα αντι-ανθρώπινο Ε-καδερίνης (Abcam, MA, USA) ή βιμεντίνη (Abcam) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, μετά πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με ένα φθοριόχρωμα σε θερμοκρασία δωματίου για 30 min σε ένα σκοτεινό θάλαμο. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και καλύπτεται με DAPI για τη χρώση των πυρήνων. Πήραμε τυχαία φωτογραφίες χρησιμοποιώντας 200 φορές μεγέθυνση.

ανάλυση Western blot

Η συγκέντρωση της συνολικής πρωτεΐνης που εξάγεται από Blank, αντι-miR-NC και αντι-miR-196a ομάδα προσδιορίστηκε με BCA κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης (Pierce, USA). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνες PVDF (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA) χρησιμοποιώντας ένα μίνι trans-blot. Ποντικού αντι-ανθρώπινης κυκλίνης D1 (Abcam), CDK4 (Abcam), CDK6 (Abcam), Ε-καδερίνης (Abcam), βιμεντίνη (Abcam), κουνελιού αντι-ανθρώπινη Ν-καντερίνη (Cell Signaling Technology, ΜΑ, USA), NFKBIA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της έκφρασης ομόλογων πρωτεϊνών. GAPDH (Santa Cruz Biotechnology) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Ηλεκτροχημικοφωτεινότητα διεξήχθη με ένα σύστημα απεικόνισης Chemilmager 5500 (San Leandro, CA, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

3’UTR αναφοράς λουσιφεράσης δοκιμασία

Το ανθρώπινο αναφοράς λουσιφεράσης NFKBIA 3’UTR κατασκευή (NFKBIA-3’UTR WT) δημιουργήθηκε με κλωνοποίηση ακολουθία NFKBIA mRNA 3’UTR σε κατάντη της pMIR-Έκθεση κατασκεύασμα (γη, Guangzhou, PR China). Το miR-196a στόχο τοποθεσία μετάλλαξης NFKBIA 3’UTR λουσιφεράσης (μετάλλαξη NFKBIA-3’UTR) κατασκεύασμα δημιουργήθηκε με τη χρήση μεταλλαξιγένεση άμεση επιτόπια χρήση εκκινητών μετάλλαξη που μεταλλάσσονται τη θέση σύνδεσης από ACTACCT να ATCGATC miR-196a. κύτταρα PANC-1 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο miR-196a και άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης και λουσιφεράση δραστηριότητες NFKBIA 3’UTR μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας την Dual-Glo λουσιφεράσης. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν διαιρώντας δραστηριότητα λουσιφεράσης Firefly με εκείνη της λουσιφεράσης της Renilla.

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD), υπολογίζεται με τη χρήση του λογισμικού SPSS, έκδοση 13.0. Τα μέσα στη συνέχεια συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ANOVA με LSD μεταξύ ομάδων ή φοιτητής

t

δοκιμή μεταξύ των ομάδων.

P

& lt?. 0.05 αναφέρεται η στατιστική σημαντικότητα

Αποτελέσματα

MiR-196α υπερεκφράζεται στον καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές

Για να διερευνήσουν το ρόλο της ΜΙΚ 196α στην ανάπτυξη καρκίνου του παγκρέατος, πρώτον εξετάσαμε την έκφραση του miR-196a σε τέσσερις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (Capan-2, BxPC-3, PANC-1 και SW1990) και αθανατοποιημένα παγκρεατικού πόρου H6C7 επιθηλιακή κυτταρική γραμμή miRNAs μικροσυστοιχιών και πραγματικό χρόνος RT-PCR. Η ιεραρχική σύμπλεγμα αποκάλυψε ότι εκφράσεις miR-196a σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές ήταν πολύ υψηλότερη από εκείνη σε H6C7 (Σχήμα 1Α). Εν τω μεταξύ, το αποτέλεσμα του πραγματικού χρόνου RT-PCR ήταν σύμφωνα με μικροσυστοιχίας. Η έκφραση του miR-196α ήταν (706,4 ± 9,4) φορές σε σε PANC-1 κύτταρα, (310,1 ± 7,5) φορές σε κύτταρα SW1990 σε, (7,6 ± 1,1) φορές σε σε BxPC-3 κύτταρα και (204,9 ± 4,8) φορές σε σε κύτταρα Capan-2, σε σύγκριση με H6C7 (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 1Β). Υπονοείται ότι miR-196a μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη του ανθρώπινου καρκίνου του παγκρέατος.

(Α) Ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίηση των miRNAs που ήταν είτε διαφορικά ανάντη ή προς τα κάτω σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και H6C7. MiRNAs που σημείωσε μια διαφορική τιμή 1 ή μεγαλύτερο ταξινομήθηκαν ως διαφορικά ρυθμίζεται προς τα πάνω, και miRNAs που σημείωσε μια τιμή -1 ή λιγότερο ταξινομήθηκαν ως διαφορικά μειωτικά. Η κλίμακα γραμμή στο κάτω μέρος του heatmap απεικονίζει την αλλαγή SD από τη μέση. έκφραση MiR-196α ήταν σημαντικά υψηλότερη σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές σε μικροσυστοιχίας. (Β) Επικύρωση του επιπέδου έκφρασης miR-196a σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές από qRT-PCR. MiR-196α ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Η έκφραση του miR-196α ήταν (706,4 ± 9,4) φορές σε σε PANC-1 κύτταρα, (310,1 ± 7,5) φορές σε κύτταρα SW1990 σε, (7,6 ± 1,1) φορές σε σε BxPC-3 κύτταρα και (204,9 ± 4,8) φορές σε σε κύτταρα Capan-2, σε σύγκριση με H6C7 (*,

P

& lt? 0,05).

Η

Επίδραση του miR-196a επί του πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης των κυττάρων PANC-1

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, η έκφραση του miR-196α ήταν πολύ υψηλότερη σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές σε σύγκριση με την αθανατοποιημένες παγκρεατικού πόρου επιθηλιακή κυτταρική γραμμή, ιδιαίτερα σε PANC-1. Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η βιολογικός ρόλος του miR-196a σε καρκίνο του παγκρέατος, εμείς επιλέξαμε PANC-1 για τα πειράματα παρακολούθησης για την υψηλή έκφραση του miR-196a και διερευνήθηκε η επίδραση των στοχευμένων knockdown του miR-196α επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την απόπτωση. Αποκαλύφθηκε ότι το αντι-miR-196α ήταν αποτελεσματικά εισάγεται εντός των κυττάρων (Σχήμα 2Α, Σχήμα 2Β) και ρυθμισμένα προς τα κάτω το επίπεδο έκφρασης miR-196a (Σχήμα 2C). WST-8 δοκιμασία αποκάλυψε ότι η πολλαπλασιασμού των κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένη σε PANC-1 κύτταρα επιμολυσμένα με αντι-miR-196α σε 72 ώρες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου αντι-miR-NC (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 2D), ενώ η μεταβολή της έκφρασης miR-196a δεν είχε σημαντική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου αντι-miR-NC στις 24 ώρες (

P

= 0.987) και 48 ώρες (

P

= 0,241).

(Α) Η επιμόλυνση των αντι-miR-196a και αντι-miR-NC σε PANC-1. (Β) σύγκρισης του ποσοστού επιμόλυνσης μεταξύ των αντι-miR-196a και αντι-miR-NC σε PANC-1. Το ποσοστό επιμόλυνσης των αντι-miR-196a ήταν (88,76 ± 2,25)%, ενώ το ποσοστό επιμόλυνσης των αντι-miR-NC ήταν (91,09 ± 1,77)% (

P

& gt? 0,05). (Γ) έκφραση του miR-196a από qRT-PCR. (Δ) της καμπύλης ανάπτυξης μεταξύ των αντι-miR-196a, αντι-miR-NC και γονικών κυττάρων PANC-1. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένη στην ομάδα αντι-miR-196a σε σύγκριση με εκείνη του αντι-miR-NC ομάδα στις 72 h (*,

P & lt? 0,05

).

LM

:. Μικροσκόπιο φωτός

Η

Επιπλέον, προσδιορίσαμε αν κυτταρικού κύκλου ή απόπτωση θα συμβάλει στην αναστολή του πολλαπλασιασμού. ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε. Μετά την φίμωση miR-196a από αντι-miR-196a σε 72 ώρες, το ποσοστό των G

0 /G

1 ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου αντι-miR-NC, (67.20 ± 3.12)% (αντι- miR-196a) vs (56.07 ± 7.93)% (αντι-miR-NC) (

P

& lt? 0,05), ενώ δεν υπήρχε στατιστική σημαντικότητα στην G

0 /G

1between αντι ομάδα -miR-196α και αντι-miR-NC ομάδα στις 24 ώρες (

P

= 0,825) και 48 ώρες (

P

= 0,785) (Σχήμα 3Α, το Σχήμα 3Β). Επιπλέον, ανιχνεύσαμε την έκφραση της κυκλίνης D1 και CDK4 /6 πρωτεΐνη. Ήταν ενδιαφέρον το γεγονός ότι μειώθηκε εκφράσεις της κυκλίνης D1 και CDK4 /6 παρατηρήθηκαν μετά την φίμωση miR-196a (Σχήμα 3C). Εν τω μεταξύ, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ της απόπτωσης Blank, miR-NC και ομάδα αντι-miR-196a σε PANC-1 κύτταρα (Σχήμα 3D). Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι knockdown του miR-196α καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, εν μέρει λόγω της G

0 /G

1 σύλληψης με Κυκλίνη D1 και CDK4 /6 η έκφραση μειώθηκε, αλλά δεν συνδέεται με την επαγωγή της απόπτωσης .

(Α) Εκπρόσωπος ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του κυτταρικού κύκλου σε PANC-1 με και απόσυρση φίμωσης miR-196a σε 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες. (Β) Σύγκριση του κυτταρικού κύκλου μεταξύ των αντι-miR-196a, αντι-miR-NC και Λευκά. Το ποσοστό των κυττάρων σε G

0 /G

1 φάση σε 72 ώρες αυξήθηκε από (56.07 ± 7.93)% (αντι-miR-NC) έως (67.20 ± 3.12)% (αντι-miR-196a) (*,

P

& lt? 0,05), ενώ δεν υπήρχε στατιστική σημαντικότητα στην G

0 /G

1between αντι-miR-196a ομάδα και αντι-miR-NC ομάδα στις 24 ώρες και 48 h. (C) Ανάλυση Αντιπροσωπευτικά western blot έδειξε προς τα κάτω ρύθμιση της κυκλίνης D1 και /6 η έκφραση CDK4 μετά καταστολή του miR-196a σε κύτταρα PANC-1 σε 72 h. (D) Σύγκριση της απόπτωσης μεταξύ των αντι-miR-196a, αντι-miR-NC και Λευκά.

Η

Ελάττωση του miR-196a καταστέλλει PANC-1 κυτταρική μετανάστευση

Για να διερευνήσουν κατά πόσον miR-196a είχε επιπτώσεις για τη διευκόλυνση του παγκρέατος μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, εκτελέσαμε ανάλυση Transwell με χρήση κυττάρων PANC-1. PANC-1 κύτταρο επιλέχθηκε λόγω της υπερέκφρασης του miR-196a και απομίμηση παγκρεατικού βιολογία του καρκίνου καλύτερα από άλλες κυτταρικές σειρές, ιδιαίτερα σε ανάλυση μετανάστευσης κυττάρων [28]. Transwell δοκιμασία αποκάλυψε ότι η ικανότητα μετανάστευση κυττάρων PANC-1 ήταν σημαντικά μειωμένη από κάτω ρύθμιση των miR-196α, περίπου 28% σε σύγκριση με το μάρτυρα (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 4Α, Εικόνα 4Β). Εν τω μεταξύ, έχουμε αναρωτηθεί αν μεσεγχυματικά-επιθηλιακά μετάβασης (ΚΟΑ) συνέβαλε στην καταστολή της PANC-1 κυτταρική μετανάστευση μετά την φίμωση miR-196a, παρατηρήσαμε για πρώτη φορά την μορφολογία του PANC-1 πριν και μετά την επιμόλυνση με αντι-miR-196a. Για το ενδιαφέρον μας, η μορφολογία των κυττάρων άλλαξε εντυπωσιακά μετά την επιμόλυνση. Στο κενό και αντι-miR-NC ομάδα, μερικά κύτταρα ήταν εν μέρει άξονα σχήμα, ενώ τα κύτταρα αντι-miR-196a ήταν στενά συνδεδεμένη, πολύγωνο κύτταρα με επιθηλιακά φαινότυπο. Εν τω μεταξύ, εντοπίσαμε MET δείκτες (βιμεντίνη και E-cadherin) έκφρασης με ανοσοφθορισμό. Αυξημένη έκφραση της Ε-καδερίνης παρατηρήθηκε μετά την φίμωση miR-196α, με έκφραση του βιμεντίνης μειώθηκε (Σχήμα 4C). Περαιτέρω, εξετάσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης που συνδέεται με την ΚΟΑ. Εντυπωσιακά, με τη μείωση των PANC-1 κυτταρική μετανάστευση μετά την φίμωση miR-196α, αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης παρατηρήθηκε, καθώς και μειωμένη έκφραση του Ν-καντερίνης και βιμεντίνης (Εικόνα 4D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-196a συμβάλλει πράγματι στην μεταναστευτικό φαινότυπο των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος, εν μέρει μέσω της ΚΟΑ.

(Α) δοκιμασία Εκπρόσωπος φρεατίων έδειξαν ότι η ικανότητα μετανάστευσης των κυττάρων PANC-1 ήταν σημαντικά μειωμένη από κατάντη ρύθμιση του miR-196a. (Β) Σύγκριση των διαμεμβρανικών κυττάρων μεταξύ αντι-miR-196α, αντι-miR-NC και Blank (*,

P

& lt? 0,05). (C) Μορφολογικές αλλαγές και χρώση ανοσοφθορισμού της MET δεικτών μεταξύ των αντι-miR-196a, αντι-miR-NC και κενό. (Δ) Ανάλυση Εκπρόσωπος western blot αποκάλυψε ότι μεσεγχυματικά-επιθηλιακά μετάβαση συνέβαλαν στην καταστολή της PANC-1 κυτταρική μετανάστευση μετά την φίμωση miR-196a. Μετά φίμωση miR-196α, η αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης, καθώς επίσης και την έκφραση του Ν-καδερίνης και βιμεντίνης μειώθηκε.

Η

NFKBIA είναι ένας στόχος του miR-196a σε καρκίνο του παγκρέατος

Στη συνέχεια διερευνήθηκε τους μοριακούς μηχανισμούς μέσω των οποίων miR-196a ρυθμίζει το μεταναστευτικό φαινότυπο. Οι πιθανές γονιδίων στόχων miR-196a με ανάλυση της βάσης δεδομένων συνοψίζονται στον Πίνακα S1. Σε απευθείας σύνδεση αναζήτηση για miR-196a στόχευση γονιδίων από TargetScan, Miranda και PicTar αποκάλυψε ότι NFKBIA, ένα πρωτο-ογκογονίδιο που σχετίζονται με τη μετανάστευση και την εισβολή, θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός στόχος της miR196a (Εικόνα 5Α). Είμαστε δίπλα καθοριστεί αν η έκφραση NFKBIA αρνητικά που συνδέονται με το επίπεδο miR-196a σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές. Όπως αποδεικνύεται στο Σχήμα 1, η έκφραση του miR-196a ήταν η υψηλότερη στα κύτταρα PANC-1, και το χαμηλότερο στην BxPC-3 κύτταρα. Έτσι, επιλέξαμε τις δύο κυτταρικές σειρές για περαιτέρω έκφραση της πρωτεΐνης NFKBIA. Για το ενδιαφέρον μας, η έκφραση της πρωτεΐνης NFKBIA ήταν υψηλότερη σε BxPC-3 κύτταρα από ότι στα κύτταρα PANC-1. Επιπλέον, NFKBIA αυξήθηκε μετά τα κάτω ρύθμιση του miR-196a σε κύτταρα PANC-1, και μειώθηκαν μετά τα πάνω ρύθμιση του miR-196a σε BxPC-3 κύτταρα (Σχήμα 5Β). Για να διαπιστωθεί άμεση αλληλεπίδραση miRNA-στόχο, έχουμε δημιουργήσει μια δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C, η δραστηριότητα της λουσιφεράσης σε κύτταρα PANC-1 ήταν μειωμένη με WT κατασκεύασμα με ρύθμιση προς τα κάτω του επιπέδου miR-196α, το οποίο θα μπορούσε εν μέρει να αποκατασταθεί με μεταλλαγμένο κατασκευάσματα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι 3’UTR του NFKBIA είναι ένας άμεσος στόχος του miR-196a.

(Α) NFKBIA είναι ένα δυναμικό γονίδιο στόχο του miR-196a προβλέπεται από υπολογιστική ανάλυση. (Β) ανάλυση Αντιπροσωπευτικά western blot έδειξε την σχέση μεταξύ της έκφρασης miR-196a και ενδογενές επίπεδο πρωτεΐνης NFKBIA. Η αναστολή του miR-196a σε PANC-1 κύτταρα αυξημένο ενδογενές επίπεδο πρωτεΐνης NFKBIA, ενώ η υπερέκφραση του miR-196a σε BxPC-3 κύτταρα εξασθενημένα ενδογενή επίπεδα πρωτεΐνης NFKBIA. (Γ) Παρεμβολή αλληλουχιών στόχου NFKBIA3’UTR σε ένα φορέα μολυβδούχο αναφοράς λουσιφεράσης σε μειωμένη δραστικότητα λουσιφεράσης σε παρουσία miR-196a σε κύτταρα PANC-1 24 ώρες μετά την ταυτόχρονη διαμόλυνση. Ιστογράμματα έδειξαν οι αξίες που προκύπτουν ως μέσος όρος ± SD από τρεις ανεξάρτητες συν-επιμολύνσεις (*,

P

& lt? 0,05).

Η

κατασιγάσει NFKBIA προάγει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των PANC-1 κύτταρα

Για να προσδιορίσετε περαιτέρω τον βιολογικό ρόλο των NFKBIA στον καρκίνο του παγκρέατος, ερευνήσαμε την επίδραση της στοχευμένη εξουδετέρωση των NFKBIA στα κύτταρα PANC-1. Εν τω μεταξύ, όπως αποδεικνύεται πριν, NFKBIA είναι ένας στόχος του miR-196α, προκειμένου να καταργήσει την επίδραση των αντι-miR-196a, είμαστε συν-επιμολυσμένα siNFKBIA και αντι-miR-196a στα κύτταρα PANC-1. Πραγματοποιήσαμε WST-8 δοκιμασία για την ανίχνευση της πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Αποκαλύφθηκε ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα PANC-1 επιμολυσμένα με SI-NFKBIA στις 72 ώρες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου του SI-NC (

P

& lt? 0,05), εν τω μεταξύ, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα PANC-1 επιμολυσμένα με SI-NFKBIA + αντι-miR-196α σε 72 ώρες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου του si-NC + αντι-NC (

P

& lt? 0,05). Υπήρχε καμία στατιστική σημαντικότητα μεταξύ si-NFKBIA και si-NFKBIA + αντι-miR-196a (

P

& gt? 0,05) (Σχήμα 6Α). Όπως φαίνεται και πριν, οι εκφράσεις της κυκλίνης D1 και CDK4 /6 μειώθηκε μετά την φίμωση miR-196a. Ερευνήσαμε περαιτέρω τις πρωτεΐνες εκφράσεις της κυκλίνης D1 και CDK4 /6 μετά την φίμωση NFKBIA. Για το ενδιαφέρον μας, η αυξημένη έκφραση της κυκλίνης D1 και CDK4 /6 παρατηρήθηκαν μετά την φίμωση NFKBIA (Εικόνα 6Β). Στη συνέχεια, μεταξύ φρεατίων δοκιμασία πρότειναν αναστολή των NFKBIA προωθείται κυττάρων μετανάστευσης. Επιπλέον, διπλή αναστολή των NFKBIA και miR-196α προωθείται κύτταρα μετανάστευση (Σχήμα 6C, 6D Σχήμα), η οποία συνεπάγεται ότι η αναστολή της NFKBIA μπλοκάρει την επίδραση των αντι-miR-196α για τη μετανάστευση των κυττάρων. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η αναστολή της NFKBIA προωθεί παγκρέατος προώθηση των καρκινικών κυττάρων και τη μετανάστευση.

(Α) καμπύλη ανάπτυξης μεταξύ των si-NFKBIA, si-NFKBIA + αντι-miR-196a και κατάλληλους ελέγχους τους. WST-8 δοκιμασία έδειξαν αναστολή του NFKBIA ενισχυμένης PANC-1 κύτταρα πολλαπλασιασμού (*,

P

& lt? 0,05). Εν τω μεταξύ, διπλή αναστολή των NFKBIA και miR-196a προώθησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. (Β) ανάλυση Αντιπροσωπευτικά western blot έδειξε προς τα πάνω ρύθμιση της Κυκλίνης D1 και /6 η έκφραση CDK4 μετά καταστολή NFKBIA σε κύτταρα PANC-1 σε 72 h. (Γ) αντιπροσωπευτική δοκιμασία transwell έδειξε ότι η ικανότητα μετανάστευση κυττάρων PANC-1 ήταν σημαντικά εξασθενημένος από ρύθμιση προς τα κάτω του NFKBIA. Επιπλέον, η αναστολή της NFKBIA μπλοκάρει την επίδραση των αντι-miR-196α για τη μετανάστευση των κυττάρων. (Δ) Η σύγκριση των διαμεμβρανικών κυττάρων μεταξύ των si-NFKBIA, si-NC, si-NFKBIA + αντι-miR-196a, και si-NC + αντι-miR-NC (*,

P

& lt? 0,05) .

η

Συζήτηση

microRNA profiling μελέτες υποδεικνύουν ότι miR-196α υπερεκφράζεται σε διάφορους καρκίνους, όπως ο καρκίνος του μαστού [29], ορθοκολικό καρκίνο [30], γαστρικό καρκίνο [ ,,,0],31], και του καρκίνου του παγκρέατος [6], [7]. Είναι ενδιαφέρον, ένας αυξανόμενος αριθμός εκθέσεις δείχνουν ότι το miR-196a παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου. Η υπερέκφραση του miR-196a συνδέεται με το βαθμό υψηλού κινδύνου, μετάσταση και φτωχή επιβίωση μεταξύ των γαστρεντερικών στρωματικών όγκων [32]. MiR-196α έχει βρεθεί ότι προάγει πολλαπλασιασμό και την εισβολή του μη-μικροκυτταρικού καρκίνου καρκίνο του πνεύμονα, υποδεικνύοντας σημαντικό βιολογικό ρόλο του στην πρόοδο του όγκου [33]. Έχει αναφερθεί ότι miR-196α ταυτίζεται με αυξημένη έκφραση να διαφοροποιήσει σωστά καρκίνου του παγκρέατος από καλοήθεις παγκρεατικό ιστό, και υψηλή έκφραση του miR-196α βρίσκεται να προβλέψει κακή επιβίωση [6]. Εν τω μεταξύ, Έχει αναφερθεί ότι τα επίπεδα έκφρασης του ορού miR-196a σε ανεγχείρητο καρκίνο του παγκρέατος (στάδια ΙΙΙ και IV) ασθενείς είναι σημαντικά υψηλότερες από εκείνες στο χειρουργήσιμη (στάδια Ι και ΙΙ) ασθενών [7]. Επιπλέον, το επίπεδο miR-196α έκφραση ορός βρέθηκε να έχει δυνητική αξία στην πρόβλεψη μέσου χρόνου επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος. Στην έρευνά μας, διευκρινίσθηκε ότι το miR-196a ήταν υπερ-εκφράζεται σε καρκίνο του παγκρέατος και up-ρύθμιση του συνδέθηκε σημαντικά με το δυναμικό της μετανάστευσης, η οποία μπορεί να προάγει παγκρέατος εξέλιξη του καρκίνου και να οδηγήσει σε κακή πρόγνωση. EMT πιστεύεται ότι είναι ένα ουσιαστικό βήμα για την εισβολή καρκίνου και μετάσταση [34], [35]. Με μειωμένη πιθανότητα μετανάστευσης μετά την φίμωση miR-196α, αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης και μειωμένη έκφραση του Ν-καδερίνης και βιμεντίνης παρατηρήθηκαν, το οποίο σήμαινε ότι μεσεγχυματικά-επιθηλιακά μετάβαση συνέβαλαν στην καταστολή της PANC-1 κυτταρική μετανάστευση μετά την φίμωση miR-196a. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι το miR-196a προωθείται πολλαπλασιασμό του καρκίνου του παγκρέατος μέσω G

0 /G

1 σύλληψης και μειωμένη έκφραση κυκλίνης D1 και CDK4 /6 έκφραση αλλά όχι απόπτωση.

Επίσης, διερευνήθηκε η μοριακός μηχανισμός του miR-196a σε παγκρεατικά ογκογένεση του καρκίνου. Οι αναδυόμενες αποδείξεις υποδηλώνουν ότι miR-196α συμβάλλει στην παθογένεση του όγκου μέσω στόχευσης συγκεκριμένων γονιδίων [36] – [39]. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι το miR-196a συνέβαλαν στην πολλαπλασιαστική και μεταναστευτική δυναμικό του καρκίνου του παγκρέατος, η οποία προώθησε την έρευνα μας για γονιδίων στόχων που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση. Πυρηνικός παράγοντας-κάπα Β (ΝΡ-κΒ), ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της φλεγμονώδους απόκρισης, ενεργοποιείται συχνά σε όγκους και μπορεί να παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη διασύνδεση φλεγμονή στην ανάπτυξη των όγκων και την εξέλιξη [40]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η καταστολή NF-κΒ στον καρκίνο αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου, γεγονός που υποδηλώνει ότι το ΝΡ-κΒ μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.