Αφηρημένο

Μειωμένη ευαισθησία του καρκίνου του προστάτη (PC) κύτταρα σε ακτινοθεραπεία αποτελεί μια σημαντική πρόκληση στην η κλινική. Η ενεργοποίηση του υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), τύπου 1 που μοιάζει με ινσουλίνη υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα (IGF1R), και στιχομυθία μεταξύ των δύο αυτών οδών σηματοδότησης έχουν ενοχοποιηθεί για την ανάπτυξη της αντίστασης ακτινοβολίας σε PC. Αυτή η μελέτη αξιολόγησε τις επιπτώσεις της στόχευσης των δύο υποδοχέων για τη ρύθμιση των ραδιο-ευαισθησίας στα κύτταρα PC. Ειδικοί αναστολείς του EGFR και IGF1R, Η erlotinib και AG1024, καθώς και siRNA που στοχεύει EGFR και IGF1R, χρησιμοποιήθηκαν για ραδιο-ευαισθητοποιούν κύτταρα PC. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι συν-αναστέλλοντας σημαντικά αμφότερους τους υποδοχείς διαβρέχεται κυτταρική ανάπτυξη και την επισκευή βλάβης του DNA, και η αυξημένη ραδιο-ευαισθησία στα κύτταρα PC. Οι επιδράσεις αυτές πραγματοποιούνται μέσω συνεργική αναστολή του ομόλογου ανασυνδυασμού κατευθυνόμενης επιδιόρθωσης του DNA (HRR), αλλά όχι μέσω αναστολής της μη ομόλογου άκρου σύνδεσης (NHEJ). Επιπλέον, η ικανότητα κίνδυνο HRR προκλήθηκε από μειωμένη φωσφορυλίωση του υποστρώματος υποδοχέα ινσουλίνης 1 (IRS1) και μετέπειτα η αλληλεπίδρασή της με Rad51. Η συνεργική δράση των αναστολέων EGFR και IGF1R επιβεβαιώθηκε επίσης σε δοκιμασία γυμνό ξενομοσχεύματος ποντικού. Αυτή είναι η πρώτη δοκιμή μελέτη συν-αναστολή EGFR και IGF1R σηματοδότησης στο πλαίσιο της ραδιο-ευαισθησίας στον υπολογιστή και μπορεί να παρέχει μια πολλά υποσχόμενη επικουρική θεραπευτική προσέγγιση για τη βελτίωση της έκβασης των ασθενών PC σε θεραπεία ακτινοβολίας

Αιτιολογική αναφορά.: Wang Υ, Yuan JL, Zhang ΥΤ, Ma JJ, Xu P, Shi CH, et al. (2013) Αναστολή των δύο EGFR και κύτταρα IGF1R ευαισθητοποιημένων του καρκίνου του προστάτη σε ακτινοβολία από Synergistic καταστολή του DNA ομόλογο ανασυνδυασμό επισκευής. PLoS ONE 8 (8): e68784. doi: 10.1371 /journal.pone.0068784

Επιμέλεια: Λουκία R. Languino, Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21η Δεκεμβρίου 2012? Δεκτές: 2, Ιουν, 2013? Δημοσιεύθηκε: 12 Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδοτείται από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30100185, Αρ 81250036, Αρ 30973000, Αρ 30872583, Αρ 81072116) και το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Shaan’xi (2009JQ4003). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PC) είναι η πιο συχνή κακοήθεια και η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους μεταξύ αρρένων ασθενών [1]. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου, η αρχική ανάπτυξη των κυττάρων PC είναι ανδρογονο-εξαρτώμενη, και αυτά τα κύτταρα υφίστανται απόπτωση μετά ανδρογόνου εξάντληση. Κατά συνέπεια, ανδρογόνων θεωρήθηκε η τυπική θεραπεία για PC για πάνω από 50 χρόνια [2]. Πολλοί ασθενείς ανέπτυξαν τελικά μια ορμόνη-νόσο ανθεκτική λόγω της αύξησης του ανδρογόνα πυρίμαχων καρκινικά κύτταρα, η οποία οδηγεί σε αποτυχία της θεραπείας ανδρογόνων κατάλυσης και αφήνει τους ασθενείς με λιγότερες θεραπευτικές επιλογές [3], [4]. Συνδυασμός των οριστικών τοπικών θεραπειών, όπως ριζική προστατεκτομή μαζί με ανοσοενισχυτικό ακτινοθεραπεία, έχει αποδειχθεί ότι βελτιώνουν την επιβίωση των ασθενών με PC [5], [6]. Ωστόσο, τέτοια θεραπεία αμφισβητείται από την εμφάνιση της ανθεκτικότητας στα καρκινικά κύτταρα. Είναι, ως εκ τούτου, υψίστης σημασίας για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών για να ξεπεραστούν ραδιοαντοχή και τη βελτίωση της ραδιο-ευαισθησίας με τη στόχευση μοριακών μηχανημάτων στα κύτταρα PC ανεξάρτητου από ανδρογόνο.

υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και ινσουλινοειδής αυξητικός υποδοχέα παράγοντα (IGF1R), δύο σημαντικότερες υποδοχείς κινάσης τυροσίνης, παίζουν κρίσιμους ρόλους στην ανάπτυξη και την πρόοδο του καρκίνου μέσω της ρύθμισης στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, εισβολή, αγγειογένεση, ανοσία καρκίνου και αντίσταση σε χημειοθεραπεία ή /και ακτινοθεραπεία [7]. Αυτοί οι δύο υποδοχείς έχουν συχνά υπερεκφράζεται σε μία ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων PC [8], [9], [10], και ως εκ τούτου θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως υποψήφιοι για στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου. Πράγματι, οι αναστολείς του EGFR και ενός άλλου μέλους της οικογένειας του EGFR Her2, συμπεριλαμβανομένης Η erlotinib, λαπατινίμπη, το cetuximab και Gefitinib, είναι οι πιο επιτυχημένες επιλογές στην τρέχουσα κλινική θεραπεία διαφόρων καρκίνων του ανθρώπου, όπως ήταν αναμενόμενο, ωστόσο, η ανάπτυξη του

de novo

αντίσταση έχει παρατηρηθεί σε κλινική μετά από μακροχρόνια χρήση αυτών των φαρμάκων, γεγονός που υποδηλώνει την ύπαρξη μηχανισμών παράκαμψης εντός κυττάρων όγκου [11]. Μηχανιστικές μελέτες σχετικά με τις κυτταρική και μοριακή συμβάντα αποκάλυψε ότι εκτεταμένη αλληλοπαρεμβολές μεταξύ EGFR και σηματοδότηση IGF1R λαμβάνει χώρα σε πολλαπλά επίπεδα, και ότι μπλοκάρισμα του σηματοδότηση EGFR οδηγεί σε αυξημένες αποκρίσεις προς το συνδετήρα IGF1R, IGF [12], [13]. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η στόχευση τους δύο υποδοχείς συγχρόνως θα μπορούσε να παρέχει καλύτερη αποτελεσματικότητα στη θεραπεία του καρκίνου και ξεπεράσει την αντίσταση του όγκου σε ένα άτομο αναστολέα, ενώ η βελτίωση της ευαισθησίας των μεμονωμένων αναστολέων στη θεραπεία του καρκίνου. Σταθερά, μελέτες έχουν δείξει ότι η διπλή στόχευση των δύο υποδοχέων μπλοκ αμοιβαία υπερφωσφορυλίωση τους, αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και επάγει την απόπτωση σε πολλαπλά καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων PC και του παχέος εντέρου [14], [15].

Σε αυτή τη μελέτη, αξιολόγησε τα αποτελέσματα της στόχευσης τόσο EGFR και σηματοδότηση IGF1R στις απαντήσεις των κυττάρων PC σε γ-ακτινοβολία. Τα δεδομένα μας έδειξαν την ισχύ του στόχευσης και τις δύο οδούς στη ρύθμιση των συμπεριφορών των κυττάρων PC εξής ακτινοθεραπεία και αποκάλυψε τις υποκείμενες μηχανισμούς. Αυτό είναι ένα σπερματικό μελέτη που δικαιολογεί περαιτέρω τη συνδυαστική χρήση των αναστολέων για EGFR και μονοπάτια IGF1R στη θεραπεία του PC.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπεία

Η ανθρώπινο ανεξάρτητου από ανδρογόνα PC κυττάρων DU145, PC3, ARCaP

Ε και ARCaP

Μ και της ανθρώπινης φυσιολογικό επιθήλιο προστάτη κυτταρική γραμμή PrEC αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Το R503 ήταν από το Πειραματικό Κέντρο Ζώων του τέταρτου Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, όπως τον έλεγχο του οχήματος), 10 μΜ Η erlotinib (inhbibitor EGFR, Eton Bioscience, San Diego, CA) και /ή 10 μΜ AG1024 (αναστολέας IGF1R, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) (ως πειραματικές ομάδες) για 1 ώρα. Τα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν όπως περιγράφεται από τους Liu et al [16]. Σε μερικά πειράματα, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν επίσης με IRS1 ή μη φίμωση ελέγχου (NSC) siRNAs (50 ηΜ, Invitrogen, Σαγκάη, Κίνα) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Για να διαπιστωθεί ακτινοβολία ανεκτική υποσειρές, τα κύτταρα PC ακτινοβολούνται σε 2 Gy την ημέρα, 5 ημέρες την εβδομάδα σε FCC-8000C

60Co ακτινοβολίας. Μετά από έξι μήνες, ιδρύθηκαν και ονομάστηκε DU145-IIRR οι sublines των DU145 που επέζησαν ιονισμένο ακτινοβολία. Αυτές οι υποσειρές στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε φαρμακευτική αγωγή και περαιτέρω πειράματα.

Κλωνογόνος

δοκιμασία

Η συνεργιστική σχηματισμό αποικιών μετά την συνδυασμένη αγωγή με αναστολείς του EGFR και IGF1 και ακτινοβόληση ερευνήθηκε από μονοστιβάδα κλωνογόνων δοκιμασίες. Τα κύτταρα άνευ ορού όλη τη νύκτα. Πέντε χιλιάδες κύτταρα σπάρθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας ιστού 10-cm διαμέτρου με μέσο των 10 mL. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AG1024 ή Erlotinib για 1 ώρα και ακτινοβολήθηκε στην υποδεικνυόμενη δόση αφού είχαν προσκολληθεί στα πιάτα. σχηματισμός αποικίας προσδιορίστηκε με χρώση κρυσταλλικού ιώδους με τη χρήση ενός μετρητή σωματιδίων Coulter την ημέρα 10 μετά των κυττάρων σπορά. κλάσμα επιβίωσης ορίστηκε ως η αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης των κατεργασμένων κυττάρων διαιρούμενη με εκείνη των κυττάρων ελέγχου. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας

Για την ανάλυση των κυττάρων απόπτωσης, τα κύτταρα (1 χ 10

4 /φρεάτιο) καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα στερήθηκαν ορού για 24 ώρες, και στη συνέχεια θεραπεία είτε με AG1024 ή Erlotinib για 1 ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια ακτινοβολήθηκαν σε δοσολογία 2 Gy. Σε 4 ώρες μετά την ακτινοβόληση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, μονιμοποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη στους 4 ° C για 2 ώρες και πλύθηκαν σε 5 mL του PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με 1 mL ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) διάλυμα (0,2 mg του RNAse Α, 0.02 mg ΡΙ, και 1 mL Triton Χ-100). Η περιεκτικότητα σε DNA σε διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με τη ροή FACS κυτταρόμετρο (BD Biosciences, San Jose, CA). Για την ανίχνευση αποπτωτικών ρυθμό σε επεξεργασμένα κύτταρα, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Annexin V και ΡΙ, και στη συνέχεια υποβάλλεται σε κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφεται [16]. Οι αννεξίνης V-θετικά και ΡΙ-αρνητικά κύτταρα που υποβάλλονται σε πρώιμη απόπτωση μετρήθηκαν ως αποπτωτικά κύτταρα. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις διπλούν και τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

εκχύλιση πρωτεϊνών και κηλίδωση Western

Διαφορετικές ομάδες κύτταρα λύθηκαν με 1% SDS ρυθμιστικού λύσης (Beyotime Inc., Πεκίνο, Κίνα). Για την εκχύλιση των πυρηνικών πρωτεϊνών, τα κύτταρα πλύθηκαν με υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Teknova, Beijing, Κίνα), και dounced στο κύτταρο douncer (Wheaton Ltd, Millville, NJ). Οι πυρηνικές συστατικά στη συνέχεια διαχωρίστηκαν από εκχυλίσματα κυτταρολύματος με φυγοκέντριση, που ακολουθείται από λύση σε ρυθμιστικό RIPA (Pierce Inc., Beijing, Κίνα).

Ανοσοκαταβύθιση και δοκιμασία Western-κηλίδος διεξήχθησαν όπως περιγράφεται από τους Liu et al [17 ]. Τα ακόλουθα αντισώματα ήταν από τη Cell Signaling: anti-γH2AX, αντι-IRS1, αντι-φωσφο IRS1 (pY612), αντι-IGF1R, αντι-φωσφο IGF1R, αντι-ΕΟΡΚ, αντι-φωσφο EGFR (Y1068), αντι-β-τουμπουλίνης , αντι-ΕΚΚ, αντι-φωσφο-ΕΚΚ, αντι-ΑΚΤ, αντι-φωσφο ΑΚΤ (S473), αντι-DNA-ΡΚ, αντι-Κυ70, αντι-Κυ80, και αντι-XRCC4. Το αντίσωμα αντι-Lamin ήταν από Abnova (Σανγκάη, Κίνα). Η αντι-HP-1α αντίσωμα ήταν από την Millipore (Σανγκάη, Κίνα). β-τουμπουλίνης, Lamin και HP-1α χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες φόρτωσης.

ανοσοφθορισμού

Ο σχηματισμός εστιών γH2AX και Rad51 ερευνήθηκε σύμφωνα με Barber et al [18]. Για χρώση ανοσοφθορισμού γH2AX και Rad51, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 1% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου που ακολουθείται από 70% αιθανόλη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση με PBS που περιέχει 0.1% Triton για 10 λεπτά, τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά με 0,5% Triton σε PBS για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από τρεις πλύσεις σε PBS, τα κύτταρα δεσμεύτηκαν με αλβουμίνη 5% βόειου ορού (BSA) σε PBS για 60 λεπτά. Στη συνέχεια, αντι-γH2AX (Trevigen, Gaithersburg, MD, 1:2000) ή αντι-Rad51 αντίσωμα (Oncogene έρευνα, 1:300) προστέθηκε σε 5% BSA σε PBS και επωάστηκαν με τα κύτταρα στους 4 ° C όλη τη νύκτα με ήπια ανάδευση. Μετά από τέσσερις εκπλύσεις σε PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν στο σκοτάδι με ένα FITC-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα σε 5% BSA σε αραίωση 1:2000 για γH2AX και 1:200 για αντι-Rad51 ανίχνευσης για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από τέσσερις επιπλέον εκπλύσεις σε PBS, οι πυρήνες χρωματίστηκαν στο σκοτάδι με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) (1 μg /mL, Invitrogen) σε PBS για 5 λεπτά, και καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν με Fluoromount G ( Southern Biotech., Birmingham, AL). Διαφάνειες εξετάστηκαν σε ένα μικροσκόπιο φθορισμού Leica, με εικόνες που συλλαμβάνονται από μια κάμερα CCD και εισάγονται στο λογισμικό ανάλυσης εικόνας για προχωρημένους SPOT (SPOT Imaging Solutions, Sterling Heights, MI). Για κάθε κατάσταση θεραπείας, τα σήματα γH2AX ή Rad51 προσδιορίστηκαν σε τουλάχιστον 50 κύτταρα. Όλες οι παρατηρήσεις επικυρωθεί από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Αναλύσεις για HR-κατευθυνόμενη επιδιόρθωσης του DNA (HRR) και το μη-ομόλογο τέλος ενώνει (NHEJ)

Η ποσοτική

in vitro

ομόλογος ανασυνδυασμός (HR) δοκιμασία διεξήχθη χρησιμοποιώντας το σύστημα ανασυνδυασμού ρεπόρτερ PDR-GFP [19]. Εν συντομία, το πλασμίδιο PDR-GFP που εκφράζει δύο μη λειτουργικά γονίδια GFP επιμολύνθηκε σταθερά σε κύτταρα DU145. Ένα δεύτερο πλασμίδιο που κωδικοποιεί το ένζυμο περιορισμού Ι Sce-Ι και ένα τρίτο πλασμίδιο που εκφράζει κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (RFP) με μία μιτοχονδριακή σήμα εντοπισμού για να δείξει την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης επιμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα DU145 που περιέχουν το πλασμίδιο PDR-GFP. Όταν εκφράστηκε I-δοβΙ, παρήγαγε DNA δίκλωνα σπασίματα (DSBs) εντός του θραύσματος SceGFP και διεγείρονται HRR να αποκατασταθεί ανέπαφο γονίδιο GFP. επιδιόρθωσης του DNA με HRR αξιολογήθηκε με μέτρηση των κυττάρων με αμφότερα σήμα πυρηνικής GFP και μιτοχονδριακή σήμα RFP εναντίον όλων θετικώς επιμολυσμένων κυττάρων, δηλαδή, αναλογία των κυττάρων με δύο κόκκινα και πράσινα σήματα σε αυτούς με μόνο το κόκκινο σήματα.

Η δοκιμασία NHEJ ελεύθερο κυττάρων πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20] με πυρηνικά εκχυλίσματα από 1 × 10

7 DU145 κύτταρα.

In vivo

όγκου ακτινοθεραπεία

Τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από το Ethnic Επιτροπή της τέταρτης Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Xi’an, Κίνα). 5 × 10

6 DU145 κύτταρα προ-αναμιγνύονται με Matrigel (BD Biosciences) για υποδόρια ένεση στο πλευρό του 10-εβδομάδων θηλυκών γυμνών ποντικών. Είκοσι δύο ημέρες αργότερα (Ημέρα 0), τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 5 ομάδες, 5 ποντικοί ανά ομάδα, με βάση τις θεραπείες που θα λαμβάνουν: δηλαδή, ομάδα ελέγχου δεν έλαβε αγωγές? ομάδα IR έλαβε γ-ακτινοβολία διαφορετικών δόσεων τις ημέρες 3, 6, 8, και 10, αντίστοιχα? ομάδα IR + Η erlotinib έλαβαν γ-ακτινοβολία όπως η ακτινοβολία ομάδα, συν 100 mg /kg /d του στόματος Η erlotinib για 10 ημέρες? ομάδα IR + AG1024 έλαβαν γ-ακτινοβολία, plus100 mg /kg /d του στόματος AG1024 για 10 ημέρες? IR + AG1024 και Erlotinib έλαβαν γ-ακτινοβολία, συν 100 mg /kg /d και τα δύο φάρμακα για 10 ημέρες. Ο όγκος του όγκου (V) παρακολουθήθηκε κάθε τρεις ημέρες για επτά εβδομάδες με μέτρηση του μήκους (L) και το πλάτος (W), και υπολογίζεται ως V = 0,5 χ L χ W

2. Το αποτέλεσμα εκφράζεται ως δείκτης πολλαπλασιασμού (ΡΙ, ΡΙ = θεραπεία V /ελέγχου V).

Η στατιστική ανάλυση

Η επίδραση της erlotinib και AG1024 στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την ανάπτυξη ξενομοσχεύματος, κλωνογονική επιβίωση και την ενεργοποίηση της κασπάσης αναλύθηκε στατιστικά χρησιμοποιώντας το

t

δοκιμή ενός αταίριαστο two-tailed του Student. Όλα τα ποσοτικά στοιχεία που παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα για

in vitro

πειράματα ή από όλα τα ζώα εντός του ομίλου για το

in vivo πειράματα

. P αξία των ≤0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. * Και ** σημάνθηκε για την P & lt? 0,05 και Ρ & lt?. 0.01 αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου σε όλα τα σχήματα

Αποτελέσματα

Μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων του όγκου και την επαγωγή απόπτωσης με στόχευση του EGFR και /ή IGF1R πριν από τη θεραπεία ακτινοβολίας

στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε για πρώτη φορά την επαγόμενη από την ευαισθησία των διαφόρων καρκινικών κυττάρων στην ακτινοβολία

in vitro

. Μεγαλώσαμε και αντιμετωπίζονται διαφορετικά καρκινικές κυτταρικές γραμμές με erlotinib (10 μΜ) και /ή AG1024 (10 μΜ) για 1 ώρα και στη συνέχεια τους ακτινοβολήθηκε με 2 Gy. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η βιωσιμότητα των κυττάρων του όγκου ήταν σημαντικά μειωμένη και των καρκινικών κυττάρων απόπτωση ενισχύεται με ακτινοβολία μετά την αναστολή των δύο EGFR και IGF1R, σε σύγκριση με τη θεραπεία ακτινοβόλησης από μόνη ή ακτινοβολία συν μπλοκάρισμα είτε υποδοχέα (Σχήμα 1Α, Β). Ειδικότερα, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα, είτε AG1024 ή Erlotinib μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα καρκινικών κυττάρων σε επιθηλιακών κυττάρων PC γραμμές (Ρ & lt? 0,05), αλλά το πιο ισχυρή ανασταλτική της ανάπτυξης δράση με ακτινοβόληση επιτεύχθηκε με ταυτόχρονη εφαρμογή και των δύο αναστολέων (Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με AG1024 ή η erlotinib θεραπεία σε DU145, PC3 και ARCaP

Ε κύτταρα) (Σχήμα 1Α). Σε αντίθεση, AG1024 ή /και Η erlotinib δεν μπορούσε ράδιο-ευαισθητοποιεί φυσιολογικό επιθήλιο προστάτη κυτταρική γραμμή PrEC (Σχήμα 1Α). Τα δεδομένα μας έδειξαν επίσης ότι και στις δύο κύτταρα DU145 και PC3, AG1024 μείωσε σημαντικά την φωσφορυλίωση IGF1R, ενώ Erlotinib ανέστειλε δραματικά την φωσφορυλίωση του EGFR, και ούτε παρουσιάζει διασταυρούμενη δραστικότητα από την άλλη υποδοχέα, υποδεικνύοντας ότι οι δύο αναστολείς λειτουργούν ισχυρά και ειδικά (Σχήμα S1).

Α, ανάλυση Ράδιο-ευαισθησία των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με αναστολείς του EGFR και IGF1R. Τα καρκινικά κύτταρα διαφορετικών ομάδων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς (μάρτυρας) ή με AG1024 (10 μΜ), Η erlotinib (10 μΜ) ή και τα δύο για 1 ώρα και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ραδιο-ευαισθησίας κλωνογονική δοκιμασία. Μετά από 10 ημέρες, οι κλώνοι σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν. κλάσμα επιβίωσης υπολογίστηκε σύμφωνα με τις μετρήσεις αποικιών και ικανότητα επίστρωσης. Β, ανίχνευση ραδιο-ευαισθησία των κυττάρων σε επεξεργασία με EGFR και IGF1R siRNAs. Κύτταρα διαφορετικών ομάδων επιμολύνθηκαν με μη φίμωση ελέγχου siRNA (NSC-siRNA), EGFR και /ή IGF1R siRNA, και στη συνέχεια υποβάλλεται σε ραδιο-ευαισθησίας κλωνογόνο δοκιμασία όπως περιγράφεται στο πάνελ Α C, απόπτωση κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με EGFR και IGF1R αναστολέων. Προστάτη κυτταρικές σειρές καρκίνου προ-αγωγή με AG1024 ή Η erlotinib σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 1 ώρα, και στη συνέχεια ακτινοβολούνται για 2 Gy. Μετά από 4 ώρες, αυτά χρωματίστηκαν με Annexin V και ιωδιούχο προπίδιο για κυτταρομετρία ροής για να προσδιοριστεί το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων. D, η απόπτωση των καρκινικών κυτταρικών γραμμών προστάτη επιμολύνθηκαν με EGFR και /ή IGF1R siRNA. Κύτταρα διαφορετικών ομάδων επιμολύνθηκαν παροδικά με NSC siRNA, IGF1R siRNA ή EGFR siRNA για 24 ώρες, και στη συνέχεια ακτινοβολούνται για 2 Gy. Η απόπτωση αναλύθηκε όπως στο πάνελ C. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

Η

Εκτός επιθηλιακά κύτταρα PC, αξιολογήσαμε επίσης τα αποτελέσματα της στόχευσης τόσο EGFR και IGF1R σηματοδότησης στην απόκριση ραδιοευαισθητοποίησης. μεσεγχυματικών κυττάρων που μοιάζουν υπολογιστή. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε ARCaP

M, το μεσεγχυματικά ομόλογό του ARCaP

E αναπτύχθηκε από τον Graham et al [21]. Και οι δύο γραμμές κύτταρα εμφανίζουν ελάχιστη έκφραση του υποδοχέα ανδρογόνου [22]. Συνεπής με τα προηγούμενα ευρήματα από Buck et al [14], σε συνδυασμό αγωγή με αναστολείς του EGFR και IGF1R δεν μπορούσε συνεργικά αναστέλλουν την κυτταρική ανάπτυξη μεσεγχυματικών σε απόκριση σε ακτινοβολία, όπως έκανε και για τα επιθηλιακά ανάπτυξη (Σχήμα 1Α).

Για να αποφευχθεί οι μη-ειδικές επιδράσεις που σχετίζονται με τις μικρές μοριακές αναστολείς, επαναλάβαμε το πείραμα επίσης στο Σχήμα 1Α χρησιμοποιώντας siRNA ειδικό για EGFR και IGF1R (Σχήμα 1Β). Όπως φαίνεται στο Σχήμα S2, τόσο siRNA εργαστεί αποδοτικά σε χτυπήσει κάτω IGF1R και EGFR, αντίστοιχα. Με μονή ή διπλή εξουδετέρωση του EGFR και /ή IGF1R με siRNA, λάβαμε παρόμοια αποτελέσματα όπως στην Εικόνα 1Α (Εικόνα 1Β).

Στη συνέχεια, θα χαρακτηρίζεται από τις πιθανές αποπτωτικά αποτελέσματα αυτών των δύο αναστολέων που χρησιμοποιούν κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 1Γ, DU145, PC3 και ARCaP

E κύτταρα έδειξαν αυξημένη ραδιο-ευαισθησίας εξής αυξανόμενες δόσεις AG1024 ή /και Η erlotinib, ενώ ARCaP

M ήταν ευαίσθητη μόνο σε AG1024, αλλά όχι να erlotinib. Η συνδυασμένη αγωγή με erlotinib και AG1024 συνεργικά ράδιο-ευαισθητοποίηση των DU145, PC3 και ARCaP

E κύτταρα, αλλά όχι ARCaP

κύτταρα Μ. Κατά τη σύγκριση κύτταρα DU145 σε κύτταρα PC3, βρήκαμε ότι η πρώτη είναι πιο ευαίσθητα στην erlotinib από το δεύτερο, δεδομένου ότι 10 μΜ Η erlotinib προκάλεσε μια ισχυρή αποπτωτική απόκριση πάνω από 1 μΜ erlotinib σε κύτταρα DU145, ενώ παρατηρήθηκε όχι πολύ αύξηση στην απόπτωση σε PC3 κύτταρα με τις ίδιες δοσολογίες της erlotinib. Παρόμοια αποτελέσματα επιτεύχθηκαν και με siRNA που στοχεύει EGFR και /ή IGF1R (Σχήμα 1D).

Ενίσχυση των ραδιο-ευαισθησίας από αναστολείς EGFR και IGF1R μέσω απομείωσης του DNA DSB επισκευή

Για να κατανοήσουμε τη μοριακή μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω ενισχυμένη ραδιο-ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε απόκριση σε AG1024 ή /και θεραπεία η erlotinib, προσδιορίσαμε την ικανότητα του DNA διπλό σκέλος διάλειμμα (DSB) σε DU145 και PC3 κύτταρα, εφόσον DSB εξασκεί την πιο θανατηφόρο επίδραση επί των κυττάρων που προκαλείται από γ -ακτινοβολία. Με την παρακολούθηση του επιπέδου της πρωτεΐνης Η2ΑΧ φωσφορυλίωσης ιστόνης για την C-τερματική σερίνη 139 κατάλοιπο, επίσης γνωστή ως γH2AX, ένα πολύ γνωστό και ευαίσθητος δείκτης DSB, αποδείξαμε ότι υπήρχε μια ταχεία και ισχυρή φωσφορυλίωση του Η2ΑΧ στην 1 ώρα μετά την ακτινοβόληση σε τόσο DU145 υπό αγωγή με όχημα ελέγχου και τα κύτταρα PC3 (Εικόνα 2Α), το οποίο μειώθηκε γρήγορα στις 4 ώρες, και επέστρεψε στο βασικό επίπεδο σε 24 ώρες, πράγμα που συνεπάγεται την ολοκλήρωση της επισκευής DSB. Σε αντίθεση, τα κύτταρα όγκου προ-αγωγή με AG1024, Η erlotinib, ή και τα δύο έδειξαν μία καθυστερημένη κορυφή φωσφορυλίωση Η2ΑΧ σε 4 ωρών, και η συνεχής Η2ΑΧ φωσφορυλίωση έως 24 ώρες μετά την ακτινοβολία, γεγονός που υποδηλώνει δυσλειτουργία επιδιόρθωσης DSB μετά AG1024 και θεραπεία Η erlotinib (Σχήμα 2Α, Β ). Επιπλέον, υπήρχε μια σημαντική διαφορά μεταξύ της ομάδας AG1024 + Η erlotinib και AG1024 ή Η erlotinib ομάδα (5 και 10 Gy, P & lt? 0.01), υποδεικνύοντας μια αθροιστική επίδραση των συν-inhibtion για τη διαδικασία επιδιόρθωσης DSB (Εικόνα 2Β)

Α, χρόνος έκφραση DSB δείκτη γH2AX πορεία μετά την ακτινοβολία: τα κύτταρα στερήθηκαν ορό επί μία νύκτα, έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 μΜ AG1024 ή /και 10 μΜ erlotinib. Western blot-κυττάρων ακτινοβολείται σε δοσολογία 2 Gy, και συλλέχθηκαν στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. πρωτεΐνη ΗΡ-1α χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα δεδομένα στη συνέχεια ποσοτικά με Image J λογισμικό και εκφράζεται ως ποσοστό του μάρτυρα. Β, ανίχνευση ανοσοφθορισμού της γH2AX εστίες σχηματισμού μετά την ακτινοβόληση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς AG1024 ή /και Erlotinib για 1 ώρα, και ακτινοβολούνται σε διαφορετικές δοσολογίες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν μετά από 24 ώρες. Τα ένθετα δείχνουν αντιπροσωπευτικές εικόνες με πράσινο σήμα γH2AX και πυρηνική χρώση μπλε DAPI. C, δοκιμασία επιδιόρθωσης DSB για HRR. Στερούνται ορού κύτταρα DU145 σε απουσία ή παρουσία AG1024 (10 μΜ) ή Η erlotinib (10 μΜ) διαμολύνθηκαν παροδικά με δύο φορείς, ένας που εκφράζει I-δοβΙ cDNA για τη δημιουργία DSBs του GFP cDNA, και ενός άλλου που εκφράζουν κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη με μία μιτοχονδριακή σήμα εντοπισμού για να δείξει την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. επιδιόρθωσης του DNA με HRR αξιολογήθηκε από την αναλογία των κυττάρων με δύο κόκκινα και πράσινα σήματα σε αυτούς με μόνο το κόκκινο σήματα. Τα ένθετα δείχνουν αντιπροσωπευτικές εικόνες των κυττάρων θετικά και αρνητικά για HRR. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD του ποσοστού των κυττάρων που είναι θετικά για την επιδιόρθωση του DNA με HRR από τρία ανεξάρτητα πειράματα. D, δοκιμασία επιδιόρθωσης DSB για NHEJ. κύτταρα DU145 προεπεξεργασία με ή χωρίς AG1024 (10 μΜ), Η erlotinib (10 μΜ) ή και τα δύο. Αντίστοιχες πυρηνικά εκχυλίσματα επωάστηκαν με το γραμμικό πλασμίδιο pBluscript KS (+) σε ένα ελεύθερο κυττάρων σύστημα για τη μέτρηση της NHEJ. Το ευθυγραμμισμένο πλασμιδικό DNA χωρίς θεραπεία με τα πυρηνικά εκχυλίσματα (DNA μόνο) και το πυρηνικό εκχύλισμα από τα κύτταρα ελέγχου χωρίς το πλασμίδιο (πυρηνικό εκχύλισμα μόνο) χρησιμοποιήθηκαν τον αρνητικό μάρτυρα. Πυρηνική εκχύλισμα από R503 ινοβλάστες χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Τα βέλη δείχνουν τις θέσεις του γραμμικού πλασμιδίου και διμερή. Ε, ανάλυση Western κηλίδας ανίχνευση πρωτεΐνη που σχετίζεται με ΝΗΕΙ. κύτταρα DU145 προεπεξεργασία με ή χωρίς AG1024 (10 μΜ), Η erlotinib (10 μΜ) ή και τα δύο, και στη συνέχεια ακτινοβολείται για NHEJ σχετίζονται πυρηνικής πρωτεΐνης (DNAPK, K70 /80, XRCC4). Lamin χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. * Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

Η

Επίδραση του EGFR και IGF1R αναστολέων στην απομείωση του DSB επισκευή μέσω της αναστολής της HRR, αλλά όχι από NHEJ

.

για να διαφοροποιηθούν εάν η απομείωση επισκευή DSB οφείλεται σε ελάττωμα HRR ή ΝΗΕΙ, οι δύο κύριες οδούς για την επισκευή DSB, θα προσδιοριστεί ποσοτικά HRR χρησιμοποιούν το σύστημα ανασυνδυασμού δημοσιογράφος PDR-GFP και εξετάστηκαν ΝΗΕΙ χρησιμοποιώντας ένα

in vitro

ελεύθερο κυττάρων δοκιμασίας [20]. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2C, για τα κύτταρα DU145, συνδυασμένη θεραπεία με AG1024 και Erlotinib ισχυρά μειωμένο επίπεδο HRR σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος ή κάθε παράγοντα μόνο του (Ρ & lt? 0,05). Σε αντίθεση, το πυρηνικό εκχύλισμα υποβάλλεται σε επεξεργασία με επιμέρους αναστολέα ή και οι δύο ήταν σε θέση να μεταβάλει την

in vitro

πρόσδεση του pBluescript KS (+), σε σύγκριση με την πυρηνικό εκχύλισμα από κύτταρα ελέγχου του οχήματος (Σχήμα 2D). Για την ανάλυση αυτή, το πυρηνικό εκχύλισμα από κύτταρα R503 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος, όπως αποδεικνύεται από τον Yang et al [23]. Επιπλέον, η έκφραση της NHEJ σχετίζονται πρωτεΐνες επιδιόρθωσης του DNA, συμπεριλαμβανομένου του DNA-ΡΚ, Κυ70, Κυ80 και XRCC4, δεν επηρεάστηκαν από AG1024, erlotinib ή και τα δύο σε κύτταρα DU145 (Σχήμα 2Ε), υποδηλώνοντας ότι η αναστολή αυτών των δύο οδών σηματοδότησης έκαναν δεν επηρεάσει ΝΗΕΙ-ξεκίνησε επιδιόρθωσης του DNA DSB, μία από τις πιο κοινές μορφές της επισκευής DSB σε κύτταρα θηλαστικών.

καταστολή της στιχομυθία σήματος σε πολλαπλά επίπεδα αναστέλλοντας τόσο EGFR και IGF1R

Προηγούμενες μελέτες αποκάλυψαν εκτεταμένο στιχομυθία μεταξύ EGFR και IGF1R μονοπατιού σηματοδότησης σε πολλαπλά επίπεδα [14]. Τα δεδομένα μας παραπάνω έδειξαν ότι η ταυτόχρονη αναστολή του EGFR και IGF1R μπορούσε προσθετικά ράδιο-ευαισθητοποίηση των κυττάρων PC μέσω της απομείωσης της επισκευής HRR DSB. Για να διερευνηθεί περαιτέρω το πώς η αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο υποδοχέων επηρεάζει την επισκευή DSB, εκτελέσαμε ανοσοκαταβύθιση-Western κηλίδας να εξετάσει τη φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ EGFR και IGF1R σε DU145 και τα κύτταρα PC3 εξής γ-ακτινοβολία. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι χωρίς ακτινοβολία, αυτές οι δύο υποδοχείς αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και στις δύο κυτταρικές γραμμές όγκου και ότι αυτή η ένωση δεν μεταβλήθηκε σημαντικά στις 24 ώρες μετά την ακτινοβολία (Σχήμα 3Α). Επιπλέον, προσδιορίσαμε την κατάντη μεταγωγής σήματος του έναν υποδοχέα σε απόκριση προς τον συνδέτη του άλλου υποδοχέα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, για DU145 και PC3 κύτταρα, η φωσφορυλίωση του EGFR αυξήθηκε με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με την αγωγή ΙΟΡ-Ι και στις δύο κύτταρα, αλλά ήταν σημαντικά μειωμένη κατά την συν-θεραπεία με τον αναστολέα EGFR, erlotinib. Παρομοίως, η φωσφορυλίωση του IRS1, μείζονος μόριο σηματοδότησης IGF1R, ενισχύθηκε μετά από θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του EGF, αλλά αναστάλθηκε μετά την προσθήκη AG1024 (Σχήμα 3C). Επιπλέον, βρήκαμε ότι ο συνδετήρας για κάθε υποδοχέα, δηλαδή, IGF-I και EGF, ήταν αρκετή για να ενεργοποιήσει αυτά τα γονίδια στόχους σε DU145 και τα κύτταρα PC3. Ωστόσο, η πιο ισχυρή ενεργοποίηση επιτεύχθηκε με συν-θεραπεία με αμφότερα IGF-I και EGF, ενώ μπλοκάρισμα αυτών των υποδοχέων σηματοδότησης είτε με AG1024 ή Η erlotinib ήταν σε θέση να μειώσει την ενεργοποίηση αυτών των γονιδίων-στόχων, αλλά η πιο ισχυρή μείωση παρατηρήθηκε σε DU145 και τα κύτταρα PC3 προ-αγωγή με δύο αναστολείς (Σχήμα 3D). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η ταυτόχρονη θεραπεία με EGFR και αναστολείς IGF1R ήταν σε θέση να καταστείλει στιχομυθία τους και με τη σειρά τους μπλοκάρουν κατάντη σηματοδότησης τους, συμπεριλαμβανομένης της PI3K /AKT οδό και ΜΑΡΚ μονοπατιού.

Ένα, Ανοσοκαταβύθιση ανίχνευση αλληλεπίδρασης /IGF1R EGFR. DU145 και PC3 κύτταρα ακτινοβολήθηκαν στη δόση των 2 Gy. Στη συνέχεια, κυτταρικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν, και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία ανοσοκαταβύθισης ανίχνευση EGFR και αλληλεπίδραση IGF1R. Β, ΙΟΡ-Ι ενεργοποιεί EGFR σε DU145 και τα κύτταρα PC3. Τα κύτταρα στερούνται ορού επί μία νύκτα, και στη συνέχεια υποβάλλεται σε ΙΟΡ-Ι διέγερση για 30 λεπτά. EGFR φωσφορυλίωση ανιχνεύεται με στύπωση Western. C, EGF ενεργοποιεί IRS1, το βασικό παράγοντα της οδού σήματος IGF1R σε DU145 και τα κύτταρα PC3. Τα κύτταρα στερούνται ορού επί μία νύκτα, και στη συνέχεια υποβάλλεται σε διέγερση EGF για 30 λεπτά. IRS1 φωσφορυλίωση ανιχνεύεται με στύπωση Western. D, ΜΑΡΚ ή AKT ενεργοποίηση μετά EGFR και IGF1R προσομοίωση της αναστολής. DU145 και PC3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με ή χωρίς AG1024 (10 μΜ), Η erlotinib (10 μΜ), AG1024 συν Erlotinib? IGF (50 ng /mL), EGF (50 ng /mL), ή EGF συν ΙΟΡ για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, /2 έκφραση ERK1 και phosphrylation, έκφραση ΑΚΤ και phosphrylation, έκφραση IRS1 και phosphrylation προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. β-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Επίδραση των αναστολέων EGFR και IGF1R στην καταστολή της IRS1 /Rad51 μεσολάβηση ομόλογου ανασυνδυασμού

τρέχοντα δεδομένα μας σε AG1024 και Erlotinib ρύθμιση IRS1 φωσφορυλίωση /ενεργοποίηση εμπλέκεται η πιθανή συμμετοχή του IRS1 /Rad51 μεσολάβηση HRR σε απόκριση σε γ ακτινοβολία στα κύτταρα PC, ως προηγούμενη μελέτη έδειξε επίσης [24]. Πράγματι, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση IRS1 προκλήθηκε με γ-ακτινοβολία με ενεργοποίηση μέγιστο επίπεδο που επιτυγχάνεται σε 4 ώρες μετά την γ-ακτινοβόληση σε DU145 και PC3 κύτταρα, ενώ η κορυφή της φωσφορυλίωσης IRS1 καθυστέρησε έως 8 ώρες μετά την γ-ακτινοβόληση μετά από αγωγή με AG1024 ή Η erlotinib και μόνο. Σε αντίθεση, συν-θεραπεία με αμφότερα AG1024 και Erlotinib μείωσε σημαντικά την ενεργοποίηση IRS1 όχι μόνο στο βασικό επίπεδο (0 ώρες μετά την ακτινοβολία), αλλά και σε όλα τα χρονικά σημεία μέχρι 24 ώρες μετά την ακτινοβολία (Σχήμα 4Α).

Α, κηλίδα Western που δείχνει επίπεδο του ρ-IRS1 σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά από 2 Gy γ-ακτινοβόληση DU145 και κυττάρων PC3 προ-επεξεργασία με ή χωρίς AG1024 (10 μΜ), Η erlotinib (10 μΜ), ή και τα δύο για 24 ώρες. β-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η αντιπροσωπευτική εικόνα γέλη εμφανίζεται στην κορυφή και τον ποσοτικό προσδιορισμό π-IRS1 /β-τουμπουλίνης αναλογία από τρία ανεξάρτητα πειράματα φαίνεται στο κάτω μέρος. Β, Ανοσοκαταβύθιση δείχνει αλληλεπίδραση μεταξύ IRS1 και Rad51 στο πυρηνικό εκχύλισμα DU145 και κυττάρων PC3. C, Ο σχηματισμός εστιών πυρηνικών Rad51 όπως αναλύθηκε με χρώση ανοσοφθορισμού. DU145 και PC3 κύτταρα διατηρήθηκαν με ή χωρίς AG1024 (10 μΜ), Η erlotinib (10 μΜ) ή και τα δύο (αριστερά τέσσερις μπάρες), ψευδο-επιμολυσμένα (pseudotreated), ή επιμολυσμένα με μη ειδικό έλεγχο siRNA (NSC siRNA) ή με IRS1 siRNA (δεξιά τρεις μπάρες). Τα ένθετα δείχνουν αντιπροσωπευτικές εικόνες με πράσινο σήμα Rad51 και πυρηνική χρώση μπλε DAPI. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με AG1024 /Erlotinib- αγωγή ή pseudotreated κύτταρα? ** Ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με AG1024- ή Erlotinib-επεξεργασμένα κύτταρα. D, Rad51 ανοσοφθορισμού χρώση DU145 και PC3 κύτταρα επεξεργασμένα με LY292004, PD98059, ή Η erlotinib ακολουθούμενη από γ-ακτινοβολία. Η πυρηνική σχηματισμός Rad51 εστιών προσδιορίσθηκε με τον ίδιο όπως στο C. Ένθετα δείχνουν αντιπροσωπευτικές εικόνες με πράσινο σήμα Rad51 και πυρηνική χρώση μπλε DAPI. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt?. 0,05, σε σύγκριση με τα ακτινοβολημένα κύτταρα μόνο

Η

Στη συνέχεια, προσδιορίζεται η φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ IRS1 και Rad51 στο πυρηνικό κλάσμα των κυττάρων που ακολουθείται γ-ακτινοβόληση με χρήση ανοσοκατακρήμνισης. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, η θεραπεία με όχημα, AG1024, erlotinib ή AG1024 συν Η erlotinib δεν άλλαξε σημαντικά τα επίπεδα του IRS1 ή Rad51 πρωτεΐνης, ενώ τα επίπεδα του IRS1 που σχετίζονται με Rad51 μειώθηκαν δραματικά σε κύτταρα κατεργασμένα με AG1024 συν Η erlotinib, η οποία είναι συνεπής με το σημαντικά μειωμένο επίπεδο φωσφο-IRS1 σε αυτά τα κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα κατέδειξαν ότι AG1024 συν Erlotinib θεραπεία κατέστειλε αλληλεπίδραση IRS1 με Rad51, υποδεικνύοντας EGFR και IGF1R συν-αναστολή θα μπορούσε να αναστείλει DNA διπλής επισκευή σπάσιμο κλώνου με αναστολή της HRR.

Επιπλέον, προσδιορίσαμε επίσης το υποκυτταρικό εντοπισμό του Rad51 ότι αποτελεί πυρηνική εστίες στις περιοχές των βλαβών του DNA. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι περίπου το 15% των κυττάρων ελέγχου υπό αγωγή με όχημα ήταν θετικά για Rad51 πυρηνικής εστίες μετά από έκθεση σε γ-ακτινοβολία.