Αφηρημένο

Μοριακή ανάλυση των κυττάρων από τα ούρα προσφέρει μια βολική προσέγγιση για την μη επεμβατική ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Η πρακτική χρήση των δοκιμών του ουροποιητικού με βάση κύτταρα συχνά παρεμποδίζεται από τις δυσκολίες στο χειρισμό και την ανάλυση μεγάλου όγκου δείγματος, την ανάγκη για ταχεία επεξεργασία των δειγμάτων για την αποφυγή της υποβάθμισης των κυτταρικών περιεχόμενο και χαμηλή ευαισθησία οφείλεται σε ένα υψηλό υπόβαθρο των φυσιολογικών κυττάρων. Σας παρουσιάζουμε μια συσκευή διήθησης, σχεδιασμένη για το σπίτι ή το σημείο-of-care χρήσης, το οποίο επιτρέπει τη συλλογή, αποθήκευση και μεταφορά του ουροποιητικού κυττάρων. Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό αυτής της συσκευής είναι μια αφαιρούμενη κασέτα που στεγάζει ένα φίλτρο μεμβράνης, το οποίο μετά από διήθηση των ούρων μπορεί να μεταφερθεί σε μια μονάδα αποθήκευσης που περιέχει την κατάλληλη λύση διατήρησης. Σε αιχμηρό πειράματα, η χρήση αυτής της συσκευής παρέχεται αποτελεσματική ανάκτηση των καρκινικών κυττάρων κύστης με εξάλειψη των & gt? 99% της περίσσειας μικρότερου μεγέθους κύτταρα. Η απόδοση της συσκευής αξιολογήθηκε περαιτέρω με ανάλυση με βάση το DNA του ουροποιητικού κύτταρα συλλέγονται από 57 ασθενείς υποβλήθηκαν σε διουρηθρική εκτομή εξής εύκαμπτο κυστεοσκόπηση υποδεικνύει την παρουσία ενός όγκου. Όλα τα δείγματα εξετάστηκαν για

FGFR3

μεταλλάξεις και επτά δείκτες της μεθυλίωσης του DNA (

BCL2

,

CCNA1

,

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2

,

SALL3

και

VIM

). Στην ομάδα των ασθενών, όπου μια μεταβατική κυττάρου όγκου επιβεβαιώθηκε σε ιστοπαθολογική αξιολόγηση, DNA ούρων ήταν θετικός για έναν ή περισσότερους δείκτες με 29 από 31 περιπτώσεις (94%), συμπεριλαμβανομένων 19 με

FGFR3

μετάλλαξη (61% ). Στην ομάδα των ασθενών με καλοήθεις ιστοπαθολογική, DNA ούρων ήταν θετικός για δείκτες μεθυλίωση σε 13 από τους 26 περιπτώσεις (50%). Μόνο ένας ασθενής σε αυτή την ομάδα ήταν θετική για

FGFR3

μετάλλαξη. Αυτή η ασθενής είχε ένα στάδιο Ta όγκο εκτομή 6 μήνες αργότερα. Η ικανότητα να εύκολα να συλλέγουν, να αποθηκεύουν και να αποστέλλει διαγνωστικά κύτταρα από τα ούρα με τη χρήση του παρουσίασε συσκευή μπορεί να διευκολύνει την μη επεμβατική εξέταση για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Andersson E, Dahmcke CM, Steven K, Larsen LK, Guldberg P ( 2015) Συσκευή φιλτραρίσματος για On-Site συλλογή, την αποθήκευση και την αποστολή των κυττάρων από τα ούρα και την εφαρμογή του σε DNA-Based διάγνωση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 10 (7): e0131889. doi: 10.1371 /journal.pone.0131889

Επιμέλεια: Jorg Tost, ΟΕΑ-Institut de Genomique, Γαλλία

Ελήφθη: 1 Οκτ 2014? Αποδεκτές: 8 του Ιούνη, 2015? Δημοσιεύθηκε: 7 Ιουλίου 2015

Copyright: © 2015 Andersson et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή έλαβε την υποστήριξη επιχορήγηση από το Ίδρυμα Candy

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. KS και PG ονομάζονται εφευρέτες σε μια αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας που κατατίθεται από Cancer Research Technology Limited, η οποία σχετίζεται με την συσκευή που περιγράφεται σε αυτό το άρθρο: αριθμός δημοσίευσης WO2015036781? αριθμό αίτησης PCT /GB2014 /052776? Ημερομηνία δημοσίευσης 19 του Μαρτίου 2015. Αυτό το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλους PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ανάλυση των σπάνιων κυττάρων που υπάρχουν στο συγκρότημα βιολογικά δείγματα υγρών παρέχει μια δυνητικά ισχυρό διαγνωστικό και εκτίμηση εργαλείο για μια σειρά ασθενειών και καταστάσεων. Ειδικότερα, η απομόνωση, η ποσοτικοποίηση και κατάντη δοκιμή των καρκινικών κυττάρων που υπάρχουν στο σώμα του ασθενούς υγρά δείγματα υπόσχονται πολλά για μη επεμβατική ανίχνευση και τον χαρακτηρισμό των όγκων για την καθοδήγηση διαγνωστικών και θεραπευτικών αποφάσεων. Μια κοινή προσέγγιση για τη διάγνωση του καρκίνου μέσω της ελάχιστα επεμβατικής δειγματοληψίας είναι με απομόνωση των ανέπαφων καρκινικών κυττάρων ή άνευ κυττάρων του DNA των όγκων από δείγματα περιφερικού αίματος [1,2]. Η ικανότητα να αναλύσει κυκλοφορούν υλικό που προέρχεται από όγκο έχει προχωρήσει γρήγορα με σημαντικές τεχνολογικές εξελίξεις και την ανακάλυψη της εξαιρετικά κατατοπιστική βιοδεικτών, συμπεριλαμβανομένων και ορισμένων που αντιπροσωπεύουν στόχους για τον καρκίνο ακρίβεια θεραπείες [3].

Για ουρολογικών καρκίνων όπως της ουροδόχου κύστης καρκίνος, ούρα παρέχει μια πιο βολική πηγή διαγνωστικού υλικού. Κύτταρα ρίξει από όγκους που βρίσκονται στο ουροποιητικό συσσωρεύονται στην κύστη και μπορούν να συλλέγονται και να αναλύονται με μη επεμβατικό τρόπο με δειγματοληψία ούρων [4]. Ούρα κυτταρολογία έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη διάγνωση ουρολογικών καρκίνων, ιδιαίτερα ως συμπλήρωμα της κυστεοσκόπηση για την ανίχνευση και επιτήρηση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Ωστόσο, για όγκους της ουροδόχου κύστης χαμηλού βαθμού, κυτταρολογία έχει μια ευαισθησία τόσο χαμηλά όσο 10-20% [5] και έχει εγκαταλειφθεί από πολλά κέντρα. Αρκετές ουροποιητικού τεστ για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης έχουν εγκριθεί από τον Αμερικανικό Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA), αλλά η απόδοση τους είναι ακόμα κατώτερη κυστεοσκόπηση από την άποψη της ευαισθησίας (αλήθεια θετικό ρυθμό) και η ειδικότητα (αληθινό αρνητικό ποσοστό) [6]. Μεγαλύτερη απόδοση μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση του γονιδίου που βασίζονται ουροποιητικού βιολογικών δεικτών όπως οι μεταλλάξεις οδηγού και μεταβολές της μεθυλίωσης του DNA, τα οποία είναι ειδικά για καρκινικό και επηρεάζεται λιγότερο από φλεγμονή και άλλες καλοήθεις συνθήκες [7-12]. Με την έλευση των βελτιωμένων μεθόδων για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των σπάνιων μορίων DNA, συμπεριλαμβανομένων αλληλούχισης επόμενης γενιάς και την ψηφιακή PCR [13], η ευαισθησία του DNA με βάση την ανίχνευση των όγκων της ουροδόχου κύστης μπορεί να αυξηθεί περαιτέρω.

Παρά του υπόσχεση, η χρήση των δοκιμασιών ουρικής με βάση κύτταρα για την ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης περιορίζεται από εγγενείς προκλήσεις της συλλογής και επεξεργασίας δειγμάτων ούρων. Η πιο κοινή διαδικασία για την ανάλυση της κυτταρικής περιεχόμενο των ούρων περιλαμβάνει καθίζηση των κυττάρων με φυγοκέντρηση. Για να αποφευχθεί η λύση και η υποβάθμιση των κυτταρικών συστατικών των κυττάρων, τα δείγματα θα πρέπει να υποβάλλονται σε επεξεργασία γρήγορα μετά την κένωση. Για αυτούς τους πρακτικούς λόγους, η δειγματοληψία γίνεται συνήθως σε ειδικό χώρο με εξειδικευμένο εξοπλισμό και εκπαιδευμένο προσωπικό. Μια άλλη σημαντική πτυχή που σχετίζεται με την απόδοση των ούρων που βασίζεται είναι η υψηλή ενδο- και δια-ατομική διακύμανση του ολικού αριθμού των ούρων κυττάρων και αναλογία όγκου-προς-τα φυσιολογικά κύτταρα [14]. Ένα υψηλό υπόβαθρο φυσιολογικών κυττάρων περιορίζει την ευαισθησία των περισσότερων προσδιορισμών ανίχνευσης και απαιτεί ένα μεγαλύτερο κλάσμα του υλικού του δείγματος πρέπει να αναλυθούν για να αυξηθεί η πιθανότητα εντοπισμού καρκινικών κυττάρων.

Το κυτταρικό συστατικό των ούρων είναι εξαιρετικά ετερογενής, αποτελούμενη των κυττάρων των διαφόρων τύπων και μεγεθών, όπως επιθηλιακά κύτταρα, πλακώδη κύτταρα και μακροφάγα [15,16]. Εμείς [17] και άλλοι [18-20] έχουν δείξει προηγουμένως ότι η προ-αναλυτική διήθηση των ούρων χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο μεμβράνης παρέχει ένα μέσο για τη σύλληψη και τον εμπλουτισμό κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης από ούρα. Με ένα μέγεθος πόρου περίπου 8 μm, όπως τα φίλτρα μπορούν να συλλάβουν φυσιολογικά και κακοήθη ουροθηλίου κύτταρα, τα οποία συνήθως έχουν διάμετρο & gt? 20 μm, ενώ εξαλείφουν κάποια μικρότερου μεγέθους κύτταρα. Μία τυπική διαδικασία για διήθηση, όπως εκείνο που χρησιμοποιείται σε προηγούμενη μελέτη μας [17], περιλαμβάνει τη χρήση σύριγγας μιας χρήσης για να αναγκάσει τα ούρα μέσω ενός φίλτρου μεμβράνης τοποθετημένα σε μία κατάλληλη υποδοχή του φίλτρου εξοπλισμένο με μια είσοδο και μια έξοδο. Μετά από διήθηση, το φίλτρο απομακρύνεται με λαβίδα και μεταφέρονται σε ένα σωληνάριο μικρο-φυγοκέντρησης για άμεση επεξεργασία ή αποθήκευση καταψύκτη. Αυτή η διαδικασία απαιτεί την κατάρτιση, δεν είναι κατάλληλο για την επεξεργασία μεγάλου όγκου και συνεπάγεται τον κίνδυνο απώλειας υλικού μέσω διαρροών και κατά το χειρισμό των λεπτές μεμβράνες του φίλτρου.

Σας παρουσιάζουμε μια συσκευή διήθησης για τη δειγματοληψία και την αποθήκευση των κυττάρων από μεγάλους όγκους ούρων ή άλλα βιολογικά υγρά. Μετά από διήθηση, το φίλτρο με συλληφθέντα κύτταρα μπορούν να αφαιρεθούν εύκολα από τη συσκευή διήθησης και τοποθετήθηκε σε μια μονάδα αποθήκευσης υδατοστεγές, το οποίο περιέχει ένα κατάλληλο διάλυμα για την παρασκευή ή τη διατήρηση των συλληφθέντων κυττάρων. Η μονάδα αποθήκευσης μπορεί στη συνέχεια να αποσταλεί σε εγκατάσταση δοκιμών για την κατάλληλη κατάντη ανάλυση του κυτταρικού περιεχομένου. Έχουμε αποδείξει την χρήση της συσκευής αυτής για το DNA που βασίζεται σε χαρακτηρισμό των ασθενών με καλοήθεις αλλοιώσεις και κακοήθεις όγκους της ουροδόχου κύστης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα ούρων

Ούρα τα δείγματα συλλέχθηκαν από ασθενείς στους οποίους ρουτίνα εύκαμπτο κυστεοσκόπηση στην κλινική εξωτερικών ασθενών έδειξε ένδειξη όγκου κύστης και ο οποίος στη συνέχεια αναφέρεται διουρηθρική εκτομή της κύστεως (TURB) στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Κοπεγχάγη, Herlev, Denmark. Η μελέτη περιελάμβανε δύο νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς και σε ασθενείς που υποβάλλονται σε ρουτίνα κυστεοσκόπηση ελέγχου ως συνέχεια της ήδη διαγνωστεί μεταβατική καρκινικών κυττάρων της ουροδόχου κύστης. Τα δείγματα μεταφέρονται σε θερμοκρασία δωματίου στη δανική Αντικαρκινική Εταιρεία και η επεξεργασία μέσα σε 4-6 ώρες μετά την κένωση. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας Ιατροβιολογικών Ερευνών της Περιφέρειας Πρωτεύουσας της Δανίας (H-2-2010-045), και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα άτομα πριν από τη συμμετοχή στη μελέτη.

Συλλογή των κυττάρων και απομόνωση DNA

Άκυροι δείγματα ούρων (100-400 ml) ή εναιωρήματα καλλιεργημένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας μία συσκευή διήθησης (Σχήμα 1) τοποθετείται με ένα πολυανθρακικό φίλτρο υδρόφιλη μεμβράνη track-χαραγμένο Nuclepore (διάμετρος 25 mm, μέγεθος πόρου 8 μm? Whatman, Maidstone, UK). Μετά από διήθηση, το φυσίγγιο του φίλτρου μεταφέρθηκε σε κασέτα αποθήκευσης, το οποίο στη συνέχεια τοποθετείται με το καπάκι από ένα Oragene DNA Kit Self-Collection που περιέχει 1,7 ml λύσης /ρυθμιστικού σταθεροποίησης (μορφή δίσκου OG-250? DNA Genotek, Οτάβα, Οντάριο, Καναδάς). Σύμφωνα με τον κατασκευαστή, το DNA είναι σταθερό σε αυτό το διάλυμα για & gt? 5 χρόνια σε θερμοκρασία δωματίου. DNA καθαρίστηκε από 0.5 ml του δείγματος χρησιμοποιώντας το διάλυμα καθαρισμού Oragene DNA (DNA Genotek), σύμφωνα με το πρωτόκολλο καταβύθιση αιθανόλης που παρέχεται από τον κατασκευαστή. Για τη συλλογή του συνολικού κυτταρικού συστατικού, 25 ml ούρων υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 2000 g για 10 λεπτά. Το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 200 μΙ αλατούχου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS) και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C. DNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Qiagen Mini Prep (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (πρωτόκολλο για τον καθαρισμό του DNA από τους ιστούς). απόδοση DNA υπολογίστηκε με ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR, χρησιμοποιώντας ένα LightCycler σύστημα 2.0 (Roche, Mannheim, Γερμανία), η FastStart DNA κύριο

PLUS SYBR Green Ι Kit (Roche), Human Genomic DNA (Roche) ως αναφορά και οι ακόλουθοι εκκινητές για

GAPDH

:. 5′-TAGTGTCCTGCTGCCCACAGTCCAG-3 ‘και 5′-GGCGACGCAAAAGAAGATGC-3’

Η συσκευή αποτελείται από μια μονάδα διήθησης (Α, μεμονωμένα συστατικά? Β, συναρμολογημένη συσκευή? C, μετά από διήθηση) και ένα υδατοστεγές κασέτα αποθήκευσης (D, μεμονωμένα συστατικά?. Ε, συναρμολογημένη κασέτα)

Η

Κυτταρική καλλιέργεια και το σύστημα μοντέλο

Το καρκίνωμα ουροθηλιακό προερχόμενο από κυτταρικές σειρές 639V και 97 – 7 ήταν από το εργαστήριο της Μάργκαρετ Α Knowles και το λιμάνι των

FGFR3

p.R248C και p.S249C μεταλλάξεων, αντίστοιχα [21]. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2. Λεμφοκύτταρα από ένα υγιή δότη παρασκευάστηκαν από περιφερικό αίμα σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Τα κύτταρα καταψύχθηκαν σε ΑΙΜ V (Gibco) που περιέχει 45% ανθρώπινο πλάσμα που προέρχεται από ορό + 10% DMSO και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Τα κατεψυγμένα κύτταρα αποψύχθηκαν σε ένα θερμαινόμενο λουτρό νερού 37 ° C, και ανακτήθηκε στο ΑΙΜ V μέσο στους 37 ° C για 30 λεπτά πριν από τη χρήση. Κύτταρα σε εναιώρημα μετρήθηκαν και η διάμετρος τους μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μετρητή κυττάρων Countess Automated (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Τα λεμφοκύτταρα και τα κύτταρα καρκινώματος αναμίχθηκαν σε διαφορετικές αναλογίες σε 100 ml PBS και υποβάλλονται σε επεξεργασία με τη χρήση της συσκευής διήθησης.

Μετάλλαξη ανάλυση

Ανίχνευση και ποσοτικοποίηση του

FGFR3

μεταλλάξεις (σελ. R248C, p.S249C, p.G370C και p.Y373C) και αντίστοιχες αλληλουχίες άγριου τύπου έγιναν από σταγονιδίου ψηφιακό PCR (ddPCR), χρησιμοποιώντας το σύστημα QX200 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) και δοκιμασίες ανιχνευτή με βάση υδρόλυση ( PrimePCR ddPCR Mutation προσδιορισμούς ανίχνευσης? Bio-Rad). Το μίγμα PCR περιείχε 11 μΙ ddPCR σταγονιδίου Supermix για ανιχνευτές (δεν dUTPs), 1,1 μΙ μετάλλαξης εκκινητών /μείγμα ιχνηλατών (FAM), 1,1 μΙ άγριου τύπου εκκινητών /μείγμα ιχνηλατών (hex) και 2 μΐ του DNA σε ένα τελικό όγκο των 22 μl. Είκοσι μικρολίτρα αυτού του μίγματος και 70 μΙ ελαίου γενιάς σταγονιδίων μεταφέρθηκαν σε διαφορετικά φρεάτια ενός φυσιγγίου παραγωγής σταγονιδίων. Μετά το σχηματισμό σταγονιδίων με τη χρήση της γεννήτριας σταγονιδίων, τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε μία πλάκα 96 φρεατίων PCR και να υποβληθεί σε ενίσχυση για 40 κύκλους στους 94 ° C για 30 sec. και 55 ° C για 60 sec. Σταγονίδια (κατά μέσο όρο ~ 16.000 ανά αντίδραση) αναλύθηκαν σε αναγνώστη των σταγονιδίων, και το λογισμικό Quantasoft (έκδοση 1.4.0.99) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των συγκεντρώσεων DNA. Αποκοπής ρυθμίσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας δείγματα DNA έλεγχο με θετικό στη μετάλλαξη και αρνητικά. Για τα δείγματα ούρων σε επεξεργασία τόσο με διήθηση και καθίζηση, ισομοριακές ποσότητες DNA χρησιμοποιήθηκαν ως εκμαγείο.

μεθυλίωσης του DNA ανάλυση

DNA (μέχρι 500 ng) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όξινο θειώδες χρησιμοποιώντας το EZ DNA Μεθυλίωση -Gold Kit (Zymo Research Corp, Orange, CA, USA), εκλούσθηκε σε 20 μΐ Μ-ρυθμιστικού έκλουσης και αποθηκεύονται στους 80 ° C. Ποσοτική ανάλυση των επιπέδων μεθυλίωσης στα υποστηρικτής CpG νησιά του

BCL2

,

CCNA1

,

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2

,

SALL3

και

VIM

πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ανιχνεύσεις TaqMan με βάση πραγματικού χρόνου PCR (MethyLight), χρησιμοποιώντας περιγράφηκε προηγουμένως εκκινητές, ανιχνευτές και οι συνθήκες [17]. Οι αντιδράσεις εκτελέστηκαν με 480 πλατφόρμα LightCycler χρησιμοποιώντας τον LightCycler 480 Probes κύριο Kit (Roche, Mannheim, Germany) και 1 μΙ κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA ανά αντίδραση.

In vitro

μεθυλιωμένο DNA (IVM? CpGenomeTM καθολική μεθυλιωμένο ϋΝΑ, Chemicon /Millipore, Billerica, ΜΑ) και ολόκληρο το γονιδίωμα-ενισχυμένο DNA χρησίμευσε ως θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι για μεθυλίωση, αντίστοιχα. επίπεδα μεθυλίωσης υπολογίστηκαν ως επί τοις εκατό μεθυλιωμένο αναφοράς (PMR?. Ref [23]) με κανονικοποίηση δείκτη-ειδικές τιμές αντίδραση στο

ALUC4

τιμές σε σχέση με τις ίδιες τιμές για πλήρως μεθυλιωμένα ελέγχου (IVM). Δείγματα με συγκέντρωση κάτω από το ισοδύναμο του 0,25 ng /μl μη κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA αποκλείστηκαν. Για κάθε δείκτη, η τιμή αποκοπής πάνω από την οποία ένα δείγμα θεωρήθηκε θετικό προσδιορίστηκε με ανάλυση του DNA από διηθείται ούρα από 11 υγιείς ελέγχους [17]. Cut-off τιμές PMR για

HOXA9

,

POU4F2

,

SALL3

και

VIM

ήταν 3, 2, 0,5 και 2, αντίστοιχα, ενώ δεν ενίσχυση φόντο παρατηρήθηκε για

BCL2

,

CCNA1

και

EOMES

.

Αποτελέσματα

Περίγραμμα της συσκευής διήθησης

το πρωτότυπο της συσκευής διήθησης και τα επιμέρους συστατικά του φαίνονται στο Σχ 1. Ολόκληρη η διάταξη συσκευή περιλαμβάνει 1) μια μονάδα διήθησης για το φιλτράρισμα ενός δείγματος βιολογικού υγρού, 2) ένα αφαιρούμενο φυσίγγιο φίλτρου που περιέχει ένα φίλτρο κατάλληλο για σύλληψη σχετικό υλικό , και 3) μια μονάδα αποθήκευσης για την προετοιμασία ή /και τη διατήρηση του περιεχομένου του φίλτρου. Η μονάδα διήθησης έχει ένα θάλαμο συλλογής, μια δεξαμενή αποβλήτων, καθώς και μια πλατφόρμα υποστήριξης φίλτρο που στεγάζει το αποσπώμενο φυσίγγιο φίλτρου (Σχήμα 1Α). Αυτά τα τρία μέρη συνδέονται για να επιτρέπει τη διέλευση ενός ρευστού από τον θάλαμο συλλογής μέσα στο δοχείο αποβλήτων μέσα από το φίλτρο του φυσιγγίου φίλτρου (Σχήμα 1Β). Ο θάλαμος συλλογής αποτελείται από ένα κυλινδρικό σάκο που περιβάλλεται από ένα ελικοειδές ελατήριο, το οποίο μπορεί να συμπιέζεται με το χέρι για να δημιουργηθεί μία πίεση που ωθεί το υγρό μέσω του φίλτρου (Σχήμα 1 C). Η πλατφόρμα υποστήριξης φίλτρου περιέχει μια βαλβίδα που απελευθερώνεται σε υψηλή πίεση, εάν το φίλτρο φράξει από υλικό, επιτρέποντας την άμεση διέλευση του ρευστού από το θάλαμο συλλογής εντός της δεξαμενής αποβλήτων. Η δεξαμενή αποβλήτων περιέχει απορροφητικό υλικό για να επιτρέπει τη διάθεση της συσκευής και υγρών αποβλήτων. Το πρωτότυπο αυτής της συσκευής σχεδιάστηκε με μέγιστη χωρητικότητα ρευστού των 500 ml για να φιλοξενήσει και να επεξεργάζεται ολόκληρο κενά ούρων.

Μετά από διήθηση, το φυσίγγιο φίλτρου με φίλτρο μπορεί να αφαιρεθεί από τη μονάδα διήθησης και εισάγεται εντός της μονάδας αποθήκευσης (Σχήμα 1 D). Το καπάκι της μονάδας αποθήκευσης περιέχει την κατάλληλη λύση επεξεργασίας ή αποθήκευσης που απελευθερώνεται πάνω στο φίλτρο όταν τοποθετείται το καπάκι. Όταν εμπλέκεται με φυσίγγιο φίλτρου και το κάλυμμα, η μονάδα αποθήκευσης σχηματίζει ένα σφραγισμένο συγκρότημα που μπορεί εύκολα και με ασφάλεια να μεταφερθεί (σχήμα 1 Ε). Μόλις παραληφθεί από έναν αναλυτή, το συλληφθέν βιολογικό υλικό μπορεί να ανακτηθεί εύκολα από τη μονάδα αποθήκευσης με απομάκρυνση του καπακιού.

Αξιολόγηση της συσκευής απόδοσης

ως πρότυπο σύστημα για την αξιολόγηση της ικανότητας του συσκευή για τη συλλογή και απαρίθμηση κυττάρων όγκου από υγρά δείγματα, χρησιμοποιήσαμε την κυτταρική γραμμή καρκινώματος ουροθηλιακό 639V, η οποία έχει μια σημειακή μετάλλαξη (p.R248C) στο γονίδιο που κωδικοποιεί τον υποδοχέα αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών 3 (

FGFR3

) με απώλεια του αντίστοιχου αλληλόμορφου άγριου τύπου (S1 Εικ). Στην πρώτη ομάδα πειραμάτων, 100 ml PBS που περιέχει μεταξύ 1.000 και 5 × 10

6 639V κύτταρα (διάμετρος, 11-18 μm) προστέθηκαν στο θάλαμο συλλογής της συσκευής και ωθείται μέσω ενός φίλτρου πολυανθρακικής μεμβράνης με ένα μέγεθος πόρου 8 μm. Για την ποσοτικοποίηση του αριθμού των κυττάρων που συλλαμβάνονται στο φίλτρο, εξάγαμε ολικό DNA και προσδιορίστηκε ο αριθμός των μεταλλαγμένων

FGFR3

μόρια χρησιμοποιώντας ένα ψηφιακό PCR (ddPCR) δοκιμασία σταγονιδίων. Σε αυτό το σκηνικό, ένα θετικό γεγονός είναι ισοδύναμο με ένα κύτταρο. Θετικά σήματα αναπαραγώγιμα ελήφθησαν για όλα τα δείγματα όταν 2 μΙ (4%) του εκχυλισμένου DNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για ddPCR (Σχήμα 2Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι, για τη χαμηλότερη συγκέντρωση των κυττάρων (1000 σε 100 ml), η ανάκτηση ήταν ~ 70% (Σχήμα 2Β). Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις των κυττάρων, υπήρξε μια μείωση στο ποσοστό ανάκτησης, κάτω στο ~ 5% στα 5 × 10

6 κύτταρα /100 ml. Αυτή η χαμηλότερη ανάκτηση αναμενόταν ως κορεσμός του φίλτρου θα προκαλέσει την απελευθέρωση της βαλβίδας πίεσης και την άμεση ροή του υπόλοιπου υγρού και κυτταρικών περιεχόμενό της στη δεξαμενή αποβλήτων. Αυτή η αρχική δοκιμή πρότεινε ότι η συσκευή διήθησης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να συλλάβει αποτελεσματικά καρκινικών κυττάρων κύστης από ένα ρευστό, και ότι το ποσοστό ανάκτησης είναι ιδιαίτερα υψηλό σε χαμηλές συγκεντρώσεις κυττάρων, όπου δεν έχει ακόμη επιτευχθεί η χωρητικότητα του φίλτρου.

PBS (100 ml) που περιέχει μεταξύ 1.000 και 5 × 10

6 639V κύτταρα υπέστη επεξεργασία χρησιμοποιώντας μία συσκευή τοποθετείται με ένα φίλτρο μεμβράνης πολυανθρακικού μεγέθους πόρου 8-μm. DNA εκχυλίστηκε από τα φίλτρα και εξετάστηκαν για μεταλλαγμένα μόρια

FGFR3

(p.R248C) χρησιμοποιώντας ddPCR. DNA από φυσιολογικό λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για άγριου τύπου

FGFR3

. Α, οικόπεδο πλάτους φθορισμού ddPCR. Οι κάθετες γραμμές αντιπροσωπεύουν ρυθμίσετε χειροκίνητα αποκοπής ρυθμίσεις. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι από ένα από τα δύο ανεξάρτητα πειράματα. Β, Bar διάγραμμα που δείχνει τον αριθμό των ανακτημένων κυττάρων (υπολογίζεται βάσει του μεταλλαγμένου

FGFR3

μόρια) σε σχέση με τον αριθμό των κυττάρων εισόδου. Οι συνολικές μετρήσεις των μεταλλαγμένων μορίων υπολογίστηκαν βάσει τριών ανεξάρτητων δοκιμών ddPCR, το καθένα έχει διάσταση μεταλλαγμένα μόρια σε 4% του συνολικού δείγματος DNA. Τα δεδομένα των μετρήσεων εις τριπλούν (το καθένα σε 4% του συνολικού DNA) από ένα πείραμα που παριστάνεται ως μέσοι ± SD. Τα ποσοστά επάνω ράβδοι αντιπροσωπεύουν τον αριθμό των ανακτημένων κυττάρων σε σχέση με τον αριθμό των κυττάρων εισόδου.

Η

Για να δοκιμαστεί η ικανότητα της συσκευής διήθησης για να αυξηθεί η συγκέντρωση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρων που υπάρχουν σε ένα περιβάλλον μικρότερου μεγέθους φυσιολογικά κύτταρα, έχουμε ενισχυμένο μεταξύ 1.000 και 50.000 639V κύτταρα σε 100 ml PBS που περιείχε 10

7 φυσιολογικούς καθαρισμένα καλλιεργημένα ανθρώπινα λεμφοκύτταρα (διάμετρος, 7-8 μm) και επεξεργάστηκαν το εναιώρημα με τη βοήθεια της συσκευής διήθησης. Ανάλυση του DNA που εξάγεται από τα φίλτρα με ddPCR εμφάνισε σήματα τόσο για μεταλλαγμένο (p.R248C) και άγριου τύπου

FGFR3

(Σχήμα 3Α). Το πιο σημαντικό, το ποσοστό ανάκτησης του μεταλλαγμένου DNA ήταν παρόμοια με εκείνη που επιτυγχάνεται με καθαρά διαλύματα των κυττάρων 639V (Σχήμα 3Β). Αν και η επεξεργασία των δειγμάτων με διήθηση εξαλειφθεί η πλειονότητα των λεμφοκυττάρων (& gt? 99%), υπήρξε μια συνεπής φόντο του άγριου τύπου

FGFR3

αλληλόμορφα (Σχήμα 3), που μπορεί να προέρχονται από υπολειμματικό μονοκύτταρα (διάμετρος, 15-25 μm) στα παρασκευάσματα λεμφοκυττάρων.

Μεταξύ 1000 και 50000 639V κύτταρα εμπλουτίστηκαν σε 10

7 φυσιολογικά λεμφοκύτταρα σε 100 ml PBS, και το εναιώρημα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τη χρήση της συσκευής διήθησης. Το DNA που εξάγεται από τα φίλτρα και ελέγχονται για μεταλλαγμένα (p.R248C? Mut) και άγριου τύπου (WT)

FGFR3

χρησιμοποιώντας ddPCR. Α, ddPCR οικόπεδα εύρος φθορισμού του

FGFR3

σήμα φθορισμού ανιχνευτή R248C-FAM (μπλε, άνω φωτογραφία) και

σήμα φθορισμού ανιχνευτή FGFR3

WT-HEX (πράσινο, κάτω πίνακα). Οι κάθετες γραμμές αντιπροσωπεύουν ρυθμίσετε χειροκίνητα αποκοπής ρυθμίσεις. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι από ένα από τα δύο ανεξάρτητα πειράματα. Β, Bar διάγραμμα που δείχνει τον αριθμό των ανακτημένων κυττάρων (υπολογίζεται βάσει των μεταλλαγμένων και WT

FGFR3

μόρια) σε σχέση με τον αριθμό των κυττάρων του όγκου εισόδου. Οι συνολικές μετρήσεις του

FGFR3

μόρια υπολογίστηκαν με βάση τριών ανεξάρτητων δοκιμών ddPCR, κάθε χρησιμοποιώντας 4% του συνολικού DNA ως μήτρα, και αντιπροσωπεύονται ως μέσο ± SD. Τα ποσοστά επάνω από τις μπάρες αντιπροσωπεύουν τον αριθμό των ανακτηθέντων κυττάρων σε σχέση με τον αριθμό των κυττάρων εισόδου.

Η

Για να αξιολογηθεί η μεταβλητότητα των αποτελεσμάτων, διηθείται 100 ml PBS που περιέχει 500, 1000 ή 5000 κύτταρα 97-7 (διάμετρος, 18-25 μm), το καθένα με 3-5 σημεία δεδομένων από τρία ανεξάρτητα πειράματα. DNA απομονώθηκε και ο αριθμός των μεταλλαγμένων

FGFR3

(p.S249C) μόρια ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ddPCR. Σε αυτό το μοντέλο, η μεταβλητότητα ενδο-δείγματος ήταν γενικά χαμηλή και μειώνεται με μεγαλύτερο αριθμό κυττάρων (S2 σχήμα).

Ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε δείγματα ούρων

Στη συνέχεια εκτιμήσαμε την απόδοση της συσκευής από την επεξεργασία των ούρων συλλέχθηκαν από 59 ασθενείς αμέσως πριν TURB. Όλοι οι ασθενείς είχαν έδειξε στοιχεία όγκου της ουροδόχου κύστης όταν εξετάστηκαν για πρώτη φορά από φθορίζουσα καθοδήγηση ευέλικτη κυστεοσκόπηση. Με βάση την ιστοπαθολογική αξιολόγηση των βιοψιών, 33 από τους ασθενείς διαγνώστηκαν με όγκους της ουροδόχου κύστης, ενώ τα υπόλοιπα 26 ασθενείς είχαν καλοήθεις βλάβες ή φυσιολογικό επιθήλιο της ουροδόχου κύστης. Οι πίνακες 1 και 2 δείχνουν τα δημογραφικά και παθολογία δεδομένα για αυτούς τους ασθενείς. Η πλειονότητα των όγκων ήταν μη επεμβατική (στάδιο Ta? 73%), το ένα ήταν ένα θηλώδες ουροθηλιακό νεόπλασμα του χαμηλού κακοήθους δυναμικού (PUNLMP), δύο ταξινομήθηκαν ως όγκος in situ (TIS), τέσσερα ήταν σταδίου Τ1 και δύο ήταν σταδίου Τ2. Είκοσι όγκους (61%) ήταν χαμηλής ποιότητας.

Η

Για να ελέγξετε αν η διήθηση θα μπορούσε να αυξήσει την αναλογία της κανονικής προς καρκινικά κύτταρα, ελέγξαμε πρώτα 13 δείγματα ούρων σε ένα split- ρύθμιση του δείγματος, όπου 25 ml από κάθε δείγμα καθιζάνουν με φυγοκέντρηση, και το υπόλοιπο υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διήθηση. DNA που απομονώθηκε από όλα τα δείγματα του φίλτρου και ιζήματος ελέγχθηκαν για τέσσερις κοινούς

FGFR3

μεταλλάξεις (p.R248C, p.S249C, p.G370C και p.Y373C) χρησιμοποιώντας ddPCR. Οκτώ από τα δείγματα (58%) ήταν θετικά για μία από αυτές τις μεταλλάξεις (Πίνακας 1). Ποσοτική ανάλυση με χρήση ισομοριακών ποσοτήτων ολικού DNA από τα φίλτρα και τα ιζήματα έδειξε ότι η αναλογία του μεταλλαγμένου προς άγριου τύπου DNA ήταν υψηλότερη στα δείγματα που διηθούνται από ό, τι τα αντίστοιχα ιζήματα (Πίνακας 3). Το πιο σημαντικό, οι μεγαλύτερες εμπλουτισμούς (6,5 και 8,0 φορές, αντίστοιχα) επιτεύχθηκαν για τα δύο δείγματα που αντιπροσωπεύουν τις χαμηλότερες μεταλλαγμένη προς άγριου τύπου αναλογίες (Σχήμα 4).

Τα δείγματα ούρων από ασθενείς με όγκους της ουροδόχου κύστης διαιρέθηκαν σε δύο κλάσματα και υποβάλλονται σε επεξεργασία από διήθηση συσκευή και καθίζηση, αντίστοιχα. Ισομοριακές ποσότητες του DNA από τα φίλτρα και τα ιζήματα ελέγχθηκαν για

FGFR3

μεταλλάξεις χρησιμοποιώντας ddPCR.

Η

Όλα τα υπόλοιπα δείγματα ούρων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διήθηση και μόνο, και το DNA εκχυλίστηκε και εξετάστηκε για

FGFR3

μεταλλάξεις χρησιμοποιώντας ddPCR και επτά ιχνηθέτες DNA-μεθυλίωσης (

BCL2

,

CCNA1

,

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2

,

SALL3

και

VIM

) χρησιμοποιώντας δοκιμασίες MethyLight. Αρκετές μελέτες του καρκίνου της ουροδόχου κύστης έχουν αναφερθεί υψηλές ευαισθησίες (& gt? 50%) και εξειδικεύσεις (& gt? 90%) για αυτούς τους δείκτες σε όγκους της ουροδόχου κύστης [7,8,24], και ως ένα πάνελ παρείχαν μία ευαισθησία 94% [17 ].

Η μέση απόδοση DNA από δείγματα ούρων από τους 33 ασθενείς με όγκους της ουροδόχου κύστης ήταν 138 ng (εύρος 6,3 έως 3.600 ng). Σε δύο δείγματα από ασθενείς με χαμηλού βαθμού Ta όγκων, η ποσότητα του DNA μετά την κατεργασία όξινου θειώδους ήταν ανεπαρκής για να επιτρέψει την ανάλυση ολόκληρου του πάνελ βιοδεικτών. Ο Πίνακας 1 δείχνει τα αποτελέσματα για τα υπόλοιπα 31 δείγματα. Δεκαεννέα από τα δείγματα περιείχαν

FGFR3

μεταλλάξεις (61%), με την πλειονότητα των μεταλλάξεων είναι p.Y373C (50%) και p.S249C (45%). Ένα δείγμα περιείχε p.Y373C και p.S249C. Ένα σύνολο 118 συμβάντα υπερμεθυλίωση προαγωγού εντοπίστηκαν σε 29 δείγματα (94%), με μέσο όρο 4,1 (εύρος 1-7) συμβάματα ανά δείγμα. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [8,17], η υψηλότερη ευαισθησία ελήφθη με

VIM

, η οποία ήταν θετική σε 81% των περιπτώσεων. Οι άλλες έξι δείκτες είχαν ευαισθησίες που κυμαίνονται από 74% (

HOXA9

) έως 29% (

EOMES

). Τα δύο δείγματα αρνητικά για όλους τους δείκτες μετάλλαξης και μεθυλίωσης ήταν από ασθενή με PUNLMP και έναν ασθενή με χαμηλού βαθμού Ta του όγκου, αντίστοιχα.

Η μέση απόδοση του DNA από δείγματα ούρων που συλλέγονται από τους 26 ασθενείς με καλοήθη ιστοπαθολογία ήταν 271 ng (εύρος 21 έως 1.605 ng). Συνολικά 30 εκδηλώσεις υπερμεθυλίωση προαγωγού εντοπίστηκαν σε 13 δείγματα (50%), με μέσο όρο 2,3 (εύρος 1-5) συμβάματα ανά δείγμα. Τα υπόλοιπα δείγματα ήταν αρνητικά για όλους τους δείκτες. Το προφίλ των θετικών δεικτών σε αυτή την ομάδα ασθενών ήταν διαφορετική από ότι σε ασθενείς με όγκους, με

SALL3

(26%),

CCNA1

(22%) και

POU4F2

(19%) είναι η πιο συχνή. Θετική δείκτες μεθυλίωση βρέθηκαν σε 8 από τους 12 ασθενείς (67%) που είχαν προηγουμένως υποβληθεί σε θεραπεία για καρκίνο της ουροδόχου κύστης και έγιναν δεκτοί για την παρακολούθηση, και σε 5 από τους 14 ασθενείς (36%), οι οποίοι δεν είχαν προηγούμενο ιστορικό καρκίνου της ουροδόχου κύστης . Μόνο ένας από τους ασθενείς με καλοήθη παθολογία κύστη είχε ένα

FGFR3

μετάλλαξη ανιχνεύσιμη στα ούρα. Αυτός ο ασθενής ήταν επίσης θετικός για πέντε δείκτες μεθυλίωση και διαγνώστηκε με μια χαμηλού βαθμού Ta όγκου σε επανάληψη κυστεοσκόπηση 6 μήνες μετά την αρνητική TURB.

Συζήτηση

Έχουμε αναπτύξει και να δοκιμαστεί μια συσκευή διήθησης επιτρέποντας την εύκολη και ανέξοδη συλλογή και επεξεργασία των διαγνωστικών κυττάρων από τα ούρα. Η συσκευή μπορεί να χρησιμοποιηθεί από ασθενείς ή από τους παρόχους φροντίδας υγείας να παρέχουν ένα δείγμα κυττάρων κατάλληλα για ανάλυση DNA. Το ρυθμιστικό στη μονάδα αποθήκευσης εξασφαλίζει τη μακροχρόνια σταθερότητα του DNA σε θερμοκρασία δωματίου, παρέχοντας επαρκή χρόνο για την αποστολή του δείγματος σε εγκαταστάσεις δοκιμών χρησιμοποιώντας την τυπική ταχυδρομικό σύστημα. Η απλή διαδικασία για την παροχή του ουροποιητικού κύτταρα μπορεί να μειώσει σημαντικά την ανάγκη για άμεση επαφή ανάμεσα στον ασθενή και το σύστημα υγειονομικής περίθαλψης, και θα μπορούσε να είναι μια ελκυστική επιλογή στις ρυθμίσεις χαμηλής πόρων, όπου κυστεοσκόπηση δεν μπορεί να προσφέρεται ως πρότυπο για την ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Η εστίαση σε αυτή τη μελέτη ήταν σχετικά με τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, αλλά η ίδια προσέγγιση μπορεί να εφαρμοστεί σε άλλες ουροποιογεννητικού καρκίνους, όπως άνω όγκοι του ουροποιητικού συστήματος [4], καθώς και άλλες συνθήκες όπου η ανάλυση της ουρικής κυττάρων έχει διαγνωστικές, προγνωστικές ή θεραπευτική αξία.

αιχμηρό πειράματα, αποδείξαμε ότι η συσκευή διήθησης ήταν ικανό να συλλάβει τα κύτταρα όγκου ενώ εξαλείφοντας μια μεγάλη περίσσεια μικρότερου μεγέθους κύτταρα. Επιπλέον, η ανάλυση των δειγμάτων ούρων από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης έδειξε ότι η διήθηση αύξησε την αναλογία όγκου-προς-φυσιολογικά κύτταρα σε σύγκριση με καθίζηση των κυττάρων με φυγοκέντρηση, ιδιαίτερα για τα δείγματα όπου η αναλογία αυτή ήταν χαμηλή. Θα πρέπει να σημειωθεί, ωστόσο, ότι η ανάκτηση και ο εμπλουτισμός των κυττάρων με διήθηση εξαρτάται από μια σειρά μεταβλητών, συμπεριλαμβανομένων των χαρακτηριστικών των κυττάρων (π.χ., μέγεθος και ικανότητα παραμόρφωσης), τα χαρακτηριστικά του φίλτρου (π.χ. μέγεθος πόρων, τον αριθμό των πόρων, το διάστημα μεταξύ τους πόρους και φίλτρο υλικού) [25] και διήθηση παραμέτρους (π.χ., ρυθμός και πίεση κατά μήκος του φίλτρου ροής) [26].

Μεταξύ των ασθενών που είχαν όγκου κύστης επιβεβαιώθηκε κατά ιστοπαθολογική εξέταση, το DNA των ούρων ήταν θετικό για τουλάχιστον έναν από οι δοκιμαστεί βιοδείκτες (

FGFR3

μεταλλάξεις και εκδηλώσεις υπερμεθυλίωση προαγωγού) στο 94% των περιπτώσεων. Το ποσοστό αυτό ήταν ενθαρρυντικά δεδομένου ότι η πλειοψηφία των ασθενών σε αυτή την ομάδα που παρουσιάζονται με μικρά μη επεμβατικές όγκους, τα οποία είναι γενικά δύσκολο να ανιχνευθούν στα ούρα, επειδή ρίχνουν σχετικά λίγα κύτταρα [27]. Ωστόσο, οι μεγαλύτερες προοπτικές μελέτες που απαιτούνται για την περαιτέρω αξιολόγηση του δυναμικού αυτής της προσέγγισης για την ανίχνευση καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε ένα διαγνωστικό περιβάλλον. Η υψηλή ευαισθησία για την ανίχνευση όγκων της ουροδόχου κύστης επιτευχθεί σε αυτή τη μελέτη μπορεί τουλάχιστον εν μέρει να αποδοθεί στις μεγάλες ποσότητες (πλήρης κενά) των ούρων σε επεξεργασία. Zuiverloon et al. [14] έδειξε ότι η ευαισθησία του DNA με βάση την ανίχνευση των όγκων της ουροδόχου κύστης αυξάνεται αναλόγως με την αύξηση του όγκου των ούρων και ότι η πιο αξιόπιστη δοκιμή επετεύχθη επί τη βάσει μιας συλλογής 24 ωρών του ουροποιητικού κυττάρων, παρόμοια με τις τυπικές διαδικασίες για συλλογή του αργού ούρων για τη διάγνωση των άλλων συνθηκών, όπως η πορφυρία και νεφρική ανεπάρκεια. Στο πλαίσιο αυτό, η συσκευή που περιγράφεται εδώ μπορεί να διευκολύνει την συχνή και επαναλαμβανόμενη δειγματοληψία.

Σχεδόν οι μισοί από τους ασθενείς υποβάλλονται σε TURB λόγω ένδειξη όγκου από ρουτίνας ευέλικτη κυστεοσκόπηση διαπιστώθηκε ότι δεν τρέφουν μεταβατική καρκινικών κυττάρων στα δείγματα βιοψίας . Είναι ενδιαφέρον, δείγματα ούρων από το ήμισυ αυτών των ασθενών ήταν θετικοί για έναν ή περισσότερους δείκτες DNA-μεθυλίωση, παρά αυτών των δεικτών είναι αρνητικά στα ούρα υγιών ατόμων. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει υπερμεθυλίωση προαγωγού στην κανονική εμφανιζόμενο ουροθήλιο από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης [28], υποδηλώνοντας έναν επιγενετικές «ελάττωμα πεδίο». Άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι η βιοδείκτες DNA-μεθυλίωση μπορεί να ανιχνευθεί στα ούρα χρόνια μετά την εκτομή ενός όγκου της ουροδόχου κύστης, παρά την έλλειψη της υποτροπής [29,30]. άλλαξε επιγενετικώς μπαλώματα της ουροδόχου κύστης φαινοτυπικά δεν διακρίνεται από την κανονική ουροδόχου κύστης μπορεί να αποτελέσει πρόδρομο βλάβες για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης και μπορεί να εξηγήσει το υψηλό ποσοστό υποτροπής. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι οι ασθενείς με ιχνηθέτες DNA-μεθυλίωση ανιχνεύσιμη στα ούρα μπορεί να βρίσκονται σε αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου της ουροδόχου κύστης αργότερα στη ζωή. Σε αντίθεση με τον υψηλό επιπολασμό του

FGFR3

μεταλλάξεις στα ούρα από ασθενείς με επιβεβαιωμένη όγκου κύστης (67%), μόνο ένας από τους ασθενείς με καλοήθη ιστοπαθολογία είχαν

FGFR3

μετάλλαξη ανιχνεύσιμη στα ούρα. Είναι ενδιαφέρον, ο ασθενής διαγνώστηκε με όγκο κύστης μισό χρόνο αργότερα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η εξέταση DNA των ούρων μπορεί να εντοπίσει κάποιες όγκους της ουροδόχου κύστης σε προγενέστερο στάδιο από τη διαδικασία TURB.

Η συσκευή διήθησης συλλαμβάνει αποτελεσματικά κύτταρα από μεγάλους όγκους ούρα και τα συμπυκνώματα και τα αποθηκεύει για εύκολη μεταφορά και κατάντη δοκιμές.