Αφηρημένο

Σε γενικές γραμμές, οι περισσότεροι από καρκίνο των ωοθηκών δεν μπορεί να ανιχνευθεί μέχρι να συμβεί σε μεγάλη κλίμακα και απομακρυσμένων μεταστάσεων, η οποία είναι η κύρια αιτία της υψηλής θνησιμότητας στον καρκίνο των ωοθηκών. Ως εκ τούτου, είναι επείγον να ανακαλύψει βιοδεικτών μετάστασης που σχετίζονται με την ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών σε απόκρυφο στάδιο μετάσταση του. Altered γλυκοζυλίωση είναι μια καθολική χαρακτηριστικό της κακοήθειας και ορισμένα είδη γλυκάνης δομές είναι πολύ γνωστές δείκτες για προόδους όγκου. Έτσι, αυτή η μελέτη στοχεύει να αποκαλύψει συγκεκριμένες αλλαγές του

Ν

-γλυκάνες στο secretome του μεταστατικού καρκίνου των ωοθηκών. Χρησιμοποιήσαμε μια ποσοτική προσέγγιση Glycomics βασίζεται στην μεταβολική επισήμανση σταθερού ισοτόπου να συγκρίνουν τη διαφορά

Ν

-glycosylation των secretome μεταξύ κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών SKOV3 και υψηλό μεταστατικό παράγωγο SKOV3-ip του. Περιέργως, μεταξύ των συνολικών 17

Ν

-γλυκάνες εντοπιστεί, το

Ν

-γλυκάνες με διχοτομεί ΟΙοΝΑο μειώθηκαν όλες σημαντικά SKOV3-ip σε σύγκριση με SKOV3. Αυτή η αλλαγή σε διχοτομεί γλυκομορφές ΟΙοΝΑο καθώς και την αντίστοιχη σύνδεσή της με καρκίνο των ωοθηκών μεταστατική συμπεριφορά περαιτέρω επικυρώνονται σε επίπεδο glycotransferase με πολλαπλές τεχνικές που περιλαμβάνουν PCR πραγματικού χρόνου, κηλίδωση Western, δοκιμασία Transwell, λεκτίνη κηλίδωση και την ανάλυση ανοσοϊστοχημείας. Η μελέτη αυτή απεικονίζεται μετάστασης που σχετίζονται με

N

-γλυκάνη μεταβολές στον καρκίνο των ωοθηκών secretome

in vitro

για πρώτη φορά, η οποία είναι μια πολύτιμη πηγή για βιοδεικτών ανακάλυψη επίσης. Επιπλέον,

Ν

-γλυκάνες με διχοτομεί ΟΙοΝΑο ρίξει φως σχετικά με την ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών σε πρώιμο στάδιο περιτοναϊκή μετάσταση η οποία μπορεί κατά συνέπεια να βελτιώσει την πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών

Παράθεση:. Zhang Χ, Γουάνγκ Υ, Qian Υ, Γου Χ, Zhang Ζ, Liu Χ, et al. (2014) Ανακάλυψη Ειδικές Μετάσταση που σχετίζονται με

Ν

-γλυκάνη Μεταβολές στα επιθηλιακά καρκίνου των ωοθηκών βάσει ποσοτικών Glycomics. PLoS ONE 9 (2): e87978. doi: 10.1371 /journal.pone.0087978

Επιμέλεια: Ρατζίβ Samant, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Σεπ, 2013? Δεκτές: 2, Γενάρη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 6, Φλεβάρη του 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό πρόγραμμα βασικής έρευνας της Κίνας (973 Program) (2012CB8221004, 2013CB910503), Εθνική υψηλής τεχνολογίας R &? D Program (863 Program) (2012AA020203) και το Εθνικό ταμείο φυσικές επιστήμες (31.100.586, 31010103906, 30930025, 31170766, 81272879, 81302258), η κορυφαία ακαδημαϊκά Πειθαρχία σχέδιο της Σαγκάης (Β117), και στη Σαγκάη έργου έμφαση βασική έρευνα (11JC1401502). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών είναι η πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια παγκοσμίως [1], [2]. Σύμφωνα με μια πρόσφατη έκθεση της American Cancer Society, περίπου 22.240 νέες περιπτώσεις θα διαγνωστούν με καρκίνο των ωοθηκών, το 2013, ενώ σχεδόν 14.030 θα υποκύψει στην ασθένεια αυτή [3]. Επί του παρόντος, πυελική υπερηχογραφία και δοκιμή CA125 στον ορό χρησιμεύσει ως κύριο ρουτίνες ανίχνευσης [4], [5], [6], [7], οι οποίες είναι αποτελεσματικές σε ορισμένες περιπτώσεις. Ωστόσο, η πλειοψηφία του καρκίνου των ωοθηκών μπορεί να εξακολουθεί να μην διαγιγνώσκεται μέχρι ο όγκος έχει προχωρήσει σε ένα προχωρημένο στάδιο, παρουσιάζοντας με μεγάλης κλίμακας ή απομακρυσμένη μετάσταση. Στην κλινική, η πιο κοινή μεταστατικό πρότυπο του καρκίνου των ωοθηκών, αναγνωρίζεται ως περιτοναϊκή εμφύτευση [8]. Λόγω του γεγονότος ότι η έγκαιρη περιτοναϊκή θέσεις μετάστασης είναι συνήθως πολύ μικρές για να ανιχνευθούν μακροσκοπικά [4], [9], το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης υποφέρει πάντα αυτή η κακή διάγνωση και μάρτυρες μια δραματική μείωση τερματικό όταν συμβαίνει μεγάλης κλίμακας περιτοναϊκή μετάσταση, από περίπου 90% στο στάδιο Ι του 2-80% στο στάδιο II-IV [4], [10], [11]. Ως εκ τούτου, είναι αναγκαίο να ανακαλύψει βιοδεικτών που σχετίζονται με μετάσταση που θα μπορούσε να βοηθήσει στην ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών όσο το δυνατόν νωρίτερα και όχι μέχρι την ευρεία διάδοση του όγκου έξω από τις ωοθήκες.

Η γλυκοζυλίωση είναι μια από τις πιο διαδεδομένες ανάρτηση -translational τροποποιήσεις που παράγει διάφορα είδη γλυκάνες που συχνά συνδέονται με πρωτεΐνες. Γλυκάνες συμμετάσχει σε σημαντικά γεγονότα παθοφυσιολογία κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της νόσου του όγκου [12], [13], [14]. Altered γλυκοζυλίωση είναι μια καθολική χαρακτηριστικό της κακοήθειας, και ορισμένες από αυτές τις τροποποιήσεις συμβάλλουν στην μεταστατική διεργασίες [12], [15]. Για παράδειγμα, η αυξημένη δραστικότητα ή την έκφραση της

N

-acetylglucosaminyltransferase V (MGAT5) και β-1, 6-ΟΙοΝΑο διακλαδισμένη

N-γλυκάνες

έχει βρεθεί σε υψηλά μεταστατικούς όγκους, όπως του παχέος εντέρου , ηπατική και του μαστού [16], [17], [18], [19], [20]. Επιπλέον, η μεταβολή στη σιαλυλίωση έχει αναφερθεί συμβάλλουν στην μετάσταση σε αυτά τα κύτταρα όγκου όπως επίσης [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27]. Επιπλέον, άλλα μοτίβα παρεκκλίνουσα γλυκοζυλίωση συμπεριλαμβανομένων των βασικών-φουκόζη, διχοτόμου ΟΙοΝΑο

N

-γλυκάνες έχουν γνωστό ότι συνδέεται με τη μετάσταση των πολλών κακοηθών κυττάρων [28], [29], [30], [31], [32]. Κατά συνέπεια, ο καρκίνος σχετίζεται με ανωμαλίες στην γλυκάνης δομές παρέχουν ένα συναρπαστικό σκεπτικό για νέα ανακάλυψη βιοδεικτών [33].

Στην περίπτωση του καρκίνου των ωοθηκών, παρεκκλίνουσα γλυκοζυλίωση έχει περιγραφεί σε πολλές μελέτες, κυρίως συμπεριλαμβανομένης της αυξημένης silylaiton και φουκοσυλίωσης της

O

-συνδεδεμένες γλυκάνες, υψηλότερα επίπεδα διπλής κεραίας

N

-συνδεδεμένες γλυκάνες, αυξημένα πυρήνα φουκοσυλίωσης, και διχοτομεί

N

-συνδεδεμένης γλυκοζυλίωσης [34]. Επί του παρόντος, ο ρόλος της γλυκοζυλίωσης τροποποίηση παίζοντας στη μετάσταση του καρκίνου των ωοθηκών έχει επίσης υποδειχθεί σε πολλές μελέτες. Για παράδειγμα, η σύνδεση mesothelin-MUC 16 που διευκολύνει την περιτοναϊκή μετάσταση των καρκίνων των ωοθηκών έχει αποδειχθεί

N

-γλυκάνη που εξαρτώνται από [35]. Η ικανότητα των κυττάρων προσκόλλησης να υαλουρονάνης σε κυτταρικές γραμμές καρκινώματος των ωοθηκών θα μπορούσε να τροποποιηθεί με την αφαίρεση τμημάτων υδατανθράκων από τις επιφάνειες των κυττάρων [36]. Αυτές οι μελέτες πρότειναν την εμπλοκή των γλυκανών στις διαδικασίες μετάσταση, ενώ ακριβής

N

-γλυκάνη αλλαγές που σχετίζονται με τη μετάσταση στον καρκίνο των ωοθηκών παρέμενε ασαφής, όπως εκείνες στην επιφάνεια των κυττάρων και των κυττάρων που εκκρίνεται γλυκοπρωτεϊνών. Δεδομένου ότι οι συγκεκριμένες αλλαγές γλυκάνης δομή σε καρκινικές κυτταρικές secretome μπορεί να αποτελούν πιθανές βιοδείκτες για την μη επεμβατική διάγνωση [37], σε αυτή τη μελέτη, επικεντρώθηκε στην αποκάλυψη της μετάστασης που σχετίζεται

N

-glycosylation μεταβολή σε γλυκοπρωτεΐνες που εκκρίνονται από ωοθηκών καρκινικά κύτταρα.

Οι ποσοτικοί Glycomics βασίζεται σε φασματομετρία μάζας (MS) έχει αποδειχθεί ότι είναι μια πολλά υποσχόμενη και ισχυρό εργαλείο για τον εντοπισμό παγκόσμιων μεταβολών των γλυκανών μεταξύ των διαφόρων βιολογικών δειγμάτων [38], [39], [40], η οποία περιλαμβάνει την ετικέτα δωρεάν στρατηγικές και σταθερές στρατηγικές σήμανση ισοτόπου. Ο πρώην μία είναι πολύ πιο απλή, ενώ η τελευταία είναι πιο ισχυρή. Μία ποσοτική μέθοδος Glycomics βασίζεται στην μεταβολική ενσωμάτωση των σταθερών ισοτόπων ετικέτες (ισοτοπική Ανίχνευση σάκχαρα και με γλουταμίνη, IDAWG) έχει αναφερθεί πρόσφατα [41]. Σε αυτή τη μέθοδο, διαφορικά σημασμένα κύτταρα μπορούν να αναμιχθούν μαζί νωρίς στη ροή της εργασίας, οι οποίες ελαχιστοποιούν οποιαδήποτε πιθανή προκατάληψη που εισάγονται κατά την επεξεργασία του δείγματος και προσφέρουν μια αξιόπιστη μέθοδο ποσοτικού [39], [42]. Στη μελέτη μας, διαφορετική από ποσοτική Glycomics ανάλυση των γλυκοπρωτεϊνών της κυτταρικής επιφάνειας χρησιμοποιώντας IDAWG αναφέρθηκε προηγουμένως, ποσοτική Glycomics μέθοδος που βασίζεται στην μεταβολική ενσωμάτωση των σταθερών ισοτόπων ετικέτες εργαζόταν στη διαφορική

Ν

-glycosylation ανάλυση των secretome μεταξύ δύο καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμές, SKOV3 και υψηλό μεταστατικό παράγωγο SKOV3-ip του. Ακολούθως, η μετάσταση σχετιζόμενη

N

-γλυκάνη αλλαγές στον καρκίνο των ωοθηκών που ανακαλύφθηκε από τη μέθοδο αυτή Glycomics περαιτέρω επικυρωμένων σε επίπεδο glycotransferase με διαφορετικές μοριακές βιολογικές τεχνικές, που περιλαμβάνουν PCR πραγματικού χρόνου, κηλίδωση Western, λεκτίνη κηλίδωση, transwell δοκιμασίας και ανάλυση ανοσοϊστοχημείας. Η συνολική ροή εργασίας στην μελέτη μας φαίνεται στο σχήμα 1. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη προσπάθεια να αποκαλύψει τη γενική εικόνα των μετάστασης που σχετίζονται με

N

-γλυκάνη μεταβολές σε καρκινικές κυτταρικές secretome ωοθηκών. Επιπλέον, μεταξύ αυτών των αλλαγών, η μείωση στο διχοτομημένου ΘΙοΝΑο τροποποίηση και την αντίστοιχη glycotransferase του (μαννοζυλο (Beta-1,4 -) – γλυκοπρωτεΐνης Βήτα-1,4-Ν-ακετυλγλυκοζαμινυλτρανσφεράση, MGAT3) έκφραση αποδείχθηκε ότι συνδέονται με υψηλότερες μεταστατικό δυναμικό. Η μελέτη παρέχει γνώσεις για την ανακάλυψη της μετάστασης που σχετίζονται βιοδεικτών, που θα μπορούσε να βοηθήσει στην ανίχνευση της πρώιμης περιτοναϊκή μετάσταση του καρκίνου των ωοθηκών, και, τέλος, τη βελτίωση της διάγνωσης του καρκίνου των ωοθηκών.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια και Metabolic σταθερό ισότοπο Labeling

υδαρής καρκίνου των ωοθηκών SKOV3 κυτταρική γραμμή και υψηλού μεταστατικού παράγωγο SKOV3-IP του ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). Αυτές οι δύο κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών αναπτύχθηκαν σε μέσα RPMI1640 κυττάρων (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen). κυτταρική σειρά 293Τ ελήφθη από το Ινστιτούτο Βιολογίας Κυττάρου Ακαδημαϊκών Sinica (Σαγκάη, Κίνα). Κύτταρα 293Τ διατηρήθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Για σταθερή πειράματα σήμανσης ισοτόπου, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί τουλάχιστον έξι διπλασιασμούς στο μέσο RPMI1640 με 10% ορό εμβρύου μόσχου, που περιέχει 20 mM Ε-γλουταμίνη (είτε

14Ν ή amide-

15Ν-Gln) για να επιτευχθεί πλήρης ενσωμάτωση τίτλο

Ν

-γλυκάνες [41]. Amide-

15N-Gin (98% καθαρότητα) αγοράστηκε από την Cambridge Isotopes, Inc. (Andover, MA, USA).

Το υπερκείμενο Απόκτηση

Έξι εκατομμύρια σημασμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε 55-cm

2 πιάτα κυτταρικής καλλιέργειας και διατηρήθηκε όλη τη νύκτα για την προσκόλληση των κυττάρων στο μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 20 mM Ε-γλουταμίνη (είτε

14Ν ή amide-

15Ν-Gln). Μετά από 12 ώρες, το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε, και τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα. Και στη συνέχεια 10 mL χωρίς ορό, φαινόλης μέσο ελεύθερο ερυθρού ΚΡΜΙ1640 με 20 mM Ε-γλουταμίνη (είτε

14Ν ή amide-

15Ν) προστέθηκαν σε κάθε τρυβλίο. Μετά από επώαση για 48 ώρες, το ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε και διηθήθηκε μέσω ενός 0,22 μm Durapore PVDF μεμβράνη (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). Πριν, κατά τη διάρκεια και μετά στέρηση ορού, η βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων εκτιμήθηκε με τη χρήση της τρυπάνης δοκιμασία αποκλεισμού μπλε βαφής. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των ρυθμισμένων μέσων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας έναν BCA κιτ προσδιορισμού πρωτεϊνών (Pierce, Rockford, IL). Το προσαρμοσμένο μέσο με ποσό ίσο πρωτεΐνη που λαμβάνεται από SKOV3 και SKOV3-ip αναμίχθηκαν. Στη συνέχεια, τα μίγματα συμπυκνώθηκαν με Amicon Ultra-15, 3000 αποκοπή μοριακού βάρους (MWCO) φυγοκεντρικές μονάδες ηθμού (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) με το υπερβολικό αλάτι αφαίρεση για ποσοτική Glycomics. Όλα τα δείγματα φυλάχθηκαν στους -80 ° C μέχρι περαιτέρω χρήσης.

Απελευθέρωση και καθαρισμός της Ν-γλυκανών από εκκρινόμενα Proteome

Ο

N

συνδεδεμένη γλυκάνη απελευθέρωσης και ο καθαρισμός διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως με ελάσσονες τροποποιήσεις [43]. Δείγματα του μικτού διαλύματος πρωτεΐνης (100 μL) αραιώθηκαν με ίσο όγκο ρυθμιστικό διάλυμα μετουσίωσης που αποτελείται από 200 mM ΝΗ

4HCO

3 (Sigma-Aldrich, Germany) που περιέχει 20 mM mdithiothreitol (Sigma-Aldrich, Germany). Τα δείγματα θερμάνθηκαν για 10 λεπτά σε λουτρό νερού 95 ° C. Μετά τα μετουσιωμένα δείγματα ψύχονται στη θερμοκρασία περιβάλλοντος δωματίου, 1 μι PNGase F (New England Biolabs, Inc., USA) προστέθηκαν σε κάθε δείγμα που ακολουθείται από ολονύκτια επώαση στους 37 ° C. Στη συνέχεια, οι πρωτεΐνες απογλυκοζυλιωμένη καταβυθίστηκαν με προσθήκη 600 μι ψυχρού αιθανόλης αποθηκευμένο στους -80 ° C για 2 ώρες. Μετά από φυγοκέντρηση στα 14.000 χ g, για 30 λεπτά στους 4 ° C, το υπερκείμενο συλλέγεται και ξηραίνεται μέσω φυγοκέντρησης κενού. Τα απελευθερωμένα γλυκάνες ήταν περαιτέρω καθαρισμένα και αφαλατώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα πορώδες Γραφικές άνθρακα στερεάς φάσης εκχύλιση (PGC-SPE). Για το σκοπό αυτό, οι PGC μικροστήλες συσκευάστηκαν με πορώδη γραφικά σκόνη άνθρακα και παρασκευάζονται χρησιμοποιώντας συμβουλές GELoader όπως περιγράφηκε προηγουμένως [44]. Οι μικροστήλες είχαν προετοιμάζονται με 6 όγκους στήλης 0.1% (ν /ν) τριφθοροοξικό οξύ (TFA) σε 80% ακετονιτρίλιο (ACN) /H

2O (ν /ν) και εξισορροπήθηκε με ίσο όγκο νερού. Στη συνέχεια, τα δείγματα εφαρμόστηκαν σε στήλες επανειλημμένα για 5 φορές για να επιτευχθεί πλήρης γλυκάνες προσρόφηση. Στη συνέχεια, οι μικροστήλες πλύθηκαν με περίπου 10 όγκους στήλης ύδατος για την απομάκρυνση των αλάτων και ρυθμιστικό. Γλυκανών εκλούστηκαν με 25% (ν /ν) ACN που περιέχει 0,05% (ν /ν) TFA. Κάθε δείγμα στη συνέχεια διαιρέθηκε σε δύο ίσα κλάσματα και λυοφιλοποιήθηκε σε ένα ξηραντήρα κατάψυξης κενού (Martin Christ GmbH, Osterode, Germany). Ένας ίσος κλάσμα από κάθε δείγμα αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι την περαιτέρω ανάλυση. Ένας άλλος ίση ποσότητα του κάθε δείγματος υπερμεθυλιωθεί.

υπερμεθυλίωση του

Ν

-γλυκάνες

Ν

-γλυκάνες είχαν υπερμεθυλιωθεί χρησιμοποιώντας μια προηγουμένως δημοσιευθεί διαδικασία με ανήλικο τροποποιήσεις [45]. Εν συντομία, ξηραίνεται

N-γλυκάνες

εναιωρήθηκαν σε 200 μι διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO), και περίπου προστέθηκαν 20 mg σκόνη ΝαΟΗ. Αφού ο πολτός αναμίχθηκε έντονα, 100 μL CH

3I προστέθηκε και η ακόλουθη επώαση διεξήχθη σε λουτρό υπερήχων για 30 λεπτά. Η αντίδραση σβήστηκε με προσθήκη 1 ml νερού, και η περίσσεια CH

3I απομακρύνθηκε υπό ένα ρεύμα αζώτου. Στη συνέχεια, 1 ml χλωροφορμίου προστέθηκαν με έντονη ανάμιξη. Μετά το διαχωρισμό φάσης, η υδατική φάση απορρίπτεται ενώ η κατώτερη φάση χλωροφορμίου πλύθηκε 10 φορές με 1 mL H

2O και ξηραίνεται κάτω από ένα ρεύμα αζώτου σε απαγωγό για /φασματομετρία μάζας ιονισμού υποβοηθούμενης από μήτρα εκρόφησης λέιζερ (MALDI MS) ανάλυση.

MALDI MS ανάλυση

MALDI ανάλυση φασματομετρίας μάζας πραγματοποιήθηκε σε AXIMA Συντονισμού MALDI QIT TOF MS (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) με ένα λέιζερ αζώτου 337 nm. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν σε μία τάση επιτάχυνσης 20 kV-στον τρόπο θετικού ιόντος και ανακλαστήρα. CID διεξήχθη σε μία ενέργεια σύγκρουσης του 4 keV χρησιμοποιώντας αργό σαν το αέριο σύγκρουσης. Το όργανο εξωτερικά βαθμονομηθεί από TOFMix ™ (LaserBio Labs, Γαλλία) που περιέχει πρότυπο βαθμονόμησης οκτώ πεπτίδια. Πριν από την ανάλυση MS, unpermethylated γλυκάνες ανασυστάθηκαν σε ένα κλάσμα 5-μι 0,1% (όγκος /όγκο, ν /ν) TFA σε 50% ACN /H

2O (ν /ν) και υπερμεθυλιωθεί γλυκάνες ανασυστάθηκαν σε ένα 5-μι κλάσμα 50% μεθανόλη. Κάθε δείγμα (1 μΙ) κηλιδώθηκε επί ενός MALDI στόχου και αφήνονται να στεγνώσουν στον αέρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Στη συνέχεια, 1 μί του 2,5-διυδροξυβενζοϊκού μήτρα οξύ (DHB, Sigma-Aldrich, Germany) σε συγκέντρωση 12,5 mg mL

-1 σε 50% ACN σε νερό (ν /ν) που περιέχει 0.1% προστέθηκε TFA πάνω στο στρώμα του δείγματος και ξηραίνεται κάτω από συνθήκες περιβάλλοντος. Κάθε δείγμα εθεάθη εις τριπλούν. Δύο βολές λέιζερ τέθηκαν για να δημιουργήσει ένα προφίλ και 200 ​​προφίλ συσσωρεύτηκαν από διαφορετικά σημεία της ακτινοβολίας λέιζερ σε ένα αρχείο για κάθε σημείο του δείγματος. Για τη σύγκριση των

Ν

-γλυκάνες από secretomes των δύο ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, ένα μίγμα 1:01 του

14N- και

15N-επισημασμένο δείγματα αρχικά λαμβάνονται μέσω ανάμειξη ίσων ξεκινώντας πρωτεΐνες ποσό. Και το μείγμα αναλύθηκε (τρεις επαναλήψεις) για να προσδιοριστεί σχετικές μεταβολές στις αφθονίες των

N-γλυκάνες

μεταξύ καρκίνου των ωοθηκών SKOV3 κυτταρική γραμμή και υψηλή μεταστατική παράγωγο SKOV3-IP. Όλες οι προτεινόμενες δομές προσδιορίζονται γλυκάνες ερμηνευόταν με βάση το χέρι για τους

m /z

τιμές σύμφωνα με το αρκετών προηγουμένως δημοσιευθεί λογοτεχνίες [46], [47], GlycoWorkbench [48], γλυκάνης Φασματομετρίας Μάζας Database [49], όπως καθώς και GlycoBase (Έκδοση 2, https://glycobase.nibrt.ie/glycobase.html).

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR για την ανάλυση της έκφρασης mRNA

Ολικά RNAs που προέρχονται από τον καρκίνο των ωοθηκών κυτταρικές σειρές με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ ™ (Invitrogen) και 2 μg ολικού RNA μεταγράφηκε ανάστροφα χρησιμοποιώντας κιτ RT Master Mix (Takara) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε σε ΑΒΙ 7500 Fast πραγματικό χρόνο σύστημα PCR (Applied Biosystems). Οι συνθήκες των κύκλων PCR συνίστατο από ένα μοναδικό στάδιο επώασης στους 95 ° C για 30 s, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 5 s στους 95 ° C, και 34 s στους 60 ° C. Όλες οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν με SYBR πράσινο Premix πραγματικό χρόνο PCR kit (Takara) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι εκκινητές οι αλληλουχίες που χρησιμοποιούνται στην ανάλυση PCR ήταν ως ακολούθως: ανθρώπινη MGAT3 εμπρός (5′-CAGGGCACAGGATTGAAGAGTT-3 ‘) και αντίστροφη ανθρώπινο MGAT3 (5′-AGCTTGGTTTCCCTTCATATTGAG-3′)? ανθρώπινο MGAT5 προς τα εμπρός (5’-GACCTGCAGTTCCTTCTTCG-3 ‘) και MGAT5 αντίστροφη ανθρώπου (5′-CCATGGCAGAAGTCCTGTTT-3′)? ανθρώπινο αφυδρογονάση αφυδρογονάση 3-φωσφορικής (GADPH) προς τα εμπρός (5’-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3 ‘) και GAPDH αντίστροφης ανθρώπου (5′-TGAGCGATGTGGCTCGGCT-3’). GADPH mRNA ανθρώπινη υπηρέτησε ως ενδογενής έλεγχος για την κανονικοποίηση. Real-time PCR ανάλυση πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.

πλασμίδια και υπερέκφραση της γονιδιακής

SKOV3-ip και SKOV3 κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Χ-tremeGENE HP DNATransfection (Roche Applied Science, Mannheim, Γερμανία ) με pcDNA3.1-MGAT3 ή pcDNA3.1-MGAT5 πλασμίδια, αντίστοιχα (που παρέχεται από έναν ερευνητή στο εργαστήριο μας), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Και φορέα pcDNA3.1 χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, η υπερέκφραση MGAT3 και MGAT5 επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση Western blot.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA και εξόντωση MGAT3

κύτταρα SKOV3 επιμολύνθηκαν με αντιδραστήριο διαμόλυνσης MGAT3 συγκεκριμένες siRNA Complex, (Santa Cruz Biotech, Inc., sc-44469), το οποίο παρασκευάστηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Κωδικοποιημένα siRNA χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, λύματα κυττάρων παρασκευάστηκαν για ανάλυση κηλίδος western για τον προσδιορισμό του γονιδίου knockdown αποτελεσματικότητα.

Western Blot και λεκτίνη Ανάλυση στυπώματος

Για να ληφθεί ολόκληρο κυτταρικές πρωτεΐνες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν , πλύθηκε με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) και μετά λύονται σε ρυθμιστικό διάλυμα SDS [50] λύσης. Οι ολικές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με δοκιμασία BCA (Pierce, Rockford, IL). Ίσες ποσότητες ολικής πρωτεΐνης προϊόντα λύσης από κάθε κυτταρική σειρά διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση δωδεκύλ θειικού πηκτής πολυακρυλαμιδίου 10% νάτριο (SDS-PAGE) και μετά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Roche Applied Science). εγώ. Η ανάλυση στυπώματος Western: Μετά από αποκλεισμό με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris που περιέχει 0.1% Tween 20 (TBST) επί 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι MGAT3 (1/1000 αραιωμένα, Sigma) ή MGAT5 (1/1000 αραιωμένο, Sigma) και στη συνέχεια ένα δεύτερο αντίσωμα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Μετά το πλύσιμο, οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγειας κιτ δοκιμασίας (ECL). ii. Λεκτίνη ανάλυση κηλίδας: Μετά τον αποκλεισμό με 5% BSA σε TBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με βιοτινυλιωμένο

Phaseolus vulgaris erythroagglutinin

(E-ΡΗΑ) (1/5000 αραιωμένο, Vector Labs) ή

Phaseolus vulgaris leucoagglutinin

(L-PHA) (1/5000 αραιωμένο, Vector Labs). Στη συνέχεια, οι μεμβράνες πλύθηκαν τέσσερις φορές με TBST, που ακολουθείται από επώαση με στρεπταβιδίνη υπεροξειδάσης χρένου (Vector Labs) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες πλύθηκαν τέσσερις φορές με TBST και ανιχνεύεται με κιτ προσδιορισμού ECL.

Transwell Δοκιμασία Μετανάστευσης

Για να αξιολογηθεί η ικανότητα των μεταναστευτικών, κυτταρική μετανάστευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση θαλάμων μορφή 24 φρεατίων transwell ( φίλτρου πόρων 8 μm, Corning, Canton, NY). Εν συντομία, τα κύτταρα SKOV3 επιμολύνονται με ειδικές siRNA MGAT3 ή MGAT5 πλασμίδιο και κύτταρα SKOV3-ΠΕ ήταν επιμολυσμένα με MGAT3 πλασμίδιο για 36 ώρες, αντίστοιχα. Μετά από αυτό, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, συλλέχθηκαν, μετρήθηκαν, και στη συνέχεια εναιωρήθηκε σε μέσο RPMI1640 ελεύθερο ορού. 2 × 10

4 κύτταρα σε 100 μΐ μέσου RPMI1640 χωρίς ορό platted σε κάθε ένθετο του άνω θαλάμου. Εν τω μεταξύ, 600 μι μέσου RPMI1640 που περιείχε 10% FBS προστέθηκε σε κάθε κατώτερο θάλαμο. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν για 12 ώρες στους 37 ° C. Μετά την απομάκρυνση των κυττάρων στην επιφάνεια του άνω μεμβράνης, τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τα κύτταρα που είχαν περάσει μέσα από το φίλτρο στον κάτω θάλαμο μετρήθηκαν μικροσκοπικώς σε 6 τυχαίες περιοχές ανά φίλτρο. Ο αριθμός των κυττάρων που διέσχισαν τη μεμβράνη αποκάλυψε την μεταναστευτική ικανότητα των δοκιμαζόμενων κυττάρων.

Ανοσοϊστοχημεία Ανάλυση

Ένα σύνολο 24 ωοθηκών καρκινικών ιστών μονιμοποιήθηκαν σε 4% φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Τομές ιστού πρώτα υποβάλλεται σε αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση για ιστοπαθολογική διάγνωση. Στη συνέχεια, ανοσοϊστοχημική χρώση χρησιμοποιώντας αντι-MGAT3 αντίσωμα (Abcam, Cambridge, MA, USA) διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [51]. Η ένταση της χρώσης MGAT3 κλιμακώθηκε από 0 έως 3, όπου το 0 αντιπροσωπεύει αρνητική χρώση, 1, 2, 3 σταθεί για αδύναμα, μέτρια και ισχυρή χρώση αντίστοιχα. Ωοθηκών καρκινικούς ιστούς ελήφθησαν από τη Μαιευτική και Γυναικολογική Κλινική Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Fudan, Σαγκάη της Κίνας. Όλα τα πρωτόκολλα έχουν εγκριθεί από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του νοσοκομείου. Όλοι οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση τους. Κλινικές πληροφορίες για αυτούς τους ασθενείς παρουσιάζονται στον Πίνακα S1.

Επεξεργασία Δεδομένων και Στατιστική Ανάλυση

MALDI MS και διαδοχική φασματομετρία μάζας (MS /MS) δεδομένα αποκτήθηκαν και επεξεργασία στο λογισμικό Launchpad (Shimadzu Biotech , Κιότο, Ιαπωνία). Οι παράμετροι της επεξεργασίας αιχμής: εξομάλυνση μέθοδο: Gaussian? αιχμής μέθοδος ανίχνευσης: κατώτατο όριο 25% του κέντρου βάρους? όριο offset: 0,500 mV. Η

m /z

αξίες και εντάσεις είχαν εξαχθεί ως αρχεία ASCII και μέγιστες εντάσεις κλιμακώθηκαν με την υψηλότερη κορυφή ως 100%. Η σχετική ποσοτικοποίηση των ανιχνεύεται

N

-γλυκάνες ήταν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που έχουν αναφερθεί προηγουμένως [42]. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism (έκδοση 5). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον τρεις φορές. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως το μέσο ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Του Student

t-test

χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία των διαφορών μεταξύ των δύο ομάδων. Wilcoxon Signed Ranks Test χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των δεδομένων ανοσοϊστοχημεία από τις δύο ομάδες. Ένα

σ

-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Ποσοτικά /Συγκριτική Ανάλυση Glycomics του υπερκειμένου μεταξύ SKOV3 και SKOV3-ip κυττάρων

Για να ανακαλύψετε το μετάστασης που σχετίζονται με

Ν

-γλυκάνη μεταβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών secretome, η συνολική ομάδα των

Ν

-γλυκάνη μείγμα, που απελευθερώνεται από το ένζυμο Peptide

Ν

γλυκοσιδάσης F από την secretome μίγμα SKOV3 (amide-

15N-Gin επισημασμένα) κύτταρα SKOV3-ip και (amide-

14N-Gin επισημασμένο), αναλύθηκε με MALDI-QIT-TOF MS ( Σχήμα 2). Ένα σύνολο από 17

Ν

-γλυκάνες εντοπίστηκαν, συμπεριλαμβανομένων των υψηλών μαννόζη, υβριδικές, διακλαδώσεων, τετρα-κεραιοειδείς δομές και διχοτομεί glycoforms ΟΙοΝΑο. Όλες τις προσδιοριζόμενες

N

-γλυκάνες με την προτεινόμενη δομή δείχθηκαν στο Σχήμα 2 και συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

N

-συνδεδεμένες γλυκάνες από ένα μίγμα 1:01 των SKOV3 -ip (Gln-14 επισήμανση) και SKOV3 (Gln-15 επισημασμένο) υπερκείμενο. Οι δομές ερμηνεύθηκαν με το χέρι με βάση την τους

m /z

τιμές σύμφωνα με αρκετές προηγουμένως δημοσιευθέντα βιβλιογραφίες [46], [47], GlycoWorkbench [48], καθώς και Glycan φάσματος μάζας Database [49]. Gin-14 δείχνει amide-

14N-Gin? Gin-15 δείχνει amide-

15N-Gin. Πράσινος κύκλος δείχνει μαννόζη? κίτρινο κύκλο δηλώνει γαλακτόζη? μπλε τετράγωνο υποδεικνύει

Ν

-ακετυλογλυκοζαμίνης? κόκκινο τρίγωνο δείχνει φουκόζης.

Η

Η ποσοτική ανάλυση των

Ν

-γλυκάνες από την secretome μίγμα SKOV3 και κύτταρα SKOV3-ip βασίστηκε σε εντάσεις σήματος. αναλογίες έντασης (SKOV3-ip /SKOV3) των 0,83 και 1,2 τέθηκαν ως όριο για να εκτιμηθεί η καθοδική ή ανοδική ρύθμιση του

Ν

-γλυκάνη επίπεδα στα κύτταρα SKOV3-ip, σε σύγκριση με τα κύτταρα SKOV3 , δεδομένου ότι το μέγιστο συντελεστή διακύμανσης (CV) (n = 9) ήταν κάτω του 20% σε αυτή τη μελέτη [43]. Σχετική ποσοτικοποίηση όλων ανιχνεύεται

Ν

-γλυκάνες μεταξύ SKOV3-ip και τα κύτταρα SKOV3 συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τρεις από τις τέσσερις δομές υψηλής μαννόζης ήταν επάνω-ρυθμίζονται σε κύτταρα SKOV3-ip.

Ν

-γλυκάνες που περιέχουν υβριδικά, διακλαδώσεων, και τετρα-κεραιοειδείς δομές με ή χωρίς φουκόζης ήταν αυξημένα στα κύτταρα SKOV3-ip. Η παρόμοια τάση παρατηρήθηκε σε τρεις γλυκάνες με πολύπλοκες διπλής κεραίας δομές. Ανάμεσα σε όλες τις μεταβολές στο

Ν

-γλυκάνες, όλα τα

Ν

-γλυκάνες με διχοτομεί ΟΙοΝΑο βρέθηκαν να είναι εμφανώς μειωμένη στα κύτταρα SKOV3-ip, με SKOV3-ip αναλογίες τους /SKOV3 που κυμαίνονται 0,73 – 0,12, ενώ όλη η β-1,6 ΟΙοΝΑο-διακλαδισμένης

Ν

-γλυκάνες ήταν αυξημένα στα κύτταρα SKOV3-ip. Μεταξύ αυτών μεταβάλλεται

Ν

-γλυκάνες, εστιάσαμε στο

Ν

-γλυκάνες με διχοτομεί ΟΙοΝΑο, εν μέρει επειδή όλοι τους μειώθηκε και ήταν το πιο προφανές μεταβληθεί

Ν

γλυκάνες. Επιπλέον, ένας αυξανόμενος όγκος στοιχείων έδειξε ότι οι διχοτομεί γλυκάνες μπορεί να επηρεάσει την εξέλιξη του όγκου και των μεταστάσεων [52] .Οι δομές που περιέχουν διχοτόμο ΟΙοΝΑο επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με διαδοχική φασματομετρία μάζας (MS /MS). Εκπρόσωπος tandem MS φάσματα του

m /z

2012.7 [Μ + Na]

+, και

m /z

2377.8 [Μ + Na]

+ παρουσιάστηκαν στα σχήματα S1 Α -Β.

είναι αξιοσημείωτο ότι σιαλικά οξέα, τυπικά παρουσιάζονται ως τερματικό μονοσακχαρίτες στην γλυκάνης ήμισυ πολλών γλυκοπρωτεϊνών, παίζουν ουσιαστικό ρόλο σε πολλές φυσιολογικές και παθολογικές διεργασίες. Σιαλυλιωμένης γλυκάνες είναι ασταθή και εύκολα να χαθούν κατά τη διάρκεια της απευθείας ανάλυση φασματομετρίας μάζας μη παραγωγοποιημένη

N

-γλυκάνες. Όπως υπερμεθυλίωση μπορούν να σταθεροποιήσουν τα υπολείμματα σιαλικού οξέος με μετατροπή πολύ πολικές -ΟΗ και -COO

– ομάδες των διαφόρων μονοσακχαριτών σε μη πολικά [38],

N-γλυκάνες

μετά υπερμεθυλίωση αναλύθηκαν επίσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι παρατηρήθηκαν πιο

Ν

-γλυκάνες με διαφορετικό βαθμό σιαλυλίωσης σε σύγκριση με τα αποτελέσματα της ανάλυσης χωρίς υπερμεθυλίωση. Παρά το γεγονός ότι το σήμα ενός

Ν

-γλυκάνη με διχοτομεί ΟΙοΝΑο μπορεί να αποκεντρωθεί σε πολλά σήματα των

Ν

-γλυκάνες με διαφορετικό βαθμό σιαλυλίωσης, η τάση μεταβολής σε όλες τις διχοτομεί δομές ΟΙοΝΑο ήταν η ίδια δεν έχει σημασία υπερμεθυλιωθεί ή όχι (βλέπε Εικόνα S2). Η ένταση του σήματος του διχοτομεί

N

-γλυκάνη χωρίς υπερμεθυλίωση (Σχήμα S2A,

m /z 2012,6

για παράδειγμα) ήταν υψηλότερο από εκείνο της υπερμεθυλιωθεί

N

-γλυκάνες σε

m /z 2489,4

,

m /z 2850,3

και

m /z 3211,4

περιέχουν 0, 1 και 2 σιαλικά οξέα αντιστοίχως (Σχήμα S2B). Είναι πιθανώς επειδή μέρος του αρχικού διχοτόμου ένταση του σήματος (Σχήμα S2A) ήταν συνέβαλε τα αντίστοιχα θραύσματα των γλυκανών με ίδια δομή, ενώ περιέχει επιπλέον 1 και 2 σιαλικά οξέα (Εικόνα S2B). Επιπλέον, οι γλυκάνη προφίλ με υπερμεθυλίωση ήταν πιο πολύπλοκη (δηλαδή, έχουν περισσότερα κορυφές). Με αυτόν τον τρόπο, προτείνεται ότι το στάδιο υπερμεθυλίωση πιθανώς θα μπορούσε να παραλειφθεί σε ποσοτική Glycomics ανάλυση αυτών των ουδέτερων

N

-γλυκάνες που είναι άσχετος προς σιαλικών οξέων, όπως διχοτομεί ΟΙοΝΑο γλυκομορφής σε αυτή τη μελέτη.

διαφορική έκφραση των MGAT3 σε SKOV3-ip και SKOV3 κυττάρων Lines

Καθώς διασχίζει υπόλειμμα ΟΙοΝΑο συντέθηκε από συγκεκριμένες glycosytransferase (MGAT3), η αλλαγή στο

Ν

-γλυκάνες με διχοτομεί ΟΙοΝΑο θα μπορούσαν να συσχετιστούν με την αντίστοιχη μεταβολή στην MGAT3. Ως εκ τούτου, σε πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR διεξήχθη για να συγκρίνουν τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της MGAT3 μεταξύ SKOV3 και κυτταρικές γραμμές SKOV3-ip. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι MGAT3 είχε εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών. Το επίπεδο του mRNA της MGAT3 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κύτταρα SKOV3 από ότι σε κύτταρα SKOV3-ip (61-φορές,

ρ

& lt? 0.001, Εικόνα 3Α). Στη συνέχεια, η έκφραση του MGAT3 σε αυτό δύο κυτταρικές σειρές αξιολογήθηκε περαιτέρω σε επίπεδο πρωτεΐνης με ανάλυση κηλίδος Western. Το κατώτερο αφθονία του MGAT3 παρατηρήθηκε για τα κύτταρα SKOV3-ip σε αντίθεση με κύτταρα SKOV3 (Σχήμα 3Β). Ως εκ τούτου, μειωμένη έκφραση MGAT3 σε δύο επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης στα κύτταρα SKOV3-ΠΕ ήταν, σύμφωνα με μειωμένη διχοτόμο τροποποίηση GluNAc στο υπερκείμενο κυττάρων SKOV3-ip που εκδηλώνεται με την ποσοτική ανάλυση Glycomics.

Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA (Α) MGAT3 σε SKOV3-ip και κυτταρικές σειρές SKOV3. Τα επίπεδα mRNA του MGAT3 κανονικοποιήθηκαν με τα επίπεδα GAPDH. Μέση πολλαπλάσια μεταβολές υπολογίστηκαν με το 2

-ΔΔCt μέθοδο. (Β) Τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του MGAT3 σε SKOV3-ip και κυτταρικές σειρές SKOV3. Τα κυτταρολύματα απομονώθηκαν με 10% SDS-PAGE για την κηλίδωση Western με τη χρήση αντισώματος έναντι MGAT3. Ανθρώπινη βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενή έλεγχο. 293Τ κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο ± SEM. Κάθε δοκιμασία πραγματοποιήθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Ένα

σ

-τιμή μικρότερη από 0.05 δείχνει στατιστική σημαντικότητα χρησιμοποιώντας Φοιτητών

t-test

.

Η

Επιδράσεις της MGAT3 για τη Μετανάστευση ικανότητα των κυττάρων του καρκίνου των ωοθηκών

τα παραπάνω στοιχεία έδειξαν ότι τα επίπεδα της MGAT3 και catalysate του,

Ν

-γλυκάνες που περιέχουν διχοτόμο ΟΙεΝΑο, ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε κύτταρα SKOV3-ip σε σύγκριση με εκείνη στα κύτταρα SKOV3. Δεδομένου ότι τα κύτταρα SKOV3-ip είναι τα άκρως μεταστατικά παράγωγα κύτταρα SKOV3, τα αποτελέσματα αυτά πρότειναν έναν πιθανό ρόλο της MGAT3 και catalysate της, διχοτομεί γλυκάνες, για τον καρκίνο κυτταρική κινητικότητα των ωοθηκών. Για να δοκιμάσετε αυτό, το γονίδιο MGAT3 ήταν υπερεκφράζεται σε κύτταρα SKOV3-ip από επιμόλυνση. ανάλυση κηλίδας Western έδειξε μια σημαντική αύξηση στην έκφραση MGAT3 μετά την επιμόλυνση, σε σύγκριση με τα κύτταρα SKOV3-ip-μάρτυρα (Σχήμα 4Α). Το επίπεδο που διχοτομεί γλυκάνες επίσης αυξημένα αναλόγως (Σχήμα 4Β). Για να επιβεβαιώσει εάν η υπερέκφραση της MGAT3 να επηρεάσουν την ικανότητα της μετανάστευσης, πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες μετανάστευσης trans-καλά. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4C και 4D, ικανότητα μετανάστευσης σε MGAT3 επιμολυσμένα κύτταρα ήταν σημαντικά μειωμένη στο 52% του ότι στα κύτταρα ελέγχου. Εν τω μεταξύ, knockdown του MGAT3 σε κύτταρα SKOV3 διεξήχθη με MGAT3 στόχευση siRNA διαμόλυνση. Η ανάλυση στυπώματος Western κατέδειξε αποτελεσματική καταστολή της έκφρασης MGAT3 σε SKOV3 μετά την επιμόλυνση (Σχήμα 5Α). Το επίπεδο που διχοτομεί γλυκάνες ρυθμίζεται προς τα κάτω ανάλογα (Σχήμα 5Β).