Αφηρημένο

Η ανάπτυξη μιας ανεξάρτητης παροχής αίματος από έναν όγκο είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της ανάπτυξης πέρα ​​από ένα ορισμένο μέγεθος και για την παροχή ενός portal για την μεταστατική διάδοση. ενδοθηλιακά κύτταρα που προέρχονται από ξενιστή (ECS) που κατοικούν μέσα και να θέτει σε κίνδυνο την αγγείωση του όγκου προέρχονται μέσω διακριτές διαδικασίες που είναι γνωστές ως βλάστησης αγγειογένεση. Πιο πρόσφατα ECs που προέρχονται απ ‘ευθείας από τα ίδια τα κύτταρα του όγκου έχουν περιγραφεί, αν και η βάση για αυτό το φαινόμενο παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Εδώ περιγράφουμε

in vitro

συνθήκες που επιτρέπουν πνευμόνων και των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα να υποβληθούν σε μια ταχεία και αποτελεσματική μετάβαση σε ECs που είναι δυσδιάκριτες από εκείνες που λαμβάνονται

in vivo

. Μια ποικιλία μεθόδων χρησιμοποιήθηκαν για να αποδείξουν ότι τα απέκτησαν φαινότυποι και τις συμπεριφορές αυτών των όγκων που προέρχονται από ECs (TDECs) μοιάζουν πολύ με εκείνα της αυθεντικής ECs. Ξενομοσχεύματα που προκύπτουν από την συν-εμβολιάζονται

κύτταρα in vitro

προερχόμενο TDECs και του όγκου ήταν επίσης πιο πολλά αγγεία από τους όγκους ελέγχου? Επιπλέον, τα αιμοφόρα αγγεία τους ήταν κατά μέσο όρο μεγαλύτερα και συχνά περιείχε προσμίξεις ECs που προέρχονται από ξενιστή και TDECs που προέρχεται από το αρχικό εμβόλιο. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να αλλοιωθεί υπό σαφώς καθορισμένες

in vitro

συνθήκες να ξεκινήσει μια μετάβαση όγκου κυττάρου-προς-ΕΚ που είναι σε μεγάλο βαθμό κύτταρο-αυτόνομο, υψηλής απόδοσης και στενά μιμείται το

in vivo

διαδικασία. Οι μελέτες αυτές παρέχουν ένα κατάλληλο μέσο με το οποίο για την αναγνώριση και ίσως να τροποποιήσετε τα πρώτα βήματα στον τομέα της παραγωγής TDEC

Παράθεση:. Elster JD, McGuire TF, Lu J, Prochownik EV (2013) Rapid

In Vitro

Παραγωγή από Ενδοθήλιο απευθείας από ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 8 (10): e77675. doi: 10.1371 /journal.pone.0077675

Συντάκτης: Ken Arai, Γενικό Νοσοκομείο της Μασαχουσέτης /Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 28, 2013? Αποδεκτές: 11 του Σεπτέμβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 9, Οκτώβρη του 2013

Copyright: © 2013 Elster et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ΝΙΗ RO1 επιχορήγηση CA140624 να EVP και μετα-διδακτορική Υποτροφία ενός Αγίου Baldrick να J.D.E. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Σε πρώιμα στάδια της, μια αρχόμενη όγκου πληροί μεταβολικές του ανάγκες μέσω απλή διάχυση των θρεπτικών συστατικών και των προϊόντων αποβλήτων [1-3]. Μετά την επίτευξη μια ορισμένη κρίσιμη μάζα, ωστόσο, η διάχυση δεν αρκεί πλέον για το σκοπό αυτό και περαιτέρω ανάπτυξη απαιτεί την ανάπτυξη ενός ανεξάρτητου αγγειακό σύστημα [3,4]. Χωρίς αυτό, το λήθαργο του όγκου ακολουθεί και μπορεί να διαρκέσει για χρόνια στη διάρκεια των οποίων πρόσθετες πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων αντισταθμίζεται από αποπτωτικά ή νεκρωτικό θάνατο [5,6]. Η επαγωγή μιας «αγγειογενετική διακόπτη», σύμφωνα με την οποία η αγγειακή παροχή δεν είναι πλέον περιοριστικό του ρυθμού, αναγνωρίζεται πλέον ως ένα κρίσιμο παράγοντα της μετέπειτα ανάπτυξης ενός όγκου, η επικοινωνία της με την συστηματική κυκλοφορία, και μεταστατικό διάδοση της [3,4]. Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, αγγειακή πυκνότητα είναι ένα καλά αναγνωρισμένο προγνωστικός παράγοντας σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, νευροβλάστωμα, και το αστροκύτωμα /γλοιοβλάστωμα [7-10].

Η αγγειογενετική διακόπτης είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει την επεξεργασία από τη χωρίς αγγεία του όγκου κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων όπως η αγγειακή ανάπτυξη ενδοθηλιακό παράγοντα (VEGF), παράγοντα ανάπτυξης ινοβλάστης (bFGF), τον προερχόμενο από αιμοπετάλια αυξητικό παράγοντα (PDGF) , αυξητικό παράγοντα εξαλλαγής βήτα (ΤΟΡ-β), και μια ποικιλία από αγγειοποιητίνες [1,11-13]. Μερικές από αυτές είναι χημειο-προσελκυστικά που κινητοποιούν τα δύο ώριμα και προγονικά ενδοθηλιακά κύτταρα (ECs) από τον μυελό των οστών και το αυτοκίνητο ωρίμανση τους και την οργάνωση σε αιμοφόρα αγγεία ( «αγγειογένεση»), ενώ άλλες επάγουν την ενδοθήλιο των γειτονικών αιμοφόρων αγγείων να πολλαπλασιάζονται και να εισβάλουν ο όγκος ( «βλάστησης αγγειογένεση») [14-16].

Το έξτρα-καρκινική προέλευση της νεοαγγείωσης σημαίνει ότι συστατικό των κυττάρων του είναι τόσο γενετικά κανονική και σταθερή και ως εκ τούτου σε μεγάλο βαθμό το ανοσοποιητικό για την ανάπτυξη της αντοχής στα χημειοθεραπευτικά που προκύπτει συνήθως μέσα στον πληθυσμό γονιδίωμά ασταθή καρκινικών κυττάρων. Πράγματι, αντι-αγγειογένεσης θεραπείες είναι εν μέρει βασίζεται στην υπόθεση ότι το αγγειακό σύστημα του όγκου διατηρεί την σταθερότητα του γονιδιώματος του πληθυσμού πρόδρομο κύτταρο του [17,18]. Bevacizumab, το πρώτο κλινικά χρήσιμες αναστολέας αγγειογένεσης, είναι ανθρωποποιημένο αντι-νΕΟΡ μονοκλωνικό αντίσωμα (mAb) που έδειξε νωρίς υπόσχεση στην θεραπεία μιας ποικιλίας καρκίνων προηγμένων [19-22]. Ωστόσο, σχεδόν όλες οι απαντήσεις είναι ελλιπείς ή /και παροδικές ως όγκοι τελικά εκ νέου δημιουργήσει αγγεία και να σταματήσει να ανταποκρίνεται στην περαιτέρω θεραπεία με το mAb. Ως αποτέλεσμα, η συνολική επιβίωση των ασθενών έχει βελτιωθεί μόνο συγκρατημένα, αν όχι καθόλου [19-23].

Πρόσφατα, εμείς και άλλοι έχουν παράσχει μια πιθανή εξήγηση για τις ατελείς αποκρίσεις σε αντι-αγγειογένεσης παράγοντες, δείχνοντας ότι μια σημαντική υπο-πληθυσμού των ΑΕΚ που σχετίζονται με όγκους απορρέουν άμεσα από τον εαυτό τους [24-28] τα καρκινικά κύτταρα. Αυτά τα «προέρχεται από όγκο ECs» (TDECs) εκφράζουν μια ποικιλία δεικτών ΕΚ, ρυθμίζουν προς τα κάτω επιθηλιακή δείκτες και σχηματίζουν λειτουργικά σκάφη

in vivo

όπου ανάμιξη με επιπλέον-ογκικά προερχόμενο ECs. Επειδή περιέχουν τα ίδια χρωμοσώματα δείκτη όπως ο πληθυσμός καρκινικών κυττάρων, προτάθηκε ότι, όπως και τα ίδια τα κύτταρα του όγκου, TDECs ήταν γονιδίωμά ασταθή [24-28]. Συνεπής με αυτή την ιδέα, ο σειριακός πέρασμα του TDECs οδηγεί στην τελική ανάδυση του κλωνικά προερχόμενων πληθυσμούς που εκφράζουν προοδευτικά πιο ισχυρή φαινοτύπους ΕΚ και είναι γενετικώς σχετίζονται με αλλά διακριτή από αμφότερες τις καρκινικά κύτταρα και TDECs έγκαιρης πέρασμα [24]. Οι TDEC έχουν προσδιοριστεί σε ένα μοντέλο ποντικού γλοιοβλαστώματος [27] και σε ανθρώπινα ξενομοσχεύματα γλοιοβλαστώματος [26,28]. Νωρίτερα, αλλά ασαφή μελέτες είχαν επίσης προτείνει την παρουσία TDECs σε άλλες πρωτογενείς ανθρώπινους όγκους [29-31]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η παραγωγή TDEC είναι μια ευρέως διαδεδομένη, αν όχι καθολική, φαινόμενο και ότι η αντίσταση σε αντι-αγγειογενετική θεραπείες μπορεί να προκύψουν ως αποτέλεσμα της εγγενούς TDEC γενωμική αστάθεια.

Το εύρημα που TDECs αποτελούν ένα λειτουργικά σημαντικό και διακριτό πληθυσμό ΕΚ εγείρει μια σειρά από ερωτήματα που είναι δύσκολο ή αδύνατο να αντιμετωπιστούν με τη μελέτη πρωτογενών όγκων ή ξενομοσχεύματα όγκου. Αυτές περιλαμβάνουν την φύση και τη σχετική σημασία των σημάτων που εκκινούν την κυτταρική όγκου σε TDEC μετάβαση, της χρονικής περιόδου για την οποία συμβαίνει αυτό, αν ανάπτυξη και τη συντήρηση TDEC είναι κυτταρικές αυτόνομα και εάν όλα τα κύτταρα εντός ενός όγκου είναι σε θέση να παράγει TDECs. Περιγράφουμε εδώ την ανάπτυξη ενός

in vitro

σύστημα που μας επιτρέπει να αντιμετωπίσουμε αυτά τα ζητήματα. Χρησιμοποιώντας συνθήκες που ευνοούν την ανάπτυξη των ECs και μιμούνται την υποξική και θρεπτικά συστατικά στερούνται μικροπεριβάλλον του όγκου, δείχνουμε ότι μια ισχυρή φαινότυπος ΕΚ μπορούν να δημιουργηθούν εύκολα από καρκινικά κύτταρα και ότι η βέλτιστη επαγωγή απαιτεί συνεργιστική συνεργασία αυτών των παραγόντων. Οι ιδιότητες του

στο vitro- προέρχονται

TDECs είναι σχεδόν δυσδιάκριτες από εκείνες που απομονώνεται απευθείας από όγκους. Επιπλέον, συν-εμβολιασμό τους με κύτταρα όγκου οδηγεί στην ανάπτυξη ξενομοσχευμάτων με ένα πυκνότερο αγγειακού συστήματος του όγκου και, σε μερικές περιπτώσεις, μια πιο γρήγορη ρυθμό ανάπτυξης. Αυτές οι μελέτες παρέχουν έτσι ένα απλό και ποσοτικά μέσα με τα οποία μπορούν να μελετηθούν TDEC οντογένεση και χειραγωγείται από την ίδρυσή της, υπό καθορισμένες συνθήκες.

Αποτελέσματα

Έκφραση των δεικτών ΕΚ σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κάτω από καθορισμένες

in vitro

συνθήκες

Εμείς αρχικά προσπάθησε να προσδιορίσει τις συνθήκες που προάγουν ένα καρκινικό κύτταρο σε μετάβαση TDEC

in vitro

. Για τις μελέτες αυτές, χρησιμοποιήσαμε το καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών OVCAR3 Η460 ανθρώπου και CaLu1 μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα, ο καρκίνος του προστάτη PC3 και. Κατά την επιλογή συνθηκών καλλιέργειας, υποθέσαμε ότι ένας συνδυασμός του ΕΚ-ειδικών μέσο ανάπτυξης και μέτρια υποξία, ίσως σε συνδυασμό με την εξάντληση ορισμένων θρεπτικών ουσιών, θα μπορούσε να ανακεφαλαιώσουμε το

in vivo

περιβάλλον που παρέχει το σήμα (ες) για TDEC μύηση. Ως εκ τούτου, τα καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν είτε σε ΕΚ-ειδικά EGM-2 μέσο + νορμοξίας (κατάσταση 1), πρότυπο μέσο ανάπτυξης + υποξία (κατάσταση 2) ​​ή ένας συνδυασμός των EGM-2 μέσο + υποξία (κατάσταση 3). Για OVCAR3 κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε επίσης μέσο συμπληρωμένο με Glutamax ΕΚ ειδικούς παράγοντες ταυτόσημες με εκείνες σε μέσο EGM2 αλλά στερούνται ασπαραγίνη, ασπαρτικό οξύ, γλουταμίνη και προλίνη + υποξία (κατάσταση 4) ή στο ίδιο μέσο + νορμοξία (κατάσταση 5). Αναφερόμαστε σε αυτό το σύνολο των προϋποθέσεων συλλογικά ως «ΕΚ-προώθηση». Όγκου κύτταρα διατηρήθηκαν σε πρότυπο τους συνιστάται μέσο ανάπτυξης υπό συνθήκες ορθοξικές χρησίμευσε ως αρχικό σημείο ελέγχου. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από αυτά τα δείγματα και αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση για την έκφραση του παράγοντα νοη Willebrand (vWF), η οποία είναι αξιόπιστα επάγεται κατά την διάρκεια του όγκου κυττάρου σε TDEC μετάβαση

in vivo

[24,25]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S1, οι περισσότερες από τις κυτταρικές σειρές όγκων που καλλιεργούνται κάτω από πρότυπες συνθήκες έδειξαν μικρή ή καθόλου έκφραση του vWF. Σε αντίθεση, vWF προκλήθηκε σε διάφορους βαθμούς κάτω από διαφορετικές συνθήκες ΕΚ προαγωγής με τα υψηλότερα και πιο σταθερά επίπεδα συνήθως να δει υπό συνθήκη 3. Αν και ο χρόνος για να επιτευχθεί η μέγιστη επαγωγή ποικίλη μεταξύ των δοκιμαζόμενων γραμμών και ήταν μερικές φορές παροδική, ήταν γενικά μέγιστη μεταξύ δ 3-5 και δεν εν συνεχεία αυξάνονται.

Αφού διαπιστώθηκε συνθήκες κάτω από τις οποίες να επιτευχθεί η μέγιστη έκφραση vWF σε κάθε κυτταρική σειρά, επεκτείναμε την αρχική μας αναλύει για να συμπεριλάβει πρόσθετες ΕΚ-ειδικούς δείκτες που χρησιμοποιούν δοκιμασίες ανοσο-φθορισμού που βασίζεται, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24,25]. Για τις μελέτες αυτές, επικεντρωθήκαμε σε Η460 και OVCAR3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 5 ημέρες υπό συνθήκες 3 και 4, αντίστοιχα. Οι ΕΚ-ειδικές πρωτεΐνες αναλύθηκαν και πάλι περιλαμβάνονται vWF καθώς και VEGFR1, VEGFR2, VE-cadherin και μόριο προσκόλλησης ΕΚ-εκλεκτικοί (ESAM). Επιπλέον, η σύνδεση του

Ulex europeus

λεκτίνη (E-λεκτίνη), η πρόσληψη ακετυλιωμένων χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (AcLDL), και η μορφολογία ακολουθήθηκαν ως δείκτες της πιο περίπλοκη φαινοτύπων ΕΚ. Κυτοκερατίνες 7 (CK7) και 19 (CK19) εξετάστηκαν επίσης ως δείκτες για το επιθηλιακό φαινότυπο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, όλοι οι δείκτες ΕΚ προκλήθηκαν σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές ενώ και οι δύο είχαν κυτοκερατίνες αισθητά κάτω ρυθμισμένα. Αυτές οι αλλαγές που εμπλέκονται τόσο το ποσοστό των κυττάρων που χρωματίζονται για τους δείκτες, καθώς και η ένταση της χρώσης θετικού κυττάρου. Έτσι, τα πρότυπα έκφρασης όλων των δεικτών μιμηθεί στενά αυτές που παρατηρήθηκαν με TDECs προέρχεται από την πραγματική μοσχευμάτων όγκων [24,25].

(

Α

) Η460 κύτταρα αναπτύχθηκαν για 5 d υπό τον όρο 3 . (

Β

) κύτταρα OVCAR3 αναπτύχθηκαν για 5 d υπό τον όρο 4. χρώση αντισώματος για την ΕΚ-ειδικούς δείκτες vWF, VEGFR1, VEGFR2, VE-cadhherin, ESAM, σύνδεση της Ε-λεκτίνη και πρόσληψη ακετυλιωμένων AcLDL πραγματοποιήθηκαν σε δύο σύνολα κυττάρων όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24,25]. χρώση των επιθηλιακών δείκτη έγινε για CK7 και CK19. Αντιχρωματισμός με DAPI διεξήχθη για να απεικονίσει πυρήνες. Οι φωτεινές εικόνες πεδίο των καρκινικών κυττάρων και TDECs περιλαμβάνονται επίσης. Εικόνες ελήφθησαν είτε 40-60X μεγέθυνση (ομοεστιακό) ή 10Χ μεγέθυνση (φωτεινό πεδίο). Οι αριθμοί στην επάνω δεξιά γωνία του κάθε πάνελ δείχνουν το ποσοστό του κάθε πληθυσμού που επέδειξε κανένα αποδεικτικό στοιχείο της χρώσης, ανεξάρτητα από την έντασή του. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. μπαρ Κλίμακα = 25 um.

Η

Λειτουργική ανάλυση του

in vitro

προερχόμενο TDECs

Για την περαιτέρω σύγκριση των φαινοτύπων της ΕΚ

στο vitro-

προέρχεται TDECs με εκείνα από τις πραγματικές ξενομοσχεύματα όγκου, εξετάσαμε την πρώην κυττάρων για την ικανότητά τους να σχηματίζουν σωλήνα όπως δομές σε ημι-στερεό μέσο. Για τις μελέτες αυτές, Η460 κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό πρότυπες συνθήκες ανάπτυξης (έλεγχος) ή υπό συνθήκες 1-3 για 5 d οπότε και απλώθηκαν σε ημι-στερεό μέσο και καλλιεργούνται υπό φυσιολογική οξυγόνωση για 5 επιπλέον ημέρες. Σύμφωνα με τις δύο πρότυπο και ΕΚ-προώθηση προϋποθέσεις 1 ή 2, Η460 κύτταρα συνεχίστηκε ως μεμονωμένα κύτταρα ή σχηματίζεται άμορφο acini, ενώ καλλιεργώντας υπό τον όρο 3 σημαντικά ενισχυμένη σχηματισμό σωλήνα (Εικόνα 2Α). Ποσοτικοποίηση της αυτό έδειξε σχηματισμό σωλήνα δια Η460 κύτταρα που πρόκειται να αυξηθεί κατά 10 έως 3/90-95 3/ 9521 3/90-9541 3/80 3/9061 3/ 952 3/90-95 3/ 9522 5/90-9542 3/90 3/9062 3/ 9535/80 3/90-9523 5/ 9543 3/ 95 3/9563 3/ 345/ 95 3/ 9524 3/ 9544 3/ 95 3/9064 3/ 9555/ 95 3/80253-5/ 9545 3/ 95 3/9065 3/ 9565/ 95 3/90-9526 3/ 9546 3/90 3/9566 3/ 9575/90-95 3/ 9527 3/ 347 3/80 3/9567 3/ 9585/ 955/90-9528 3/ 9548 3/90 3/9068 3/ 395/ 955/ 9529 3/90-9549 3/90 3/9069 3/ 95105/80-855/ 9530 3/ 9550 3/50 3/9070 3/ 31110/ 955/90-9531 3/ 9551 3/ 95 3/9571 3/ 9512 3/ 95 3/ 9532 3/ 352 3/ 3 3/5072 3/ 95135/ 95 3/ 9533 3/ 9553 3/30-40 3/9573 3/ 951410/ 953/ 95345/ 9554 3/30-40 3/8074 3/ 31510/90-95 3/ 9535 3/ 95555/90-95 3/9575 3/ 316 3/90-953/ 9536 3/ 95565/ 95 3/9576 3/ 9517 3/90-95 3/ 9537 3/ 95575/ 95 3/9577 3/ 95185/ 953/ 9538 3/ 3585/90-95 3/9578 3/ 95195/ 95 3/ 9539 3/ 3595/ 95 3/9579 3/ 320 3/ 95 3/90-95405/ 9560 3/ 95 3/9580 3/ 95Table 1. Η ενδοθηλιακή διαφοροποίηση ανθρώπινων καρκινικών γραμμή κλώνοι απλού κυττάρου.

Κυτταρικό διαχωρισμό χρησιμοποιήθηκε για τους σπόρους μεμονωμένα Η460 και τα κύτταρα OVCAR3 σε πλάκες 96 φρεατίων. 20 κλώνοι που προέρχονται από κάθε τύπο κυττάρων επεκτάθηκαν και αξιολογήθηκαν υπό κανονικές ή ΕΚ-προώθηση συνθηκών για την E-λεκτίνη δέσμευσης και AcLDL πρόσληψη. Επιπλέον 20 κλώνους που προέρχονται από κάθε Η460-Tie2-GFP και τα κύτταρα OVCAR3-Tie2-GFP αξιολογήθηκαν επίσης για την έκφραση της GFP. Το ποσοστό των θετικών κυττάρων για καθένα από αυτά τα ΕΚ-ειδικούς δείκτες ακόλουθες 5 ημέρες πολλαπλασιασμού μετρήθηκαν υπό πρότυπες συνθήκες ή συνθήκες 3 ή 4 και τις δύο τιμές που λαμβάνονται χωρίζονται από το «/». Οι μελέτες αυτές δεν λαμβάνουν υπόψη τις μεγάλες διαφορές στην ένταση δείκτη που συνέβησαν μετά από υποξικές πολλαπλασιασμού, οι οποίες απεικονίζονται στο σχήμα S2. CSV Λήψη CSV

TDECs ενσωματώσει στην νεοαγγείωση όγκου, να ενισχυθεί η ανάπτυξη του όγκου και την αύξηση της πυκνότητας των αγγείων

προηγούμενα ευρήματα μας που

στο vivo-

προέρχονται TDECs μπορεί να ενσωματώσει στον όγκο νεο-αγγείωση και την αύξηση της πυκνότητας των αιμοφόρων αγγείων [24,25] πρότεινε ότι

in vitro

προερχόμενο TDECs μπορεί να συμπεριφέρονται με παρόμοιο τρόπο. Για να αντιμετωπιστεί αυτό, EGFP-tagged καρκινικά κύτταρα Η460 [25] καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες 3 για 5 d, αναμιγνύεται με ένα 20-πλάσια περίσσεια

Discosoma

sp.

Κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (DsRed ) ταμπέλα σήμα Η460 καρκινικά κύτταρα και πολλαπλασιάζονται ως υποδόρια ξενομοσχεύματα σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς. ενέσεις ελέγχου έγιναν ταυτόσημα αλλά με τον πληθυσμό EGFP + αναπτύσσονται υπό πρότυπες συνθήκες. Οι όγκοι που προκύπτουν από την πρώην μείγμα κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά ταχύτερα από εκείνα από την τελευταία (Σχήμα 4Α). Μικροσκοπία φθορισμού κατεψυγμένων τομών έδειξε επίσης τα αιμοφόρα αγγεία των όγκων πρώην να εμπλουτιστεί για EGFP + ECs (Σχήμα 4Β), υποδεικνύοντας μία προτίμηση για

in vitro

προερχόμενο TDECs να ενσωματώσει στο αγγειακό σύστημα του όγκου. Τέλος, τα αιμοφόρα αγγεία των πρώην όγκους ήταν τόσο πυκνότερο και μεγαλύτερες από εκείνες των τελευταίων όγκων (Σχήμα 4C-4F). Παρόμοια πειράματα που έγιναν με κύτταρα OVCAR3 έδειξε ότι τα προκύπτοντα μοσχευμάτων όγκων, ενώ δεν αυξάνεται πολύ πιο γρήγορα από τους ομολόγους του ελέγχου τους, έκαναν περιέχει μεγαλύτερη αναλογία EGFP + αυλού TDECs και ένα πυκνότερο αγγειακό σύστημα (Σχήμα S3). Έτσι, η συν-ένεση του

σε vitro-

προέρχονται TDECs διευκολύνει νεοαγγείωση όγκου, η οποία, σε ορισμένες περιπτώσεις, επιτρέπει την επιτάχυνση της ανάπτυξης του όγκου.

ΕΟΡΡ- tagged Η460 κύτταρα διατηρήθηκαν για 5 d υπό τον όρο 3. τα προκύπτοντα TDECs στη συνέχεια αναμιγνύονται με ένα 20-πλάσια περίσσεια DsRed-tagged κύτταρα όγκου Η460 που καλλιεργούνται κάτω από πρότυπες συνθήκες και ένα σύνολο 10

6 κύτταρα εμβολιάστηκαν υποδορίως στα πλευρά γυμνών ποντικών και αναπαράγεται όπως όγκων ξενομοσχεύματα. όγκων ελέγχου αποτελείτο από το ίδιο μείγμα DsRed-tagged καρκινικά κύτταρα και κύτταρα όγκου EGFP-tagged πολλαπλασιάζονται κάτω από πρότυπες συνθήκες. (

Α

) Γραφική αναπαράσταση της ανάπτυξης του όγκου. Οι όγκοι των όγκων προσδιορίσθηκαν στους υποδεικνυόμενους χρόνους και οι μέσες απεικονίσθηκαν (± SEM). Η

σ

τιμή που εμφανίζεται για 17η ημέρα οι όγκοι του όγκου προήλθε με τη χρήση t-test ένα μονόπλευρο του Student. (

B

) Ομοεστιακή εικόνες φθορισμού των κρυοτομών όγκους από κάθε μία από τις δύο ομάδες. μπαρ Κλίμακα = 25 um. (

C

) Αντιπροσωπευτικά χαμηλής ισχύος αιματοξυλίνη-ηωσίνη-χρωματισμένες τομές ιστών εγκλεισμένων σε παραφίνη που λαμβάνονται από τυπικές όγκους σε κάθε μία από τις δύο ομάδες. (

D

) Γραφική απεικόνιση του μέσου αριθμού των αιμοφόρων αγγείων του όγκου ανά πεδίο (± SEM) σε τυπικές πεδία κάθε τύπο όγκου. Ο συνολικός αριθμός των τομέων που εξετάστηκαν ήταν 32 για την κατάσταση 3 όγκους και 24 για το πρότυπο όγκους κατάσταση. Μόνο τα σκάφη που παρουσιάζουν διακριτές lumens και περιέχει ερυθρά αιμοσφαίρια, που υποδεικνύεται από το

μαύρη

βέλη

, μετρήθηκαν. (

E

) Γραφική απεικόνιση της μέσης εγκάρσιας διατομής των αιμοφόρων αγγείων (± SEM) στους δύο τύπους όγκων. Ο συνολικός αριθμός των σκαφών που μετρήθηκαν ήταν 85 από τις συνήθεις όγκοι κατάσταση και 248 από την κατάσταση 3 όγκους. (

F

) Ο μέσος αριθμός των αιμοφόρων αγγείων του όγκου με διατομές (± SEM) που ήταν μικρά (30-499 um

2), μεσαία (500 – 1999 um

2) , μεγάλα (2000-4999 um

2), και πολύ μεγάλο (≥ 5000 um

2), όπως μετράται χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση

t

δοκιμή ενός μονόπλευρο Μαθητή (*,

σ

& lt? 0,01? **,

σ

& lt? 0.001? ***

σ

& lt? 0,0001). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Συζήτηση

Πρόσφατες παρατηρήσεις σε μια ποικιλία διαφορετικών καρκίνων έχουν δείξει ότι το ECS αποτελείται από τον όγκο νεο-αγγείωση μπορεί να προέρχεται απευθείας από τον όγκο οι ίδιοι και τα κύτταρα συνυπάρχουν με ΑΕΚ προέρχεται από εξω-καρκινικές πηγές [24-28]. Μοιάζει πολύ καρκινικών κυττάρων με τους προκατόχους τους, αυτά τα TDECs είναι γονιδίωμά ασταθή [24]. Αυτό μπορεί να προσφέρει ένα πλεονέκτημα επιβίωσης στο πρόσωπο του αντι-αγγειογένεσης θεραπειών, έτσι ίσως λογιστική για τις παροδικές επιδράσεις αυτών των παραγόντων [19-22]. Πράγματι, έχουμε παρατηρήσει ότι

στο vitro- προέρχονται

TDECs όπως αυτές που περιγράφονται εδώ μπορούν να προκύψουν σε μέσο EGM2 λείπει VEGF και έτσι φαίνεται να είναι ανεξάρτητη από την παρούσα αυξητικού παράγοντα, ακόμη και σε περίπτωση απουσίας προηγούμενης επιλογής. Επιπλέον, τα εξαιρετικά χαμηλά επίπεδα μεταγραφημάτων VEGF που εντοπίστηκαν σε κύτταρα Η460 και OVCAR3 σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR, δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά μετά την επαγωγή του φαινοτύπου TDEC (δεν φαίνεται).

Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι ο όγκος κύτταρα μπορούν να χειριστούν

in vitro

υπό καθορισμένες συνθήκες για να δημιουργήσει TDECs που είναι τόσο βιοχημικά και λειτουργικά παρόμοια με εκείνα που προέρχονται

in vivo

[24,25]. Ότι σχεδόν όλα τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να αποκτήσουν ΕΚ-όπως ιδιότητες (Πίνακας 1), ενώ η απώλεια των επιθηλιακών χαρακτηριστικά τους είναι σύμφωνο με το προηγούμενο εύρημα μας ότι οι κλώνοι ενός κυττάρου που προέρχεται από τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να παράγουν TDECs

in vivo

[25]. Έτσι, η ικανότητα για την παραγωγή TDEC φαίνεται να είναι ένας κοινός, αν όχι καθολική, χαρακτηριστικό που μοιράζεται με την πλειοψηφία του πληθυσμού των κυττάρων του όγκου και είναι κύτταρο αυτόνομη. Το μεταβλητό ποσοστό των TDECs βρίσκονται σε διαφορετικούς όγκους [25] μπορούν έτσι να είναι λιγότερο ενδεικτική της κάθε εγγενή γενεών χωρητικότητα από ανταγωνιστικών διαδικασιών, όπως βλάστησης αγγειογένεση, υπο-βέλτιστες συνθήκες για την επαγωγή TDEC και την έλλειψη άλλων επιλεκτικών πιέσεων όπως η προηγούμενη θεραπευτική επεμβάσεις. Το ακίνητο φαίνεται να περιορίζεται σε κύτταρο όγκου πληθυσμούς καθώς δεν παρατηρήσαμε ECs να προκύψουν από μη-μετασχηματισμένα κύτταρα, όπως ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά ή πρωτογενείς ή αθανατοποιημένες βρογχικών και επιθηλιακά κύτταρα μαστικού αδένα, όταν καλλιεργείται υπό συνθήκες ταυτόσημες με εκείνες που περιγράφονται στο παρόν (δεν φαίνεται).

η ικανότητα να παράγουν TDECs υπό καθορισμένες

in vitro

συνθήκες απαντήσεις αρκετές ερωτήσεις που δεν μπορούν να αντιμετωπιστούν εύκολα με τη χρήση

in vivo

μοντέλα όπου το μικροπεριβάλλον του όγκου είναι συχνά ετερογενή , υπόκεινται σε ταχεία αλλαγή [1,33] και όπου ο σχηματισμός TDEC είναι πιθανό να ανταγωνιστεί με πρόσθετες διαδικασίες αγγειακή αναδιαμόρφωση. Οι ερωτήσεις αυτές περιλαμβάνουν τη φύση και τις αλληλεξαρτήσεις των επαγωγικών σήματα για TDECs και το χρονοδιάγραμμά τους. Προφανείς υποψήφιοι για τέτοια μόρια σηματοδότησης περιλαμβάνουν EC-ειδικούς αυξητικούς παράγοντες όπως VEGF, bFGF και ΤΟΡ-βήτα, καθώς επίσης και υποξία, όλα εκ των οποίων είναι ισχυροί επαγωγείς νεοαγγείωσης όγκων [3-5,11-14]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι, τουλάχιστον

in vitro

, ούτε οι παράγοντες ανάπτυξης που παρέχονται από ΕΚ-ειδικό μέσο ανάπτυξης ούτε υποξία και μόνο είναι ιδιαίτερα ισχυροί επαγωγείς του όγκου των κυττάρων σε μετάβαση TDEC, αλλά ότι, σε συνδυασμό, είναι ιδιαίτερα συνεργιστική. Αυτό δεν είναι εντελώς απροσδόκητο καθώς αυτοί οι παράγοντες έχουν καιρό γνωστό ότι είναι αναγκαία για την παραγωγή και τη συντήρηση της νεοαγγείωσης του όγκου που προκύπτει από τις πιο παραδοσιακές πηγές [34,35]. Σε ορισμένες περιπτώσεις, όπως αποδεικνύεται και από τα αποτελέσματά μας με τα κύτταρα OVCAR3, άλλοι παράγοντες, όπως η επιλεκτική θρεπτικών στέρηση ή οξέωση μπορεί να παίξει επιπλέον υποστηρικτικό ρόλο και απομένει να διερευνηθούν διεξοδικότερα. Η ακριβής φύση αυτών των δραστών και τη σχετική σημασία τους για την παραγωγή TDEC είναι πιθανό να είναι αρκετά εξαρτάται από τις εγγενείς ιδιότητες των συγκεκριμένων τύπων όγκου, απέκτησε δευτεροβάθμια αλλαγές και διάφορα άλλα ανταγωνιστικά και συνεργαζόμενων περιβαλλοντικών παραγόντων. Είναι επίσης πιθανό ότι η διάρκεια της έκθεσης σε διάφορους επαγωγικούς παράγοντες, καθώς και όταν κατά την διάρκεια του όγκου των κυττάρων να TDEC μεταβατική περίοδος είναι γενεσιουργός θα παίξουν σημαντικό ρόλο. Όλα αυτά τα ερωτήματα θα πρέπει να είναι διευθυνσιοδοτούμενα χρησιμοποιώντας τους τύπους των αναλύσεων που περιγράφονται εδώ, τα οποία επιτρέπουν την ακριβή έλεγχο και το χρονοδιάγραμμα των δυνητικών περιβαλλοντικών συνθήματα.

προηγούμενες μελέτες μας είχαν δείξει ότι τόσο η έκφραση των ΕΚ-ειδικών δεικτών και η λειτουργία του

in vivo

προερχόμενο TDECs ήταν κυτταρική σειρά που εξαρτάται και αυτό επιβεβαιώνεται από τις τρέχουσες μελέτες. Ίσως το πιο προφανές παράδειγμα αυτό φαίνεται από τις διαφορές μεταξύ Η460 και OVCAR3 TDECs όσον αφορά την ικανότητά τους να επηρεάζουν ρυθμούς ανάπτυξης ξενομόσχευμα όγκου και το μέγεθος του σκάφους (σχήματα 4 και S3). Είτε αυτό αντανακλά εγγενείς λειτουργικές διαφορές του TDECs, τα πρότυπα ανάπτυξης των ίδιων των κυττάρων του όγκου, στρωματικά αλληλεπιδράσεις ή ενός συνδυασμού αυτών των παραγόντων είναι προς το παρόν άγνωστη. Οριστική απόδειξη για τέτοιου είδους σχέσεις αιτίου-αποτελέσματος περιμένει μέλλον επιβεβαίωση.

Η ικανότητα να ανακεφαλαιώσουμε το καρκινικό κύτταρο σε μετάβαση TDEC αποτελεσματικά, γρήγορα και με σαφώς καθορισμένες και εύκολα μεταβάλλεται προϋποθέσεις θα πρέπει τώρα να επιτρέψουν πιο εμπεριστατωμένη αξιολόγηση των ακριβείς ρόλους διαδραματίζουν οι επιμέρους επαγωγική παράγοντες στη διευκόλυνση αυτής της διαδικασίας, καθώς και τη σχετική τους σημασία. Η ευκολία με την οποία TDECs μπορούν να δημιουργηθούν επίσης προτείνει ότι μπορεί να χρησιμεύσει ως πολύτιμη αντιδραστήρια που θα χρησιμοποιηθούν στην ταυτοποίηση νέων παραγόντων που εμποδίζουν αυτή τη διαδικασία.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλες οι μελέτες του ποντικιού διεξήχθησαν σύμφωνα με το νόμο προστασίας των ζώων και της Δημόσιας Πολιτικής Υπηρεσίας Υγείας και έχει εγκριθεί από το Πανεπιστήμιο του Θεσμικών Φροντίδας ζώων του Πίτσμπουργκ και της Επιτροπής Χρήση (IACUC) (Αριθμός άδειας: 0812276). Τα ζώα στεγάστηκαν σε μονάδες άνευ παθογόνου στο Νοσοκομείο Παίδων του Πίτσμπουργκ, σύμφωνα με τους κανονισμούς IACUC.

Ζώα

Η ηλικία και το φύλο-συμφωνημένα ηυ /ηυ αγοράστηκαν από Harlan Sprague-Dawley Laboratories ( Indianapolis, ΙΝ). Μελέτες όγκων ξενομοσχεύματος διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24,25].

In vitro

επαγωγή TDECs και ξενομοσχεύματος όγκου ανάπτυξη

καρκίνωμα NCI-Η460 ανθρώπινου πνεύμονα (Η460) , CaLu-1 ανθρώπινο καρκίνωμα του πνεύμονα, του καρκίνου του προστάτη PC3, και κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών OVCAR3 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και διατηρήθηκαν υπό νορμοξικές «πρότυπο» συνθήκες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24,25]. Τα μέσα καλλιέργειας περιλαμβάνονται άλφα Minimal Essential Medium ( «ΜΕΜ») για Η460 και PC3 και μέσον McCoy 5Α για CaLu-1 και OVCAR3, τόσο συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 2 mM γλουταμίνη, 110 μg /ml πυροσταφυλικό, ελάχιστη μη ουσιωδών αμινοξέα, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη και 100 μονάδες /ml πενικιλλίνης G). Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) και ΕΚ-ειδικό μέσο ανάπτυξης EGM-2 αγοράσθηκαν από την Cambrex Bio Science (Walkerville, MD). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C. Για τις περισσότερες γραμμές όγκου, επαγωγή μιας φαινοτύπου ΕΚ επετεύχθη με καλλιέργεια κυττάρων υπό μια ποικιλία συνθηκών. Αυτές περιλάμβαναν μέσο EGM-2 υπό ορθοξικές συνθήκες (κατάσταση 1)? πρότυπο μέσο όρο κάτω από υποξικές [1% O

2 σε θερμοκοιτίδα Υποξική γάντι ασφαλείας (Coy Laboratory Products Inc., Grass Lake, MI)] (κατάσταση 2)? ή μέσο EGM2 + υποξία (κατάσταση 3). Για ορισμένα πειράματα, η βέλτιστη επαγωγή απαιτείται πέραν θρεπτικό μέσο με ανεπάρκεια [Glutamax μέσο D-ΜΕΜ λείπει η μη ουσιώδη αμινοξέα ασπαραγίνη, ασπαρτικό οξύ, γλουταμίνη, και προλίνη (Invitrogen, Inc.)] υπό συνθήκες υποξίας αλλά κατά τα άλλα περιέχουν το πανομοιότυπο ανάπτυξη παράγοντες και τα συμπληρώματα ως μέσο EGM-2 (κατάσταση 4). Μια τελική όρος που περιλαμβανόταν στην παραπάνω θρεπτικά συστατικά ανεπαρκές μέσο συν νορμοξίας (κατάσταση 5). Λεντοϊών συσκευασία και λοιμώξεις να παράγουν EGFP- ή DsRed-tagged κύτταρα πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25].

υποδόρια ξενομοσχεύματα όγκου ελήφθησαν με ενοφθαλμισμό 10

6 κύτταρα όγκου, τα οποία αποτελούνται από EGFP-tagged TDECs και DsRed-tagged καρκινικά κύτταρα (1:20), υποδορίως στα πλευρά του ηυ ηυ /όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. μετρήσεις όγκου των όγκων έγιναν κάθε 2-3 ημέρες μέχρι τη μέγιστη επιτρεπόμενη διάμετρο ca. 2 οπι επιτεύχθηκε (τυπικά 4-6 εβδ και για τα δύο κύτταρα H460 και OVCAR3) στο οποίο σημείο οι όγκοι αποκόπηκαν. Ξεχωριστές θραύσματα όγκων χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή των κατεψυγμένων και ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές.