Αφηρημένο

Το αρχιτεκτονικό παράγοντας μεταγραφής HMGA2 εκφράζεται άφθονα κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Σε αρκετές κακοήθεις νεοπλασίες περιλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη, υψηλής επανέκφραση του

HMGA2

συσχετίζεται με κακοήθεια και κακή πρόγνωση. Η

ας-7

οικογένεια miRNA περιγράφεται για τη ρύθμιση

HMGA2

αρνητικά. Το υπόλοιπο του

ας-7

και

HMGA2

συζητείται να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην αιτιολογία των όγκων. Για να αναλυθεί περαιτέρω ο ρόλος του HMGA2 στον καρκίνο του προστάτη μια σταθερή και υψηλή επαναληψιμότητα

in vitro

μοντέλο συστήματος είναι προϋπόθεση. Εδώ έχουμε δημιουργήσει μια κυνικός CT1258-EGFP-HMGA2 καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή που υπερεκφράζουν σταθερά HMGA2 συνδέονται με EGFP και επιπλέον η κυτταρική σειρά αναφοράς CT1258-EGFP εκφράζουν αποκλειστικά EGFP να αποκλείσει EGFP προκαλείται από επιδράσεις. Αμφότερες οι ανασυνδυασμένες κυτταρικές σειρές που χαρακτηρίζεται με μικροσκοπία φθορισμού, κυτταρομετρία ροής και ανοσοκυτταροχημεία. Η πολλαπλασιαστική επίδραση του εκτοπικά υπερεκφράζεται HMGA2 προσδιορίστηκε μέσω δοκιμασίες BrdU. Συγκριτική καρυότυπο της παράγωγης και οι αρχικές CT1258 κυτταρικές σειρές διεξήχθη για να αναλυθεί χρωμόσωμα συνοχή. Ο αντίκτυπος της έκτοπη

HMGA2

έκφραση στο ρυθμιστή του

ας-7α

αναλύθηκε με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Μικροσκοπία φθορισμού και ανοσοκυτταροχημεία ανιχνεύεται επιτυχή έκφραση της EGFP-HMGA2 πρωτεΐνη σύντηξης συσσωρεύεται αποκλειστικά στον πυρήνα. Οι αναλύσεις της γονιδιακής έκφρασης επιβεβαίωσε

HMGA2

υπερέκφραση σε CT1258-EGFP-HMGA2 σε σύγκριση με CT1258-EGFP και φυσικά κύτταρα. Σημαντικά υψηλότερο

ας-7α

επίπεδα έκφρασης βρέθηκαν σε CT1258-EGFP-HMGA2 και CT1258-EGFP. Οι δοκιμασίες BrdU ανιχνεύθηκε αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων CT1258-HMGA2-EGFP σε σύγκριση με CT1258-EGFP και μητρική CT1258. Οι αναλύσεις των κυτταρογενετική CT1258-EGFP και CT1258-EGFP-HMGA2 οδήγησε σε μια συγκρίσιμη hyperdiploid καρυότυπο όπως περιγράφεται για εγγενή CT1258 κύτταρα. Να διερευνήσει περαιτέρω την επίδραση της ανασυνδυασμένης υπερεκφρασμένης HMGA2 σε κύτταρα CT1258, άλλους επιλεγμένους στόχους που περιγράφονται στην διέπουν ρύθμιση HMGA2 ελέγχθηκαν επιπλέον. Η νέα φθορίζουσα CT1258-EGFP-HMGA2 κυτταρική γραμμή είναι μια σταθερή εργαλείο που επιτρέπει

in vitro

και

in vivo

αναλύσεις των HMGA2 μεσολάβηση επιδράσεις σε κύτταρα και την ανάπτυξη και παθογένεση του καρκίνου του προστάτη.

Παράθεση: Willenbrock S, Wagner S, Reimann-Berg Ν, μουλά Μ, Hewicker-Trautwein Μ, Nolte I, et al. (2014) Παραγωγή και Χαρακτηρισμός ενός σκύλου ΕΟΡΡ- HMGA2 Καρκίνος του προστάτη

In Vitro

μοντέλο. PLoS ONE 9 (6): e98788. doi: 10.1371 /journal.pone.0098788

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Αυστρία

Ελήφθη: 17 Φεβρουαρίου 2014? Δεκτές: 7 Μαΐου 2014? Δημοσιεύθηκε: 10 του Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Willenbrock et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Δεν υπάρχει τρίτη ταμεία κόμμα υποστήριξε αυτή τη μελέτη. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε με την εσωτερική του προϋπολογισμού της Κλινικής Μικρών Ζώων, Πανεπιστήμιο της Κτηνιατρικής, Ανόβερο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Με την παρούσα οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι Jörn Bullerdiek, συν-συγγραφέας στο πρώην συνεργατική εκδόσεις, είναι μέλος PLoS ONE Συντακτική Επιτροπή. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE Editorial πολιτικές.

Εισαγωγή

Σύμφωνα με πρόσφατη παγκόσμια στατιστικά του καρκίνου, ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη πιο συχνή διάγνωση του καρκίνου και την έκτη κύρια αιτία θανάτου μεταξύ των αρσενικά σε οικονομικά ανεπτυγμένες χώρες [1]. Άλλωστε ο άνθρωπος, ο σκύλος είναι ο μόνος γνωστός εξημερωμένα είδη θηλαστικών ανάπτυξη αυθόρμητο καρκίνο του προστάτη με μεγάλο ενδιαφέρον [2].

Σε αντίθεση με την κατάσταση στους άνδρες, η συχνότητα εμφάνισης των σκύλων καρκινωμάτων του προστάτη είναι χαμηλή λογιστική για 0,2 – 0,6% του κυνικός νεοπλασίες [3]. Ωστόσο, η νόσος είναι τοπικά επεμβατική και στα δύο είδη με συγκρίσιμο εξέλιξη, μεταστατική πρότυπο και ιστοπαθολογία [2], [4].

Η μέση ηλικία κατά τη διάγνωση σε σκύλους είναι δέκα χρόνια και έτσι, επηρεάζει κυρίως Elder άτομα όπως επίσης αναφερθεί σε άνδρες [5] – [7]. Λαμβάνοντας υπόψη τη φυσιολογική ηλικία κατά τη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη, η αντίστοιχη διάρκεια ζωής είναι παρόμοια μεταξύ των δύο ειδών που δείχνουν αυξημένη συχνότητα με την ηλικία [6].

Στους ανθρώπους, ο καρκίνος του προστάτη είναι συνήθως μια μάλλον αργή πρόοδο του καρκίνου, ενώ κυνικός προστάτη καρκίνο αυξάνεται με ταχείς ρυθμούς, εξαιρετικά επιθετική και λιγότερο διαφοροποιημένη παρουσιάζοντας μια φτωχή πρόγνωση [3], [8]. Καρκίνος του προστάτη αδένα σκύλου δεν αποκρίνεται στη θεραπεία στέρησης ανδρογόνων που μοιάζει ως επί το πλείστον ανθρώπινο πτωχά διαφοροποιημένο, ανδρογόνο καρκίνο του προστάτη ανθεκτικού [4], [9]. Λόγω των ομοιοτήτων που αφορούν την παρουσίαση των ανθρώπων και των σκύλων του καρκίνου του προστάτη, ο σκύλος έχει τον τελευταίο καιρό έχει επικεντρωθεί ως χρήσιμες φυσικό συμπληρωματικό ζωικό μοντέλο για την αξιολόγηση νέων θεραπειών του καρκίνου του προστάτη [10].

Η έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου του προστάτη στους άνδρες είναι επί του παρόντος γίνεται χρήση καθιερωμένων βιοχημικών μοριακών δεικτών όπως ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA) και ειδικό προστατικό αντιγόνο μεμβράνης (PSMA) με σημαντική επιτυχία.

σε σύγκριση με την κατάσταση στον άνθρωπο, στον καρκίνο του προστάτη σκύλους διαγνωστεί σε ένα το στάδιο είναι πολύ αργά ασθένεια, λόγω της απουσίας αξιόπιστων βιοχημικών προγνωστικά εργαλεία δείκτη ειδικού προστατικού και τη θεραπεία παραμένει η παρηγορητική δεδομένου ότι εξακολουθεί να μην υπάρχει τυπική θεραπευτική προσέγγιση για τη θεραπεία του σκύλου του καρκίνου του προστάτη είναι διαθέσιμη [11], [12]. Αν και αρκετές μελέτες αναφέρουν ανοσοαντιδραστικότητα για ανθρώπινη PSA σε κυνικός μη νεοπλασματικά καρκινικού ιστού του προστάτη και του προστάτη, μέχρι τώρα PSA δεν θα μπορούσε να βρεθεί στο πλάσμα του καρκίνου του προστάτη που φέρουν τα σκυλιά [9], [12] – [16].

κατά συνέπεια, ο προσδιορισμός αξιόπιστων μοριακοί βιοδείκτες, όπως PSA και PSMA στους άνδρες, επιτρέποντας την έγκαιρη ανίχνευση και αξιόπιστη πρόγνωση του σκύλου του καρκίνου του προστάτη θα είναι σημαντικής αξίας για τη μελλοντική ανάπτυξη και την αξιολόγηση των θεραπευτικών στρατηγικών, καθώς και την αξιολόγηση της ανταπόκριση στη θεραπεία [2].

στο πλαίσιο αυτό, το High-Mobility-Group πρωτεΐνη Α2 (HMGA2) βρέθηκε πρόσφατα για να εξυπηρετήσει ενδεχομένως ως προγνωστικός δείκτης για κυνικός προστάτη νεοπλασιών [17]. Εδώ, η ανάλυση ενός υποσυνόλου διαφορετικά δείγματα σκύλου ιστό προστάτη έδειξαν σαφώς ότι η έκφραση του

HMGA2

αυξάνεται σημαντικά σε συσχετισμό με την επιζήμια βαθμού των δειγμάτων ιστού [17]. Επιπλέον,

HMGA2

βρέθηκε να χρησιμεύσει ως ένα δυνητικό δείκτη διαφοροποίησης του σκύλου κακοήθων Τ- και Β-κυττάρου λέμφωμα [18] και να ρυθμίζεται αυξητικά σθεναρά κυνικός καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων του στόματος (μη δημοσιευμένα δεδομένα).

Στους ανθρώπους, μια εκ νέου έκφραση του

HMGA2

βρέθηκε επίσης σε διάφορες κακοήθεις όγκοι όπως λευχαιμία [19], [20], λέμφωμα [18], του μαστού [21], το πάγκρεας [22] , μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [23], από του στόματος των πλακωδών κυττάρων [24], και καρκίνωμα του θυρεοειδούς [25] είναι ένας δείκτης κακής πρόγνωσης. Σε μια πρόσφατη μελέτη, η έκφραση πρωτεΐνης HMGA2 δείχθηκε να είναι σημαντικά υψηλότερη σε ιστούς όγκων σε σύγκριση με τα γειτονικά τους φυσιολογικούς ιστούς [26]. Επιπλέον, ένα

HMGA2

εμπλοκή στην επαγωγή της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) στον ανθρώπινο προστάτη καρκινική κυτταρική σειρά PC-3 ευρέθη [26].

Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι HMGA2 διαδραματίζει κεντρικό ρόλο σε διάφορες οντότητες του όγκου συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του προστάτη μέσα σε δύο είδη υποστηρίζοντας σθεναρά

HMGA2

εκ νέου έκφρασης ως προγνωστικός δείκτης όγκου.

σε γενικές γραμμές, η εξαιρετικά διατηρημένη πρωτεΐνη HMGA2 είναι άφθονα εκφράζεται κατά την διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης που ενεργεί ως αρχιτεκτονικό παράγοντα μεταγραφής στον πυρήνα [27], [28]. Μέσα σε αυτό το ρόλο, HMGA2 ευρέως αναφερθεί ότι εμπλέκεται σε μια ποικιλία κυτταρικών διεργασιών, όπως η γονιδιακή έκφραση, επαγωγή νεοπλασματικής μεταμόρφωσης, και την προώθηση της μετάστασης [29], [30].

Η έκφραση του

HMGA2

ρυθμίζεται μέσω micro RNAs (miRNA) του

ας-7

οικογένεια μέσω σύνδεσης με αλληλουχίες που βρίσκονται στην 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR) της μεταγραφής [31] – [35], όλα από τα οποία είναι συντηρημένα σε τρωκτικά, σκύλο, κοτόπουλο και [36] – [38]. Η δέσμευση του

ας-7

miRNAs με συμπληρωματικές αλληλουχίες ρυθμίζει μετα-μεταγραφικά την έκφραση του

HMGA

2 με αρνητικό τρόπο [31], [35], [39], [40]. Πρόσφατα, μια απορυθμισμένη

ας-7

έκφραση σχετίστηκε με πνεύμονα [41], [42], του μαστού [43] και τον καρκίνο του προστάτη [44].

Ο κυνικός προστάτη αδενοκαρκινώματος προέρχεται CT1258 κυτταρική σειρά [45] – [47] που χρησιμοποιείται στα πλαίσια της παρούσας μελέτης αναλύθηκε επίσης για

HMGA2

έκφρασης δείκτη από εμάς αποκαλύπτοντας μια ισχυρή υπερέκφραση (αδημοσίευτα δεδομένα). Το αποτέλεσμα αυτό επιτρέπει να υποθέτουν ότι μια υπερέκφραση αυτού του γονιδίου-στόχου είναι πιθανόν να παίζουν σημαντικό ρόλο στην κυνικός καρκίνο του προστάτη, προάγοντας τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων.

Για να επαληθευτεί αυτή η υπόθεση, η διαθεσιμότητα των σταθερών εργαλείων που επιτρέπουν την αξιολόγηση του περιγράφεται

HMGA2

–

ας-7 άξονα

στον καρκίνο του προστάτη

in vitro

και

in vivo

είναι προϋπόθεση. Ως εκ τούτου, ιδρύσαμε σταθερά επιμολυσμένων κυτταρικών σειρών του CT1258 παρέχοντας μια αξιόπιστη

in vitro

σύστημα να αναλύσει τις βασικές πτυχές της υπόθεσης μας.

Αναλύσαμε τις πολλαπλασιαστικές επιδράσεις των αφθόνως εκφράζεται ανασυνδυασμένου

HMGA2

σε κύτταρα CT1258. Ως εκ τούτου, ένα σταθερό CT1258 κυτταρική γραμμή που εκφράζει ανασυνδυασμένο EGFP-tagged HMGA2 (CT1258-EGFP-HMGA2) δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κατασκεύασμα φορέα έκφρασης που περιέχει την κωδικεύουσα αλληλουχία (CDS) του σκύλου

HMGA2

γονίδιο που στερείται της 5’UTR και 3’UTR και ως εκ τούτου δεν βασίζονται οι άμεσες αρνητικές μηχανισμούς ρύθμισης από

ας-7

[31].

για να αξιολογηθεί η λειτουργικότητα του ανασυνδυασμένου φορέα έκφρασης HMGA2 και για την παρακολούθηση της βιολογικής δραστηριότητας του το ανασυνδυασμένο εκφράζεται HMGA2, ένα GFP-tag προστέθηκε στο

HMGA2

CDS παραγωγή μιας πρωτεΐνης σύντηξης HMGA2-GFP. Για να αποκλειστεί ότι η πρωτεΐνη GFP έχει επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, μια περαιτέρω σταθερή CT1258 κυτταρική γραμμή (CT1258-EGFP) που εκφράζουν μόνο GFP δημιουργήθηκε. Η

HMGA2

και

ας-7α

έκφραση προσδιορίστηκε μέσω ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου στο CT1258-EGFP-HMGA2 και CT1258-EGFP σε σύγκριση με μητρική CT1258 κύτταρα.

Επιπλέον, η έκφραση των επιλεγμένων άμεσων και έμμεσων HMGA2-στόχους, όπως

HMGA1

[48],

SNAI1

[49],

SNAI2

και

Cdh1

[49] αναλύθηκε.

Για να χαρακτηριστεί ο πολλαπλασιασμός των περιγραφόμενων τρεις κυτταρικές γραμμές, δοκιμασίες ενσωμάτωσης BrdU διεξήχθησαν. Συγκριτική καρυότυπο αναλύσεις του που δημιουργήθηκε πρόσφατα και οι αρχικές CT1258 κυτταρικές σειρές επιπλέον διεξάγεται για τον εντοπισμό κυτταρογενετική αλλαγές ενδεχομένως να συμβαίνουν κατά τη διάρκεια του πλασμιδίου ενσωμάτωση στο γονιδίωμα του CT1258 κατά τη διάρκεια της εγκατάστασης των σταθερών ανασυνδυασμένων κυτταρικών σειρών.

Εν ολίγοις το νέα φθορισμού κυνικός CT1258-EGFP-HMGA2 κυτταρική σειρά παρέχει ένα πολύτιμο εργαλείο για περαιτέρω έρευνες σχετικά με πολλαπλασιαστικές επιδράσεις HMGA2 μεσολάβηση και τους μηχανισμούς ρύθμισης HMGA2 διαλεύκανση της ανάπτυξης και της παθογένεσης των σκύλων του καρκίνου του προστάτη. Καθώς ο σκύλος αντιπροσωπεύει ένα μοναδικό φυσικό μοντέλο για την ανθρώπινη καρκίνο του προστάτη, οι γνώσεις σχετικά με τη συμμετοχή της HMGA2 στο σκύλων του καρκίνου του προστάτη θα προσφέρει οφέλη και για τους δύο, τους ανθρώπους και τα σκυλιά, σχετικά με την ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών και την αξιολόγηση της επιτυχίας της θεραπείας.

Μέθοδοι

CT1258 κυτταρική γραμμή

οι συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας, καθώς και τα χαρακτηριστικά του σκύλου καρκίνου του προστάτη CT1258 κυτταρική σειρά έχουν περιγραφεί προηγουμένως από εμάς [45], [46 ].

pEGFP-C1-

HMGA2

έκφρασης πλασμίδιο

Η αλληλουχία κωδικοποίησης της πρωτεΐνης του σκύλου

HMGA2

ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ζεύγος εκκινητών EcoRI_sA2_lo ( 5′-CGGAATTCCTAGTCCTCTTCGGCAGACT-3 ‘), BamHI_sA2_Up (5′-CGGGATCCCACCATGAGCGCACGCGGT-3’). Τα ληφθέντα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε γέλη αγαρόζης 1,5%, ανακτάται με QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Γερμανία), συνδέθηκε στον φορέα πλασμιδίου pEGFP-C1 (BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA, USA) και η αλληλουχία για επαλήθευση. Η επιμόλυνση με το pEGFP-C1-

HMGA2

κατασκευάσει οδηγεί στην έκφραση μιας ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σύντηξης ΕΟΡΡ- HMGA2 η οποία αναμένεται να είναι εντοπισμένη στον πυρήνα.

Generation of Fluorescent CT1258 κυτταρικών σειρών

Η επιμόλυνση των κυττάρων CT1258.

300.000 μητρική CT1258 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση και καλλιεργούνται σε σταθερές συνθήκες χρησιμοποιώντας μέσο 199 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Γερμανία) συμπληρωμένο με 10% FCS (ΡΑΑ Laboratories GmbH, Coelbe, Γερμανία), και 2% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Biochrom AG, Βερολίνο, Γερμανία).

Η διαμόλυνση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας 7,5 μΙ Mirus διαμετακόμιση 2020 αντιδραστήριο (Mirusbio LLC, Madison, WI, USA) σε 250 μΐ μέσου Ορίί-ΜΕΜ Ι ορού μειώνεται (Life Technologies, Darmstadt, Germany) που περιέχει 2.5 μg του pEGFP-C1 (BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA, USA) ή ανασυνδυασμένη pEGFPC1-HMGA2 πλασμίδιο. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες σε μέσο καλλιέργειας. Η πρόσληψη και έκφραση του DNA επιβεβαιώθηκε με μικροσκοπία φθορισμού χρησιμοποιώντας ένα Leica DMI 6000B φθορισμού μικροσκόπιο (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar Γερμανία).

G418 επιλεκτική δοκιμασία καμπύλη εξολόθρευσης αντιβιοτικό.

Πριν γενιά των φθορίζουσα κυτταρικές σειρές CT1258, η τιτλοδότηση του κατάλληλης ποσότητας του εκλεκτικού αντιβιοτικό G418 (Geneticin syn?. Life Technologies, Darmstadt, Γερμανία) που απαιτούνται για την επιλογή των κυττάρων CT1258 διεξήχθη με μία δοκιμασία καμπύλη σκοτώσει. εφαρμόστηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις G418 (0, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 μg /ml) επί 100.000 μητρική CT1258 κύτταρα σπάρθηκαν σε φρεάτια μιας 12 φρεατίων. Για την επιλογή των θετικών κυττάρων μετά την επιμόλυνση χρησιμοποιήθηκε η συγκέντρωση στην οποία κανένα κύτταρο επέζησαν τις άνω συνθήκες μετά από επτά ημέρες.

Επιλογή θετικά επιμολυσμένα κύτταρα CT1258.

φθορισμού παραλλαγές της κυτταρικής γραμμής CT1258 ήταν δημιουργήθηκαν για να εκφράσουν ιδιοσυστατικά την ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (EGFP) που κωδικοποιείται από το άδειο pEGFP-C1 πλασμιδίου και ένα ΕΟΡΡ- HMGA2 πρωτεΐνη σύντηξης με έκφραση του ανασυνδυασμένου pEGFP-C1-

HMGA2

πλασμίδιο. Για τη δημιουργία των σταθερών κυτταρικών σειρών CT1258, τα επιμολυσμένα κύτταρα επελέγησαν με το αντιβιοτικό G418 (Life Technologies, Darmstadt, Germany).

Αρχικά συγκέντρωση 400 μg G418 /ml στο μέσο χρησιμοποιήθηκε κατά την επιλογή για σταθερή κύτταρα. Μια ημέρα μετά την επιμόλυνση, το μέσο καλλιέργειας 199 αντικαταστάθηκε με μέσο 199 που περιέχει G418. Στη συνέχεια το μέσο επιλογής αλλάχθηκε κάθε 24 έως 48 ώρες για τις πρώτες δύο εβδομάδες, το οποίο οδηγεί στην επιλογή των κυττάρων που έχουν σταθερά ενσωματωμένο το πλασμίδιο GFP με το κωδικοποιημένο γονίδιο αντίστασης νεομυκίνη αντιβιοτικό για επιλογή σε κύτταρα θηλαστικών σε γονιδιωματικό DNA τους. Κύτταρα που δεν εκφράζουν το κατασκεύασμα θα σκοτωθεί από G418. Η συγκέντρωση του G418 μειώθηκε σε 300 μg /ml μετά από τρεις μήνες της συνεπούς επιλογή για τη συντήρηση των παραγόμενων φθοριζόντων κυτταρικών γραμμών.

μικροσκόπιο φθορισμού και κυτταρομετρία ροής (FCM)

GFP έκφραση της φθορίζουσα κυτταρικές σειρές CT1258-EGFP και CT258-EGFP-HMGA2 αναλύθηκε μετά G418 επιλογής με μικροσκοπία φθορισμού και ποσοτικά κατά κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company, Heidelberg, Germany) με το κανάλι FL-1 για να προσδιοριστεί το ποσοστό του GFP-θετικά κύτταρα. Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν για 3-5 λεπτά, επαναιωρήθηκαν σε BD FACSFlow θηκάρι Fluid (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) που περιέχει 1 μΜ έως-PRO-3 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Γερμανία), και σε ένα συνολικός αριθμός των 1 × 10

4 συμβάντα μετρήθηκε για κάθε δείγμα με κυτταρομετρία ροής. TO-PRO-3 είναι μια πολύ-κόκκινο διαπερνά λεκές κύτταρο νουκλεϊκού οξέος που μετράται στο κανάλι FL-4 που επιτρέπει υπερευαίσθητη ανίχνευση του δίκλωνου DNA των νεκρών κυττάρων. Η ανάλυση της κυτταρομετρίας ροής των δεδομένων έγινε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Cell Quest (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA).

Ανοσοκυτοχημεία

Ενσωμάτωση των κυτταρικών σειρών.

κυτταρικά εναιωρήματα των καλλιεργημένων κυτταρικών γραμμών σταθεροποιήθηκαν σε 4% φορμαλίνη. Σφαιρίδια κυττάρου που λαμβάνεται με φυγοκέντρηση εγκλείστηκαν σε παραφίνη και κόβονται σε 3-4 μm φέτες για ανοσοκυτταροχημική χρώση.

ανοσοκυτταροχημική χρώση.

Για ανάκτηση αντιγόνου, θέρμανση μικροκυμάτων του τομές παραφίνης σε 0,01 Μ κιτρικό οξύ (ρΗ 6,0 για 20 λεπτά) (Quartett, Βερολίνο, Γερμανία) διεξήχθη. Η αναστολή της ενδογενούς ενεργότητας υπεροξειδάσης επιτεύχθηκε με εμβάπτιση σε 0,5% Η

2O

2 (ν /ν) σε μεθανόλη (20 λεπτά). Μετά την αποστράγγιση του ορού αποκλεισμού οι τομές επωάστηκαν με ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα πολυκλωνικό γίδινο HMGA2 (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA) αραιωμένου 1:400 σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS, ρΗ 7,2, 0,15 Μ) περίπου 16-18 ώρες στους 4 ° C. Μετά την πλύση σε PBS, οι τομές επωάστηκαν με ένα συζευγμένο με βιοτίνη αντίσωμα κατσίκας για IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Το αντιδραστήριο αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης (Vector Laboratories) εφαρμόστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Το χρωμογόνο που χρησιμοποιήθηκε ήταν 3’3-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική-(Sigma Aldrich, Μόναχο, Γερμανία) 0,05% (β /ο) με 0,03% Η

2O

2 (ν /ν) ως υπόστρωμα σε 0.1 Μ Τρις- ρυθμιστικό διάλυμα (Τρις-υδροξυμεθυλο-αμινομεθανίου? Merck, Darmstadt, Germany). Οι τομές βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη Mayers και τοποθετημένα. Οι αρνητικοί έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν με την αντικατάσταση των πρωτογενών αντισωμάτων με φυσιολογικό ορό κατσίκας. Για τον καθορισμό των ανοσοκυτταροχημική αντιδράσεις χρώσης, χρησιμοποιήθηκαν τομές παραφίνης από ένα κυνικός ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του στόματος.

RNA Απομόνωση και Σύνθεση cDNA

Το συνολικό RNA του EGFP και EGFP-HMGA2 εκφράζοντας καθώς και μητρική CT1258 κύτταρα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας το NucleoSpin miRNA (Macherey-Nagel, Düren, Germany) κιτ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, συμπεριλαμβανομένων μια επί στήλης DNase πέψης για την απομάκρυνση ενδεχόμενων γενωμικού μολύνσεις DNA.

οι αντίστοιχες συνθέσεις cDNA με mRNAs ως εκμαγείο πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 250 ng ολικού RNA από κάθε δείγμα και το QuantiTect Reverse Transcription Kit ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Qiagen, Hilden, Germany).

Για την αντίστροφη μεταγραφή του miRNAs 30 ng ολικού RNA από κάθε δείγμα, ο TaqMan microRNA αντίστροφη Transcription Kit και το αντίστροφο έναυσμα μεταγραφή παρέχεται με τα TaqMan microRNA Δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκαν. Όλα τα βήματα διεξήχθησαν ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Applied Biosystems, Darmstadt, Γερμανία).

HMGA1, HMGA2, SNAI1, SNAI2

και

Cdh1

σε πραγματικό χρόνο PCR

για την σχετική ποσοτικοποίηση του

HMGA2, HMGA1, SNAI1, SNAI2

και

Cdh1

επίπεδα μεταγραφής σε σχέση με το ενδογενές γονίδιο ελέγχου

GUSB

και

HPRT1

ενισχύσεις PCR διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το ep Eppendorf Mastercycler realplex πραγματικού χρόνου PCR System (Eppendorf AG, Hamburg, Germany).

2 μΐ κάθε cDNA που αντιστοιχεί σε 25 ng του συνολικού RNA ενισχύθηκαν σε ένα συνολικό όγκο 20 μΐ χρησιμοποιώντας το TaqMan καθολική PCR Master Mix (Applied Biosystems, Darmstadt, Γερμανία) με 600 ηΜ του κάθε εκκινητή και 200 ​​ηΜ ιχνηλάτη για φθορογόνο κυνικός

HMGA1, HMGA2

ανάλυση έκφρασης γονιδίου (προηγουμένως δημοσιευθεί από εμάς σε Joetzke et al. [18]. τα διαθέσιμα στο εμπόριο αναλύσεις της γονιδιακής έκφρασης TaqMan χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των σκύλων στόχων

SNAI1

(Cf02705362_s1),

SNAI2

(Cf02701218_u1) και

Cdh1

(Cf02697525_m1), καθώς και για τις ενδογενείς ελέγχους, κυνικός

GUSB

(Cf02622808_m1) και κυνικός

HPRT1

(Cf02626258_m1) (Applied Biosystems, Darmstadt, Γερμανία).

οι συνθήκες PCR ήταν ως εξής: α. 2 λεπτά στους 50 ° C και 10 λεπτά στους 95 ° C, που ακολουθείται από 40 κύκλους με 15 δευτερόλεπτα στους 95 ° C και 1 λεπτό στους 60 ° C

Όλα δείγματα μετρήθηκαν εις τριπλούν και για κάθε διαδρομή μάρτυρες μη πρότυπο και μη ανάστροφης μεταγραφάσης αντιδράσεις ελέγχου συμπεριλήφθηκαν. Μια ανάλυση της αποδοτικότητας προηγούμενο όλων των δοκιμασιών PCR που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη διεξήχθη με εφαρμογή το ίδιο πρότυπο σε διαφορετικά στάδια αραίωσης που καλύπτουν μέγεθος του πέντε (cDNA που αντιστοιχεί στο 100 με 0,001 ng RNA). Οι αντιδράσεις PCR όλων των γονιδίων στόχων που αναλύθηκαν έδειξαν συγκρίσιμη αποδοτικότητες εξασφάλιση κατάλληλης σχετική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR. Για την ανάλυση με βάση ΔΔCT μέθοδο μητρική CT1258 κύτταρα που ορίζεται ως βαθμονομητή.

Ας-7α

,

RNU6B

Real-time PCR

Σχετική ποσοτικοποίηση του σκύλου

ας-7α

και

RNU6B

επίπεδα μεταγραφής miRNA πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το ep Eppendorf Mastercycler realplex πραγματικού χρόνου PCR System (Eppendorf AG, Αμβούργο, Γερμανία). 1.33 μΙ κάθε cDNA ενισχύθηκαν σε συνολικό όγκο 20 μΐ χρησιμοποιώντας TaqMan καθολική PCR Master Mix (Applied Biosystems, Darmstadt, Γερμανία), αριθ AmpErase UNG και προσδιορισμούς TaqMan microRNA για

ας-7a

(Δοκιμασία ID: 000.377) και

RNU6B

(Δοκιμασία ID:. 001093) (Applied Biosystems, Darmstadt, Γερμανία)

οι συνθήκες PCR ήταν ως εξής: 10 λεπτά στους 95 ° C, που ακολουθείται από 40 κύκλους με 15 s στους 95 ° C και 1 λεπτό στους 60 ° C.

Όλα τα δείγματα μετρήθηκαν εις τετραπλούν και για κάθε διαδρομή μάρτυρες μη πρότυπο και αντιδράσεις ελέγχου μεταγραφάσης μη αντίστροφη συμπεριλήφθηκαν.

Α ανάλυση αποτελεσματικότητας προηγούμενο από τις δοκιμασίες miRNA PCR που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη πραγματοποιήθηκε εφαρμόζοντας το ίδιο πρότυπο σε διαφορετικά στάδια αραίωσης, δείχνουν συγκρίσιμη βελτίωση της αποτελεσματικότητας. Για την ανάλυση με βάση τη μέθοδο ΔΔCT η ομάδα ελέγχου ορίστηκε ως βαθμονομητή εκτέλεση σχετικής πραγματικού χρόνου PCR με

ας-7a

ως γονιδίου-στόχου.

Real-time PCR Στατιστική Ανάλυση

η στατιστική ανάλυση των σχετικών πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη εφαρμογή του κριτηρίου υπόθεση με το υπόλοιπο εργαλείο λογισμικού το 2009, την έκδοση 2.0.13 (Qiagen, Hilden, Γερμανία) [50]. ΥΠΟΛΟΙΠΟ προσδιορίζει εάν υπάρχει μια σημαντική διαφορά μεταξύ των δειγμάτων και ελέγχων λαμβάνοντας υπόψη αποδόσεις αντίδρασης και χρησιμοποιώντας τεχνικές τυχαιοποίησης. Μια ρ-τιμή ≤0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

Ο πολλαπλασιασμός των γηγενών CT1258 κυττάρων σε σύγκριση με την καθιερωμένη φθορισμού CT1258-EGFP και CT1258-EGFP-HMGA2 κυτταρικές γραμμές αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία χρωματομετρική πολλαπλασιασμού BrdU κυττάρων ELISA (Roche Applied Science, Mannheim, Germany). Αυτή η δοκιμασία μετρά την ενσωμάτωση του αναλόγου θυμιδίνης 5-βρωμο-2-δεοξυουριδίνη (BrdU) στο μόλις συντεθέν DNA του αναπαραγόμενα κύτταρα με ELISA χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-BrdU.

Ένας συνολικός αριθμός 15,000 κύτταρα /φρεάτιο από κάθε μία κυτταρική γραμμή CT1258 σπάρθηκε σε οκτώ διαφορετικά φρεάτια και καλλιεργείται στις προηγουμένως περιγραφείσες συνθήκες. BrdU προστέθηκε μετά από 24 ώρες και επωάστηκαν για δύο ώρες. Η δοκιμασία πολλαπλασιασμού διεξήχθη σύμφωνα με το (κυτταρικός πολλαπλασιασμός ELISA, χρωματομετρική, Roche Applied Science, Mannheim, Germany) του κατασκευαστή πρωτόκολλο. Τα προϊόντα της αντίδρασης ποσοτικοποιήθηκαν με μέτρηση της απορρόφησης στα 370 nm (μήκος κύματος αναφοράς 492 nm) με ένα μέγιστο από 27 και μόνο διαβάζει σε χρονική περίοδο 30 λεπτών χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο σάρωσης πολλαπλών φρεατίων είναι εξοπλισμένα με το λογισμικό ανάλυσης Gen 5 (Synergy ΗΤ multi -mode ανάγνωσης μικροπλάκας, BioTek Instruments Inc., Bad Friedrichshall Γερμανία). Τα αποτελέσματα απορρόφηση συσχετίζεται άμεσα με την ποσότητα της σύνθεσης του DNA και με την παρούσα με τον αριθμό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων.

Τα αποτελέσματα αναφέρονται ως μέσες τιμές απορρόφησης εκφράζεται ως Max V [δέλτα 370-492] και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση . Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση OriginPro 8 λογισμικού (OriginLab Corporation, Northampton, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Το τεστ Shapiro-Wilk εφαρμόστηκε για να ελέγξετε αν τα δεδομένα είναι κανονικά κατανεμημένα. Με βάση το αποτέλεσμα της δοκιμής Shapiro-Wilk, ένα αντιστοιχισμένο δείγμα t-test διεξήχθη για να εκτιμήσει τη σοβαρότητα της πολλαπλασιαστικής διαφορές μεταξύ CT1258-EGFP, CT1258-EGFP-HMGA2 και μητρική CT1258 κύτταρα. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές για * p ≤ 0,05, ** p≤0.001 σε 0,01 και *** ρ & lt?. 0.001

χρωμοσωμάτων Προετοιμασία

Για την παρασκευή χρωμοσωμάτων του CT1258-EGFP και CT1258- EGFP-HMGA2 κύτταρα κολσεμίδη (Biochrom AG, Βερολίνο, Γερμανία) προστέθηκε σε μια τελική συγκέντρωση 0.1 μg /ml για 90 λεπτά πριν από τη συγκομιδή. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν για 20 λεπτά σε υποτονικό μέσο (1: 6? Μέσο 199: H

2O? (Μέσο 199: Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany)) και τελικά σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη /παγόμορφο οξικό οξύ (3 :1) ακολουθώντας τις συνήθεις μεθόδους [51]. Το εναιώρημα μειώθηκε σε πλακίδια παγωμένου και ξηραίνεται για 5 ημέρες στους 37 ° C που ακολουθείται από ΟΤΟ-banding που διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως από τους [52]. Τα αποτελέσματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και καταγράφονται με BandView, 6.0, πολλά είδη, Εφαρμοσμένη Spectral Imaging, το Ισραήλ. Περιγραφή καρυότυπος ακολούθησε την ονοματολογία που προτείνει Reimann et al. [53].

Αποτελέσματα

μικροσκόπιο φθορισμού και FCM

μικροσκόπιο φθορισμού.

κύτταρα CT258 επιμολυσμένα με τον μη ανασυνδυασμένο φορέα έκφρασης pEGFP-C1 έδειξε πράσινος φθορισμός σε όλο το κυτταρόπλασμα λόγω έκφραση EGFP (Εικ. 1Β), ενώ μη τροποποιημένη μητρική CT1258 κύτταρα δεν έδειξαν φθορισμό EGFP (Σχήμα 1Α).

Α:. διερχόμενου φωτός εικόνα του χαρακτηριστικού περιγράμματος αναπτύξεως του φυσικού CT1258 κυττάρων . Β: συγχωνευμένη εικόνα της EGFP κυττάρων που εκφράζουν CT1258-EGFP? EGFP εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα. C: συγχωνευμένη εικόνα της CT1258-EGFP-HMGA2 κυττάρων που εκφράζουν το πυρηνικό εντοπισμένη ΕΟΡΡ- HMGA2 πρωτεΐνη σύντηξης. D-F: κυτταρομετρίας ροής αναλύσεις της έκφρασης EGFP στις κυτταρικές σειρές τριών CT1258 απεικονίζεται στο dot-οικόπεδα δείχνει πλευρική σκέδαση (SSC) έναντι EGFP φθορισμού. Αριθ φθορισμός GFP είναι ανιχνεύσιμη στη μητρική CT1258 κύτταρα (D), 84,1% του EGFP-θετικών κυττάρων είναι παρόντες στην κυτταρική σειρά CT1258-EGFP και (F) 97.0% EGFP-θετικά κύτταρα σε CT1258-EGFP-HMGA2. Ανά δείγμα 1 × 10

4 συμβάντα αναλύθηκαν.

Η

Η επιμόλυνση του CT1258 με pEGFPC1-HMGA2 είχε ως αποτέλεσμα την έκφραση ενός ανασυνδυασμένου σκύλου πρωτεΐνη σύντηξης ΕΟΡΡ- HMGA2 η οποία θα μπορούσε μόνο να ανιχνευθεί στον πυρήνα των επιμολυσμένων κυττάρων (Εικ. 1 C).

FCM.

για τον προσδιορισμό της EGFP θετικών κυττάρων με FCM, και οι δύο φθορίζουσες κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με εγγενή μη επιμολυσμένα κύτταρα CT1258 (Σχ. 1D ). Dead, TO-PRO-3 θετικά κύτταρα εξαλείφονται με gating πριν από την ανάλυση EGFP θετικότητα. Τα κύτταρα μετρήθηκαν για CT1258 στην 319η πέρασμα, για CT1258-EGFP στην 27η πέρασμα, και για CT1258-EGFP-HMGA2 στην 113η πέρασμα.

Η ζωτικότητα των κυτταρικών σειρών κυμαίνονταν από 85% έως 93 % (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ένα μέσο ποσοστό 84,1% EGFP θετικών κυττάρων από το συνολικό κυτταρικό πληθυσμό του G418 επιλεγμένη κυτταρική σειρά CT1258-EGFP (Εικ. 1 Ε) και 97,0% EGFP θετικών κυττάρων για την CT1258-EGFP-HMGA2 κυτταρική γραμμή (Σχ. 1 F) προσδιορίστηκε .

Ανοσοκυτοχημεία

Περίπου το 50% της κυτταρικής σειράς CT1258-EGFP είχε πυρηνική επισήμανση για HMGA2 (Εικ. 2Β). Σε περίπου 70-80% των CT1258-EGFP-HMGA2 κύτταρα ισχυρή επισήμανσης για HMGA2 ανιχνεύθηκε, το οποίο ήταν αποκλειστικά παρόντες στον πυρήνα (Σχήμα 2C).

Α:. Native CT1258 κύτταρα, Β: CT1258-EGFP κύτταρα, C: CT1258-EGFP-HMGA2 κύτταρα. Περίπου το 50% της φυσικής CT1258 κυτταρική γραμμή και των κυττάρων CT1258-EGFP έδειξαν HMGA2-θετικών πυρηνική επισήμανση. Σε περίπου 70-80% των CT1258-EGFP-HMGA2 κύτταρα, μια ισχυρή και αποκλειστικά πυρηνική επισήμανση για HMGA2 ήταν ανιχνεύσιμη.

Η

Σχετική

HMGA2

Real-time PCR Ανάλυση έκφρασης

Όλα τα αποτελέσματα της PCR σε πραγματικό χρόνο αναλύθηκαν με βάση την μέθοδο ΔΔCT. Η αναλογία έκφραση του

HMGA2

mRNA σε κύτταρα CT1258-EGFP βρέθηκε να είναι 0,88 /0,92 σε σχέση με το

HPRT1 /GUSB

έκφραση σε σύγκριση με το επίπεδο που σημειώθηκε στη μητρική CT1258 κύτταρα (Σχ. 3 ). Σε αντίθεση, η

HMGA2

έκφραση σε CT1258-EGFP-HMGA2 κύτταρα ήταν 7,0 /8,0 φορές αυξημένη (σε σχέση με το

HPRT1 /GUSB

) σε σύγκριση με την αντίστοιχη έκφραση στη μητρική CT1258 κύτταρα (Εικ . 3).

Σχετική

HMGA2 /HPRT1

και

HMGA2 /GUSB

έκφραση στη μητρική CT1258, CT1258-EGFP και CT1258-HMGA2-EGFP κύτταρα. Οι ράβδοι σφάλματος είναι τυπικές αποκλίσεις. * P ≤ 0,05 δείχνει μια στατιστικά σημαντική απορρύθμιση της έκφρασης του

HMGA2

στα κύτταρα CT1258-HMGA2-EGFP σε σύγκριση με μητρική CT1258.

Η

Σχετική

Ας-7α

real-time PCR έκφραση Ανάλυση

Το

ας-7α

επίπεδο έκφρασης σε CT1258-EGFP και CT1258-EGFP-HMGA2 κύτταρα ήταν 2,0 και 3,1 φορές υψηλότερες (σε σχέση με το

RNU6B

) σε σύγκριση με το ανιχνεύεται έκφραση στη μητρική CT1258 κύτταρα (Εικ. 4).

Σχετική

ας-7α

/RNU6B έκφραση στη μητρική CT1258, CT1258-EGFP και CT1258-HMGA2-EGFP κύτταρα. Οι ράβδοι σφάλματος είναι τυπικές αποκλίσεις. Δεν στατιστικά σημαντική απορρύθμιση της έκφρασης του

ας-7α

στο CT1258-EGFP και CT1258-HMGA2-EGFP ανιχνεύθηκε σε σύγκριση με μητρική CT1258 κύτταρα. Στατιστικά σημαντικές ρ αξία ορίστηκε ως ≤0.05.

Η

Σχετική

HMGA1

Real-time PCR Έκφραση Ανάλυση

Το

HMGA1

επίπεδο ήταν 1,5 και αυξήθηκε κατά 1,7 φορές (σε σχέση με το

HPRT1

και

GUSB

) σε CT1258-EGFP-HMGA2. Σε κύτταρα CT1258-EGFP συγκρίσιμη αυξημένη έκφραση δεν θα μπορούσε να ανιχνευθεί (1,0 /1,0 σε σχέση με την

HPRT1

και

GUSB

) σε σύγκριση με τις φυσικά κύτταρα (Εικ. 5).

Σχετική

HMGA1 /HPRT1

και

HMGA1 /GUSB

έκφραση στη μητρική CT1258, CT1258-EGFP και CT1258-HMGA2-EGFP κύτταρα. Οι ράβδοι σφάλματος είναι τυπικές αποκλίσεις. * P ≤ 0,05 δείχνει μια στατιστικά σημαντική αυξημένη έκφραση του

HMGA1

στα κύτταρα CT1258-HMGA2-EGFP σε σύγκριση με μητρική CT1258 και CT1258-EGFP.

Η

Σχετική

SNAI1, SNAI2

και

Cdh1

Real-time PCR έκφραση Ανάλυση

Σχετική

SNAI1

έκφραση των γονιδίων καθαριότητας

HPRT1 /GUSB

βρέθηκε να είναι 0.8 /0.8 αντίστοιχα σε CT1258-EGFP και 1 /1.2 στην CT1258-EGFP-HMGA2 όταν συγκρίνονται με την φυσική κύτταρα CT1258 (σχήμα S1).

σχετική

SNAI2

έκφραση (σε σχέση με

HPRT1 /GUSB

) βρέθηκε 1.5 /1.6 στα κύτταρα CT1258-EGFP και 1.4 /1.6 σε CT1258-EGFP-HMGA2 κύτταρα σε σύγκριση με CT1258 (σχήμα S2).

Cdh1

ήταν μόλις και μετά βίας εκφράζεται σε όλες τις κυτταρικές σειρές με Ct τιμές υψηλότερες από ό, τι 36, έτσι μια ανάλυση με τη μέθοδο ΔΔCT δεν ήταν δυνατό.

Real-time PCR Στατιστική ανάλυση

η δοκιμή υπόθεση της σχετικής πραγματικού χρόνου PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του εργαλείου λογισμικού ΥΠΟΛΟΙΠΟ 2009, έκδοση 2.0.13 (Qiagen, Hilden, Γερμανία) [50]. Οι στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν ξεχωριστά για την CT1258-EGFP και CT1258-EGFP-HMGA2 κύτταρα σε σύγκριση με το φυσικό CT1258.