Abstract

Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του κακοήθους μεσοθηλιώματος περιτοναϊκή (MPEM), οζίδια όγκου διαδίδονται διάχυτα μέσα στην κοιλιά και οι όγκοι χαρακτηρίζονται από διακριτά φαινοτυπικά υπο-τύπους. Πρόσφατες μελέτες σε καρκίνους συμπαγών οργάνων έχουν δείξει ότι τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) παίζουν κεντρικό ρόλο στην έναρξη και την εξέλιξη των όγκων. Ωστόσο, δεν είναι γνωστό εάν ογκογόνα βλαστικά κύτταρα υπάρχουν και εάν προάγουν την ανάπτυξη του όγκου σε MPEM. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αναπτύξει και που χαρακτηρίζεται από ένα μοντέλο CSC για MPEM χρησιμοποιώντας σταθερώς επεκτάσιμη ογκογόνα βλαστικών κυττάρων που προέρχονται από όγκους ασθενών. Βρήκαμε μορφολογικά διακριτοί πληθυσμοί των ΚΕΠ που χωρίζουν ασύμμετρα ή συμμετρικά σε MPEM

in vitro

κυτταρικής καλλιέργειας. Τα βλαστικά κύτταρα MPEM (MPeMSCs) δείκτες ρητή αρχέγονων κυττάρων c-myc, NES και VEGFR2 και παρουσία των συστατικών της μήτρας κύτταρα σχηματίζουν σφαίρες αποικία. MPeMSCs είναι πολυδύναμα, διαφοροποιούνται σε νευρωνικούς, αγγειακές και λιπώδης απόγονοι κατόπιν ορίζονται επαγωγή και τα διαφοροποιούμενα κύτταρα εκφράζουν γράμμωσης-ειδικούς δείκτες όπως TUBB3, πρώιμο νευρωνική δείκτη? vWF, VEGFA, VEGFC και IL-8, ενδοθηλιακούς δείκτες? και PPARγ και FABP4, λιπώδη δείκτες. πειράματα Ξενομεταμοσχεύσεις MPeMSCs απέδειξε την ανάπτυξη όγκων σε πρώιμο στάδιο σε σύγκριση με μητρικά κύτταρα. Ο περιορισμός πειράματα αραίωσης χρησιμοποιώντας MPeMSCs και ενδοθηλιακά γράμμωσης επαγόμενη κύτταρα που προέρχονται από ένα και μόνο MPeMSC ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη όγκων σε πρώιμο στάδιο στην τελευταία ομάδα που υποδεικνύει ότι τα ενδοθηλιακά διαφοροποίηση MPeMSCs είναι σημαντική για την έναρξη του όγκου MPEM. Η παρατήρησή μας ότι οι όγκοι MPEM περιέχουν βλαστικά κύτταρα με ογκογόνο δυναμικό έχει σημαντικές επιπτώσεις για την κατανόηση των κυττάρων της προέλευσης και εξέλιξης του όγκου σε MPEM και ως εκ τούτου ΚΕΠ στόχευσης μπορεί να είναι μια χρήσιμη στρατηγική για την αναστολή κακοήθη εξέλιξη

Παράθεση:. Varghese S , Whipple R, Martin SS, ο Αλέξανδρος HR (2012) Cancer Πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα που προέρχονται από τα ανθρώπινα Κακοήθη περιτοναϊκή μεσοθηλίωμα Προώθηση Ογκογένεση. PLoS ONE 7 (12): e52825. doi: 10.1371 /journal.pone.0052825

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, City of Hope Εθνικό Ιατρικό Κέντρο και Beckman Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Αύγ 2012? Αποδεκτές: 23 Νοέμβρη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 28 του Δεκεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Varghese et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος STEM-(παρόμοια) β-κύτταρα με αυτο -renewal και όγκου δυναμικό κίνηση έχουν ταυτοποιηθεί σε διάφορους τύπους όγκων [1] – [3] και πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι αυτά τα κύτταρα παίζουν κεντρικό ρόλο στην εξέλιξη των κακοηθών όγκων. Το μοντέλο CSC περιγράφει την ύπαρξη ενός μικρού υποπληθυσμό πλαστικών κυττάρων με δυναμικό δια-σε όγκους. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι ένα μεγάλο ποσοστό των κυττάρων εντός όγκων διατηρούν ιδιότητες βλαστοκυττάρων και ακόμη περισσότερο διαφοροποιημένα κύτταρα μπορούν να μετασχηματιστούν σε βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν [4], [5]. Αν αυτή είναι η περίπτωση, την εξάλειψη των ΚΕΠ δεν θα μπορούσε να είναι μια χρήσιμη στρατηγική για τη μείωση της ανάπτυξης του όγκου. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό για την ανάπτυξη μοντέλων για την κατανόηση της βιολογίας CSC και προσδιορίζει τις νέες στρατηγικές για την πρόληψη κακοήθους προόδου του όγκου. Οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν αυτο-ανανέωση των δύο ΚΕΠ και φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων πιστεύεται ότι είναι παρόμοια [6]. Επί του παρόντος, ταυτοποίηση και απομόνωση ΚΕΠ ήταν σε μεγάλο βαθμό εξαρτάται από την συγκεκριμένη δείκτες κυτταρικής επιφάνειας [7], [8], αν και η έκφραση αυτών των δεικτών εξαρτάται από διάφορους παράγοντες όπως η κατάσταση διαφοροποίησης των κυττάρων και εξειδικευμένες παράγοντες. CD133 έχει χρησιμοποιηθεί ως ένα υποθετικό δείκτη βλαστικών κυττάρων σε γλοιοβλάστωμα [9] και ο καρκίνος του παχέος εντέρου [10], CD34 εκφράζουν επιθηλιακά κύτταρα του όγκου, όπως CSCs σε δερματικά καρκινικά [11], CD44 κύτταρα που εκφράζουν στον καρκίνο του μαστού [12], CD26 θετικά κύτταρα είναι που εμπλέκονται στη διαδικασία των μεταστάσεων, της διεισδυτικότητας και χημειοαντίσταση σε καρκίνο του παχέος εντέρου [13], CD271 θετικά κύτταρα κινήσει εξέλιξη μελανώματος και μετάσταση [14] και τις ιδιότητες των ΚΕΠ ταυτοποιήθηκαν σε CD24 θετικά κύτταρα του υπεζωκότα μεσοθηλίωμα [15]. Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία απόδειξη για την ύπαρξη των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν που κινεί την ανάπτυξη του όγκου σε MPEM. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε την παρουσία ογκογόνων κυττάρων μεσοθηλιώματος με ιδιότητες ΚΕΠ σε σταθερές κυτταρικές σειρές που προέρχονται από όγκους ασθενών MPEM

Κακοήθη περιτοναϊκή μεσοθηλίωμα προέρχεται διάχυτα μέσα στην επένδυση ορογόνου υμένα του περιτοναίου.? είναι μια επιθετική μορφή καρκίνου με μια αξιοσημείωτη τάση για περιφερειακές μεταστάσεις. Κατά τη διάγνωση, αυτός ο καρκίνος βρίσκεται γενικά σε ένα στάδιο της διάχυτης κακοήθη πρόοδο με ένα μεγάλο αριθμό από μεταβλητά μεγέθους οζιδίων του όγκου. Γενικά, οι όγκοι έχουν ένα ανεπαρκώς αγγειοποιημένου παχύ εσωτερικό πυρήνα που περιβάλλεται από ένα εξωτερικό νεοαγγειακή περιοχή. θεραπευτικές επιλογές, όπως η χειρουργική cytoreduction και συστηματική χημειοθεραπεία μπορεί να ελέγξει την εξέλιξη του όγκου σε μερικούς ασθενείς, αλλά ο θάνατος του ασθενούς οφείλεται κατά κύριο λόγο στην προοδευτική υποτροπή του όγκου. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι η ενεργοποίηση του φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) και του στόχου της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά σηματοδότησης σε MPEM συνδέεται με συντομευμένη επιβίωση των ασθενών [16]? αυτές οι οδοί που ενέχονται στην ενεργοποίηση των βλαστοκυττάρων και τον πολλαπλασιασμό [17], [18]. σηματοδότηση ΡΙ3Κ είναι επίσης σημαντική για τη διατήρηση της κυτταρικής πολικότητας σε καρκινικά κύτταρα [19].

Αν και οι κυτταρικές σειρές που προέρχονται MPEM επιβιώσει επ ‘αόριστον κατά την διάρκεια ανακαλλιέργειας, στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα νωρίς-πέρασμα προέρχονται από όγκους ασθενή σε αποφευχθεί επιλογή ενός συγκεκριμένου υποσυνόλου των επιθετικών καρκινικών κύτταρα έναρξης διατηρούνται κατά την διάρκεια παρατεταμένης ανακαλλιέργεια. Εδώ έχουμε προσδιορίσει ότι ένα μεγάλο ποσοστό των προοπτικά δημιουργούνται σταθερά κύτταρα MPEM στον πολιτισμό δημιουργούν επιπλέοντα κύτταρα με τις ιδιότητες των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων, όπως η διαίρεση ασύμμετρη κυττάρων, αυτο-ανανέωση και πολυδυναμικότητα. Τα τυχαία επιλεγμένα single MPeMSCs έδειξε κλωνική εξέλιξη, φαινοτυπική ποικιλομορφία υπό καθορισμένες συνθήκες και δυνατότητες δια-. Ως εκ τούτου, η σημαντική πλαστικότητα του MPeMSCs μπορεί να συμβάλλει στο σχηματισμό του αναπτυξιακώς ποικίλο πληθυσμό κυττάρων που βρέθηκαν σε όγκους και επιθετικότητα των όγκων κατά τη διάρκεια της παθολογικής εξέλιξης. Συλλογικά, η μελέτη μας αποκαλύπτει ότι MPEM λιμάνι ΚΕΠ και εξέλιξης του όγκου οφείλεται στην αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης των ΚΕΠ.

Αποτελέσματα

διακρίνονται μορφολογικά πληθυσμοί των MPeMSCs που χωρίζουν Ασύμμετρο ή Συμμετρικά και Express Stem κυττάρων Μαρκαδόροι

Μεταξύ των σταθερών MPEM κυτταρικές σειρές που δημιουργούνται, μεσο-CL1 ήταν PTEN αρνητικό

(αρνητικά) ενώ μεσο-CL2 και μεσο-CL3 ήταν PTEN κυτταρικές σειρές που εκφράζουν (Εικ. S1). Παρά το γεγονός ότι και οι τρεις κυτταρικές σειρές MPEM δημιουργείται βλαστικών κυττάρων με αυτο-ανανέωση που αποσπώνται και αιωρούνται σε καλλιέργεια πριν από προσκολλημένα ανάπτυξη, μεσο-CL1 έχει την τάση να παράγει ξενομοσχεύματα όγκου κατά την υποδόρια ή ενδοπεριτοναϊκή εμφύτευση σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς και χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει ένα μοντέλο MPEM CSC . Σε γενικές γραμμές, ΚΕΠ θηλαστικών σχηματίζουν πολλαπλές συσσωματώματα σφαιροειδές αποικίες στον πολιτισμό [20]? σχηματισμός αποικιών ήταν περιορισμένη όταν MPeMSCs καλλιεργήθηκαν κάτω από πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων προσκολλημένων. Ωστόσο, ο σχηματισμός κλωνική σφαίρα ενεργοποιήθηκε όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μια πλάκα Matrigel. Φως μελέτες μικροσκοπίας έχουν εντοπίσει δύο μορφολογικά διακριτοί πληθυσμοί των ΚΕΠ στον πολιτισμό MPEM? κυττάρων με ή χωρίς εξωτερική ενθυλάκωσης κάλυμμα, οι οποίοι εμφάνισαν ασύμμετρη ή συμμετρική διαίρεση. Για να αποδείξουν ότι τα απομονωμένα κύτταρα διατηρούν βλαστικά κύτταρα ιδιότητες, που παρουσιάστηκε για πρώτη φορά μελέτες time-lapse σε ζωντανά κύτταρα σε μελέτες πολιτισμό και ανοσοφθορισμού σε κύτταρα φορμαλδεΰδη και διαπίστωσε ότι τα κύτταρα διαιρούνται τόσο ασύμμετρα και συμμετρικά (Εικ. 1Α, Β). Σε μια ασύμμετρη διαίρεση, τα κύτταρα διαιρούνται άνισα παράγει ένα μεγάλο βλαστικών κυττάρων και ένα μικρό κύτταρο γενικά ονομάζεται ως το προγονικών κυττάρων. Πειράματα παλμού-εκδίωξης χρησιμοποιώντας το ανάλογο θυμιδίνης BrdU έχουν δείξει ότι κατά τη διάρκεια ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση το πρότυπο DNA σημασμένο με BrdU, μετά από μια μακρά σφυγμού, διαχωρίζονται αποκλειστικά εντός του νέου βλαστικών κυττάρων, ενώ η νεοσυντιθέμενη DNA συμπυκνώνεται μέσα στο διαφοροποίησης κυττάρου. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης συμμετρικό δύο θυγατρικά κύτταρα μοιράζονται το πρότυπο DNA (Σχ. 1 C). Μια άλλη μορφολογικά διακριτή πληθυσμό ΚΕΠ εντοπίστηκε στον πολιτισμό MPEM με ενθυλάκωση εξωτερικό περίβλημα που σχηματίζεται από τα μητρικά κύτταρα ως σκούρο φούσκα-όπως προεξοχές. Τα νεοσυσταθείσα κύτταρα αποσπώνται από το γονικό κύτταρο και επιπλέει στον πολιτισμό και τα κύτταρα «hatched’-out από το εξωτερικό περίβλημα να ξεκινήσει την ανάπτυξη. Λόγω του κυμαινόμενου χαρακτήρα αυτών των κυττάρων, μελέτες time-lapse ήταν ανεπιτυχείς? Ωστόσο, το φως και φθορίζουσες ενδείξεις μικροσκοπία δείχνουν ότι τα κύτταρα διαιρούνται επίσης ασύμμετρα ή συμμετρικά (Εικ. 2Α). Όπως διαπιστώθηκε σε άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές, έχουμε επίσης εντοπιστεί μεγάλες πολυ-εμπύρηνα προσκολλημένα κύτταρα σε κυτταρική καλλιέργεια που παράγουν ένα ή περισσότερα βλαστικά κύτταρα που προέρχονται τυπικά από τον πυρήνα χωρίς πλήρη κυτοκίνηση του πατρικού κυττάρου (Εικ. 2Β).

(Α) Time-lapse εικόνες των ασύμμετρων και συμμετρικών κυτταρική διαίρεση σε MPeMSCs. διαίρεση ασύμμετρη κυττάρων (βέλη) δημιουργεί δύο άνισα κύτταρα (άνω πάνελ)? διαίρεση συμμετρική κυττάρων (βέλη) παράγει δύο πανομοιότυπα κύτταρα (κάτω πίνακας). το μέγεθος των κυττάρων φαίνεται στο μΜ. Ώρα (ώρα: λεπτά) σημειώνεται στην κάτω αριστερή γωνία. Ράβδοι κλίμακας: 20 μΜ. (Β) φθορισμού εικόνες των ασύμμετρων (άνω τμήμα) και συμμετρική (κάτω πίνακας) κυτταρική διαίρεση στη MPeMSCs. πυρηνική χρώση Hoechst παρουσιάζει ασύμμετρη και συμμετρική διαίρεση των κυττάρων. (Γ) του DNA διαχωρίζονται ασύμμετρα κατά την κυτταρική διαίρεση (άνω πάνελ). Τα κύτταρα αναπτύσσονται σε BrdU για αρκετές διελεύσεις (περίοδος παλμού) και μετά από μια μακρά παλμό BrdU απομακρύνεται από την κυτταρική καλλιέργεια (η Chase)? κατακράτηση BrdU στα διαιρούμενα κύτταρα μελετήθηκε χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-BrdU. Σε μια ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση, η μήτρα DNA σημασμένο με BrdU διαχωρίζονται εντός του νέου κόρη βλαστικών κυττάρων ενώ προσφάτως συντεθέν DNA χωρίς ετικέτα BrdU συμπυκνώνεται μέσα στο διαφοροποίησης κυττάρου. Κατά τη διάρκεια συμμετρική διαίρεση των κυττάρων με BrdU σημασμένο DNA διαχωρίζονται τυχαία μέσα στα θυγατρικά κύτταρα (κάτω πάνελ).

Η

(Α) Σχηματισμός MPeMSCs με κάψας που καλύπτουν και τις πιθανές ασύμμετρη και συμμετρική διαίρεση των βλαστικών κυττάρων. a, b, ΚΕΠ προέρχονται από τα γονικά κύτταρα ως σκούρο φούσκα-όπως προεξοχές (βέλη). Τα κύτταρα αποσπώνται και αιωρούνται στον πολιτισμό και MPeMSCs «εκκολάπτονται-out» της κάψουλας (βέλη). c, Ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση σε βλαστικά κύτταρα καψικό. Ασύμμετρο διαιρούμενα κύτταρα προέρχονται από την κάψουλα (άνω πάνελ, τα βέλη) ή κύτταρα διαιρούνται άνισα μαζί με την κάψουλα δημιουργώντας δύο μη ταυτόσημες κύτταρα (κάτω πίνακας). d, κυτταρική διαίρεση Συμμετρική της κάψας βλαστικών κυττάρων. Ράβδοι κλίμακας: 100 px. e, f, Fluorescent εικόνες των ασύμμετρων (ε) και το συμμετρικό (στ) κυτταρική διαίρεση των ενθυλακωμένων κυττάρων. Τα βέλη δείχνουν το εξωτερικό κάλυμμα καψικό του κυττάρου (Β) ένα, MPeMSCs προέρχονται από τον πυρήνα ενός κυττάρου πολυπύρηνων? το νεοσχηματισμένο κύτταρο κινείται μέσω του κυτταροπλάσματος και απελευθερώνεται από το γονικό κύτταρο. β, Προέλευση των πολλαπλών ΚΕΠ από πολυπύρηνα κυττάρων. γ, φθορισμού εικόνες ενός πολυπύρηνων κυττάρων.

Η

Στη συνέχεια θα εξεταστεί αν οι απομονωμένες MPeMSCs ήταν πραγματικά προέρχεται από γονική κακοήθη mesothelial κύτταρα. Εκτιμήσαμε την έκφραση ενός γνωστού δείκτη μεσοθηλίωμα, MSLN, και βρήκε μια ισχυρή έκφραση του γονιδίου σε αμφότερες MPeMSCs και γονικής MPEM κύτταρα (Σχ. 3Α). Οι ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων των απομονωμένων MPeMSCs περαιτέρω προσδιορίζεται από την έκφραση των γνωστών σημειωτών βλαστοκυττάρων συμπεριλαμβανομένων Nanog, SOX2, Oct4, c-myc και KLF4 (Σχ. 3Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, το πρότυπο της έκφρασης των δεικτών νωρίς βλαστικών κυττάρων ήταν παρόμοια και στις δύο γονικών κυττάρων και MPeMSCs ενώ c-myc έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με MPeMSCs γονικά κύτταρα. Αντιστρόφως, το πολυδύναμο σημειωτή βλαστοκυττάρων, CD133 και δείκτες ενδοθηλιακών βλαστικών κυττάρων, CD31 και CD144, ήταν μη ανιχνεύσιμα σε MPeMSCs (Σχ. 3C).

(Α) σχετική έκφραση του mRNA του mesothelin (MSLN) και (Β) τα γονίδια δείκτη βλαστικών κυττάρων σε γονικά κύτταρα MPEM και MPeMSCs. έκφραση c-myc ήταν σημαντικά υψηλότερη (*

ρ

& lt? 0,05) σε MPeMSCs ενώ άλλοι σημειωτές βλαστοκυττάρων έδειξαν συγκριτικά παρόμοιο μοτίβο έκφρασης και στις δύο ομάδες. (Γ) Η κυτταρομετρία ροής αξιολόγηση της ανθρώπινης CD133, CD31 και CD144 έδειξε ότι οι πρωτεΐνες δεν εκφράζονται σε MPeMSCs. Τα διαγράμματα μπαρ εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM.

Η

Πολλαπλές επαγωγής Lineage σε MPeMSCs

πολυδυναμικότητα είναι το σήμα κατατεθέν των βλαστικών κυττάρων. Ωστόσο, δεν έχει οριστικά αποδειχθεί ότι τα ΚΕΠ μπορούν να επιτύχουν πολλαπλές μοίρα μετά από επαγωγή καταγωγή. Για να αποδειχθεί η ικανότητα του MPeMSCs για την επίτευξη πολλαπλών μοίρες, ΚΕΠ καλλιεργήθηκαν σε νευρωνικών, αγγειακές και διαφοροποίηση λιπώδους συνθήκες. Όταν υπο-συρροή προσκολλημένα MPeMSCs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με trans-ρετινοϊκού οξέος, που ακολουθείται από την προσθήκη του μέσου νευρικών διαφοροποίησης, τα κύτταρα διαφοροποιούνται σε νευρώνες σαν κύτταρα με τυπικό νευρωνική μορφολογία. Φθορισμού μελέτες απεικόνισης και qPCR της έκφρασης mRNA έδειξε ότι οι νευρωνικής γράμμωσης που προκαλείται από τα κύτταρα εξέφρασαν νευρικών NES δείκτη βλαστικών κυττάρων και μια πρώιμη νευρωνική TUBB3 δείκτη? Ωστόσο, BEX1 δεν έδειξε σημαντική διαφορά μεταξύ MPeMSCs και νευρικών διαφοροποιημένα κύτταρα (Σχ. 4Α). Τα επιπλέοντα νευρικά βλαστικά κύτταρα που προέρχονται από τη νευρωνική διαφοροποιημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και καλλιεργήθηκαν για πολλές γενιές για να αποδείξει αυτο-ανανέωση και πολλά από αυτά τα κύτταρα εμφανίζονται τυπικά νευρωνική μορφολογίες.

(Α) Διαφοροποίηση του MPeMSCs σε νευρώνα κύτταρα όμοια στο μέσο νευρικών διαφοροποίησης (βέλος). Ανοσοφθορισμό και σχετικές μελέτες έκφρασης mRNA δείχνει ότι διαφοροποιημένα νευρωνικά κύτταρα εκφράζουν το νευρικό νεστίνη δείκτη βλαστικών κυττάρων και μια πρώιμη νευρωνική δείκτη βIII-τουμπουλίνης (*

σ

& lt? 0,01). (Β) Η ενδοθηλιακή διαφοροποίηση των MPeMSCs σε μια φόρμα Matrigel επιφάνεια σωληνοειδή δίκτυα (βέλη). Φθορισμού απεικόνιση δείχνει ότι τα κύτταρα εκφράζουν τον δείκτη ενδοθηλιακών βλαστικών κυττάρων, VEGFR2, και η πρόσληψη των Dil-AcLDL από διαφοροποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα. Σχετική μελέτες έκφρασης mRNA δείχνει ότι κατά τη διάρκεια της ενδοθηλιακής διαφοροποίησης έκφραση VEGFR2 και VEGFR3 μειώθηκε σημαντικά (*

ρ

& lt? 0,05), ενώ οι εκφράσεις των δεικτών ενδοθηλιακού κυττάρου, vWF, VEGFA, VEGFC και IL-8 σημαντικά αυξημένη (*

σ

& lt? 0.001). (Γ) Ένα ενιαίο MPeMSC σχηματίσουν μια σφαίρα αποικία σε μια επιφάνεια Matrigel που ακολουθείται από εκτεταμένη διάδοση των MPeMSCs. Ράβδοι κλίμακας 100 px. (D) MPeMSCs διαφοροποιούνται σε λιποκύτταρα (Oil Red) και (F) εκφράζουν δείκτες λιποκυττάρων ΡΡΑΚγ και FABP4 (*

ρ

& lt? 0,01) σε λιπώδη διαφοροποιημένων κυττάρων σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Τα διαγράμματα Bar εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM? ΝΔ, δεν είναι ανιχνεύσιμη.

Η

Είμαστε δίπλα αξιολόγησε την ικανότητα της MPeMSCs να σχηματίσουν ενδοθηλιακά κύτταρα. MPeMSCs εκφράζουν VEGFR2, μια ενδοθηλιακή δείκτη προγονικών κυττάρων. Τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα θετικά για VEGFR2 σχηματισμό αγγειακών πρόγονοι και να μετατρέψει σε ώριμα αιμοφόρα αγγεία [21]. Για να μελετηθεί η διαφοροποίηση των MPeMSCs σε ενδοθηλιακά γράμμωση, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας επικαλυμμένα με συστατικά μήτρας υπόγειο-μεμβράνης (Matrigel). Στις Matrigel, τα κύτταρα επάγονται ενδοθηλιακών κυτταρικής διαφοροποίησης και σχηματίζονται σωληνοειδή δίκτυα. μελέτες έκφρασης γονιδίων σε ενδοθηλιακά γράμμωση-επαγόμενα κύτταρα σε σύγκριση με MPeMSCs αποκάλυψε ότι VEGFR2 και έκφραση VEGFR3 μειώθηκαν σημαντικά σε κύτταρα κατά τη διάρκεια των ενδοθηλιακών διαφοροποίησης ενώ η έκφραση του vWF, VEGFA και VEGFC έγιναν αυξητικά στη διαφοροποίηση των κυττάρων. Ομοίως, η προ-αγγειογόνος παράγοντας, IL-8 έδειξε μια αύξηση 10 φορές κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των ενδοθηλιακών κυττάρων σε σύγκριση με MPeMSCs. Για την επικύρωση περαιτέρω η διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών, τα κύτταρα επωάστηκαν με λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας, Dil-AcLDL, και βρήκε πρόσληψη λιποπρωτεϊνών από τα ενδοθηλιακά διαφοροποιημένα κύτταρα (Εικ. 4Β). Στην Matrigel MPeMSCs σχηματίζουν επίσης σφαίρες αποικία που ακολουθείται από την εκτεταμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Εικ. 4C). Τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα παράγουν πολλαπλά κλωνικά σφαίρες σε

in vitro κυτταρικής καλλιέργειας

διευκόλυνση της ταχείας πολλαπλασιασμό ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων.

Για να προσδιοριστεί κατά πόσον οι MPeMSCs διαφοροποιούνται σε λιποκύτταρα, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε trans-ρετινοϊκού οξέος ακολουθούμενη από μέσο διαφοροποίησης λιπώδη και δοκιμάστηκαν για ενδοκυτταρική συσσώρευση ουδέτερο λιπίδιο. καταθέσεις λιπιδίων προσδιορίστηκαν σε λιπώδη διαφοροποιημένα κύτταρα. Έλεγχος και διαφοροποιημένα κύτταρα αναλύθηκαν περαιτέρω για γνωστούς δείκτες των λιποκυττάρων με χρήση qPCR και βρήκε μια σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση του ΡΡΑΚγ και FABP4 (Σχ. 4D, F).

Tumor Σχηματισμός από Single MPeMSCs Κυττάρων

Η αρχική μας μελέτες χρησιμοποιώντας MPEM γονικά κύτταρα έδειξαν ότι ενέσεις των 3 × 10

6 κύτταρα μεσο-CL1 ήταν σε θέση να παράγει και τις δύο υποδόρια και ενδοπεριτοναϊκή όγκων σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς ενώ μεσο-CL2 και μεσο-CL3 ήταν μη-ογκογόνα. Στα υποδόρια ένεση ποντίκια, τα κύτταρα Μεσο-CL1 δημιουργούνται σταθερά πρώτη ψηλαφητό όγκο την ημέρα 30 μετά τη μεταμόσχευση των κυττάρων του όγκου, ενώ παρόμοιες ενέσεις MPeMSCs πήρε μόνο 15 ημέρες για να αναπτύξει το πρώτο χειροπιαστό όγκου. Αντιστρόφως, η μεταμόσχευση νευρικών γράμμωσης επαγόμενης κύτταρα έδειξαν ψηλάφηση του όγκου την ημέρα 35 αποδεικνύοντας ότι και οι δύο γονικά κύτταρα και νευρωνικά διαφοροποιημένα κύτταρα είχαν παρόμοιες ογκογόνο δυναμικό. Μελέτες έχουν δείξει ότι οι ενέσεις των καρκινικών κυττάρων αιωρούνται σε Matrigel έχουν υψηλότερες συχνότητες σχηματισμού όγκων [22]. Μας

in vitro

μελέτες κατέδειξαν ότι Matrigel προωθείται ενδοθηλιακή διαφοροποίηση και ενεργοποίηση των αγγειογενετικών παραγόντων στα ενδοθηλιακά διαφοροποιημένα κύτταρα. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι ένας μικρός αριθμός MPeMSCs θα μπορούσε να δημιουργήσει όγκους εντός ενός ενδοθηλιακού θέση. Για να δοκιμαστεί η σημασία των ενδοθηλιακών κυττάρων διαφοροποίησης των MPeMSCs στην ανάπτυξη του όγκου, πραγματοποιήσαμε πειράματα περιοριστική αραίωση. Πεντακόσια κύτταρα που προέρχονται από ένα μόνο μη επιλεγμένα MPeMSC ένεση με Matrigel που δημιουργείται ψηλαφητών όγκων σε ποντικούς κατά την ημέρα 59 μετά τη μεταμόσχευση των καρκινικών κυττάρων ενώ οι ποντικοί έλαβαν ίσο αριθμό κυττάρων αιωρούνται σε PBS δεν μεγαλώνουν όγκων κατά τη διάρκεια μιας περιόδου προθεσμίας δύο μηνών (Σχ. 5Α) υποδεικνύοντας ότι η ενδοθηλιακή διαφοροποίηση των ΚΕΠ είναι κεντρικής σημασίας για την ανάπτυξη του όγκου. Για να δοκιμαστεί

in vivo

δια-ενδοθηλιακών κυττάρων που προέρχονται από MPeMSCs, πρώιμους όγκους που προέρχονται από τα ενδοθηλιακά γενεαλογία κατευθυνόμενη κύτταρα συν-ένεση με Matrigel αναλύθηκαν για την έκφραση του NES και TUBB3 και διαπίστωσε ότι τα κύτταρα εκφράζουν αμφότερες τις νευρωνικές πρωτεΐνες ( Σχ. 5Β).

(Α) γονικά κύτταρα από τα οποία προέρχονται MPeMSCs εγχύθηκαν υποδορίως (n = 8) στο δεξί πλευρό αθυμικών γυμνών ποντικών (ηυ /ηυ). Πρώτα ψηλαφητή όγκου εμφανίστηκε την ημέρα 30 μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων. Παρόμοιες ενέσεις MPeMSCs (n = 8) που δημιουργείται ψηλαφητά νεοπλάσματα την ημέρα 15 (οι όγκοι τελικού σταδίου φαίνεται). Περιορίζοντας τα πειράματα αραίωσης, κύτταρα που προέρχονται από ένα και μόνο MPeMSC χωρίστηκαν και αναπτύχθηκαν είτε σε μια πλάκα Matrigel να επάγει ενδοθηλιακή διαφοροποίηση ή σε ένα κανονικό πλάκα καλλιέργειας κυττάρων με LIF που περιέχουν μέσο. Πεντακόσια κύτταρα διαχωρίζονται από την πρώτη ομάδα επαναιωρήθηκαν σε Matrigel και εγχύθηκαν υποδόρια (n = 8). Οι όγκοι βρέθηκαν για πρώτη φορά με ψηλάφηση την ημέρα 59 (ποντίκια με 60 ημέρες ανάπτυξης όγκου μετά την ψηλάφηση του όγκου δείχνονται), ενώ παρόμοιες ενέσεις MPeMSCs (n = 10) επαναιωρήθηκαν σε PBS δεν παράγουν όγκους. (Β) με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση και ανοσοφθορισμό ιστών όγκου. Πρόωρη όγκοι που δημιουργούνται από τα ενδοθηλιακά γενεαλογία επαγόμενη κύτταρα εκφράζουν νευρωνικούς δείκτες? NES και TUBB3.

Η

Συζήτηση

Το σημαντικό εύρημα αυτής της μελέτης είναι ο προσδιορισμός των ΚΕΠ με τη χαρακτηριστική ασύμμετρη διαίρεση των βλαστικών κυττάρων και ογκογένεσης με ανθρώπινους όγκους MPEM. Μέχρι σήμερα δείκτες CSC έχουν ευρέως χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό και την απομόνωση βλαστικών κυττάρων από όγκους. Ωστόσο, δεν δείκτης βλαστικών κυττάρων έχει αποδειχθεί ότι είναι μια καθολική δείκτης για ΚΕΠ. Ορίζεται κουλτούρα MPeMSCs που προέρχονται από όγκους των ασθενών προωθείται αυτο-ανανέωση, σχηματισμός αποικίας και σε πολλαπλές διαφοροποίηση επιβεβαιώνοντας ένα φαινότυπο βλαστοκυττάρων. Το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του MPeMSCs έναντι άλλων ΚΕΠ είναι ότι τα κύτταρα σπάνια σχηματίζουν κλωνική σφαίρες σε τακτική καλλιέργεια προσκολλημένη κυττάρων και ως εκ τούτου το σχέδιο ατομική κυτταρική διαίρεση μπορεί να απεικονιστεί με τη χρήση μικροσκοπίου, το οποίο βοηθά στον εντοπισμό και την απομόνωση ΚΕΠ. Ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση είναι χαρακτηριστικό των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων και μελέτες time-lapse μας έδειξε ότι MPeMSCs χωρίζουν ασύμμετρα και τα θυγατρικά κύτταρα κληρονομούν διακριτά κυτταροπλασματικά συστατικά [23] για να σχηματίσουν βλαστικά κύτταρα και διαφοροποίηση των κυττάρων. Αυτή η παρατήρηση υποστηρίζεται περαιτέρω από διαδικασία σήμανσης BrdU παλμού και διαπίστωσε ότι το πρότυπο DNA διατηρεί εντός της κόρης βλαστικών κυττάρων. Επιπλέον, βρήκαμε συμμετρική διαίρεση των κυττάρων στο MPeMSCs παράγει κύτταρα με περίπου ίσα μεγέθη. Εκτός από αυτές τις χαρακτηριστικές διαιρέσεις βλαστοκυττάρων, MPeMSCs δείχνουν ένα διαφορετικό μηχανισμό για τον πολλαπλασιασμό των αρχέγονων κυττάρων με δημιουργία κυττάρων ενθυλακωμένα μέσα σε μια μεμβρανώδη εξωτερικό κάλυμμα. Αυτά τα κύτταρα συνήθως επιπλέουν στον πολιτισμό, και να εμφανίσει τόσο ασύμμετρη και συμμετρική κατανομή. Η σημασία του σχηματισμού των βλαστικών κυττάρων κάψας πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω. Είναι πιθανό ότι ο σχηματισμός αυτών των ενθυλακωμένων κυττάρων είναι εξειδικευμένη ομοιόσταση εξαρτώμενη και η οποία επιτρέπει ΚΕΠ να πολλαπλασιάζονται γρήγορα και να επιβιώσουν σε αντίξοες συνθήκες εξειδικευμένες. Τα μοναδικά μορφολογικά χαρακτηριστικά αυτών των κυττάρων μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό ΚΕΠ

in vitro

. Τα παράγωγα MPeMSCs δείχνουν σημαντική έκφραση της MSLN, μια εξέχουσα δείκτη για το μεσοθηλίωμα [24] δείχνει ότι η ΚΕΠ προέρχεται από τα μητρικά κύτταρα μεσοθηλιώματος. Οι σημειωτές βλαστοκυττάρων δοκιμάστηκε σε δύο γονικά κύτταρα και MPeMSCs δείχνουν ομοιότητες στην έκφραση τους, εκτός από το ογκογονίδιο MYC, και αυτό συνέπεια της γονιδιακής έκφρασης υποδηλώνει ότι η γονική κύτταρα έχουν επίσης δυνατότητες για αποδιαφοροποίηση [5]. Η ογκοπρωτεΐνη MYC η οποία ενεργοποιείται σε διάφορους τύπους όγκων [25] είναι σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε MPeMSCs? MYC γονίδιο είναι σημαντική για τον πολλαπλασιασμό των βλαστικών κυττάρων και για τη συντήρηση των πολυδύναμων ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων [26], [27].

Πρόσφατες εκθέσεις σχετικά με τα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν προέρχονται από γλοιοβλαστώματος υποδηλώνουν ότι ΚΕΠ διαφοροποιούνται σε ενδοθηλιακά κύτταρα κατά τη διάρκεια ανάπτυξη του όγκου [28], [29]. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η παρουσία του φαινοτύπου των βλαστικών κυττάρων σε MPEM, ελέγξαμε πολυδυναμικότητα των MPeMSCs με ανάπτυξή τους σε πολλές συνθήκες διαφοροποίησης. Κύτταρα πρώτα καλλιεργήθηκαν σε νευρωνική συνθήκες διαφοροποίησης ορό ελαχιστοποιούνται και διαπίστωσε ότι MPeMSCs διαφοροποιηθούν σε κύτταρα με χαρακτηριστική νευρική μορφολογία και εξέφρασε την νευρωνική δείκτες. Ταυτοποιήσαμε NES ως σημαντικό νευρωνικό δείκτη βλαστικών κυττάρων σε MPeMSCs και η έκφραση του βρέθηκε επίσης σε ξενομοσχεύματος όγκους δείχνοντας ότι νευρωνική διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων είναι δυνατόν κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου. Ομοίως, η έκφραση των βλαστικών κυττάρων του ενδοθηλίου VEGFR2 δείκτη ήταν επίσης σημαντικά υψηλό σε MPeMSCs? σε μια μήτρα θέση κύτταρα διαφοροποιούνται σε ενδοθηλιακά κύτταρα [9] με χαρακτηριστική σωληνωτά δίκτυα που υποδηλώνει MPeMSCs είναι άρρηκτα προγραμματιστεί για ενδοθηλιακά διαφοροποίηση. Αυτή η άμεση συμβολή του MPeMSCs στην περιοχή αγγείωσης του όγκου μπορεί να είναι σημαντική για την ταχεία και διάχυτης ανάπτυξης του όγκου που βρίσκονται σε ασθενείς MPEM. Νευρικά βλαστικά κύτταρα είναι εκτοδερμική προέλευσης, ενώ τα ενδοθηλιακά κύτταρα προέρχονται από το μεσόδερμα. Ωστόσο, τα ενδοθηλιακά κύτταρα που μοιάζουν μπορεί να προέρχονται από νευρικά βλαστικά κύτταρα [30]. Στις μελέτες μας (αδημοσίευτα δεδομένα) όταν νευρικά διαφοροποιημένα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα πιάτο Matrigel, τα κύτταρα διαφοροποιούνται σε ενδοθηλιακά κύτταρα με τυπικό σωληνοειδή δίκτυα υποδεικνύοντας δια-κυττάρων γράμμωσης-δεσμευτεί. Έχει αναφερθεί ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα transdifferentiate σε μεσεγχυματικά κύτταρα για την επαγωγή στέλεχος-όπως ιδιότητες [31]. Κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι τα οφέλη από την αντι-αγγειογενετική θεραπεία για τον καρκίνο περιορισμένες και σε πολλές περιπτώσεις αντι-αγγειογενετική θεραπείες οδηγούν σε μια αρχική απάντηση που ακολουθείται από υποτροπή του όγκου [32]. Σε αυτό το πλαίσιο αγγειακή διαφοροποίηση των ΚΕΠ που κατοικούν εντός των όγκων μπορεί να έχει ένα κεντρικό ρόλο στην ταχεία αναπλήρωση των ενδοθηλιακών κυττάρων.

Καμία μελέτη μέχρι σήμερα έχει αντιμετωπιστεί ότι ένα συγκεκριμένο τύπο κυττάρων ξεκινά την ανάπτυξη του όγκου σε ασθενείς. αρχικές μελέτες ξενομεταμόσχευση μας χρησιμοποιώντας ανασταλτικό παράγοντα λευχαιμίας (LIF) αντιμετωπίζονται αδιαφοροποίητη MPeMSCs έδειξε επαγωγή όγκων σε πρώιμο στάδιο σε ποντίκια που αποδεικνύει ότι MPeMSCs είναι ογκογόνο. Αν και MPeMSCs δεν σχηματίζουν σφαίρες αποικία σε καλλιέργεια προσκολλητικών κυττάρων, καλλιέργεια απλού κυττάρου σε μια πλάκα μήτρας που παράγεται σφαίρες αποικία που δείχνει τον φαινότυπο βλαστοκυττάρων που προέρχονται από τα κύτταρα. Σε αυτή τη μελέτη, δημιουργήσαμε ένα πρότυπο όγκου CSC χρησιμοποιώντας έναν περιορισμένο αριθμό κυττάρων πολλαπλασιάστηκαν από ένα μόνο MPeMSC. Τα δεδομένα από τη μελέτη αυτή, όταν προβάλλονται μαζί με το

in vitro

μαρτυρίες υποστηρίζουν ένα μοντέλο όπου MPeMSCs επαναιωρείται σε Matrigel προωθήσει επιθετικά την ανάπτυξη όγκων, κυρίως λόγω της ενδοθηλιακής διαφοροποίησης των ΚΕΠ, διότι όλες οι ένεση τα ποντίκια ανέπτυξαν ψηλαφητών όγκων περίπου 60 ημέρες όγκου έγχυση των κυττάρων. Αντιστρόφως, ψηλάφηση όγκος δεν ήταν εμφανής σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με αδιαφοροποίητα MPeMSCs επαναιωρήθηκαν σε PBS. Αν και τα κύτταρα με ογκογόνο δυναμικό ισομερώς κατανεμημένα σε δύο ομάδες, τα συστατικά μήτρας προωθείται σχηματισμός αποικίας και την ταχεία επαγωγή ενδοθηλιακών γράμμωσης. Σε όγκους ενδοθηλιακά κύτταρα αποδιαφοροποιούνται ή transdifferentiate να σχηματίσουν πιο βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν ή άλλους τύπους διακριτά κυττάρου που μπορεί να συμβάλλουν σε αύξηση όγκων σε πρώιμο στάδιο. Έχει αποδειχθεί ότι το μικροπεριβάλλον που περιβάλλει την νεοαγγείωση των όγκων είναι άκρως πολλαπλασιαστικών και έχουν CSCs βρεθεί κοντά σε ενδοθηλιακά κύτταρα [33]. Μαζί τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η πολυδυναμικότητα και η πλαστικότητα των MPeMSCs μπορεί να είναι ένας συμβάλλοντας παράγοντας για την ανάπτυξη του όγκου MPEM σε ασθενείς. Περαιτέρω εξέταση των παραγόντων που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό CSC και διαφοροποίηση της γενεαλογίας μπορεί να παρέχει σημαντικές πληροφορίες για την ανάπτυξη της MPEM και μπορεί να παρέχει μια βάση για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών παρεμβάσεων.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα γραμμές, Cell Culture και απομόνωση των MPeMSCs

MPEM κυτταρικές σειρές (μεσο-CL1, μεσο-CL2 και μεσο-CL3) προήλθαν από ανθρώπινους όγκους MPEM συλλέγονται επί του σκάφους επανεξέταση ίδρυμα εγκεκριμένα πρωτόκολλα του Εθνικού Ινστιτούτου για τον Καρκίνο και ενημέρωσε συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς για τη χρήση των δειγμάτων όγκου, συμπεριλαμβανομένης της παραγωγής κυτταρικών γραμμών [15]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (RPMI? Gibco) συμπληρωμένο με 10% ν /ν FBS (Atlanta Biologicals) υπό τυπικές συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων σε ένα υγροποιημένο 5% CO2 επωαστή στους 37 ° C. Τα κύτταρα επιβεβαιώθηκαν ως μεσοθηλίωμα με ανοσοϊστοχημεία για γνωστά δείκτες μεσοθηλιώματος και με ηλεκτρονική μικροσκοπία και χαρακτηρίστηκαν για

in vitro

χαρακτηριστικά ανάπτυξης και

in vivo

ανάπτυξη ξενομοσχεύματος. Παρά το γεγονός ότι και οι τρεις κυτταρικές σειρές που δημιουργούνται MPEM επιπλέοντα βλαστικά κύτταρα, μεσο-CL1, το ΡΤΕΝ

(neg) κυτταρική γραμμή με δυνατότητα να δημιουργήσει τόσο υποδόρια και ενδοπεριτοναϊκή όγκων σε αθυμικά γυμνά (πυ /ηυ) ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη. Εμείς ενεργοποιείται παραγωγή βλαστικών κυττάρων σε κύτταρα MPEM με σπορά τους σε υπο-συρρέουσα πυκνότητα για την ελαχιστοποίηση κύτταρο-προς-κύτταρο αγκύρωση σε 5% ν /ν FBS-RPMI (μέσο χωρίς ορό μειώνεται). Υπό αυτές τις συνθήκες οι MPeMSCs υπάρχουν στον πληθυσμό γονική κυτταρική δημιουργούν επιπλέοντα βλαστικά κύτταρα τα οποία στη συνέχεια συλλέχθηκαν και καλλιεργήθηκαν παρουσία του LIF τη διατήρησή τους σε μια αδιαφοροποίητη κατάσταση. Τα επιπλέοντα MPeMSCs συλλέγονται από το LIF αγωγή κυτταρική καλλιέργεια χρησιμοποιήθηκε για μετέπειτα πειράματα. Για όλα τα πειράματα MPeMSCs καλλιεργήθηκαν απουσία LIF εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Short-Time ζωντανών κυττάρων απεικόνισης και ανοσοφθορισμού

Για να καθορίσει ότι οι απομονωθεί επιπλέοντα κύτταρα ΚΕΠ, μελετήσαμε πρώτα βλαστικών κυττάρων διαίρεση σε ζωντανά κύτταρα από μελέτες time-lapse χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο (Olympus IX71)? εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellSens. Για ανοσοφθορισμού, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0,2% Triton Χ-100 (Sigma) σε PBS για 10 λεπτά, εκτός για την ανίχνευση των πρωτεϊνών επιφανείας κυττάρου. Τα κύτταρα πλύθηκαν, με PBS και μπλοκαρίστηκαν με 5% BSA σε PBS που περιέχει 0.25% ΝΡ-40 για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με οποιοδήποτε από τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: Alexa Fluor συζευγμένο μονοκλωνικό αντι-α-τουμπουλίνης (1:1000? Millipore), Alexa Fluor συζευγμένο Φαλλοϊδίνη (1:1000? Invitrogen), Hoechst 33342 (1:5000? Sigma) , αντι-νεστίνη (αντι-NES, 1:250? Millipore), αντι-βIII-τουμπουλίνης (αντι-TUBB3? 1:1000? Covance), αντι-αγγειακού ενδοθηλιακού υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα (αντι-VEGFR) 2 (1:200 ? Cell Signaling), αντι-CD133 /1-αλλοφυκοκυανίνη (APC, 1:100? Miltenyi Biotech). Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες δευτερεύοντα αντισώματα από την Molecular Probes (Invitrogen): Alexa Fluor συζευγμένα ποντικού ή κουνελιού αντι-IgG (1:1000). Δευτερεύοντα αντισώματα μόνα ή IgG1 ποντικού χρησίμευσε ως έλεγχος για μη ειδική σύνδεση. Εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας είτε τον Όλυμπο CKX41 μικροσκόπιο φθορισμού εξοπλισμένο με F-View II CCD ψηφιακή φωτογραφική μηχανή ή τη χρήση του Ολύμπου 1 × 81 μικροσκόπιο με Fluoview-1000 scanner συνεστιακό λέιζερ.

BrdU επισήμανση και Chase

για να προσδιοριστεί περαιτέρω η ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση σε MPeMSCs, επιδιώξαμε να δοκιμάσει τον διαχωρισμό του DNA εκμαγείου κατά τη διάρκεια της διαίρεσης μιτωτικής κυττάρων χρησιμοποιώντας 5-βρωμο-2-δεοξυουριδίνη (BrdU) pulse-chase [34]. Εν συντομία, MPeMSCs υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ BrdU (Sigma) για αρκετά περάσματα να διασφαλιστεί ότι κλώνους του DNA σημάνθηκαν με BrdU σε συντριπτική πλειοψηφία των κυττάρων. Μετά από μια μακρά παλμό BrdU απομακρύνθηκαν από την καλλιέργεια κυττάρων και εξετάστηκαν για το πρότυπο σήμανσης BrdU κατά την κυτταρική διαίρεση. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη και επωάστηκαν σε 2Ν HCl που περιείχε 0,5% Triton Χ-100 για 1 ώρα. και αποκλείστηκαν με 5% BSA που περιέχει 0.25% ΝΡ-40. Τα κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-BrdU-FITC (Βϋ Biosciences) όλη τη νύκτα στους 4 ° C, πλύθηκαν και βάφτηκαν αντίθετα με DAPI. BrdU μοτίβο σήμανσης στα κύτταρα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας Ολύμπου 1 × 81 μικροσκόπιο με Fluoview-1000 scanner συνεστιακό λέιζερ.

Παρασκευή RNA, πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR και κηλίδωση Western

Το συνολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen) και προ-αγωγή με DNase. Ένα σύνολο 1 μg RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA με αντίστροφη μεταγραφάση III (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.