Abstract

Ιστορικό

Hedgehog (ΗΗ) σηματοδότηση διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην κανονική κυτταρικές διεργασίες, στην κανονική γαστρεντερική ανάπτυξη και διαφοροποίηση των θηλαστικών, και στην ογκογένεση και τη διατήρηση του κακοήθους φαινοτύπου σε ένα ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων. Αύξηση αποδείξεις εμπλέκουν περαιτέρω την εμπλοκή των HH σηματοδότησης στην ογκογένεση και μεταστατική συμπεριφορά των καρκίνων του παχέος εντέρου. Ωστόσο, γονιδιωματική προσεγγίσεις για τη διαλεύκανση του ρόλου των HH σηματοδότησης σε καρκίνους σε γενικές γραμμές λείπουν και τα δεδομένα που προκύπτουν με HH σηματοδότησης στον καρκίνο του παχέος εντέρου είναι εξαιρετικά περιορισμένη.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Για να προσδιορίσετε το μοναδικό κατάντη στόχοι των γονιδίων GLI, οι μετεγγραφικών ρυθμιστών του HH σηματοδότησης, στο πλαίσιο του καρκινώματος κόλου, χρησιμοποιήσαμε ένα μικρό μόριο αναστολέα τόσο GLI1 και GLI2, GANT61, σε δύο κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου, ΗΤ29 και GC3 /C1. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου αποδεικνύεται συσσώρευση GANT61-κατεργασμένων κυττάρων στο G1 /S όριο. cDNA μικροσυστοιχιών προφίλ γονιδιακής έκφρασης των 18.401 γονιδίων που εντοπίζονται διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων (βαθμούς με) τόσο κοινή και μοναδική για ΗΤ29 και GC3 /C1. Αναλύσεις που χρησιμοποιούν GenomeStudio (στατιστικές), Matlab (θερμότητα χάρτη), Εφευρετικότητα (κανονική ανάλυση οδός), ή με qRT-PCR, προσδιορίζονται p21

Cip1 (CDKN1A) και p15

Ink4b (CDKN2B), η οποία παίζει ρόλο στην το G1 /S σημείο ελέγχου, και up-γονιδίων που ρυθμίζονται στο G1 /S όριο. Τα γονίδια που καθορίζουν περαιτέρω πρόοδο του κυτταρικού κύκλου σε G1 /S, συμπεριλαμβανομένων E2F2, κυκλίνης Ε2 (CCNE2), cdc25A και CDK2, και τα γονίδια που ρυθμίζουν τη διέλευση των κυττάρων μέσω της G2 /M (CYCLIN A2 [CCNA2], CDC25C, κυκλίνη Β2 [CCNB2], CDC20 και CDC2 [CDK1], ήταν κάτω-ρυθμίζονται. Επιπλέον, νέα γονίδια που εμπλέκονται στην αντίδραση στο στρες, η απάντηση βλάβες στο DNA, αντιγραφή του DNA και επιδιόρθωση του DNA εντοπίστηκαν μετά την αναστολή της HH σηματοδότησης.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτή η μελέτη προσδιορίζει γονίδια που εμπλέκονται σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό HH-εξαρτώμενο καρκίνο του παχέος εντέρου σε κύτταρα, και μετά την αναστολή της, τα γονίδια που ρυθμίζουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και εκδηλώσεις κατάντη του G1 /S όριο.

Citation :.. Shi Τ, Mazumdar Τ, DeVecchio J, Duan ZH, Agyeman Α, Αζίζ M, et al (2010) cDNA μικροσυστοιχιών Gene Expression προφίλ του Hedgehog μονοπάτι σηματοδότησης Αναστολή σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου PLoS ONE 5 (10): e13054. doi: 10.1371 /journal.pone.0013054

Επιμέλεια: Terence Lee, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 6 Ιουν 2010? Αποδεκτές: 2 Σεπτέμβρη 2010? Δημοσιεύθηκε: 1 Οκτωβρίου 2010

Copyright: © 2010 Shi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οικονομική ενίσχυση από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου των βραβείων RO1 CA 32613 (JAH), RO1 108929 (JAH), και από το Cleveland Clinic. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Hedgehog (ΗΗ) σηματοδότηση παίζει έναν κρίσιμο ρόλο σε μια ποικιλία φυσιολογικών κυτταρικών διαδικασιών. Είναι ζωτικής σημασίας στην εμβρυογένεση, τη ρύθμιση της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικά μετάβασης, την σχηματοποίηση της ένα ευρύ φάσμα δομών σπονδυλωτών σε μία ποικιλία οργάνων, τη διατήρηση της ομοιόστασης ενήλικο ιστό, την επισκευή των ιστών, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, και στο θάλαμο διάσωσης [1] , [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Η κανονική οδός HH είναι επίσης κρίσιμη για φυσιολογική γαστρεντερική ανάπτυξη των θηλαστικών, όπου εμπλέκεται στη ρύθμιση της διαφοροποίησης συντεταγμένη της κανονικής εντερικών λαχνών [10], [11], [12]. Έτσι, κατά τη συνήθη γαστρεντερικό σωλήνα, οι συνδετήρες HH επάγονται στα διαφοροποιημένα κύτταρα γύρω από την λάχνης επιφάνεια, δημιουργώντας ένα βρόχο αρνητικής ανάδρασης για την αναστολή κανονική σηματοδότηση WNT στα βασικά κύτταρα της κρύπτης, προστατεύοντας έτσι διαφοροποιημένα κύτταρα από τις πολλαπλασιαστικές επιδράσεις του WNT [ ,,,0],13]. Η ενεργοποίηση της κανονικής οδού HH σηματοδότησης περιλαμβάνει την σύνδεση συνδετήρων HH στον υποδοχέα της μεμβράνης Patched (PTCH1), η οποία γίνεται εσωτερικεύεται οδηγούν στην ενεργοποίηση του μορίου σηματοδότησης λειαίνονται (ΠΕΑ) μέσω απελευθέρωσης από PTC μεσολάβηση καταστολής. SMO ενεργοποιεί ο τελικός κριτής του HH σηματοδότησης, η οικογένεια GLI των μεταγραφικών παραγόντων που προσδένονται στο GACCACCCA στοιχείου μορφής δεσμευτικών συναίνεση αλληλουχίες υποκινητή για να ρυθμίσει μεταγραφικά HH γονιδίων στόχου [3], [14], [15]. GLI1 και GLI2, οι μεταγραφικοί ενεργοποιητές της HH σηματοδότησης, διαθέτει διακριτά καθώς και επικαλυπτόμενες λειτουργίες που περιλαμβάνουν ενεργοποιητή (GLI1 και GLI2) ή καταστολέα (GLI2) δραστηριότητες [16]? Ωστόσο, οι ρόλοι τους στη ρύθμιση των διαδικασιών HH γνώμονα κυτταρικό πολλαπλασιασμό, επιβίωση ή θάνατο κυττάρου είναι ελάχιστα κατανοητές. Ιστορικά, GLI1 έχει θεωρηθεί η πιο αξιόπιστη δείκτης δραστηριότητας οδού HH, ωστόσο GLI2 φαίνεται να είναι η κύρια ενεργοποιητής HH σηματοδότησης, με GLI1 ως μεταγραφικός στόχος του GLI2 [3], [7], που οδηγεί σε αύξηση του HH σηματοδότησης τόσο ποσοτικά όσο και από ποιοτική [16]. Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό των πρωτεϊνών GLI είναι ότι η βιολογική τους δράση είναι μεταβλητής, επηρεάζεται από το κυτταρικό περιβάλλον [17], [18].

Η ενεργοποίηση της κανονικής καταρράκτη HH σηματοδότησης ενεργοποιούνται ανωμάλως και καλά γνωστό ότι παίζουν ένα κρίσιμο ρόλο στην ογκογένεση και τη διατήρηση του κακοήθους φαινοτύπου σε διάφορους τύπους ανθρώπινων καρκίνων. Τέτοια ενεργοποίηση εμπλέκει ενίσχυση GLI1 ή GLI2, μεταλλάξεις σε PTC ή SMO, ή απορυθμισμένη έκφραση του γονιδίου [3], [4]? Αυτά τα κακοήθη κύτταρα είναι επίσης ευαίσθητα στον αναστολέα μικρού μορίου που στοχεύει SMO, κυκλοπαμίνη [4], [19], [20], [21], [22], [23]. Τα καρκινώματα του παχέος εντέρου πιστεύεται ότι προέρχονται από συστατική ενεργοποίηση του σηματοδότηση Wnt με μετάλλαξη της APC ή γονίδια β-κατενίνης, ενώ η εμπλοκή του μονοπατιού σηματοδότησης HH δεν είναι τόσο σαφής. Στο γαστρεντερικό κακοήθειες, μεταγραφική πάνω ρύθμιση συνδετών ΗΗ έχει ταυτοποιηθεί ως το κυρίαρχο ενεργοποιητή της σηματοδότησης HH σε αυτές τις ασθένειες (που επισκοπείται στο [3]). Επιπλέον, υπάρχει απόδειξη ότι οι αναδυόμενες HH σηματοδότηση εμπλέκεται σε καρκινογένεση του παχέος [24], [25], καρκινώματος κόλου βλαστοκυττάρων αυτοανανέωσης, και στη μεταστατική συμπεριφορά των προηγμένων καρκίνων του παχέος εντέρου [26]. Ωστόσο, γονιδιωματικό προσεγγίσεις για τη διαλεύκανση του ρόλου των HH σηματοδότηση σε καρκίνους γενικά λείπουν, ρυθμιστικά γονίδια κατάντη του GLI1 και GLI2 που λειτουργούν σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και τη διατήρηση του κακοήθους φαινοτύπου HH παραμένουν ατελώς χαρακτηριζόμενη [5], και παραγόμενα δεδομένα επί HH σηματοδότηση στον καρκίνο του παχέος εντέρου είναι εξαιρετικά περιορισμένη.

Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός καθοδηγείται από την εξέλιξη των κυττάρων διαμέσου του κυτταρικού κύκλου που αποτελείται από διαδοχική διέλευση από G1, S, G2 και Μ φάσεις. Οι εξαρτώμενες από κυκλίνη κινάσες (CDKs) συνδυάζονται με κυκλίνες για να οδηγήσει το μηχανισμό του κυττάρου του κύκλου [27], [28]. Έτσι, CDK2 συνεργάτες με κυκλίνη Ε στην G1 /μετάβαση S και με την κυκλίνη Α κατά τη διάρκεια της φάσης S, CDK4 και CDK6 δεσμεύονται με κυκλίνη D κατά τη διάρκεια της εξέλιξης σε G1 /S, ενώ τα σύμπλοκα CDC2 με την κυκλίνη Α σε G2, και με κυκλίνη Β κατά τη διάρκεια της G2 /M μετάπτωσης. τα μέλη της οικογένειας CDC25 ρυθμίζει επίσης την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου μέσω αποφωσφορυλίωσης της CDKs [29], [30]. Οι αναστολείς CDK, συμπεριλαμβανομένων ρ21

Cip1 [29], [31] και ρ15

Ink4b [[32], δεσμεύονται σε σύμπλοκα κυκλίνης-CDK κατά τη μετάβαση του κυτταρικού κύκλου, ιδιαίτερα σε G1 /S (p21

Cip1, ρ15

Ink4b? [32]) και G2 /M (ρ21

Cip1? [29]), και μπορεί επίσης να επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G1 /S σύνορο εξής κυτταροστατικά σήματα μέσω λειτουργικής αναστολής του cyclin- σύμπλοκα CDK. Η οικογένεια E2F μεταγραφικών παραγόντων ρυθμίζει επίσης την έκφραση των γονιδίων που απαιτούνται για τη μετάβαση G1 /S, ιδιαίτερα γονίδια που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση του μηχανισμού αντιγραφής του DNA, και επιδιόρθωση του DNA [33].

τεχνολογία cDNA μικροσυστοιχιών έχει παρέχεται η δυνατότητα να μελετήσει την έκφραση χιλιάδων γονιδίων ταυτόχρονα, και είναι ένα σημαντικό εργαλείο για την ανατομή των οδών μεταγωγής σήματος. Για το καταρράκτη σηματοδότησης HH, /GLI έκφραση του γονιδίου-στόχου ΗΗ έχει εξεταστεί μετά από διέγερση EGF [6] ή επαγώγιμος GLI1 [16] ή GLI2 [9] γονιδιακή ενεργοποίηση σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα, ή στο μετασχηματισμό κυττάρων που προκαλείται από GLI1 [7]. Για τον προσδιορισμό μοναδική κατάντη στόχοι των γονιδίων GLI που λειτουργούν σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό στο πλαίσιο του καρκινώματος κόλου, χρησιμοποιήσαμε ένα μικρό αναστολέα μόριο τόσο GLI1 και GLI2, GANT61, τα οποία προσδιορίζονται σε μια οθόνη μικρού μορίου με βάση κύτταρα για αναστολείς GLI1 μεσολάβηση μεταγραφής [34]. GANT61 δρα στον πυρήνα για να εμποδίσει τη λειτουργία GLI1, αναστέλλει τόσο GLI1- και GLI2- μεσολάβηση της μεταγραφής, και παρουσιάζει υψηλό βαθμό εκλεκτικότητας για HH /GLI σηματοδότηση [34]. Έτσι, GANT61 ενεργεί κατάντη της κυκλοπαμίνης (στόχευση ΠΕΑ) για την αναστολή των τελικών καθοριστικούς παράγοντες της μεταγραφικής ρύθμισης HH.

Σε δύο κυτταρικές σειρές καρκινώματος ανθρώπινου κόλον, ΗΤ29 και GC3 /c1, αναστολή της οδού σηματοδότησης HH χρησιμοποιώντας GANT61 μειωμένη έκφραση του GLI1, GLI2 και τον υποδοχέα HH συνδέτη, PTCH1, και ανέστειλε πολλαπλασιασμό επάγοντας κυτταρική συσσώρευση στο G1 /S όριο 24 ώρες μετά την αγωγή, προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Για περαιτέρω λεπτομερή ανάλυση χρησιμοποιώντας προφίλ γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών cDNA και ποσοτική Real-Time PCR, p21

Cip1 (CDKN1A) και p15

Ink4b (CDKN2B), που μπορεί να προκαλέσει το G1 /S σημείου ελέγχου, ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω, ενώ γονίδια που καθορίζουν την περαιτέρω είσοδο από την G1 στην S-φάση, συμπεριλαμβανομένων E2F2, η κυκλίνη Ε2 (CCNE2), cdc25A και CDK2 μειώθηκαν στην έκφραση. Ταυτόχρονη με μειωμένη G1 έως την εξέλιξη της φάσης S, μειωμένη έκφραση της κυκλίνης Α2 (CCNA2), CDC25C, κυκλίνη Β2 (CCNB2), CDC20 και CDC2 (CDK1), που ρυθμίζουν τη διέλευση των κυττάρων μέσω της G2 /M επίσης αποδειχθεί. Πρόσθετες νέων γονιδίων που εμπλέκονται στην αντίδραση στο στρες, και η ανταπόκριση σε βλάβες του DNA, που δεν έχουν προηγουμένως εντοπιστεί μετά τον τερματισμό της HH σηματοδότησης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, περιλαμβάνουν τα γονίδια έγκαιρη αντίδραση DDIT2 (GADD45G), DDIT3 (GADD153), DDIT4 (REDD1), PPP1R15A (GADD34) και ATF3 που ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα. Γονίδια που εμπλέκονται στη σύνθεση και επιδιόρθωση του DNA (Tyms, TOP2A, ΤΚ1, πόλο, POLE2), και επιπλέον νέα γονίδια που εμπλέκονται στην εξέλιξη ή βλάβη του DNA αποκρίσεις S-φάσης, που ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται, περιλαμβάνουν KIAA0101 (p15 [PAF]), Αναπαραγωγή παράγοντας C παραλλαγές 2, 3, 4, 5, Cdt1, η E2F μεταγραφικοί παράγοντες CDCA4 και TFDP1, MDC1, FANCD2, PCNA, και τα γονίδια που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA, RAD51C (XRCC3), RAD54B, RAD51 και HELLS. Συνεπώς, η παρούσα μελέτη έχει προσδιορίσει τα γονίδια που ρυθμίζονται κατά τη διάρκεια της λήξης του HH-εξαρτώμενο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση σε καρκινικά κύτταρα κόλου, και περιλαμβάνει γονίδια που σχετίζονται με τη σύλληψη G1 /S φάσης, βλάβες στο DNA και λόγω άγχους.

Αποτελέσματα

GANT61 προκαλεί κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση των γονιδίων και τη συσσώρευση των κυττάρων ανθρώπινου καρκινώματος του παχέος εντέρου σε G1 /S

σε ΗΤ29 και c1 κύτταρα GC3 /αγωγή με GANT61 (20 μΜ) για έως 48 GLI hr, η έκφραση των γονιδίων στόχων GLI1 και GLI2 ήταν και οι δύο κάτω ρυθμισμένα, και επίσης ο υποδοχέας ρίζας συνδέσεως HH PTCH1, όπως προσδιορίζεται με qRT-PCR (Σχήμα 1Α). Στη συνέχεια, ΗΤ29 ή GC3 /c1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία, εις διπλούν, με GANT61 (20 μΜ) ακολουθούμενη από χρώση ΡΙ και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για τον προσδιορισμό της κατανομής του κυτταρικού κύκλου μεταξύ G1, S και G2 /M φάσεις (Σχήμα 1Β). Σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, τα κύτταρα συσσωρεύονται στο G1, 24 ώρες μετά τη θεραπεία με GANT61. Σε κύτταρα ΗΤ29 GANT61-αγωγή, μία αύξηση κατά 20% των κυττάρων G1-φάση συνδέθηκε με μια αντίστοιχη μείωση κυττάρων εντός του G2 /Μ φάσης (14%) και στη φάση S (5%), σύμφωνα με μια G1 /S σημείο ελέγχου σύλληψη. Σε c1 κύτταρα GC3 /, αύξηση 8% σε κύτταρα G1-φάση στις 24 ώρες μετά την αγωγή GANT61 αντιστοιχούσε επίσης με μια παρόμοια μείωση σε κύτταρα στο G2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου (Εικόνα 1Β).

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για έως και 48 ώρες με GANT61 (20 μΜ) ή με 0,2% DMSO (έλεγχος οχήματος). (Α) qRT-PCR του GLI1, GLI2 και PTCH1 γονιδίων από χρόνο 0 έως 48 ώρες. (Β) DNA εκχυλίστηκε στις 24 ώρες μετά τη θεραπεία, βάφονται με ιωδιούχο προπίδιο, και στη συνέχεια αναλύθηκαν για τις επιδράσεις της αναστολής του HH σηματοδότησης για διανομή φάση των κυττάρων εντός του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής.

Η

cDNA microarray αναλύσεις προσδιοριστούν οι αλλαγές στην έκφραση γονιδίων τόσο κοινή και μοναδική για ΗΤ29 και GC3 /c1 μετά τη θεραπεία GANT61

για να οριοθετηθούν οι αλλαγές στην έκφραση γονιδίων σε ΗΤ29 και /c1 κύτταρο καρκινώματος ανθρώπινου κόλον γραμμές GC3 σε απόκριση σε θεραπεία με ο ανταγωνιστής GLI1 /GLI2, GANT61, η έκφραση των 18.401 ανθρώπινα γονίδια σκιαγραφήθηκε στα κύτταρα ελέγχου σε αγωγή με φορέα (0,2% DMSO) και σε κύτταρα επεξεργασμένα με GANT61 (20 μΜ) για 24 ώρες. Γονίδια με False Discovery Rate (FDR) -adjusted p-τιμή του & lt? 0.001 και διπλώστε την αλλαγή & gt? 1.5 θεωρήθηκαν διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (βαθμούς με) που προκαλείται από GANT61 σε σχέση με τον έλεγχο του οχήματος, εκ των οποίων 1.368 γονίδια που εκφράζονται διαφορικά σε ΗΤ29 και 1,002 γονίδια σε GC3 /c1 κύτταρα (Σχήμα 2). 755 γονίδια ή 558 γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω, και 613 ή 444 γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω, σε ΗΤ29 και c1 κύτταρα GC3 /, αντίστοιχα. 763 και 397 γονίδια εκφράζονται διαφορικά και μοναδική για ΗΤ29 ή GC3 /C1, αντίστοιχα. Από τους 763 βαθμούς με μοναδική για ΗΤ29, 459 (60%) ήταν πάνω ρυθμισμένα και 304 (40%) ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω. Ομοίως, από τους 397 βαθμούς με μοναδική για GC3 /c1, 262 (66%) ήταν τα επάνω ρυθμισμένη και 135 (34%), ρυθμισμένα προς τα κάτω. Σε αντίθεση, 605 γονίδια που αντιπροσωπεύουν το 3,4% του συνόλου των γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά που είναι κοινά και για τις δύο κυτταρικές σειρές? Από αυτά, 296 ήταν πάνω ρυθμισμένα (49%), και 309 (51%) ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω (Σχήμα 2). Όλα τα γονίδια που είναι κοινές στα δύο ΗΤ29 και GC3 /c1 που ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα ή προς τα κάτω ρυθμισμένα (ρ & lt? 0.001). Αναφέρονται στους Πίνακες 1 και 2, αντίστοιχα

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GANT61 (20 μΜ) ή φορέα μόνο (0,2% DMSO) για 24 ώρες, και το ολικό RNA εκχυλίστηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Αλλαγές στην έκφραση γονιδίου προσδιορίστηκαν με προφίλ γονίδιο cDNA μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας την Illumina Ανθρώπου-ref8 V3.0 συστοιχία Bead-Chip. Γονίδια με False Discovery Rate (FDR) -adjusted τιμή p (p & lt? 0.001) και διπλώστε την αλλαγή & gt? 1.5 θεωρήθηκαν βαθμούς με. Άνω πίνακα: up-ρυθμιζόμενα γονίδια. Κάτω πίνακας: γονίδια κάτω-ρυθμίζονται. Διαφορική έκφραση για το σύνολο, μοναδικό up-ρύθμιση, το μοναδικό προς τα κάτω-ρυθμίζονται, κοινή up-ρύθμιση, και τα κοινά κάτω-ρυθμίζονται βαθμούς με, φαίνονται.

Η

Η

Διαφοροποίηση των κανονικών σηματοδότησης οδοί έπειτα από την αναστολή της HH σηματοδότησης

τα γονίδια με σημαντικές αλλαγές στην έκφραση μετά από θεραπεία GANT61 είχαν ανατεθεί σε διαφορετικές οδούς κανονική σηματοδότησης και υποβάλλεται σε Ingenuity Ανάλυση Pathway (IPA), όπου η προκύπτουσα 1.368 βαθμούς με το ΗΤ29 και 1.002 βαθμούς με το GC3 /c1 χαρτογραφήθηκαν σε δίκτυα που ορίζεται από τη βάση δεδομένων ΙΡΑ (Εικόνα 3). Για τους χαρτογραφηθεί βαθμούς με συμπεριλαμβανομένων τόσο επάνω και υποβαθμίσουν τα ρυθμιζόμενα γονίδια, τα 15 πιο σημαντικά μεταβληθεί κανονικών μονοπατιών σε ΗΤ29 αποδειχθεί -log (p-value) που κυμαίνονται 2,045 με 9,025, και GC3 /C1 2,32 έως 7,509. Από τα 15 γονίδια που περιλαμβάνουν πορείες σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται, 12 ήταν κοινή και στις δύο κυτταρικές σειρές. Τα 3 κοινών μονοπατιών με τη μεγαλύτερη απόκλιση προς τα κάτω ρυθμισμένα έκφρασης περιλαμβάνουν γονίδια που εμπλέκονται στο DNA απόκριση βλάβη, έλεγχος σημείου ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, και μίτωση. Άλλες οδοί προς τα κάτω-ρυθμίζονται εμπλέκονται στην G1 /S και G2 /σημεία ελέγχου Μ βλάβες στο DNA, το μεταβολισμό πρόδρομο του DNA, και η κυτταρική σηματοδότηση συμμετοχή διαφόρων οδών συμπεριλαμβανομένων και εκείνων που εμπλέκονται σε καρκίνους, που επίσης αποδεικνύουν 3 υπογραφές μοναδική είτε ΗΤ29 ή GC3 /C1 (Σχήμα 3 ). Από τις 15 οδούς που περιλαμβάνουν γονίδια που είναι τα πλέον σημαντικά πάνω ρυθμισμένα, 8 είναι κοινά τόσο ΗΤ29 και GC3 /C1, και 7 αντιπροσωπεύουν μοναδικά μονοπάτια για κάθε κυτταρική σειρά, καταδεικνύοντας μεγαλύτερη ποικιλία των μορφών επάνω ρυθμισμένη έκφραση γονιδίου (Σχήμα 3 ). Τα πάνω-ρυθμίζονται μονοπάτια κοινή και στις δύο κυτταρικές σειρές περιλαμβάνουν το μεταβολισμό που σχετίζονται, όπως στεροειδή, πυροσταφυλικό, γλυκόλυση γλουταθειόνη, ή γλυκερολιπίδιο, και δεν συνδέονται άμεσα με τον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού.

Οι 15 κορυφαίες κανονικών μονοπατιών σηματοδότησης , που προσδιορίζεται από το ΙΡΑ, που ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα ή προς τα κάτω ρυθμισμένα με κατεργασία GANT61 σε ΗΤ29 και GC3 c1 κύτταρα /, φαίνονται. Οι 1.368 βαθμούς με το ΗΤ29 και 1.002 βαθμούς με το GC3 /C1 χαρτογραφήθηκαν στο συγκεκριμένο δίκτυο IPA-. Οι τιμές p σημασία που καθορίζουν την πιθανότητα ότι η συσχέτιση μεταξύ των γονιδίων στο σύνολο δεδομένων και την κανονική οδός είναι από τύχη και μόνο υπολογίστηκαν με την ακριβή δοκιμή του Fisher, και εκφράζονται ως -log (p-value). Α Διαδρομές με εμπλουτισμένο κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια. Β Πορείες με εμπλουτισμένο up-ρυθμιζόμενων γονιδίων. Μπλε: Μονοπάτια κοινό τόσο ΗΤ29 και GC3 /C1. Κόκκινο: Μονοπάτια μοναδική είτε ΗΤ29 ή GC3 /C1. Κίτρινο πλατείες:. Λόγος του αριθμού των βαθμούς με το οποίο αντιστοιχεί σε ένα συγκεκριμένο κανονικό μονοπάτι διαιρούμενο με το συνολικό αριθμό των γονιδίων που απαρτίζουν το μονοπάτι

Η

Γονίδια που δείχνουν μοτίβα αλλαγή φορές διαφορά στην GANT61 επεξεργασμένο ΗΤ29 και GC3 /c1 κύτταρα

/επιλέχθηκαν

Διπλώστε τα πρότυπα των πιο υψηλά βαθμούς με το ΗΤ29 και GC3 αλλαγή c1, αναλύονται και παρουσιάζονται σε ένα χάρτη θερμότητας για να αξιολογούν και να συγκρίνουν ομοιότητες και διαφορές στην διαφορική έκφραση μεταξύ των δύο κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπεία με GANT61 (Σχήμα 4). Εκτός από τα γονίδια με διαφορετικές λειτουργίες που δεν σχετίζονται άμεσα με HH-εξαρτώμενο πολλαπλασιασμό, up-ρυθμιζόμενα γονίδια που επηρεάζουν την G1 /S μετάβαση και την επακόλουθη εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, και τα οποία είναι κοινά σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, περιλαμβάνουν CDKN1A, και το DNA -Φθορά επαγώγιμο μεταγραφές 3 και 4 (DDIT3 και DDIT4). Ένας πολύ μεγαλύτερος αριθμός γονιδίων που εμπλέκονται σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μετάπτωση κύκλου του κυττάρου μέσω της G1 /S όριο, της εξέλιξης της φάσης S, και G2 /M μετάπτωσης, ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε έκφραση, και κοινή και στις δύο κυτταρικές σειρές. Αυτά περιλαμβάνουν CDC6 (συμμετέχουν σε G1 /S), τρία γονίδια που οδηγούν την είσοδο και διέλευση από S-φάσης (CCNE2, E2F2) και G2 (CCNA2), γονίδια που εμπλέκονται στην αντιγραφή και επιδιόρθωση του DNA (Tyms, πόλο, TOP2A, ΤΚ1, POLE2), και τα δύο γονίδια που ρυθμίζουν τη μίτωση (AURKB, CDC20?. Σχήμα 4, αστερίσκους)

Ο χάρτης θερμότητας που παράγεται στο Matlab (Mathworks), και συγκρίνει διπλώστε τα πρότυπα από τα πιο ιδιαίτερα βαθμούς με το ΗΤ29 αλλαγή και κύτταρα GC3 /C1 μετά τη θεραπεία GANT61. Τα πιο υψηλά βαθμούς με επέδειξε τιμή p διαφορική έκφραση p & lt? 0.001 μεταξύ του ελέγχου του οχήματος (0,2% DMSO) και GANT61-επεξεργασμένα κύτταρα. Αριστερό πάνελ (κόκκινο): up-ρυθμιζόμενα γονίδια. Δεξί πάνελ (πράσινο): γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω. Γονίδια σημειώνονται με αστερίσκους καθορίσουν εκείνα τα γονίδια με συγκεκριμένους ρόλους στην G1 /S μετάβαση, την εξέλιξη της S-φάσης, αντιγραφή του DNA ή επισκευή, ή ρύθμιση του G2- ή Μ- μεταβάσεις φάσης. Fold αλλαγές όλων των κάτω ρυθμισμένα βαθμούς με και όλα εκτός από ένα επάνω ρυθμισμένα DEG είναι ≤8 (bar φάσμα κεντρικό χρώμα).

Η

Από τους 296 ρυθμισμένα προς τα πάνω γονίδια, εκτός από τα γονίδια συγκριτικά εκπροσωπούνται στο χάρτη θερμότητας που περιλαμβάνουν DDIT3 (GADD153) και DDIT4 (REDD1), επιπλέον μυθιστόρημα DNA μεταγραφές βλάβη που επάγεται από εντοπίστηκαν επίσης και περιλαμβάνουν DDIT2 (GADD45G), PPP1R15A (GADD34) και ATF3 (Πίνακας 1). TP53INP1, τα οποία μπορούν να ρυθμίζουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου, και TP53INP2, τα οποία προσδιορίζονται με τις απαντήσεις κυτταρικό θάνατο, ήταν επίσης πάνω ρυθμισμένα. Από τα 309 γονίδια σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε απάντηση GANT61, νέα γονίδια εντοπίστηκαν περιλαμβάνουν KIAA0101 (p15 [PAF]), αναπαραγωγή Παράγοντα Ο παραλλαγές 2, 3, 4, 5, Cdt1, η E2F μεταγραφικοί παράγοντες CDCA4 και TFDP1, MDC1, PCNA , FANCD2, και τα γονίδια που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA, RAD51C (XRCC3), RAD54B, RAD51 και HELLS (Πίνακας 2).

διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια που εμπλέκονται στην G1 /S και G2 /M μεταβάσεις

για να αξιολογεί περαιτέρω τα γονίδια που εμπλέκονται στον έλεγχο της προόδου του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος κόλου μετά τη θεραπεία GANT61, 10 γονίδια που εμπλέκονται στην G1 /S ή G2 /M μεταπτώσεις, που προσδιορίζονται από ΙΡΑ, επιλέχθηκαν για περαιτέρω εξέταση. Γονίδια που απαιτείται κατά τη G1 /S όριο για G1 /μετάβαση S, ή για την επαγωγή ενός G1 /S σημείου ελέγχου εξής κυτταροστατικά σήματα, περιλαμβάνει τις δύο αναστολείς κινάσης εξαρτώμενης από κυκλίνη, ρ21

Cip1 (CDKN1A) και ρ15

Ink4B (CDKN2B), που ρυθμίζεται προς τα πάνω από 5.2- και 3.1- φορές, 24 ώρες μετά τη χορήγηση GANT61 (Πίνακας 3). Πρόσθετες γονίδια που απαιτούνται για την G1 /S μετάβαση που ρυθμίζεται προς τα κάτω περιλαμβάνει το Ε2 παράγοντα μεταγραφής E2F2 (-4,2 φορές), και άλλα κρίσιμα γονίδια που είχαν κάτω-ρυθμίζονται από 2.1- 3.2- να φορές, περιλαμβάνουν κυκλίνη Ε (CCNE2) , CDK2 και cdc25A. Κατά G2 /M, GANT61 επαγόμενη κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση του CCNA2 (CYCLIN Α2), κυκλίνη Β1 (CCNB1), κυκλίνη Β2 (CCNB2), CDK1 (CDC2), και CDC25C με 2.3- έως 3.1- φορές (Πίνακας 3).

για να προσδιοριστεί η ευρωστία του γονιδίου μικροσυστοιχιών cDNA προφίλ έκφρασης μετά από θεραπεία ΗΤ29 και GC3 c1 κύτταρα /με GANT61 (20 μΜ) για 24 ώρες, qRT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορισθούν οι μεταβολές στην έκφραση του επιλεγμένου ομάδα 10 βαθμούς με προσδιορίζεται από τις μικροσυστοιχίες cDNA. Τα γονίδια που εμπλέκονται και οι εκκινητές συντίθενται παρουσιάζονται στον Πίνακα 4. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε cDNA που παράγεται χρησιμοποιώντας ολικό RNA που απομονώθηκε από ανεξάρτητα GANT61 επεξεργασμένου ΗΤ29 και GC3 /c1 κύτταρα για 0 ​​ώρες, 16 ώρες, 24 ώρες, 38 ώρες και 48 ώρες μετά τη θεραπεία. GAPDH χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση όλων των δεδομένων qRT-PCR. Γονίδια που καθορίζεται από qRT-PCR περιελάμβανε την έκφραση του E2F2, CCNE2, cdc25A και CDK2 σε G1 /S, οι οποίες κάτω ρυθμισμένα, πάνω ρύθμιση CDKN1A και CDKN2B στο G1 /S και προς τα κάτω ρύθμιση CCNA2, CDC25C, CCNB2 , και CDK1 σε G2 /M (σχήμα 5). Το επάνω ρυθμισμένη ή προς τα κάτω ρυθμισμένα αλλαγές στην έκφραση γονιδίων μετά από θεραπεία GANT61 και καθορίζεται από cDNA microarray προφίλ, επιβεβαιώθηκαν με qRT-PCR (Σχήμα 5).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα μόνο (0,2% DMSO) ή GANT61 (20 μΜ) για 16 ώρες, 24 ώρες, 38 ώρες, ή 48 ώρες. Ολικό RNA εκχυλίστηκε και qRT-PCR διεξήχθη όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι χρησιμοποιώντας τις ομάδες εναρκτήρα που παρατίθενται στον Πίνακα 2. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από 4 προσδιορισμών, και GAPDH χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει τα σχετικά επίπεδα mRNA.

Συζήτηση

Η οδός σηματοδότησης HH ενεργοποιείται σε μία ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων παρακάτω μεταλλάξεις στα γονίδια που ρυθμίζουν κανονική σηματοδότηση HH, συμπεριλαμβανομένου του υποδοχέα PTC, και το μόριο σηματοδότησης HH, SMO, και μπορεί επίσης να ενεργοποιηθεί μέσω μεταγραφικής πάνω ρύθμιση των συνδετών ΗΗ (που επισκοπείται στο [3]). Αυτή η οδός γίνεται ολοένα και μεγαλύτερη σημασία λόγω απόκτηση διορατικότητα εξέχοντα ρόλο σε πολλές αναπτυξιακές διαδικασίες, και στη διατήρηση του κακοήθους φαινοτύπου σε μια ευρεία ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων, των οποίων η ανάπτυξη έχει βρεθεί να προληφθεί με εκλεκτική αναστολή του ιδιοσυστατικού HH δραστηριότητα οδού [14], [35], [36]. Οι όγκοι του εγκεφάλου, του προστάτη, του δέρματος, του παγκρέατος, και του νεφρού έχουν αποδείξει την απαίτηση για σηματοδότηση HH-GLI, και ανταποκρίθηκαν στην αναστολή της HH σηματοδότησης μόριο στόχο SMO με κυκλοπαμίνη ή SMOshRNA [4], [19], [20] [21], [22], [23].

Οι μεταγραφικοί ενεργοποιητές σε HH σηματοδότηση περιλαμβάνουν μέλη της οικογένειας GLI παραγόντων μεταγραφής, GLI1 και GLI2, τα οποία έχουν τόσο διακριτές καθώς και επικαλυπτόμενες λειτουργίες [16 ]. Η ενεργοποίηση των πρωτεϊνών GLI είναι μία περίπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει τροποποιήσεις και τις αλληλεπιδράσεις ενός αριθμού θετικών και αρνητικών ρυθμιστών της οδού και δεν έχει πλήρως κατανοηθεί [1], [14], [35]. γονίδια-στόχοι που ρυθμίζονται από το μονοπάτι σηματοδότησης Hh διαφέρουν μεταξύ ιστών και κυτταρικών τύπων, καθώς και να επηρεάζεται από την παρουσία ή την απουσία ρυθμιστικών παραγόντων συν-εκφράζεται με GLI πρωτεΐνες που τελικά καθορίζουν τις μεταγραφικές προγραμμάτων ενεργοποιείται από HH σηματοδότηση [6], [37 ]. Έτσι, ογκογόνο μονοπάτια σηματοδότησης συγκλίνουν σε κανονική σηματοδότηση HH στο επίπεδο των παραγόντων μεταγραφής GLI και επιπροσθέτως σε γονίδια στόχους καθοδικά του GLI1 και GLI2 να οδηγεί περαιτέρω το σηματοδοτικό μονοπάτι HH στην κυτταρική επιβίωση σε κακοήθειες [6], [7], [20 ], [38], [39], [40]. Η φαινότυπος σηματοδότησης ΗΗ επομένως επηρεάζεται σημαντικά και τελικά καθορίζεται από την συν-έκφραση των συμπληρωματικών ρυθμιστικών παραγόντων, και ως εκ τούτου από την κυτταρική έννοια της γονιδιακής έκφρασης.

HH σηματοδότηση παίζει ένα ρόλο στο πρόγραμμα διαφοροποίησης των κανονικών εντερικών λαχνών [11], [12], [41], και έχει προταθεί πρόσφατα ότι η ανθρώπινη καρκίνου του παχέος εντέρου επιθηλιακά κύτταρα εμφανίζουν έναν άξονα σηματοδότησης HH-GLI στη διαδικασία της καρκινογένεσης [24], [25]. Έκφραση των συστατικών οδού HH-GLI επιδείχθηκε με συνέπεια σε μια ανάλυση των 40 πρωτογενών ανθρώπινων καρκινωμάτων κόλου και όγκων μεταστατικό στο ήπαρ [26], σύμφωνα με τα ευρήματα των προηγούμενων ερευνητών [25], [42], [43]. Έτσι, χρησιμοποιώντας qRT-PCR, η έκφραση του GLI1, PTCH1, GLI2 και SHH προσδιορίστηκε σε όλα τα ανθρώπινα καρκινώματα του κόλου που εξετάστηκαν. Η απαίτηση τόσο για GLI1 και GLI2 για παρατεταμένη πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών καρκινώματος κόλον in vitro, συμπεριλαμβανομένων ΗΤ29, αποδείχθηκε με τη χρήση της τεχνολογίας siRNA [26]. Επιπλέον, knockdown του ΠΕΑ με SMOshRNA εμπόδισε την ανάπτυξη των κυττάρων ΗΤ29 σε ποντίκια SCID, ενώ κ.β. ΗΤ29 υποδόρια ξενομοσχεύματα ανταποκρίθηκαν στην κυκλοπαμίνη με μείωση του όγκου του όγκου [26]. Έτσι, κανονική ενεργοποίηση GLI1 και GLI2 μέσω SMO είναι σημαντική για την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ανθρώπινου καρκινώματος του παχέος εντέρου σε βιολογικό περιβάλλον.

Στην παρούσα μελέτη, η λειτουργία και των δύο GLI1 και GLI2 κατάντη του ΠΕΑ ανεστάλη στο παρουσία GANT61, ένα μικρό μόριο που αναστολέα ταυτοποιήθηκε από μια οθόνη με βάση κύτταρα να αναστέλλουν ειδικώς GLI1 διαμεσολαβούμενη μεταγραφή, αλλά ότι επίσης ανέστειλε την λειτουργία του GLI2 [34]. επιλέχθηκε Αυτό παράγοντα να αναστέλλει ειδικώς τις τελικές ρυθμιστές του HH σηματοδότησης, οι παράγοντες μεταγραφής GLI, σε διαλεύκανση των κατάντη γονιδίων στόχων που καθορίζουν HH-εξαρτώμενο πολλαπλασιασμό σε ανθρώπινα κύτταρα καρκινώματος παχέος εντέρου. Δύο κυτταρικές γραμμές, χαρακτηρίζεται καλά στα εργαστήρια μας, ΗΤ29 και GC3 /c1, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GANT61 (20 μΜ) για 24 ώρες, και η έκφραση των GLI1, GLI2 και PTCH1 mRNA ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω. Περαιτέρω, τα αποτελέσματα επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, όπως καθορίζεται από την κατανομή των κυττάρων εντός του ανάλυση κυτταρικού κύκλου και κυτταρομετρίας ροής απέδειξε συσσώρευση των κυττάρων στο G1 μετά από θεραπεία, με ταυτόχρονη μείωση των κυττάρων από την G2 /διαμερίσματος Μ, και στην περίπτωση των ΗΤ29 , επίσης από το S-φάση, γεγονός που υποδηλώνει την επαγωγή μιας G1 /S σημείου ελέγχου.

ΗΤ29 και GC3 c1 κύτταρα /στη συνέχεια σε επεξεργασία με GANT61 (20 μΜ) για 24 ώρες, το RNA εκχυλίζεται και αλλαγές στη γονιδιακή έκφρασης προσδιορίστηκαν από Illumina cDNA μικροσυστοιχιών προφίλ. Μετά από στατιστικές αναλύσεις, 1.368 γονίδια σε ΗΤ29 και 1.002 γονίδια στα GC3 /C1, προσδιορίστηκαν να διαμορφώνεται σημαντικά από τη θεραπεία GANT61 (FC & gt? 1.5? P & lt? 0.001). Για τα γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω στην έκφραση, 296 γονίδια ήταν κοινή και στις δύο κυτταρικές σειρές, καθώς και για τα γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω, 309 γονίδια ήταν κοινή και στις δύο κυτταρικές σειρές. Ο αποκλεισμός των κυττάρων στο όριο G1 /S αποδεικνύεται από τα επάνω ρυθμισμένη έκφραση του p21

Cip1 και Ρ15

Ink4b ότι εν μέρει ρυθμίζουν την G1 /S μετάβαση. ρ15

Ink4b είναι ένα μέλος της οικογένειας των ΙΝΚ4 αναστολέων CDK, επάγεται σε απόκριση προς κυτταροστατική σήματα [32], [44], και τα σύμπλοκα με την κυκλίνη D /CDK4 ή κυκλίνη D /CDK6 να μεσολαβήσει σύλληψη G1-φάση σε η μετάβαση G1 /S σε ορισμένα συστήματα [30], [32]. ρ21

Cip1 μπορούν να δεσμεύουν ένα ευρύ φάσμα των συμπλοκών κυκλίνης-CDK, με προτίμηση για εκείνα που περιέχουν CDK2 (που επισκοπείται στο [31], [45], και κατά τη διάρκεια ενός κανονικού κύκλου του κυττάρου, διευκολύνει το σχηματισμό συμπλόκου δραστικού κυκλίνης-CDK για την προώθηση τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Ωστόσο, όταν υπερεκφράζεται, ρ21

Cip1 σχηματίζει ένα σύμπλοκο με ανασταλτική κυκλίνης Ε /CDK2, οδηγώντας σε G1- και, κατά συνέπεια, S- σύλληψης φάση, σχηματίζοντας έτσι το G1 /S σημείου ελέγχου [46], [47]. Η προγραμματισμένη χρονισμός της έκφρασης των κυκλινών E, Α και Β που οδηγούν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, αντανακλάται στις σημαντικές αλλαγές στις φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Κυκλίνη Ε εκφράζεται σε μέγιστα επίπεδα στα κύτταρα που υφίστανται την G1 στην S μετάβαση, η μείωση κατά τη διάρκεια της S- εξέλιξης φάση, έτσι ώστε G2 Μ κύτταρα /είναι κυκλίνης Ε-αρνητικό (που επισκοπείται στο [30]). κυκλίνης Α εκφράζεται στα τέλη G1, καταδεικνύει έντονη έκφραση κατά τη διάρκεια της φάσης S, και αυξάνεται καθώς τα κύτταρα προχωρήσουν προς G2, με υποβάθμιση της νωρίς μίτωση? κυκλίνες τύπου Β αρχίζουν να εκφράζονται στα τέλη S-φάση, και οδηγούν τα κύτταρα αν και G2- Μ- φάσεις του κυτταρικού κύκλου [30] και. CDK2 ελέγχει την G1 /S μετάβαση με συμπλοκοποίηση με κυκλίνη Ε, και ενεργοποιείται από cdc25A, το οποίο αποφωσφορυλιώνει CDK2 [48]. CDC2 ελέγχει την κυτταρική έναρξη μίτωση στη G2 /M μετάπτωσης, σχηματίζοντας έτσι σύμπλοκα με κυκλίνες Α και Β, ενεργοποιείται από CDC25C, και είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω στο τέλος της φάσης-Μ [29]. Όλα αυτά τα γονίδια ρυθμίζονται προς τα κάτω σε έκφραση σε απόκριση προς την αναστολή της GLI1 /λειτουργίας GLI2 (Πίνακας 2). Έτσι, τα σήματα που προκαλούνται για την προώθηση κυτταρική συσσώρευση στο G1 /μολύβδου S στην καταστολή των γονιδίων που ρυθμίζουν την περαιτέρω πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, και ρ21

έκφραση Cip1 έχει δειχθεί ότι καταστρέφουν την έκφραση των γονιδίων που ρυθμίζουν την αντιγραφή και την επιδιόρθωση του DNA, και μίτωση [49], [50], [51]. Στην παρούσα μελέτη τα γονίδια αυτά περιλαμβάνουν CDC6 (που δραστηριοποιούνται σε G1 /S και απαραίτητη για την έναρξη της αντιγραφής του DNA), Tyms, TOP2A, ΤΚ1, πόλο και POLE2 (S-φάση), και AURKB και CDC20 (μίτωση [52] , [53]), που προσδιορίζεται με ανάλυση χάρτη θερμότητας. Μια σχηματική αναπαράσταση των γονιδίων που εμπλέκονται σε GANT61 επαγόμενη αναστολή της προόδου του κυτταρικού κύκλου κατά την εξέλιξη της G1 /S, S-φάσης και ρύθμιση κατά την διάρκεια G2- και Μ-φάσεις, που προσδιορίζονται από μικροσυστοιχίες cDNA, ανάλυση θερμότητα χάρτη, και με qRT-PCR , φαίνεται στο σχήμα 6, και περιλαμβάνει 5 των κοινών μονοπατιών σηματοδότησης 12 που προσδιορίζεται με ανάλυση ΙΡΑ.

από cDNA μικροσυστοιχιών, θερμότητα χάρτη, και αναλύει qRT-PCR, γονίδια που εμπλέκονται σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου, συμπεριλαμβανομένων η G1 /S μετάβαση, και την εξέλιξη μέσα από S- G2- και Μ- φάσεις, παρουσιάζονται. Τα γονίδια που ταυτοποιούνται περιλαμβάνουν αναστολείς CDK, τα μέλη της CDK και των οικογενειών CDC, κυκλίνες, γονίδια που εμπλέκονται στην αντιγραφή και επιδιόρθωση του DNA, και τα γονίδια που ρυθμίζουν την μιτωτικής ατράκτου, και να περιλαμβάνουν 5 των κοινών μονοπατιών σηματοδότησης 12 που προσδιορίζεται με ανάλυση ΙΡΑ. Κόκκινο: Up-ρυθμιζόμενα γονίδια. Πράσινο: Down-ρυθμιζόμενων γονιδίων. Ελαφριά σκιά → σκούρα απόχρωση, την αύξηση της διαφορικής έκφρασης.

Η

γονίδιο μικροσυστοιχιών cDNA Περιεκτική προφίλ ανάλυση των γονιδίων που καθορίζουν το φαινότυπο σηματοδότησης HH έχει διεξαχθεί μόνο σε μοντέλα μη καρκινικό κύτταρο. Σε αυτά τα συστήματα, η ενεργοποίηση GLI έχει διεγερθεί από αγωγή με EGF [6], σταθερή GLI1 ή έκφραση Ha-ras [7], ή έκφραση ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένης GLI2 [16]. Σε αυτές τις μελέτες, η κυκλίνη D [6], [7], GADD153 [7], CDKN2B, CDKN1A, CDK2, PCNA, TOP2A, CCNB1, ΧΚΧΧ1 [16], έχουν αναγνωριστεί ως γονίδια ενεργοποιούνται κατάντη του GLI.