Abstract

Οι αναστολείς Μικρό μόριο εναντίον της πρωτεΐνης γερανυλγερανυλτρανσφεράσης-Ι όπως P61A6 έχουν δειχθεί ότι αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό μιας ποικιλίας ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων και δραστικότητα κατά του όγκου παρουσιάζουν σε μοντέλα ποντικού. Η ανάπτυξη αυτών των αναστολέων μπορεί να επιταχυνθεί δραματικά από την ανάθεση στόχευση του όγκου και την ικανότητα ελεγχόμενης αποδέσμευσης. Ως πρώτο βήμα προς αυτή την κατεύθυνση, έχουμε έγκλειστα P61A6 σε ένα νέο τύπο λιποσωμάτων που ανοίγουν και απελευθερώνουν φορτία μόνο υπό συνθήκες χαμηλού ρΗ. Αυτά τα λιποσώματα τύπου χαμηλό ρΗ αποδέσμευσης παρασκευάστηκαν με ρύθμιση της αναλογίας των δύο τύπων παραγώγων φωσφολιπιδίων. Φόρτωση γερανυλγερανυλτρανσφεράσης-Ι αναστολέα (GGTI) που παράγεται λιποσώματα με μέση διάμετρο 50-100 nm. GGTI απελευθέρωσης σε διάλυμα εξαρτιόταν έντονα επί τιμές ρΗ, δείχνοντας μόνο απελευθέρωσης σε ρΗ χαμηλότερο από 6. Απελευθέρωση φορτίων σε ένα ρΗ-εξαρτώμενο τρόπο μέσα στο κύτταρο καταδείχθηκε με τη χρήση ενός αναστολέα αντλίας πρωτονίων βαφιλομυκίνη Α1 ότι η αυξημένη λυσοσωματικής ρΗ και ανέστειλαν η απελευθέρωση μιας χρωστικής μεταφέρεται στο ρΗ λιποσώματος. Παράδοση GGTI στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος καταδείχθηκε με την αναστολή της πρωτεΐνης γερανυλγερανυλίωση στο εσωτερικό του κυττάρου και αυτή η επίδραση παρεμποδίστηκε από βαφιλομυκίνη Α1. Επιπλέον, GGTI παραδίδονται από ρΗ λιποσώματα που επάγεται αναστολή πολλαπλασιασμού, G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου που σχετίζεται με την έκφραση του κυτταρικού κύκλου ρυθμιστή ρ21

Cip1 /WAF1. παρεμπόδιση του πολλαπλασιασμού παρατηρήθηκε επίσης με διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Διαθεσιμότητα των nanoformulated GGTI ανοίγει τη δυνατότητα να συνδυάσει με άλλους τύπους αναστολέων. Για να αποδείξει αυτό το σημείο, συνδυάσαμε την λιποσωμική-GGTI με αναστολέα φαρνεσυλτρανσφεράσης (FTI) για την αναστολή της K-Ras σηματοδότησης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το ενεργοποιημένο K-Ras σηματοδότησης σε αυτά τα κύτταρα μπορεί να είναι αποτελεσματικά αναστέλλεται και παρατηρείται ότι συνεργική δράση των δύο φαρμάκων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν μια νέα κατεύθυνση στη χρήση των GGTI για τη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Lu J, K Yoshimura, Goto Κ, Lee C, Hamura K, Kwon O, et al. (2015) Nanoformulation της Γερανυλογερανυλο Τρανσφεράσης-Ι αναστολείς για Cancer Therapy: Λιποσωμικά Ενθυλάκωση και του pH εξαρτάται από την παράδοση στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 10 (9): e0137595. doi: 10.1371 /journal.pone.0137595

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 23η Απριλίου του 2015? Αποδεκτές: 18, Αυγούστου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 9η Σεπτεμβρίου 2015

Copyright: © 2015 Lu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το ΝΙΗ χορηγήσει CA41996 (με FT) και R01GM071779 και P41GM081282 (ΟΚ), https://grants.nih.gov/grants/giwelcome.htm. Ένα μέρος των εργασιών που πραγματοποιούνται σε αυτό το χαρτί υποστηρίζεται από μια χορηγία συμφωνία έρευνας με NOF, Inc (στο FT). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. NOF Corporation παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους συγγραφείς [Kohei Yoshimura και ο Ken Hamura ]. Η συμβολή τους στη μελέτη ορίζεται στην ενότητα Συγγραφέας συνεισφορά. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Μια κατηγορία αντικαρκινικών φαρμάκων που προορίζονται για την αναστολή της σύνδεσης της μεμβράνης των πρωτεϊνών σηματοδότησης έχουν αναπτυχθεί όλα αυτά τα χρόνια . GGTI (γερανυλγερανυλτρανσφεράσης-Ι αναστολέα) αποτελεί χαρακτηριστικό παράδειγμα αυτού του τύπου των αντικαρκινικών φαρμάκων [1-3]. GGTI αναστέλλει πρωτεΐνη γερανυλγερανυλτρανσφεράσης Ι (ΟΟΤάση-Ι), ένα ένζυμο που προσθέτει μια ομάδα γερανυλογερανυλο C20 σε πρωτεΐνες όπως RhoA, RhoC, Rap1 και Ral στο κυστεΐνη εντός της καρβοξυ-τερματικό τετραπεπτίδιο συναινετική αλληλουχία CAAL (C είναι κυστεΐνη, το Α είναι ένας αλειφατικό αμινοξύ και το C-τερματικό υπόλειμμα είναι λευκίνη ή φαινυλαλανίνη). Χαρακτηρισμός των ποντικών με όρους knockout του ΟΟΤάσης-Ι έδειξε ότι τα αποτελέσματα ανεπάρκεια ΟΟΤάσης-Ι στην αναστολή του σχηματισμού όγκου πνεύμονα K-ras επαγόμενη ογκογόνο και δραματικά αυξάνει την επιβίωση των ποντικών [4]. ΟΟΤαση-I αποτελέσματα αναστολή σε αναστολή του πολλαπλασιασμού που σχετίζονται με G1 σύλληψη και τη συσσώρευση των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου, όπως ρ21

Cip1 /WAF1, τονίζοντας τη σημασία της ΟΟΤαση-Ι σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [5-7].

με την συστηματική εξέταση μιας χημικής ένωσης βιβλιοθήκη κατασκευάστηκε από φωσφίνη κατάλυση της allenoate ενώσεων, έχουμε ήδη εντοπίσει αρκετές ΟΟΤαση-Ι αναστολέα (GGTI) ενώσεις που μπλοκάρουν την τροποποίηση πρωτεϊνών και αναστέλλουν την σύνδεση της μεμβράνης και τη λειτουργία του Ral, Rho, και Rap υποοικογένεια πρωτεΐνες [8,9]. Αυτές οι ενώσεις αναστέλλουν ΟΟΤάσης-Ι με ανταγωνισμό με τις πρωτεΐνες του υποστρώματος της. Κυττάρων δραστικές ενώσεις P61A6 και P61E7 προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου και κατέστειλε την ανάπτυξη ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του παγκρέατος και του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα [10,11]. Η αποτελεσματικότητα του GGTI P61A6 να αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου καταδείχθηκε χρησιμοποιώντας ανθρώπινα παγκρεατικά ξενομόσχευμα καρκίνου του [10]. Σε αυτό το πείραμα, σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου παρατηρήθηκε με μικρή παρενέργειες όπως κρίνεται από τους νεφρούς και ηπατικών ενζύμων προφίλ και από αιματολογικές χαρακτηρισμό. Η αναστολή της γερανυλγερανυλίωση στον όγκο επιδείχθηκε. Μια παρόμοια αναστολή της ανάπτυξης του όγκου παρατηρήθηκε με τη χρήση ξενομοσχευμάτων καρκίνου του πνεύμονα σε ποντικούς [11].

Μια σημαντική πρόκληση για περαιτέρω ανάπτυξη GGTI είναι να προσδώσει ικανότητα στόχευσης του όγκου σε αυτές τις ενώσεις. Ενώ είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν χαμηλές ποσότητες GGTI για την ελαχιστοποίηση των πιθανών παρενεργειών, η πιθανότητα ότι υπάρχει δοσο-περιοριστική τοξικότητα της ένωσης αυτής GGTI δεν μπορεί να αποκλειστεί, επειδή ΟΟΤάσης-Ι είναι ένα ένζυμο το οποίο λειτουργεί επίσης σε φυσιολογικά κύτταρα. Έτσι, είναι σημαντικό να αναπτυχθεί μια νέα γενιά νανο-διατυπωθεί GGTI που αποδίδει κατά προτίμηση ένωση GGTI σε όγκους. Αυτό θα επέτρεπε τη στόχευση του όγκου, να μειώσουν τις ανεπιθύμητες διανομή σε άλλα μέρη του σώματος, αποφεύγοντας έτσι οποιαδήποτε πιθανά αποτελέσματα επί των φυσιολογικών ιστών.

Μια δραματική πρόοδο στην νανοτεχνολογία έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη ενός αριθμού συστημάτων παροχής φαρμάκου περιλαμβάνουν λιποσώματα , μικκύλια πολυμερούς, ιούς και μεσοπορώδη νανοσωματίδια οξειδίου του πυριτίου [12-25]. Αυτά τα νανοσωματίδια μπορούν να παραδώσει το φάρμακο να όγκου με ενισχυμένη διαπερατότητα και κατακράτηση επίδραση [13], καθώς και με τη χρήση των προσδεμάτων που στοχεύουν υποδοχείς σε καρκινικά κύτταρα, αποφεύγοντας έτσι τις ανεπιθύμητες συστημικές χημειοτοξικότητα. Μεταξύ αυτών, τα λιποσώματα έχουν επωφελή χαρακτηριστικά που περιλαμβάνουν αποτελεσματική ενθυλάκωση, σχετικά εύκολη προετοιμασία, βιοδιασπασιμότητας και βιοσυμβατότητα [26-31]. Επιπλέον, το φωσφολιπίδιο δομή διπλής στιβάδας λιποσωμάτων είναι κατάλληλη για τη δημιουργία βιο-σχετικών λειτουργιών όπως η αποσταθεροποίηση της μεμβράνης και /ή σύντηξη μεμβράνης, προάγοντας την κυτταρική ενσωμάτωση της μεμβράνης αδιαπέραστο μορίων κατά μήκος κυτταρικών μεμβρανών εντός των κυττάρων.

Εκτός για στόχευση όγκων, είναι σημαντικό για την επίτευξη ελεγχόμενης απελευθέρωσης έτσι ώστε αντικαρκινικά φάρμακα θα κυκλοφορήσει κατά προτίμηση στον όγκο. Πρόσφατα, προσεγγίσεις για να συνθέσει ένα νέο τύπο λιποσωμάτων με δυνατότητα απελευθέρωσης χαμηλό pH έχουν αναφερθεί [32,33]. Επειδή ενδοκυττάρια λυσοσωμική pH είναι χαμηλό, αλλά και επειδή μικροπεριβάλλον του όγκου έχει χαμηλό pH οφείλεται σε συνθήκες υποξίας [34-36], το χαρακτηριστικό αυτό παρέχει ένα πλεονέκτημα που η απελευθέρωση του φαρμάκου είναι πιο περιορισμένη σε καρκινικά κύτταρα.

Σε αυτό το χαρτί, αναφέρουμε παρασκευή λιποσωμάτων τα οποία ενσωματώνουν αποτελεσματικά φάρμακα μικρών μορίων και βαφές και αφήστε το φορτίο όταν αντιμετωπίζουν συνθήκες χαμηλού pH. GGTI P61A6 ήταν αποτελεσματικά ενθυλακώνονται σε ρΗ-ευαίσθητο λιποσώματα και παραδόθηκε σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Η αναστολή της πρωτεΐνης γερανυλγερανυλίωση καθώς και αναστολή πολλαπλασιασμού, επιδράσεις κυτταρικού κύκλου και η συσσώρευση του αναστολέα του κυτταρικού κύκλου ρ21

Cip1 /WAF1 παρατηρήθηκαν με την παράδοση των GGTI από τα ευαίσθητα στο ρΗ λιποσώματα. Έχουμε περαιτέρω επεκτείνει τη χρήση του λιποσωμικού GGTI για τη θεραπεία του καρκίνου αποδεικνύοντας ότι η λιποσωματική-GGTI μπορεί να συνδυαστεί με αναστολέα φαρνεσυλτρανσφεράσης (FTI) να αναστέλλουν K-Ras σηματοδότησης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Μια GGTI ένωση P61A6 που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη αυτή προήλθε από την ένωση βιβλιοθήκης allenoate προέλευσης, όπως περιγράφονται στις προηγούμενες δημοσιεύσεις μας [9-11]. 20 mM διάλυμα αποθέματος GGTI P61A6 σε DMSO διατηρήθηκε στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. FTI ένωση BMS225975 περιγράφηκε προηγουμένως [37]. Αυτή η ένωση αναστέλλει πρωτεΐνη φαρνεσυλοτρανσφεράσης ειδικά με μικρή αναστολή της πρωτεΐνης γερανυλγερανυλτρανσφεράσης Ι και RabGGTase. COATSOME

® MC-6081 (1-παλμιτοϋλ-2-ολεοϋλ-sn-γλυκερο-φωσφοχολίνη (POPC)), Sunbright

® DSPE-PG8MG (προϊόν συμπύκνωσης του Ν- (οκταγλυκερόλη-γλουταρυλ) διστεαροϋλφωσφατιδυλαιθανολαμίνη με 3- μεθυλγλουταρικού οξύ (DSPE-PG8MG)), παρασχέθηκαν από NOF CORPORATION (Τόκιο, Ιαπωνία). 1, 2-διπαλμιτοϋλ-sn-γλυκερο-3-φωσφοαιθανολαμίνη-Ν- (λισσαμίνη ροδαμίνης Β σουλφονυλο) (άλας αμμωνίου) (Rhodamine-ΡΕ) αγοράστηκε από την Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL, USA).

Σχεδιασμός και Προετοιμασία χαμηλό pH-ευαίσθητα λιποσώματα

κενά λιποσώματα ευαίσθητα στο ρΗ παρασκευάστηκαν από POPC και DSPE-PG8MG. Τυπικές διαδικασίες που περιγράφονται παρακάτω. POPC και DSPE-PG8MG (μοριακή αναλογία? 85:15) διαλύθηκαν σε ένα μίγμα χλωροφορμίου-μεθανόλης, και ο διαλύτης απομακρύνθηκε σε έναν περιστροφικό εξατμιστήρα. Το μίγμα λιπιδίων ξηράνθηκε υπό κενό, και ενυδατωμένο με υδατικό διάλυμα (10 κ.εκ.) που περιέχει σουκρόζη ως ένα κρυοπροστατευτικό. Μετά την εξώθηση του εναιωρήματος λιποσώματος μέσω μεμβράνης (μέγεθος πόρων 0,22 μm), το ληφθέν εναιώρημα ξηράνθηκε δια καταψύξεως για να δώσει την ευαίσθητη στο ρΗ κενά λιποσώματα [38].

Rhodamine φθορισμού επισήμανση των λιποσώματα

ροδαμίνη-επισημασμένο ρΗ-ευαίσθητο κενά λιποσώματα παρασκευάστηκαν από POPC, DSPE-PG8MG, και ροδαμίνη-ΡΕ (μοριακή αναλογία? 85: 15: 0,1). POPC και DSPE-PG8MG διαλύθηκαν σε ένα μίγμα χλωροφορμίου-μεθανόλης. Ροδαμίνη-ΡΕ διαλύθηκε σε χλωροφόρμιο και προστέθηκε στο διάλυμα λιπιδίων, και ο διαλύτης απομακρύνθηκε σε έναν περιστροφικό εξατμιστήρα. Το μίγμα λιπιδίων ξηράνθηκε υπό κενό, ενυδατωμένο με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει σακχαρόζη. Μετά την εξώθηση του εναιωρήματος λιποσώματος μέσω μεμβράνης (μέγεθος πόρων 0,22 μm), το ληφθέν εναιώρημα ξηράνθηκε δια καταψύξεως για να δώσει τις φθορίζουσα χρωστική σημασμένο ευαίσθητη στο ρΗ κενά λιποσώματα.

Ροδαμίνη-επισημασμένο σκόνη λιποσώματος ανασυστάθηκε σε PBS ρυθμιστικό σε 10 μg /ml, κατεργασμένο με υπερήχους σε συσκευή υπερήχων (τύπος υδρόλουτρο) για 10 λεπτά, και προστίθεται στα κύτταρα MiaPaCa-2 που καλλιεργήθηκαν σε 8 φρεάτια θάλαμο κυψελίδων για 4 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα PBS και επωάστηκαν με 50 ηΜ LysoTracker πράσινο, που ακολουθείται από επώαση σε θάλαμο κυτταρικής καλλιέργειας για επιπλέον 1 ώρα πριν την παρατήρηση με μικροσκόπιο φθορισμού.

Drug-φορτωμένο Παρασκευή Λιποσώματος

Ένα μικρό δείγμα (130 μL) του διαλυμένου GGTI (1,2 mg) σε 75% EtOH με 10% DMSO (τελική συγκέντρωση = 6.41 mg /ml), αραιωμένα σε dH

2O σε 10%, αναμίχθηκε με 1.3 mg ξηράς κόνεως λιποσωμάτων, και το μίγμα περιστράφηκε σε 4 ° C για 4 ώρες ακολουθούμενη από κατεργασία με υπερήχους για 2 λεπτά χρησιμοποιώντας συσκευή υπερήχων λουτρού ύδατος τύπου. Το λιποσωμικό εναιώρημα εξωθείται μέσω μιας πολυανθρακικής μεμβράνης με μέγεθος πόρων των 100 nm. Ταυτόχρονα, 6 ml Sepharose 4Β γέλης αναμίχθηκε με 2 ml PBS επί πάγου και εφαρμόσθηκε σε στήλη 10 ml, συσκευασμένο με την ταχύτητα 15 cm /h. Και στη συνέχεια το μίγμα της λιποσωμάτων και GGTI φορτώθηκε στην κορυφή της γέλης στη στήλη. Αφού αφέθηκε το δείγμα να εισέλθουν στην ρητίνη, η στήλη αμέσως γεμάτη με κρύο ρυθμιστικό διάλυμα PBS, και άντλησης ξεκίνησε με ταχύτητα 15 cm /h για να απομακρυνθεί ελεύθερα φάρμακα που δεν φορτώθηκαν σε λιποσώματα από τα φορτωμένα με φάρμακο λιποσώματα [32] . Τα εκλούσματα συλλέχθηκαν και τα κλάσματα που περιέχουν τα λιποσώματα πιστοποιήθηκαν με θολότητα τους. Το δείγμα διατηρείται στους 4 ° C για περαιτέρω πειράματα.

ναρκωτικών και Dye Απελευθέρωση από λιποσώματα

Τύπου

φαρμάκων από λιποσωμάτων μετρήθηκε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). 400 μΙ λιποσώματα ενθυλάκωσης GGTI (συλλέγεται από στήλη Sepharose) αναμίχθηκε με 150 mM NaCl, φυγοκεντρήθηκε στις 100,000 rpm για 10 λεπτά, 4C, για να καθιζάνει λιποσωμική GGTIs. Το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 400 μΙ PBS. 73 μΙ του αναδιαλυμένου διαλύματος προστέθηκαν σε 927 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος PBS με ποικίλες τιμές ρΗ, και στη συνέχεια αναμιγνύεται στους 37 ° C για 15 λεπτά. Triton Χ-100 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος 100% επειδή Triton Χ-100 μπορούν να διασπάσουν τα λιποσώματα (τελική συγκέντρωση: 0,1%). Τα μίγματα προστέθηκαν στα αεροθάλαμοι του υπερηθμού Amicon Ultra-4 (MWCO = 10kDa, Millipore), φυγοκεντρήθηκε στα 13.000 g για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα εκλούσματα υποβλήθηκαν σε HPLC για να μετρηθεί η συγκέντρωση της απελευθερωμένης GGTI (Waters Micromass LCT Premier Φασματόμετρο Μάζας). Απελευθέρωση φθορίζουσας χρωστικής πυρανίνης διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Ένα μικρό δείγμα (500 μL) του 35 mM πυρανινης, 50 mM DPX (βρωμιούχο π-ξυλόλιο-δις-πυριδίνιο), και 25 mM φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (ρΗ 7.4) αναμίχθηκαν με 7 mg λιποσωμάτων, και το μίγμα υποβλήθηκε σε υπερήχους για 2 λεπτά χρησιμοποιώντας συσκευή υπερήχων υδατολούτρου. Πυρανίνης φθορισμός αποσβένεται με DPX εσωτερικό των λιποσωμάτων, αλλά θα εκπέμψει έντονο φθορισμό μετά την απελευθέρωση από λιποσωμάτων. Τα λιποσώματα ενθυλάκωσης πυρανινης και DPX προστέθηκαν σε 25 mM φωσφορικού και 125 mM ρυθμιστικό NaCl με ποικίλες τιμές ρΗ και η ένταση του φθορισμού (512 nm) μετρήθηκε με φασματοφθοριόμετρο (416 nm, Jasco FP-6500). Το ποσοστό απελευθέρωσης του πυρανινης από λιποσώματα ορίστηκε ως Release (%) = (Ft-Fi) /(FF-Fi) × 100 όπου Fi και Ft σημαίνουν τα αρχικά και ενδιάμεσα εντάσεις φθορισμού, αντίστοιχα. FF είναι ο ένταση φθορισμού μετά την προσθήκη του Triton Χ-100 (τελική συγκέντρωση: 0,1%).

Cell Culture

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού, MCF-7, παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική σειρά MIAPaCa2, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου Η596, Η358, Α549 και ένα φυσιολογικό ανθρώπινο βρογχικό επιθήλιο κυτταρική σειρά BEAS-2Β ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. Όλες οι κυτταρικές σειρές καρκίνου διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ ή RPMI συμπληρωμένο με 10% FCS (Sigma), 2% Ε-γλουταμίνη, 1% πενικιλλίνη και 1% στρεπτομυκίνη. κύτταρα BEAS-2Β καλλιεργήθηκαν με BEBM μέσων προστίθενται με ειδικές αυξητικούς παράγοντες (Lonza /Clonetics Co.). Το μέσο ήταν σαν ρουτίνα αλλάζονται κάθε 3 ημέρες, και τα κύτταρα διαχωρίστηκαν με θρυψινοποίηση πριν φτάσουν σε συρροή.

Παράδοση Βαφές σε καρκινικά κύτταρα

παράδοσης

δοξορουβικίνη εξετάστηκε ως ακολούθως. Μετά από φυγοκέντρηση μέσω στήλης Sepharose 4Β για την απομάκρυνση ελεύθερα φάρμακα, ένα ομοιογενές εναιώρημα των doxorubicin φορτωμένων λιποσωμάτων προστέθηκε σε κύτταρα καρκίνου του μαστού MCF-7, που καλλιεργήθηκαν σε ένα θάλαμο γυαλιού 8 καλά. 6 ώρες μετά την επώαση, τα κύτταρα πλύθηκαν και εξετάστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού για την απεικόνιση της κατανομής των Doxorubicin σε καρκινικά κύτταρα. Τα λιποσώματα πυρανινης φορτωμένα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. κύτταρα MiaPaCa-2 (3 χ 10

5 κύτταρα) καλλιεργήθηκαν για όλη την νύχτα σε ένα 8 φρεάτια γυάλινο θάλαμο κυτταρικής καλλιέργειας. εναιωρήματα λιποσώματος προστέθηκαν στα κύτταρα και επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37 ° C. Μετά την επώαση, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS δύο φορές και παρατηρήθηκαν με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Carl Zeiss). θεραπεία βαφιλομυκίνη διεξήχθη με 160 ηΜ βαφιλομυκίνη Α1 για 6 ώρες πριν από την προσθήκη των λιποσωμάτων. Πορτοκαλί χρώση ακριδίνης (Sigma) διεξήχθη σε συγκέντρωση 6 μΜ.

Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός Αναστολής

δοκιμασίας αναστολής πολλαπλασιασμού διεξήχθη με τη χρήση ενός κιτ κύτταρο-καταμέτρηση από Dojindo Molecular Technologies, Inc. κύτταρα του καρκίνου σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (5000 κύτταρα καλά

-1) και επωάστηκαν σε φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2/95% ατμόσφαιρα αέρα για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και το μέσο αλλάχθηκε σε ένα φρέσκο ​​μέσο που περιέχει GGTI-φορτωμένα λιποσώματα ή κενά λιποσώματα με ίδιο όγκο σε ρυθμιστικό ως έλεγχος στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS για να απομακρυνθεί λιποσώματα τα οποία δεν είχαν ληφθεί από τα κύτταρα, και τα κύτταρα στη συνέχεια επωάζονται σε φρέσκο ​​μέσο για επιπλέον 48 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν σε DMEM με 10% διάλυμα WST-8 για άλλες 2 ώρες. Η απορρόφηση του κάθε φρεάτιο μετρήθηκε στα 450 nm με μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας. Δεδομένου ότι η απορρόφηση είναι ανάλογη με τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων εντός του μέσου, ο αριθμός βιώσιμων κυττάρων προσδιορίσθηκε με τη χρήση ενός προηγουμένως παρασκευασθέντος καμπύλη βαθμονόμησης (Dojindo Co.).

Ανάλυση Western Blot

Cells υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GGTI-λιποσώματα, κενά λιποσώματα, ή GGTI για 24 ώρες, συλλέχθηκαν και υπέστησαν λύση σε ρυθμιστικό λύσης (1% Triton Χ-100, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl σε ρΗ 7.5, 1 mM EDTA, και 1 × μίγμα αναστολέα πρωτεάσης). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής επί πηκτής πολυακρυλαμιδίου SDS και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS) που περιέχει 5% (β /ο) αποβουτυρωμένο γάλα. Μετά από πλύση με TBS που περιέχει 0.1% Tween 20 (Sigma), οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύχτα με το πρώτο αντίσωμα (έναντι μη πρενυλιωμένο μορφή Rapi, Santa Cruz Biotechnology, CA) αραιωμένο με TBS. Μετά το πλύσιμο, οι μεμβράνες επωάστηκαν για 2 ώρες με το δεύτερο αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, CA). Συγκροτήματα ανιχνεύθηκαν με σύστημα ECL (Amersham Pharmacia Biotech Κ.Κ., UK). Η φωσφορυλίωση της ERK ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον phorphorylated μορφή της ERK καθώς και εναντίον ολική ΕΚΚ (Cell Signaling, CA). αντίσωμα αντι-ακτίνης αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (CA).

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσοι ± SD. Στατιστικές συγκρίσεις έγιναν με τη χρησιμοποίηση έλεγχος τ μετά από ανάλυση της διακύμανσης. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν ότι είναι σημαντικά διαφορετική σε Ρ τιμή & lt? 0.05, που σημειώνονται με *.

Αποτελέσματα

Σχεδιασμός και Προετοιμασία Χαμηλό pH-ευαίσθητα λιποσώματα (pH-λιποσώματα)

pH-λιποσώματα μας είναι σταθερή σε φυσιολογικό ρΗ, αλλά αποσταθεροποιηθεί υπό όξινες συνθήκες λόγω της πρωτονίωσης, ως εκ τούτου ανταποκρίνεται σε περιβάλλοντα χαμηλού ρΗ του ενδοσώματος-λυσοσώματα μέσα στα κύτταρα [32]. Τα λιποσώματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά λιπίδια, DSPE-PG8MG και POPC. Ένα γενικό σχήμα του DSPE-PG8MG φαίνεται στο Σχ 1. Αυτό το μόριο περιέχει ένα φωσφολιπίδιο που είναι συνδεδεμένο με καρβοξυλιωμένο χαρακτηριστική ομάδα πολυγλυκερίνης (PG αλυσίδα). Υπό όξινες συνθήκες, η αλυσίδα PG πρωτονιώνεται με αποτέλεσμα την αποσταθεροποίηση των λιποσωμικών μεμβρανών προκαλώντας σύντηξη με μεμβράνες ενδοσωμική. Το περιεχόμενο των λιποσωμάτων στη συνέχεια θα απελευθερώνονται στο κυτταρόπλασμα. Με την αλλαγή της αναλογίας των δύο λιπιδίων, είναι δυνατόν να σχεδιάσουμε λιποσώματα τα οποία ανταποκρίνονται σε διαφορετικές τιμές ρΗ. Εδώ, ο πολυγλυκερίνης τροποποιημένο με γλουταρικό οξύ 3-μεθυλο είναι γνωστό ότι έχει μια τιμή ρΚα 6.3 [39,40]. Ως εκ τούτου, DSPE-PG8MG έχει μια παρόμοια τιμή pKa του παραγώγου πολυγλυκερίνη, και θα έχει ένα pH-ανταπόκρισης κοντά pH 6. Στην περίπτωσή μας, θέλαμε να επιτύχουμε την απελευθέρωση του περιεχομένου σε pH κάτω του 6, αλλά λίγο απελευθέρωσης πάνω από ρΗ 6. Έτσι, αποφασίστηκε να βρει την κατάλληλη σύνθεση των λιπιδίων στο παρόμοια διαδικασία. Εν συντομία, διασπορές ρΗ λιποσωμάτων τα οποία έγκλειστα πυρανινης χρωστικής προστέθηκαν στα διαλύματα σε διάφορες τιμές ρΗ. Και το ρΗ-αποκρισιμότητα των λιποσωμάτων αξιολογήθηκε με μέτρηση της ποσότητας του πυρανινης απελευθερώνεται από αυτούς. Μετά τη δοκιμή διαφορετικές αναλογίες, αποφασίσαμε να χρησιμοποιήσουμε την POPC και η αναλογία DSPE-PG8MG των 85 και 15 (mol%).

Η

Η ενδοκυτταρική εντόπιση του pH-λιποσωμάτων

Για να διερευνήσουν την κυτταρική πρόσληψη και ενδοκυτταρικό εντοπισμό του ρΗ λιποσώματα, συνθέσαμε ροδαμίνη-σημασμένο ευαίσθητες στο ρΗ κενά λιποσώματα (ροδαμίνη χρωστική ήταν ομοιοπολικά συζευγμένο με τα λιπίδια κατά τη διάρκεια της σύνθεσης), όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. Παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα MiaPaCa-2 επωάστηκαν με ροδαμίνη-σημασμένο λιποσώματα για 4 ώρες και λιποσωματική φθορισμός εξετάστηκε με μικροσκόπιο φθορισμού. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α, στικτή φθορισμός παρατηρήθηκε σε περιπυρηνική περιοχή ενδεικτική της λυσοσωματικής εντοπισμού. Το σημείο αυτό επιβεβαιώθηκε με τη χρήση Lysosensor Πράσινο DND-189 (Life Technologies). Lysosensor Πράσινο DND-189 εμφανίζει πράσινο φθορισμό μόνο όταν μέσα στο ενδοκυττάριο όξινο διαμερίσματα όπως λυσοσώματα. Συν-εντοπισμό του κόκκινου φθορισμού Ροδαμίνη και πράσινο φθορισμό Lysosensor παρατηρήθηκε, επιβεβαιώνοντας λυσοσωμική εντόπιση των λιποσωμάτων. Έτσι, λιποσώματα φαίνεται να συσσωρεύεται σε λυσοσώματα όταν προσλαμβάνεται από τα κύτταρα.

GGTI φορτωμένα λιποσώματα παρασκευάστηκαν και μετά εκτέθηκαν σε διάλυμα ρυθμίστηκε σε διαφορετικές τιμές ρΗ για 15 λεπτά και την απελευθέρωση των GGTI εξετάστηκε με HPLC. TritonX-100 χρησιμοποιήθηκε ως πλήρη έλεγχο απελευθέρωσης. Το σύμβολο * υποδηλώνει στατιστικά σημαντική διαφορά στην τιμή Ρ & lt? 0.05.

Η

Drug φόρτιση και η απελευθέρωση

αποδοτικότητα φόρτωσης λιποσώματος φαρμάκων και βαφές ελέγχθηκε με ανάμιξη με λιποσώματα, χρησιμοποιώντας στήλη Sepharose 4Β για την απομάκρυνση ελεύθερα φάρμακα και την αποδέσμευση του περιεχομένου από τα λιποσώματα με Triton Χ-100. συγκέντρωση GGTI μετρήθηκε με σύγκριση με ένα πρότυπο δείγμα GGTI χρησιμοποιώντας LC-MS. Εμείς εκτιμάται ότι η ικανότητα φόρτωσης του GGTI σε λιποσώματα είναι περίπου 30% του συνολικού GGTI. Για να εξετάσει το μέγεθος του ανασυσταθέντος λιποσωμάτων, έχουμε υποστεί GGTI-φορτωμένα λιποσώματα σε δυναμικές μετρήσεις σκέδασης φωτός (DLS). Όπως μπορεί να φανεί στο σχήμα 2Β, βρήκαμε ότι το μέγεθος των GGTI φορτωμένων λιποσωμάτων κυμαίνεται από 46 έως 65 nm σε διάμετρο με μέσο μέγεθος 54,9 nm. Έτσι, η παρασκευή μας έχει ένα σχετικά στενή κατανομή μεγέθους.

Απελευθέρωση GGTI από τα λιποσώματα εξετάστηκε με φόρτωση GGTI, συλλέγοντας GGTI φορτωμένα λιποσώματα και την αποδέσμευση του περιεχομένου εκθέτοντας να PBS ρυθμιστικό διάλυμα με διάφορες τιμές ρΗ που κυμαίνονται από 4,5 έως 8. Όπως φαίνεται στο Σχ 2C, λιποσώματα διατηρούνται GGTI μέσα σφικτά σε ουδέτερο ή βασικό ρυθμιστικά. Μικρή απελευθέρωση GGTI παρατηρήθηκε σε ένα εύρος ρΗ 6-8. Ωστόσο, όταν το ρΗ ήταν κάτω από 6, παρατηρήθηκε μία σημαντική απελευθέρωση του GGTI από τα λιποσώματα. Σε ρΗ 5.5, πάνω από το 80% των φορτωμένων GGTI απελευθερώθηκε. Παρομοίως, σχεδόν πλήρης απελευθέρωση παρατηρήθηκε σε ρΗ 5 και σε ρΗ 4,5 (δεν φαίνεται). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι ευαίσθητες στο ρΗ λιποσώματα αποτελεσματικά αποσταθεροποιηθεί σε όξινες συνθήκες. Μια απότομη μετάβαση μεταξύ pH 5,5 και pH 6 δείχνει ότι αυτό το είδος των λιποσωμάτων παρέχει ένα κατάλληλο όχημα για την ενδοκυτταρική ελεγχόμενη απελευθέρωση.

Χαμηλό pH-εξαρτώμενη Παράδοση Loaded Dye στο εσωτερικό του κυττάρου

Η δοξορουβικίνη φορτωμένο λιποσώματα χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση ενδοκυτταρικής ικανότητα απελευθέρωσης του φαρμάκου, δεδομένου ότι η δοξορουβικίνη εκπέμπει έντονο κόκκινο φθορισμό υπό UV διέγερση. Μετά από έκλουση από μία στήλη Sepharose 4Β για την απομάκρυνση ελεύθερα φάρμακα, ένα ομοιογενές εναιώρημα των doxorubicin φορτωμένων λιποσωμάτων προστέθηκε σε κύτταρα καρκίνου του μαστού MCF-7, που καλλιεργήθηκαν σε ένα θάλαμο γυαλιού οκτώ φρεατίων. 6 ώρες μετά την επώαση, τα κύτταρα πλύθηκαν και εξετάστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού για την απεικόνιση της κατανομής των Doxorubicin σε καρκινικά κύτταρα. Τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με δοξορουβικίνη εμφάνισαν έντονο κόκκινο φθορισμό (Σχήμα 3Α) στο κυτταρόπλασμα και σε πυρήνες. Αυτό ήταν παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε με κύτταρα κατεργασμένα με ελεύθερη doxorubicin (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Από την άλλη πλευρά, τα κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με λιποσώματα χωρίς δοξορουβικίνη παρέμειναν μη φθορίζουσα

Α:. Φθορισμού εικόνες μικροσκοπίας των κυττάρων MCF7 επωάστηκαν με δοξορουβικίνη φορτωμένα λιποσώματα για 6 ώρες (ερυθρός φθορισμός). Τα κύτταρα ελέγχου δεν έλαβαν λιποσώματα. Β: Απελευθέρωση πυρανίνης χρωστικής σε κύτταρα MiaPaCa-2 εξετάζεται με φθορισμό του με ή χωρίς την κατεργασία με βαφιλομυκίνη Α1. εικόνα αντίθεσης φάσης παρουσιάζεται. C:. Οι Επιδράσεις της βαφιλομυκίνη Α1 στο pH των ενδοκυττάριων οργανιδίων αποδεικνύεται χρησιμοποιώντας ακριδίνης πορτοκαλί

Η

Τα παραπάνω πειράματα δείχνουν ότι τα λιποσώματα μπορούν να φορτωθούν με χρωστικές ουσίες και τα ναρκωτικά και με επιτυχία και να παραδώσει αποτελεσματικά το περιεχόμενο σε καρκινικά κύτταρα. Θελήσαμε να χαρακτηριστεί περαιτέρω η εξαρτώμενη από το ρΗ χαρακτηριστικό χαμηλής απελευθέρωσης των λιποσωμάτων στο εσωτερικό του κυττάρου. Για να διερευνηθεί αυτό το σημείο, χρησιμοποιήσαμε πυρανίνης βαφή φορτωμένα λιποσώματα και τα επεξεργασμένα κύτταρα με βαφιλομυκίνη, ένα φάρμακο που μεταβάλλει λυσοσωματικής ρΗ. Βαφιλομυκίνη Α1 (BAF) είναι ένας ειδικός αναστολέας της ενδοκυτταρικής αντλίας πρωτονίων χυμοτοπίων, αναστέλλοντας την οξίνιση του συστήματος χυμοτοπίων, όπως ενδο /λυσοσώματα, να αυξήσουν έτσι λυσοσωμική pH [41,42]. Παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα MiaPaCa-2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 160 ηΜ BAF για 6 ώρες και στη συνέχεια πυρανίνης βαφή φορτωμένα λιποσώματα προστέθηκαν στα κύτταρα. Τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 12 ώρες πριν από την εξέταση με μικροσκοπία φθορισμού. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, η θεραπεία με BAF προληφθούν πλήρως ενδοκυτταρική απελευθέρωση της πυρανίνης, αποδεικνύεται από την έλλειψη βαφής, σε σύγκριση με το φωτεινό πράσινο φθορισμό των κυττάρων που δεν έχουν εκτεθεί σε BAF. Για να επιβεβαιώσετε το αποτέλεσμα της BAF για την μείωση της οξύτητας των ενδοσωμάτων, ακριδίνης πορτοκαλί βαφή (AO) εκτελέστηκε. ΑΟ είναι ένα φθορίζον ασθενής βάση που χρησιμοποιείται συχνά ως ένας ανιχνευτής για την παρακολούθηση της οξίνισης των οργανιδίων. Σε ουδέτερο ή αλκαλικό περιβάλλον αυτό χρωστική εκπέμπει πράσινο φθορισμό, αλλά όταν εκτίθεται σε όξινα διαμερίσματα, είναι ιονισμένο και η εκπομπή του υποβάλλεται σε μια μετατόπιση προς το ερυθρό. Στα μη επεξεργασμένα κύτταρα, το κόκκινο φθορισμός παρατηρήθηκε μέσα διακριτές οργανίδια κυτταρόπλασμα, υποδεικνύοντας ότι η ΑΟ είχε συσσωρευτεί σε όξινα οργανίδια (Σχήμα 3C). Ωστόσο, το κόκκινο φθορισμό μειώθηκε δραματικά μετά από 6 ώρες θεραπείας BAF, υποδεικνύοντας ότι η BAF είχε αυξηθεί το ρΗ των ενδοσωμάτων στα κύτταρα MIAPaCa-2. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η απελευθέρωση της χρωστικής από τα λιποσώματα εξαρτάται από τις συνθήκες χαμηλού ρΗ σε ενδοκυτταρικά οργανίδια.

Λιποσωμικά GGTI Αναστέλλει Πρωτεΐνη γερανυλογερανυλίωση μέσα στο κύτταρο και αυτό το αποτέλεσμα εξαρτάται από το χαμηλό pH του λυσοσώματα

απελευθέρωση GGTI και την αποτελεσματικότητα για την αναστολή της πρωτεΐνης γερανυλογερανυλίωση στο εσωτερικό των καρκινικών κυττάρων διερευνήθηκαν. Το σχήμα 4Α δείχνει ότι η παράδοση GGTI από τα λιποσώματα έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της πρωτεΐνης γερανυλγερανυλίωση στο εσωτερικό του κυττάρου. Σε αυτό το πείραμα, κύτταρα MiaPaCa-2 υπέστησαν αγωγή με λιποσωματική-GGTI για 3 ώρες, και οι πρωτεΐνες συνελέγησαν από κυτταρικό λύμα για ανάλυση Western. Όπως φαίνεται, επεξεργασία των κυττάρων είτε με GGTI μόνος P61-A6 ή GGTI-φορτωμένο λιποσώματος οδήγησε στην εμφάνιση του μη πρενυλιωμένο μπάντα Rap1, υποδεικνύοντας ότι τα λιποσώματα παρέχουν και να απελευθερώσουν την ένωση GGTI εσωτερικό των κυττάρων για να λειτουργήσει και ανέστειλε πρωτεΐνη γερανυλγερανυλίωση. Δεδομένου ότι οι ρΗ λιποσώματα εμφανίζουν σημαντική αποσταθεροποίηση κάτω από ρΗ 6, το οποίο αντιστοιχεί στο ρΗ του endolysosome εσωτερικό, το ρΗ-λιποσώματα ήταν πιθανόν να αποσταθεροποιηθεί ή να συντήκονται με μεμβράνες ενδοσωμική με αποτέλεσμα την απελευθέρωση του φορτίου φαρμάκου σε κυτοσόλιο, αναστέλλοντας ΟΟΤάσης-Ι και κλείδωμα Rap1 πρενυλίωση. Για να εξεταστεί η ευαισθησία ρΗ απελευθέρωσης GGTI, το ίδιο πείραμα επαναλήφθηκε μετά την κατεργασία των κυττάρων με ρΗ μεταβάλλοντας ένωση βαφιλομυκίνη Α1. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Α, η θεραπεία με βαφιλομυκίνη A1 κατάργησε την επίδραση της λιποσωματικής-GGTI επί Rap1 πρενυλίωση. Αυτό είναι σύμφωνο με την ιδέα ότι η αύξηση του pH των λυσοσώματα μεταβάλλεται από βαφιλομυκίνη Α1 δεν θα μπορούσε να αποσταθεροποιήσει πια pH-λιποσώματα, ως εκ τούτου, GGTIs κρατήθηκαν στο εσωτερικό των λιποσωμάτων. Ως εκ τούτου, όταν παραλαμβάνεται από τα κύτταρα, η οξύτητα του ενδοσώματα είναι κρίσιμη για αποσταθεροποίηση ή /και σύντηξη του ρΗ λιποσωμάτων με endolysosome για την αποτελεσματική απελευθέρωση και μεταφορά των περιεχομένων σε κυτοσολίου.

Η

Λιποσωμικά GGTI Αιτίες Παρεμπόδιση του πολλαπλασιασμού των παγκρέατος και καρκινικά κύτταρα πνεύμονα

Η επίδραση της χορήγησης φαρμάκου από το ρΗ λιποσώματα εξετάστηκε με δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Ο καρκίνος του παγκρέατος κυτταρική γραμμή MiaPaCa-2 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με άφορτο λιποσώματα, GGTI φορτωμένα λιποσώματα ή ελεύθερη GGTI (ίδιος όγκος σε ρυθμιστικό διάλυμα) με διάφορες συγκεντρώσεις για 72 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Β, σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού παρατηρήθηκε με GGTI φορτωμένα λιποσωμάτων. Αυτή η αναστολή ήταν παρόμοια ή καλύτερη από εκείνη που παρατηρείται με δωρεάν GGTI. Αντίθετα, κενά λιποσώματα δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ακόμη και σε 180 μg /mL. Τα λιποσώματα ίδιοι φαίνεται να είναι μη-τοξικά σε αυτές τις συγκεντρώσεις.

Ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά του GGTI είναι ότι επάγουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1. Για να εξεταστεί εάν αυτό ισχύει για τα κινητά εφέ χρησιμοποιώντας λιποσωμική GGTI, κύτταρα κατεργασμένα με λιποσωματική GGTI αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4Γ, η θεραπεία των κυττάρων MIAPaCa-2 είτε με διάλυμα GGTI ή Lipo-GGTI για 24 ώρες προκάλεσε τον εμπλουτισμό των κυττάρων G1 φάση, ενώ το ποσοστό των κυττάρων S φάσης μειώθηκε από αυτές τις θεραπείες. Ποσοστό των κυττάρων G2 άλλαξε μόνο ελαφρά.

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι GGTI επάγει την έκφραση ενός ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου p21

Cip1 /WAF1 [7]. Διέγερση αυτού εξαρτάται από κυκλίνη αναστολέα κινάσης αποτελέσματα στη συσσώρευση των κυττάρων φάσης G1. προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι RhoA είναι ένας από τους κύριους στόχους της GGTI και ότι RhoA καταστέλλει p21

έκφραση Cip1 /WAF1. Να εξετάσει κατά πόσον λιποσωματικού-GGTI επάγει p21

έκφραση Cip1 /WAF1, θα αντιμετωπίζονται κύτταρα MiaPaCa-2 με λιποσωμική GGTI και πραγματοποιείται ανάλυση Western. Όπως φαίνεται στο Σχ 4D, σημαντική επαγωγή του ρ21

Cip1 /WAF1 παρατηρήθηκε με τη θεραπεία με λιποσωμική GGTI.

Σε προηγούμενες μελέτες μας, αποδείξαμε ότι GGTI P61A6 ανέστειλε και τις δύο του παγκρέατος και του πνεύμονα καρκινικών κυττάρων σε ζώο μοντέλα, ως εκ τούτου, ελέγξαμε επίσης λιποσωμικό GGTI με καρκινικές κυτταρικές σειρές διαφορετικά πνεύμονα, Η596, Η358 και Α549, καθώς και με φυσιολογικά βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική σειρά BEAS-2Β. Όπως φαίνεται στο σχήμα 5, σε σύγκριση με εκφορτώνονται λιποσώματα, λιποσώματα GGTI έδειξαν σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με μια ποικιλία από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν. Λιποσωμικά GGTI καταστέλλεται περίπου 60-80% του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, ενώ η ίδια συγκέντρωση των κενών λιποσωμάτων δεν το έκανε. Είναι ενδιαφέρον ότι η φυσιολογική ανθρώπινη βρογχικό επιθήλιο κυτταρική σειρά BEAS-2Β έδειξε απροσδόκητα ισχυρή αντίσταση στην λιποσωμική GGTI σύγκριση με καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Ο μηχανισμός αυτής της αντίστασης παραμένει άγνωστη και εγγυάται περαιτέρω διερεύνηση.

Οι αριθμοί κυττάρων μετά από θεραπείες 72 ώρες », εμφανίζονται ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Άδεια λιποσώματα δεν επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό. Το σύμβολο * υποδηλώνει στατιστικά σημαντική διαφορά στην τιμή Ρ & lt? 0.05.

Η

Λιποσωμικά GGTI συνεργεί με FTI (αναστολέα φαρνεσυλτρανσφεράσης) να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των K-Ras Activated Cancer Cells

Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η λιποσωμική-GGTI είναι ένας νέος τύπος αντικαρκινικού φάρμακα που έχει τη δυνατότητα να παραδοθεί στον όγκο. Αυτό ανοίγει τη δυνατότητα ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αναστολή της K-Ras σηματοδότησης που ενεργοποιείται σε έναν αριθμό ανθρώπινων κρουσμάτων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του παγκρέατος, των πνευμόνων και του κόλου. Η οικογένεια πρωτεϊνών Ras, ιδιαίτερα K-Ras, μπορεί να πρενυλιώνεται εναλλακτικά είτε από ΡΤάσης ή ΟΟΤαση-Ι [43-45].