Αφηρημένο

Πρόσφατες έρευνες έχουν δείξει ότι ορισμένες φυτικές πολυφαινόλες, δηλαδή, ουρσολικό οξύ (UA), η οποία αναφέρεται ότι έχουν αντικαρκινική δράση, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για να ευαισθητοποιήσουν καρκινικά κύτταρα σε θεραπεία με ακτινοβολία με αναστολή οδούς που οδηγούν στην αντίσταση ακτινοθεραπεία. Αυτό το πείραμα σχεδιάστηκε για να διερευνήσει τις επιδράσεις και πιθανός μηχανισμός ραδιοευαισθητοποίησης από UA στην κυτταρική σειρά BGC-823 από ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα γαστρικού καρκίνου

in vitro

. UA προκάλεσε κυτταροτοξικότητα σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, και χρησιμοποιήσαμε μια συγκέντρωση υπο-κυτταροτοξικότητα των UA να δοκιμαστεί radioenhancement αποτελεσματικότητα με UA σε γαστρικό καρκίνο. Ραδιοευαισθησία προσδιορίστηκε με δοκιμασία κλωνογόνο επιβίωση. Surviving κλάσμα της συνδυασμένης ομάδας με ακτινοβολία και υπο-κυτταροτοξικότητα UA σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με την ομάδα ακτινοβολία. Η βελτιωμένη αποτελεσματικότητα ραδιοευαισθητοποίηση συσχετίστηκε με αυξημένη G2 /M σύλληψης, αυξημένη αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), ρυθμίζεται προς τα κάτω Ki-67 επίπεδο και βελτιωμένη απόπτωση. Εν κατακλείδι, όπως UA αποδεικνύεται ισχυρό αποτέλεσμα του πολλαπλασιασμού και συνεργική επίδραση, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μια πιθανή ευαισθητοποιητής φάρμακο για την εφαρμογή της ακτινοθεραπείας

Παράθεση:. Yang Υ, Jiang Μ, Χου J, Lv Χ, Yu L , Qian Χ, et al. (2015) Ενίσχυση της Ακτινοβολίας Επιπτώσεις από ουρσολικό οξύ σε BGC-823 ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος γαστρικός καρκίνος κυτταρική γραμμή. PLoS ONE 10 (7): e0133169. doi: 10.1371 /journal.pone.0133169

Επιμέλεια: Jian-Hua Μάο, Lawrence Berkeley National Laboratory, University of California, Berkeley, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 26, Ιανουαρίου 2015? Αποδεκτές: 24 του Ιουνίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 15 Ιουλίου 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Νο 81172094), Top Έξι ταλέντα του έργου της επαρχίας Jiangsu (Grant Νο 2011ws005), και Ιατρική Επιστήμη και Τεχνολογία Αναπτυξιακά έργα της Nanjing (Grant Νο ZKX10011). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παρά τη μείωση της συχνότητας εμφάνισης, γαστρικό καρκίνο εξακολουθεί να θεωρείται μία από τις κύριες αιτίες των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Χειρουργική επέμβαση εξακολουθεί να είναι ο στυλοβάτης της κάθε θεραπευτική αγωγή? Ωστόσο, περίπου τα δύο τρίτα των ασθενών που έχουν διαγνωστεί με καρκίνο του στομάχου έχουν ανεγχείρητο τοπικά προχωρημένο ή /και μεταστατική νόσο. Το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών ασθενείς που είχαν διαγνωστεί με προχωρημένο τοπική-περιφερειακή γαστρικό καρκίνο και έχουν υποβληθεί σε θεραπευτική εκτομή παραμένουν σε χαμηλά επίπεδα, λόγω του υψηλού κινδύνου της τοπικής υποτροπής ή απομακρυσμένες μεταστάσεις ακόμα και αν εκτομή ήταν πιστεύεται ότι είναι θεραπευτική. [1] Μια προοπτική τυχαιοποιημένη διακομματικής Ομάδας (INT) -0.116 δοκιμή (556 ασθενείς) και αναδρομική Κορέας εμπειρίας (990 ασθενείς) παρουσίασαν μείωση σε τοπικό ποσοστό υποτροπής με μετεγχειρητική περιφερειακή ακτινοβολία σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία και ένα υψηλότερο ποσοστό επιβίωσης στο σκέλος ανοσοενισχυτικό. [2] η ακτινοθεραπεία είναι η κύρια τοπική-περιοχική τροπικότητα ελέγχου για ανεγχείρητο καρκίνο του στομάχου [3] Το Εθνικό Δίκτυο Comprehensive Cancer (NCCN) οδηγίες συστήνουν ακτινοθεραπεία ως τυπική θεραπεία για τους ασθενείς με καρκίνο του στομάχου με υψηλό κίνδυνο υποτροπής.? [4] Ωστόσο, υπάρχουν δύο σημαντικές όρια που σχετίζονται με τη θεραπεία του καρκίνου με ακτινοβολία γαστρικό: (1) εγγενής ή επίκτητη ανθεκτικότητα σε ακτινοθεραπεία? (2) μη ειδική τοξικότητα προς το γαστρικό βλεννογόνο και γύρω φυσιολογικούς ιστούς. [2,5]

Για την αντιμετώπιση αυτών των περιορισμών, έχουν επιστημονική προσπάθειες έχουν γίνει για να ψάξετε για μια αποτελεσματική ραδιοευαισθητοποιητής από βότανα με χαμηλότερη τοξικότητα και υψηλότερη αποτελεσματικότητα. Πρόσφατες έρευνες έχουν δείξει ότι πολλές φυτικής προέλευσης πολυφαινόλες, συμπεριλαμβανομένων κουρκουμίνη, φλαβοπιριδόλη, εμοδίνη, ουρσολικό οξύ και κλπ, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να ευαισθητοποιήσει κύτταρα όγκου σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και η ακτινοθεραπεία με αναστολή των οδών που οδηγούν στην αντίσταση θεραπεία. [6,7, 8] Αυτοί οι παράγοντες έχουν επίσης βρεθεί να είναι προστατευτικά από τοξικότητες θεραπεία σχετιζόμενη. [5] ουρσολικό οξύ (UA), πεντακυκλικόν τριτερπενίου οξύ, το οποίο θεωρείται ένα από τα πιο ελπιδοφόρα χημειοπροληπτική παράγων για καρκίνο, έχει δειχθεί να παρακινήσει αντικαρκινική δραστηριότητες συμπεριλαμβανόμενης της αναστολής της έναρξης του όγκου και της προώθησης. [9,10] Είναι επίσης προκάλεσε διαφοροποίηση των κυττάρων του όγκου με ρύθμιση της έκφρασης της διαφοροποίησης-ειδικά γονίδια στα κύτταρα τερατοκαρκινώματος F9 ποντίκι. [11] Επιπλέον, υπήρξε στοιχεία που αποδεικνύουν ότι UA παράγεται ένα αντι-αγγειογενετική δράση στην γκόμενα chorioalantoic μεμβράνη και ένα αντι-επεμβατική δραστηριότητα σε ανθρώπινα κύτταρα ινοσαρκώματος ΗΤ1080. [12,13]

Ωστόσο, πριν από την έρευνα δεν έχει ακόμα αποδείξει αν UA μπορεί να ενισχύσει τις επιδράσεις της ακτινοβολίας σε κακόηθες νεόπλασμα . Το πείραμα σχεδιάστηκε για να διερευνήσει τις επιπτώσεις και τις πιθανές μηχανισμό in vitro της ραδιοευαισθητοποίησης από UA στην κυτταρική σειρά BGC-823 από ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα γαστρικό καρκίνο να παρέχει την θεωρητική υποστήριξη για την κλινική χρήση.

Υλικά και μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

BGC-823 κύτταρα ελήφθησαν από τη Σαγκάη Ινστιτούτο Κυτταρικής Βιολογίας (Shanghai, Κίνα) και αποθηκεύονται σε μέσο RPMI 1640 με 10% ορό μόσχου σε 37 ° C σε ατμόσφαιρα κορεσμένη με νερό με 5% CO

2.

κυττάρων κυτταροτοξικότητα δοκιμασία

η κυτταροτοξικότητα προσδιορίστηκε με δοκιμή ΜΤΤ πραγματοποίησε δημοσιευθεί στο παρελθόν. [14] Για να φανεί, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 8 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις UA (0, 5, 6,25, 10, 12.5, 20, 40, 50 μg /ml) για 48 ώρες σε τουλάχιστον τρία πανομοιότυπα βοθρία. Κάθε φρεάτιο στη συνέχεια προστέθηκε 20 υΙ ΜΤΤ, που παρασκευάζεται με ανάμιξη 5 mg ΜΤΤ με 1 ml φυσιολογικό αλατούχο διάλυμα, και επωάστηκε για επιπλέον 4 ώρες. Μέσο σε κάθε φρεάτιο αντικαταστάθηκε με 150 μΐ DMSO. Η απορρόφηση προσδιορίστηκε με αναγνώστη μικροπλακός (ΒΙΡ-RAD) στα 490 nm. Τα τυφλά βυθίσματα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν για μηδενισμό απορρόφηση. Το ποσοστό αναστολής (IR%) υπολογίστηκε με τη χρήση του υποβάθρου διορθωμένη απορρόφηση από την ακόλουθη εξίσωση:.

Το IC

50 ορίστηκε ως η συγκέντρωση που απαιτείται για 50% αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης

κυττάρων ομαδοποίηση και in vitro ιονίζουσα ακτινοβολία

τα κύτταρα χωρίστηκαν τυχαία σε 4 ομάδες: ομάδα ελέγχου (Α), η ομάδα UA (Β), η θεραπεία με ακτινοβολία (RT) ομάδα (C), και ομάδα συνδυασμένης (D ). Τα κύτταρα BGC-823 καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και στη συνέχεια ομάδα Β και Δ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με UA, ενώ η Ομάδα Γ και Δ ακτινοβολήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα 6-MeV γραμμικό επιταχυντή δέσμης ηλεκτρονίων (Elekta, Σουηδία).

κλωνογόνος

δοκιμασία επιβίωσης

ακτινοευαισθησία προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία κλωνογονικού επιβίωσης. Τα κύτταρα (500-2000 ανά φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με UA (0, 6,25 και 10 ug /ml) για 24 ώρες και στη συνέχεια εκτίθενται σε αυξανόμενες δόσεις RT (0, 2, 4, 6 και 8 Gy). Μετά από 10-14 ημέρες επώασης, οι αποικίες αποτελούνταν από περισσότερα από 50 κύτταρα παρατηρήθηκαν. Οι αποικίες πλύθηκαν προσεκτικά, χρωματίστηκαν με αιθανόλη /κρυσταλλικό ιώδες χρώμα, και στη συνέχεια μετρήθηκαν. Η απόδοση επιμετάλλωση (ΡΕ) υπολογίστηκε ως (μέση απαριθμήσεις αποικίας /κύτταρα εμβολιάζονται), και κλάσμα επιβίωσης (SF) υπολογίστηκε ως [μέσο όρο αριθμών αποικιών /(κύτταρα σπάρθηκαν × ΡΕ)], όπου ΡΕ ορίστηκε ως (μέση απαριθμήσεις αποικίας για un-ακτινοβολημένα ελέγχους /κύτταρα seeded). D

0 τιμές υπολογίστηκαν από ένα μοντέλο πολλαπλών στόχων single-hit [S = 1 – (1-ε

-D /D0)

Ν], που αντιπροσώπευε τη μέση δόση ενός θανατηφόρου έκθεσης. αναλογία ενίσχυσης ευαισθητοποιητή (SER) υπολογίστηκε ως D

0 αναλογία μεταξύ της θεραπείας συνδυασμού και RT και μόνο. ​​

κυτταρικού κύκλου ανάλυσης

Η επίδραση του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος ιωδιούχου προπιδίου /RNase (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) χρώση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 2,5 × 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με UA (0 και 10 ug /ml) για 24 ώρες και στη συνέχεια εκτίθενται σε RT (0 και 2Gy) για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, μονιμοποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη στους -20 ° C, πλύθηκαν σε PBS, επαναιωρήθηκαν σε 1 ml PBS που περιέχει 1 mg /ml ΚΝάση και 50 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου, επωάζονται στο σκοτάδι για 30 λεπτά στους 37 ° C, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (FACScan, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA).

Μέτρηση της απόπτωσης

Cells ποσοτικοποίηση των κυττάρων απόπτωσης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αννεξίνης-ν-ΡΙΤΟ Kit ανίχνευσης απόπτωσης (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 2,5 × 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με UA (0 και 10 ug /ml) για 24 ώρες και στη συνέχεια εκτίθενται σε RT (0 και 2Gy) για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, και επαναιωρήθηκαν σε 500 μλ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης, και 5 μΙ του ισοθειοκυανικού αννεξίνης-ν-φλουορεσκεΐνη (FITC), και στη συνέχεια, προστέθηκαν 5 μΙ ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ). Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με ένα κυτταρομετρία ροής.

Ανίχνευση αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS)

Οι συγκεντρώσεις των ενδοκυτταρικών ROS ανιχνεύθηκαν με τη χρήση των φθοριζόντων ανιχνευτών μεμβράνη διαπερατή 2 ‘, 7’-dichlorofluorescin διοξεικό (DCFH-DA) (Beyotime, Haimen, Jiangsu, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 1 × 10

6 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με UA (0 και 10 ug /ml) για 24 ώρες, και στη συνέχεια εκτίθενται σε RT (0 και 2Gy) για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, επαναιωρήθηκαν DCFH-DA για 30 λεπτά, πλύθηκαν με RPMI 1640 χωρίς ορό, και στη συνέχεια να ανιχνεύεται με κυτταρομετρία ροής. Η μέση ένταση φθορισμού (MFI) που αντιπροσωπεύεται ενδοκυτταρικό επίπεδο ROS.

Η ανοσοϊστοχημική χρώση για την αξιολόγηση Ki-67 έκφραση

Ki-67 έκφραση πρωτεΐνης αξιολογήθηκε από την αβιδίνης-βιοτίνης συγκρότημα ανοσοϊστοχημική (ZSGB-BIO , Πεκίνο, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 2 × 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων με καλυπτρίδα για κάθε φρεάτιο, και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με UA (0 και 10 ug /ml) για 24 ώρες, και στη συνέχεια εκτίθενται σε RT (0 και 2Gy) για 24 ώρες. Στη συνέχεια, οι καλυπτρίδες στερεώθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, επωάστηκαν με 0,5% Triton Χ-100 για 20 λεπτά, πλύθηκαν σε PBS και επωάστηκαν με 3% Η

2O

2 για 15 λεπτά. Μετά την έκπλυση με PBS τρεις φορές, τα κύτταρα τα οποία προσαρτήθηκαν στις καλυπτρίδες επωάστηκαν με Ki-67 μονοκλωνικά αντισώματα για 60 λεπτά στους 37 ° C, και στη συνέχεια πλένονται σε PBS και πάλι. Συζευγμένο με βιοτίνη δεύτερα αντισώματα για 20 λεπτά στους 20-37 ° C, πλύθηκαν με PBS για τέσσερις φορές, στη συνέχεια χρωματίζονται με DAB χρώσης Kit, πλύθηκε με νερό, και στη συνέχεια με αιματοξυλίνη.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσος όρος ± SD, και σημαίνουν συγκρίσεις διεξήχθησαν με μονόδρομη ANOVA. P & lt? 0.05 έγινε δεκτή ως στατιστικά σημαντική. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS, v. 17.0.

Αποτελέσματα

Τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα της UA στην BGC-823 κύτταρα

Η κυτταροτοξική δράση της UA στην BGC-823 κύτταρα αξιολογούνται με βάση την ανάλυση ΜΤΤ. Βρήκαμε ότι UA δοσοεξαρτώμενο αυξημένη κυτταροτοξικότητα σε γαστρικό καρκίνο κυτταρική γραμμή BGC-823 (Σχήμα 1). Η ημι-μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50) τιμές για BGC-823 ήταν 17.5ug /ml. Ελαφρά κυτταροτοξικότητα (& lt? 15%) της UA για BGC-823, 10 μg /ml, χρησιμοποιήθηκε για τις επόμενες προγραμματισμένες πειράματα, για να ελεγχθεί η radioenhancement οφείλεται σε μια άμεση κυτταροτοξική δράση

Μετά από επώαση 48 ωρών με UA σε. τις δεικνυόμενες συγκεντρώσεις, η κυτταροτοξικότητα προσδιορίστηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ. UA προκάλεσε κυτταροτοξικότητα σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, το IC

50 UA για BGC-823 ήταν 17.5ug /ml, και ορίσαμε 10 ug /ml ως μια ελαφρά κυτταροτοξικότητα (υπο-κυτταροτοξικότητα) (& lt? 15%) συγκέντρωση .

η

Τα αποτελέσματα ραδιοευαισθητοποίησης της UA in vitro

Οι καμπύλες επιβίωσης των κυττάρων μετρήθηκαν με τη δοκιμασία κλωνογονικού επιβίωση απεικονίζεται στο Σχήμα 2. σε σύγκριση με την RT μόνον, SF

2 του RT σε συνδυασμό με UA μειώθηκαν σημαντικά σε BGC-823 κύτταρα, οι τιμές SER των συνδυασμένων ομάδων ήταν 1.180 φορές και 1.315 φορές. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι UA ενίσχυσε την επίδραση της ακτινοβολίας του BGC-823 σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο μέσα σε ένα ελαφρά συγκεντρώσεις κυτταροτοξικότητα.

ραδιοευαισθησία προσδιορίστηκε με δοκιμασία κλωνογόνο επιβίωση. Surviving κλάσμα της συνδυασμένης ομάδας ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με την ομάδα ακτινοβολία (** p & lt? 0,01)..

Η

Η κατανομή κυτταρικού κύκλου και την επαγωγή της απόπτωσης

Για να διερευνηθεί αν RT και ή /και θεραπεία UA θα μπορούσε να προκαλέσει οποιαδήποτε διαταραχή του κυτταρικού κύκλου, μια ανάλυση της BGC-823 κύτταρα κατεργασμένα με 2Gy ακτινοβολία ή /και 10 ug /ml UA διεξήχθη. Σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, 10 ug /ml UA μόνος έδωσε σχεδόν καμία επίδραση επί του κυτταρικού κύκλου. Ωστόσο, η συνδυασμένη ομάδα UA και προκαλείται από την ακτινοβολία διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην

1 φάση G (51,87% έναντι 60,28%, p = 0,13) και το G

2 /M φάση (3,14% έναντι 13,67%, p & lt ? 0,01) σε σύγκριση με την ομάδα ακτινοβολία 2Gy (σχήμα 3Α και 3C). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η θεραπεία συνδυασμού μπορεί να έχει προκαλέσει G

1 φάση και G

2 /M σύλληψη φάση, η οποία ήταν πιο ευαίσθητα στις επιβλαβείς επιπτώσεις της ακτινοβολίας. Τα παρόμοια συμπεράσματα από τα δεδομένα κυτταρικού κύκλου έχει αποδειχθεί από προηγούμενη μελέτη [15].

περιεχόμενο DNA των σταθερών και των κυττάρων ΡΙ-χρώση μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής, και του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε. Ποσοστά των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου χορηγήθηκαν σε κάθε διάγραμμα (Σχήμα 3Α). Σε σύγκριση με την ομάδα IR, την προσθήκη UA επάγεται διακοπή του κυτταρικού κύκλου κατά την G

1 φάση και G

2 /M φάση και ένα σημαντικά μειωθεί φάσης S, αποδεικνύοντας αντίσταση σε θεραπεία με ακτινοβολία. Σχήμα 3Β έδειξε το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων (αννεξίνη V

+, PI

+/-). Η ομάδα συνδυασμού προκάλεσε περισσότερο απόπτωση BGC-823 κυττάρων σε σύγκριση με τις άλλες τρεις ομάδες.

Η

Ο συνδυασμός της UA και ακτινοβολία θα μπορούσε επίσης να προκαλέσει περισσότερο αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, όπως φαίνεται στο σχήμα 3Β. Η αναλογία των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά με την εφαρμογή τόσο του UA και ακτινοβολία σε BGC-823 κύτταρα, σε αντίθεση με UA ή IR θεραπεία μόνη της. (78,2% έναντι 9,6% και 12,5%, ρ & lt? 0,01, Σχήμα 3D)

UA αυξημένη RT που προκαλείται από το σχηματισμό ROS

είναι ευρέως αποδεκτό ότι η θανάτωση των κυττάρων μετά από έκθεση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία είναι εν μέρει διαμεσολαβείται από ROS. [16] ανάλυση ROS χρήση DCF-DA παράγεται η μέση ένταση φθορισμού (MFI), η οποία εκπροσωπούμενη ενδοκυτταρική επίπεδο ROS της κάθε ομάδας (Σχήμα 4Α και 4Β). ΝΧΙ μόνη ομάδα UA, μόνη ομάδα RT και ομάδα UA + RT αυξήθηκε κατά 1,15 φορές, 1,53 φορές και 2,09 φορές σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Το επίπεδο του ROS της ομάδας συνδυασμού αυξήθηκε σημαντικά σε σχέση με την μόνη ομάδα RT, αποκαλύπτοντας ότι η προσθήκη UA σε RT επάγεται περισσότερο σχηματισμό ROS από την RT και μόνο. ​​

Οι συγκεντρώσεις των ενδοκυτταρικών ROS ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας την μεμβράνη διαπερατή φθορισμού ανιχνευτές 20, 70-dichlorofluorescin διοξεικό (DCFH-DA) με κυτταρομετρία ροής. Η μέση ένταση φθορισμού (MFI) που αντιπροσωπεύεται ενδοκυτταρικό επίπεδο ROS. Η διαφορά ΝΧΙ μεταξύ συνδυασμό ομάδας και της ομάδας RT ήταν σημαντική (P & lt? 0,01) (ns: δεν είναι σημαντική? **: Ρ & lt? 0,01)

Η

Η ανοσοϊστοχημική χρώση του Ki-67

.

Ki-67 ήταν γνωστό ως πυρηνικό αντιγόνο, η οποία συχνά σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. πείραμα μας ανιχνεύεται το θετικό συντελεστή Ki-67 πρωτεΐνη με ανοσοϊστοχημική χρώση, και τα αποτελέσματα απεικονίζονται στο Σχήμα 5. Ποσοστό Ki-67 θετικών κυττάρων της συνδυασμένης ομάδας μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, καθώς και την ομάδα θεραπείας με ακτινοβολία .

Σχήμα 5Α έδειξαν τις εικόνες των αποτελεσμάτων της Ki-67 ανοσοϊστοχημική χρώση κυτταρικής γραμμής BGC-823 (μεγέθυνση: 10 χ 40). Ποσοστό Ki-67 θετικών κυττάρων της συνδυασμένης ομάδας μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, καθώς και η ομάδα θεραπείας με ακτινοβολία. Σχήμα 5Β έδειξε ότι η διαφορά μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της ομάδας UA ήταν μη σημαντικές? Ωστόσο, υπήρξε μια σημαντική μείωση, μεταξύ της ομάδας συνδυασμού και της ομάδας RT (** P & lt? 0,01).

Η

Συζήτηση

Αυτή η έρευνα εξέτασε τις επιδράσεις και πιθανός μηχανισμός UA ως ραδιοευαισθητοποιητής. Η δοκιμασία ΜΤΤ και δοκιμασία κλωνογονική επιβίωση έδειξαν ότι σε συνδυασμό με IR UA ήταν ανώτερη σε κυτταροτοξικότητα σε σχέση με IR και μόνο. Αυτή η δράση παρατηρήθηκε σε αμφότερες τις ομάδες με διαφορετικές συγκεντρώσεις υπο-κυτταροτοξικότητα της UA, 6.25ug /ml και 10 ug /ml. Σε αυτή τη δόση, UA είχε ελαφρά κυτταροτοξικότητα σε ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή BGC823 και δεν έχουν σημαντική κυτταροτοξικότητα σε κανονικό γαστρικό κυτταρική σειρά. [17] Αυτό έδειξε ότι UA ήταν ένα ελπιδοφόρο ραδιοευαισθητοποίηση

in vitro

.

Κεντρική σε ακτινοθεραπεία του καρκίνου είναι η μεγιστοποίηση θεραπευτική αποτελεσματικότητα στον ιστό του όγκου ενώ ελαχιστοποιεί τη ζημιά σε φυσιολογικούς ιστούς. Ενώ επεξεργασμένη σχεδιασμό και την πρόσφατη φυσικές τεχνικές μπορεί να αυξήσει με ασφάλεια τη δόση ακτινοβολίας στον ιστό του όγκου, ενώ η μείωση της δόσης στα γύρω φυσιολογικούς ιστούς, [18] τρέχουσες τεχνικές ακτινοθεραπείας ακόμα δεν μπορεί να αποφύγει τον τραυματισμό κοντά φυσιολογικούς ιστούς. Περαιτέρω ακτινοθεραπευτικές όφελος μπορεί να βρεθεί με την εξέταση της βιολογικής απόκρισης του μικροπεριβάλλον του όγκου για να αποκαλύψει το πώς να αυξήσει την ευαισθησία ενός όγκου στην ακτινοβολία ή να αναστέλλουν τις παρενέργειες από την ακτινοβολία. [19]

φυσιολογικούς ιστούς γύρω γαστρικό καρκίνο, όπως εντερικές και του γαστρικού, είναι ευαίσθητα στην ιονίζουσα ακτινοβολία. Ως αποτέλεσμα, η δόση ιονίζουσας ακτινοβολίας προς ιστό όγκου πρέπει να περιοριστεί. Επιπλέον, τα επικαλυπτόμενα παρενέργειες της ιονίζουσας ακτινοβολίας θα ενισχύσει ακτινοθεραπεία παρενέργειες, και ακόμη και να διακόψει τη θεραπεία. συγκέντρωση Υπο-κυτταροτοξικότητα των UA συνδυασμό με ιονίζουσα ακτινοβολία, ωστόσο, μπορεί να αυξήσει την κυτταροτοξικότητα από την ιονίζουσα ακτινοβολία, ενώ χαμηλή συγκέντρωση UA είναι σχεδόν αβλαβής για τους φυσιολογικούς ιστούς. Αυτή η στρατηγική μπορεί να αυξήσει το θεραπευτικό δείκτη σε ιστό του όγκου χωρίς αύξηση της δόσης ακτινοβολίας και ακτινοθεραπευτικό παρενέργεια.

Για τον προσδιορισμό του μηχανισμού της ραδιοευαισθητοποίησης της UA, πραγματοποιήσαμε ανάλυση σε πολλαπλά βήματα. Πρώτα, αναλύσαμε την κατανομή του κυτταρικού κύκλου. συγκέντρωση υπο-κυτταροτοξικότητα της UA δεν αποφέρει καμία σημαντική επίδραση επί του κυτταρικού κύκλου, ενώ συγκρίνουν με ιοντίζουσα ακτινοβολία μόνη της, η συνδυασμένη θεραπεία ενισχυμένη G

2 /M σύλληψη. Η ραδιοευαισθησία των κυττάρων συσχετίζεται με τον κυτταρικό κύκλο, και η συσχέτιση είναι υψηλότερη στο G

2 /M φάση και χαμηλότερη σε φάση S. Αυτό μπορεί να είναι ο πιο σημαντικός λόγος για την ενισχυμένη ραδιοευαισθητοποίηση παρατηρήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Δεύτερον, αναλύσαμε τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS. Το επίπεδο ROS της ομάδας συνδυασμού αυξήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, ομάδα της μονοθεραπείας UA, ή ακόμη και την ομάδα ιονίζουσα ακτινοβολία. Η προσθήκη της UA σε ιοντίζουσα ακτινοβολία που προκαλείται περισσότερο σχηματισμό ROS. Η ιονίζουσα ακτινοβολία προκάλεσε την ραδιόλυση του νερού, η οποία δημιουργείται ROS, όπως ρίζες υδροξυλίου και υπεροξειδίου. Αυτά τα μόρια των ROS έπαιξε σημαντικό ρόλο στην ιονίζουσα ακτινοβολία που προκαλείται κυτταρική βλάβες, όπως η οξειδωτική βλάβη του DNA, που οδηγούν δυνητικά σε τόσο κλωνογονικού θάνατο και την απόπτωση. Τρίτον, σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι το ποσοστό του Ki-67 θετικών κυττάρων της ομάδας συνδυασμού μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου ή την ομάδα θεραπείας με ακτινοβολία. Ki-67 είναι γνωστό ως ένα κυτταρικό κύκλο που σχετίζεται αντιγόνο και ένα χρήσιμο δείκτη πολλαπλασιασμού. Ki-67 πρωτεϊνικό επίπεδο συσχετίζεται με υψηλότερες πολλαπλασιασμό και μεταστάσεις ικανότητα. [20,21]

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη είναι η πρώτη προσπάθεια να αποδείξει ότι UA θα μπορούσε να συνεργούν με ιοντίζουσα ακτινοβολία κατά της ανθρώπινης κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου . Ο βασικός μηχανισμός της βελτιωμένης αποτελεσματικότητας ραδιοευαισθητοποίηση μπορεί να είναι η ενισχυμένη G2 /M σύλληψης, αυξημένη ROS και ρυθμισμένα προς τα κάτω επίπεδο Ki-67. Συλλογικά, όπως καταδεικνύεται UA ισχυρή επίδραση κατά του πολλαπλασιασμού και συνεργική επίδραση, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένα δυναμικό ευαισθητοποιητή φάρμακο για την εφαρμογή της ακτινοθεραπείας. Ωστόσο, είναι χωρίς αμφιβολία ότι απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να αξιολογήσει τη σκοπιμότητα και τα οφέλη από τη χρήση Παραδοσιακής Κινέζικης Ιατρικής όπως ραδιοευαισθητοποιητές πριν από την πραγματική κλινικές εφαρμογές. Τα περισσότερα πειράματα και επαναλήψεις που απαιτούνται σε άλλους τύπους όγκων και σε δοκιμές σε ζώα, προκειμένου να επιβεβαιωθεί η αποτελεσματικότητα της προτεινόμενης στρατηγικής.