Αφηρημένο

Ιστορικό

Μια πληθώρα αποδεικτικών στοιχείων που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας μοντέλα ποντικών δείχνει ότι CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Treg) διατηρεί την περιφερική ανοχή σε αυτό-αντιγόνα και επίσης αναστέλλουν κατά του όγκου ανοσοαποκρίσεων. Μέχρι σήμερα υπάρχουν περιορισμένες πληροφορίες σχετικά με CD4

+ αποκρίσεις των Τ κυττάρων σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC). Εμείς που καθορίζονται για τη μέτρηση αποκρίσεων Τ κυττάρων σε ένα αντιγόνο που σχετίζεται με όγκο και να εξετάσει κατά πόσον Treg προσκρούουν σε αυτές τις αντικαρκινικές ανοσολογικές αποκρίσεις σε ασθενείς με CRC.

Μεθοδολογία και ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Treg εντοπίστηκαν και χαρακτηρίζεται ως CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Μια αυξημένη συχνότητα των Treg καταδείχθηκε σε αμφότερες τις περιφερικό αίμα και μεσεντερικούς λεμφαδένες των ασθενών με καρκίνο παχέος εντέρου (CRC) σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες είτε ασθενείς είτε με φλεγμονώδη νόσο του εντέρου (IBD). Εξάντληση των Treg από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) των ασθενών CRC εκδηλωθεί CD4

+ αποκρίσεις των Τ κυττάρων, όπως παρατηρείται από την απελευθέρωση ΙΡΝγ, στον όγκο που σχετίζεται 5Τ4 αντιγόνο, ενώ δεν παρατηρήθηκε επίδραση σε ένα υγιή ομάδα ελέγχου ίδιας ηλικίας .

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι Treg ικανές αναστολής που σχετίζονται με όγκους αντιγόνο ειδικές ανοσοαποκρίσεις είναι εμπλουτισμένα σε ασθενείς με CRC. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν ένα σκεπτικό για το χειρισμό Treg για την ενίσχυση της ανοσοθεραπείας του καρκίνου

Παράθεση:. Clarke SL, Betts GJ, Plant A, Ράιτ KL, El-Shanawany TM, Harrop R, et al. (2006) CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ ρυθμιστικά Τ κύτταρα καταστολή Anti-Tumor ανοσολογική απάντηση στους ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 1 (1): E129. doi: 10.1371 /journal.pone.0000129

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Χριστόφορος Arendt, Sanofi-Aventis, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Σεπτεμβρίου του 2006? Αποδεκτές: 14 Νοέμβρη του 2006? Δημοσιεύθηκε: 27 Δεκ 2006

Copyright: © 2006 Clarke et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τη χρηματοδότηση από το Tenovus Cancer Charity, Κάρντιφ, και ένα μικρό βραβείο επιχορήγηση από το Κάρντιφ και Vale NHS Trust. KLW χρηματοδοτήθηκε από μια επιχορήγηση του έργου Wellcome Trust και του Συνδέσμου Διεθνών Ερευνών Καρκίνου. AMG είναι ένα MRC ανώτερος ερευνητής

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τέταρτη πιο συχνά. διαγνώστηκε κακοήθης νόσος με κατ ‘εκτίμηση 1 εκατομμύριο νέα κρούσματα και πάνω από 500 000 θανάτους κάθε χρόνο σε όλο τον κόσμο [1]. Η τρέχουσα διαχείριση των ασθενών με CRC περιστρέφεται γύρω από εκτομή του πρωτογενούς όγκου και των τοπικών λεμφαδένες και την επιλεκτική χρήση του 5-φθοροουρακίλη (5FU? Αναστέλλει θυμιδυλική συνθάση), με βάση τη χημειοθεραπεία [2]. Πρόσφατες πρόοδοι στην προεγχειρητική απεικόνιση, χειρουργική τεχνική και η χρήση του νεο-επικουρική χημειοθεραπεία έχουν βελτιωθεί αποτελέσματα, αλλά ορθοκολικού καρκίνου παραμένει η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις δυτικές χώρες με το 40-50% των ασθενών που υποβάλλονται σε θεραπευτική δυνητικά λειτουργία, που υποβάλλονται υποτροπής ή θανάτου από μεταστατική νόσο.

Κλινικο-παθολογική σταδιοποίηση της νόσου συσχετίζεται έντονα με την πρόγνωση. Είναι ενδιαφέρον, βελτιωμένη κλινική έκβαση συνδέεται επίσης με την παρουσία των ογκο-διηθητικά λεμφοκύτταρα (TILs), ιδιαίτερα εάν τα λεμφοκύτταρα εισβάλλουν τα αδενικά στοιχεία του όγκου [3], [4]. Αυτό υποδηλώνει ότι η αντι-όγκου ανοσοαποκρίσεις μπορούν να επηρεάσουν την ανάπτυξη του πρωτογενούς όγκου, και μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στον έλεγχο μεταστατικής νόσου. Έμμεση απόδειξη για τη σημασία της ανοσολογικής απόκρισης σε ασθενείς με καρκίνο είναι η επιδημιολογική σύνδεση σε ορισμένους πληθυσμούς μεταξύ αυξημένη συχνότητα εμφάνισης όγκων και μεταμόσχευση ανοσοκαταστολή μετά οργάνων [5].

Μεγάλο ενδιαφέρον έχει προκύψει πρόσφατα στο ρόλο ενός φυσικά πληθυσμό CD4

+ CD25

+ ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Treg), η οποία χαρακτηρίζεται από την έκφραση του παράγοντα μεταγραφής FoxP3 διχαλωτή κεφαλή, και αυξημένα επίπεδα των δεικτών επιφανείας CD45RO, CTLA-4, και GITR [6 ], [7], [8]. Treg έχουν δειχθεί για τον έλεγχο αυτο-αντιγόνου ειδικές αποκρίσεις στην περιφέρεια, και ως εκ τούτου μπορεί να παίζει ένα ρόλο στον έλεγχο κατά του όγκου ανοσοαποκρίσεων. Αρκετές ομάδες περιλαμβανομένης της δικής μας, έδειξαν ότι η εξάντληση των Treg προάγει την παραγωγή της κατά του όγκου ανοσοαποκρίσεων και απόρριψη όγκου σε μοντέλα ποντικών (που επισκοπείται στο [9]). Υπάρχουν στοιχεία που δείχνουν ότι αυτές οι προστατευτικές αντιδράσεις στοχεύουν τόσο όγκου-ειδικά αντιγόνα, καθώς και αντιγόνα από κοινού όγκου [10], [11].

Πιο πρόσφατα, αρκετές μελέτες έχουν παρατηρηθεί αυξημένη συχνότητα των CD4

+ CD25

+ Τ κυττάρων στο περιφερικό αίμα ασθενών με διάφορους τύπους καρκίνου, αν και η πλειοψηφία αυτών των μελετών δεν επιβεβαίωσαν ότι επρόκειτο Treg με χρώση για Foxp3 (που επισκοπείται στο [9]). Η παρουσία του Foxp3

+ Treg εντός του TILs του καρκίνου των ωοθηκών έχει, ωστόσο, έχουν αναγνωριστεί ως ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για την φτωχότερη πρόγνωση. Επιπλέον, μετά από καθαρισμό από τον ασκίτη όγκου, αυτοί Treg δείχθηκε να καταστέλλει Her2-ειδικές αποκρίσεις Τ κυττάρου

in vitro

[12].

Το ανθρώπινο ογκο-εμβρυϊκού αντιγόνου, 5Τ4, είναι μια 72kDa γλυκοπρωτεΐνη πλούσιες σε λευκίνη μεμβράνη που εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στον πλακούντα και επίσης σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκινωμάτων, συμπεριλαμβανομένων του παχέος εντέρου, του στομάχου, του νεφρικού και των ωοθηκών, αλλά σπάνια σε φυσιολογικούς ιστούς [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Σε αυτή τη μελέτη εξετάσαμε την υπόθεση ότι αναπτύσσουν Treg εις το CRC ασθενείς που καταστέλλουν 5Τ4-ειδικές ανοσοαποκρίσεις. Τα δείγματα από ασθενείς με CRC ή IBD, και υγιείς μάρτυρες εξετάστηκαν για την αντιμετώπιση τρία ερωτήματα: είναι η συχνότητα των Treg (CD25

hiCD4

+ FoxP3

+ Τ κύτταρα) αυξήθηκαν στο αίμα ή λεμφαδένες από ασθενείς με CRC? μπορεί κατά όγκων Τ κυτταρικές αποκρίσεις προς 5Τ4 να αναγνωρίζονται ασθενείς CRC? και δεν Treg προσκρούουν σε αυτές τις αντικαρκινικές ανοσολογικές αποκρίσεις;

Μέθοδοι

ομάδες

Δείγμα

ασθενείς

CRC προσδιορίστηκαν από τις συνεδριάσεις της ομάδας διεπιστημονικής με την πρώτη παρουσίαση του αδενοκαρκινώματος και δεν αναφέρθηκαν απομακρυσμένες μεταστάσεις στην απεικόνιση διατομής (στάδιο TNM Ι-ΙΙΙ? Δούκα στάδιο Α-Γ). ασθενείς IBD (ελκώδη κολίτιδα ή νόσο του Crohn) φοιτούν κλινική ή υποβάλλονται σε εκλεκτική χειρουργική εκτομή είχαν προσληφθεί για τη μελέτη. Τοπική έγκριση επιτροπής δεοντολογίας χορηγήθηκε για τη μελέτη από την Επιτροπή Δεοντολογίας τοπική Έρευνας Bro Taf.

Τα αντιγόνα

Το καθαρισμένο παράγωγο πρωτεΐνης (PPD) (Statens Serum Institut, Δανία), αιμοσυγκολλητίνη (ΗΑ) ήταν ένα είδος δώρο από τον Dr John Skehel (NIMR, Mill Hill), 5Τ4 παρήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19] (Oxford Biomedica). Όλα τα αντιγόνα χρησιμοποιήθηκαν σε τελική συγκέντρωση 1 μg /ml.

Καθαρισμός των λεμφοκυττάρων

30-50 ml του αίματος από ασθενείς ή ελέγχους και ηπαρινισμένου (10 U /ml). PBMCs εκχυλίστηκαν με φυγοκέντρηση επί Lymphoprep (Axis-Shield, Όσλο, Νορβηγία). Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε RPMI πριν από την περαιτέρω χρήση. Οι λεμφαδένες αποκόπηκαν από νωπά δείγματα μέσα σε 30 λεπτά από τη χειρουργική επέμβαση, πλύθηκαν σε RPMI, πουρέ μέσω ενός αποστειρωμένου κυττάρου σουρωτήρι και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των λεμφοκυττάρων από τους κόμβους αίματος και της λέμφου

δείγματα υπέστησαν χρώση με φθορισμό σημασμένα αντισώματα προς CD4 (κλώνος RPA-Τ4), CD25 (κλώνος Μ-A251), CD45RO (κλώνος UCHL1) και CTLA4 (κλώνος ΒΝΙ3) (BD Pharmingen), CD4 (κλώνος S3.5) (Caltag ) και CD25 (κλώνος 4E3) (Miltenyi Biotec). Όλα χρώση διεξήχθη σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), 2.5% FCS, 5 mM EDTA και ενδοκυτταρική χρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Cytofix, κιτ Cytoperm (BD Pharmingen). χρώση Foxp3 εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ FITC αντι-ανθρώπινης χρώσης FoxP3 (κλώνος pCH101) (71 – 5776 eBioscience). Λεμφοκύτταρα περίφραξη σε προς τα εμπρός και τα προφίλ πλευρά διασποράς. Όλα κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε σε ένα BD FACSCalibur και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ανάλυσης v3.1 Σύνοδο Κορυφής (build 839 DakoCytomation, Fort Collins, Colorado).

CD4

+ CD25

hi add-back πειράματα

τα καθαρισμένα PBMC εμπλουτίστηκαν για τα CD4

+ κύτταρα και στη συνέχεια χωρίζεται σε CD4

+ CD25

hi και CD4

+ CD25

– κλάσματα χρησιμοποιώντας μαγνητικά σφαιρίδια (Miltenyi CD4

+ CD25

+ ρυθμιστικές κιτ απομόνωσης). Η κυτταρομετρία ροής του κάθε κλάσματος έδειξε ότι η αυστηρότητα των CD25

+ κυτταρική επιλογή από το Miltenyi CD4

+ CD25

+ ρυθμιστικές κιτ απομόνωσης και Miltenyi αντι-CD25 χάντρες ήταν συγκρίσιμη. Μία δοκιμασία πολλαπλασιασμού στήθηκε χρησιμοποιώντας 2×10

4 CD4

+ CD25

– κύτταρα, ενεργοποιημένα με 0,5 μg /ml δεσμευμένο στην πλάκα αντι-CD3 (κλώνος ΟΚΤ3) (eBioscience) και 1 μg /ml διαλυτού αντι -CD28 (κλώνος 28,2) (BD Pharmingen) αντισωμάτων σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% θερμικά επεξεργασμένο FCS, 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, 2 mM Ε-γλουταμίνη και 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο. CD4

+ CD25

– κύτταρα ενεργοποιούνται μόνα τους ή με την παρουσία των CD4

+ CD25

hi σε κύτταρα ποικίλες αναλογίες 1:01, 1:0.1, 1:0.01 και 1:0.001 CD4

+ CD25

-:CD4

+ CD25

hi κύτταρα. Ο πολλαπλασιασμός μετρήθηκε την ημέρα 3 με την προσθήκη του 0,037 MBq /φρεάτιο (1 μΟί) του [

μεθυλ

-3Η] -θυμιδίνης (Amersham Biosciences) για τις τελικές 18 ώρες της καλλιέργειας. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν πάνω σε φίλτρα εκτυπώνονται filtermat Α (Wallac, Turku, Φινλανδία προμηθευτής Perkin Elmer) χρησιμοποιώντας ένα συλλέκτη κυττάρων ΤΟΜΤΕΚ. Μόλις φίλτρα ήταν στεγνό, MeltiLex Προστέθηκαν φύλλα σπινθηριστή τήξης στο (Wallac) και τα φίλτρα διαβάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα υγρό σπινθηρισμού Microbeta και φωταύγεια μετρητή Trilux 1450 (Wallac).

προσδιορισμούς ELISPOT της IFN-γ

τα αντισώματα ελήφθησαν από την Mabtech (Natka, Σουηδία) και η ELISPOT αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ υποστρώματος αλκαλικής φωσφατάσης από την Bio-Rad (Hercules, California). Η επίδραση της εξάντλησης Treg επί της παραγωγής IFN-γ αντιγόνου-ειδική αξιολογήθηκαν σε παράλληλες δοκιμασίες. CD25

hi κύτταρα αφαιρέθηκαν με τη χρήση μαγνητικού διαχωρισμού με μικροσφαιρίδια MACs CD25 (Miltenyi Biotec, Germany). Εν συντομία, 1.5 χ 10

7 PBMC επωάστηκαν με 15 μΙ αντι-CD25 επικαλυμμένα σφαιρίδια σε συνολικό όγκο αντίδρασης 150 μΐ ρυθμιστικού (1 χ PBS, 0,5% BSA, 5 mM EDTA) στους 4 ° C για 15 λεπτά . Περίσσεια χάντρες πλύθηκαν μακριά και το PBMC έτρεξαν κάτω από μια στήλη MS. Η στήλη πλύθηκε με 3 χ 1 ml πλύσεις σε ρυθμιστικό διάλυμα. Η αποτελεσματικότητα της εξάντλησης επιβεβαιώθηκε με κυτταρομετρία ροής. Οι προσδιορισμοί ρυθμίστηκαν χρησιμοποιώντας είτε 3,5 × 10

5 μη-αραιωμένη ή CD25

hi-εξαντλημένο κύτταρα σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 5% θερμικά επεξεργασμένο FCS, 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, 2 mM L -γλουταμίνη και 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο ανά φρεάτιο μιας πλάκας 96-φρεατίων διήθηση πολυμερές-backed (ΜΑΙΡ-δ-4510) (Millipore, Moslheim, Γαλλία) σε ένα συνολικό όγκο αντίδρασης 100 μΙ /φρεάτιο. Οι συγκεντρώσεις των αντισωμάτων που χρησιμοποιούνται και τα βήματα πλύσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, όλες οι επωάσεις αντισωμάτων ήταν με 50 μΙ /φρεάτιο. Η μέθοδος έχει περιγραφεί προηγουμένως [20]. PPD, ΗΑ και 5Τ4 δοκιμάστηκαν εις διπλούν φρεάτια, έχουν προστεθεί σε μία τελική συγκέντρωση 1 μg /ml, και σε σύγκριση με φρεάτια ελέγχου χωρίς πρωτεΐνη. Η πλάκα επωάστηκε στους 37 ° C, 5% CO

2 για 18 ώρες. Τα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα απαριθμήθηκαν στο επίπεδο του ενός κυττάρου με απαρίθμηση του αριθμού των κηλίδων ανά βοθρίο με τη χρήση ενός αυτόματου αναγνώστη ELISPOT (Cadama). Ανταποκρίθηκαν ταυτοποιήθηκαν ως έχει τουλάχιστον 5 κύτταρα που σχηματίζουν κηλίδες (SFC) ανά 10

6 PBMC, μετά την αφαίρεση του φόντου, και μια αύξηση τουλάχιστον 50% πάνω από το υπόβαθρο.

Η στατιστική ανάλυση

κυτταρομετρίας ροής δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το

t-test

(GraphPad Prism έκδοση 2.0 (GraphPad Software). το ποσοστό των ασθενών με καρκίνο και των υγιών μαρτύρων τοποθέτηση μια απάντηση σε 5Τ4 συγκρίθηκε χρησιμοποιώντας ένα κλειστό το ασύζευκτο μαθητή μέθοδος μορφή για τη σύγκριση των διαφορών και τον υπολογισμό των διαστημάτων εμπιστοσύνης [21].

Αποτελέσματα

Ορισμός ο πληθυσμός των ανθρωπίνων Treg

Χρησιμοποιώντας τις αυστηρές παραμέτρους πύλης ανέφερε πρόσφατα [8], Treg ήταν προσδιορίζονται ως CD4 θετικά κύτταρα με φωτεινότερα χρώση CD25 από αυτήν του CD4-αρνητικού πληθυσμού (Σχήμα 1α). Η συχνότητα των Treg υπολογίστηκε ως το ποσοστό των CD4

+ CD25

hi κύτταρα στο CD4

+ του πληθυσμού, και ήταν της τάξεως των 0,09 έως 1,44% του

+ κυττάρων CD4 σε PBMC από υγιείς μάρτυρες ίδιας ηλικίας. Σύμφωνα με προηγούμενες εκθέσεις, η συντριπτική πλειοψηφία των CD4

+ CD25

hi κύτταρα CTLA4-θετικών και εκφράζεται CD45RO (& gt? 97%) [6], [7], [8]. Το CD25

πληθυσμός hi αναλύθηκε περαιτέρω από την έκφραση του Foxp3. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1β, πάνω από το 95% των CD4

+ CD25

hi κύτταρα εξέφρασαν FoxP3, σε σύγκριση με περίπου 30% των CD4

+ CD25

int κύτταρα. Αυτό το πρότυπο της χρώσης ήταν η ίδια και για τις δύο υγιείς ελέγχους και τους ασθενείς CRC. έκφραση Foxp3 ήταν αμελητέα σε CD4

+ CD25

– κυττάρων (Σχήμα 1β)

(Α) CD4

+ CD25

-., CD4

+ CD25

int και CD4

+ CD25

hi κύτταρα εντοπίστηκαν, όπως φαίνεται. CD4

+ CD25

hi κύτταρα είναι εκείνα όπου η έκφραση CD25 ήταν υψηλότερη από ότι στο CD4

– πληθυσμού. (Β) έκφραση FoxP3 εντός κάθε πληθυσμό εκτιμήθηκε με ενδοκυτταρική χρώση. (C) Πρόσφατα απομονωμένα CD4

+ CD25

– Τ κύτταρα (2 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) καλλιεργήθηκαν μόνο (CD25- /χαμηλή) ή με CD4

+ CD25

hi Τ κύτταρα σε διάφορες αναλογίες, και διεγείρονται με δεσμευμένο στην πλάκα αντι-CD3 και διαλυτό αντι-CD28. Πολλαπλασιασμό αξιολογήθηκε από (

3Η) -θυμιδίνης. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο των εις τριπλούν φρεάτια με τυπική απόκλιση, από έναν εκπρόσωπο δοκιμασία.

Η

Για να επιβεβαιώσετε την κανονιστική φαινότυπο αυτού του πληθυσμού των CD4

+ CD25

hi κύτταρα, την ικανότητά τους να καταστέλλουν την ενεργοποίηση των CD4

+ CD25

– κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα συν-καλλιέργεια

in vitro

δοκιμασία πολλαπλασιασμού. CD4

+ CD25

– και CD4

+ CD25

hi κύτταρα διαχωρίζονται από PBMC, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Η προσθήκη των CD4

+ CD25

hi κύτταρα να πολυκλωνικώς διεγείρονται CD4

+ Τ κύτταρα καταστέλλονται με σαφήνεια τον πολλαπλασιασμό των CD4

+ CD25

– Τ κύτταρα και, όπως αναφέρθηκε από τους άλλους, αυτή η καταστολή ήταν δοσοεξαρτώμενη [8], [22], [23] (Σχήμα 1γ).

CRC ασθενείς έχουν αυξημένους αριθμούς Treg στο περιφερικό αίμα

Ο Treg είχαν φαινοτυπικά ορίζεται όπως περιγράφεται παραπάνω . Το σχήμα 2α δείχνει τις συχνότητες των Treg στους ΜΚΠΑ ασθενών CRC (n = 12, εύρος ηλικίας 58-80 ετών) σε σύγκριση με αντίστοιχης ηλικίας υγιείς μάρτυρες (n = 11, εύρος ηλικίας 48-93 ετών) και σε ασθενείς με φλεγμονώδη νόσο του εντέρου (n = 22, εύρος ηλικίας 19-80 ετών). Σε όλες τις ομάδες, η συχνότητα του Treg ήταν λιγότερο από 2% των CD4

+ Τ κύτταρα. Ωστόσο, η μέση συχνότητα σε ασθενείς CRC (1,13%) ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου (ΙΒϋ ασθενείς 0,56%, υγιείς ελέγχους 0,46%). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στη συχνότητα των Treg στους υγιείς μάρτυρες και ασθενείς IBD.

(Α) Προσφάτως απομονωθέντα PBMC από 12 ασθενείς CRC, 11 υγιείς ελέγχους της ίδιας ηλικίας και 22 ασθενείς IBD βάφτηκαν με αντισώματα προς CD4 και CD25. Χρησιμοποιώντας τη στρατηγική gating σκιαγραφείται στο Σχήμα 1, Treg απαριθμήθηκαν. (Β) μεσεντερικών δείγματα λεμφαδένα (LN) συλλέχθηκαν από χειρουργικά δείγματα των 8 CRC και 7 ασθενείς IBD και χρωματίστηκαν και περιφραγμένο όπως παραπάνω. Τα στοιχεία δείχνουν το ποσοστό των CD4

+ κυττάρων που ήταν CD25

hi σε κάθε δείγμα. Κάθε σύμβολο αντιπροσωπεύει έναν ασθενή. Οι τιμές ρ υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα αταίριαστο μαθητή

t-test

.

Η

CRC ασθενείς έχουν αύξηση του αριθμού των Treg στους μεσεντέριους λεμφαδένες

Η απόκτηση λέμφου ελέγχου κόμβων από υποκείμενα χωρίς κοιλιακή ασθένεια δεν ήταν δυνατή. ΙΒϋ ασθενείς προσφέρουν μια κολονική ομάδα ελέγχου της νόσου στους ασθενείς CRC, ο τελευταίος συχνά επιδεικνύοντας περιοχές φλεγμονής γύρω από τον όγκο. Επιπλέον, τα αποτελέσματα από PBMCs δεν έδειξε σημαντική μεταβολή στις συχνότητες των Treg σε ασθενείς με IBD σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες. Ως εκ τούτου, εμείς θεώρησε λογικό να χρησιμοποιήσει μεσεντέριους λεμφαδένες που λαμβάνονται από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση IBD ως ομάδα ελέγχου, στην οποία να εξετάσει Treg στη δευτερογενή λεμφικό ιστό.

Φρέσκα λεμφαδένες ελήφθησαν από τα χειρουργικά δείγματα και παρασκευάζεται ως περιγράφονται στις μεθόδους. Οι συχνότητες των Treg στους μεσεντέριους λεμφαδένες που λαμβάνονται από CRC ασθενείς (n = 8), και ασθενείς IBD (n = 7) συγκρίθηκαν (Σχήμα 2β). ασθενείς CRC πάλι έδειξαν μια σημαντική αύξηση στη συχνότητα των Treg, αντανακλώντας την αύξηση που έχουν ήδη περιγραφεί στο περιφερικό αίμα. Η λεμφαδένα προερχόμενο CD25

hi Treg είχε το ίδιο φαινότυπο με αυτά που βρίσκονται στο αίμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στη συνολική αναλογία των CD4

+ ή CD8

+ Τ κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Ασθενείς με μη μεταστατικό CRC επιδεικνύουν έντονη CD4

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις να υπενθυμίσει αντιγόνα

PBMCs καθαρίστηκαν από ασθενείς με CRC (n = 14) πριν από το χειρουργείο και την ειδική CD4

+ Τ κυτταρική απόκριση στην ανάκληση ελέγχου αντιγόνα PPD και ΗΑ μετρήθηκε με ΙΡΝ-γ απελευθέρωση. Αυτά τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με υγιή ίδιας ηλικίας μάρτυρες (n = 11) (Σχήμα 3). πειράματα εξάντληση CD4 και CD8 επιβεβαίωσε ότι αυτές ήταν CD4

αποκρίσεις + Τ κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Δεν υπήρξε καμία ένδειξη ότι οι ασθενείς σε ανοσοκαταστολή? Όλα τα υποκείμενα ανταποκρίθηκαν σε τουλάχιστον ένα αντιγόνο. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αξιολογήθηκε επίσης σε παράλληλα πειράματα ως μέτρο της ενεργοποίησης των κυττάρων Τ, και πάλι καμία ένδειξη ανοσοκαταστολής βρέθηκε προεγχειρητικά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Σύνολο PBMC από 11 ίδιας ηλικίας μάρτυρες και 14 CRC ασθενείς αξιολογήθηκαν για αποκρίσεις στα αντιγόνα PPD και ΗΑ, μετράται με ΙΡΝ-γ ELISPOT. Καθαρισμένα PBMC προστέθηκαν σε 3,5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο, και επωάστηκαν για 18 ώρες παρουσία είτε 1 μg /ml PPD, 1 μg /ml ΗΑ ή χωρίς αντιγόνο. Wells στήθηκαν εις διπλούν. Λιγότερες από 5 σχηματίζουν κηλίδες κύτταρα /10

6 PBMC θεωρήθηκε αρνητική.

Η

Treg έχουν σημαντική επίδραση στις αντικαρκινικές ανοσολογικές αποκρίσεις στο αίμα των ασθενών με CRC

Μια σειρά από δοκιμασίες διεξήχθησαν επί CRC ασθενείς (n = 14) και κατάλληλης ηλικίας μάρτυρες (n = 11) για να προσδιοριστεί κατά πόσον απομάκρυνση των CD25

hi κύτταρα μετέβαλε την ανοσοαπόκριση σε αντιγόνα ανάκλησης και το αντιγόνο που συνδυάζεται με καρκίνωμα 5Τ4. Εμείς βελτιστοποιημένο σύστημα απομόνωσης έχει σχεδιαστεί ειδικά για να καταστρέφουν μόνο τα hi κύτταρα CD25

από τα δείγματα μας, όπως περιγράφεται στις μεθόδους (Σχήμα 4α). Προσφάτως απομονωμένα PBMCs χρησιμοποιήθηκαν σε

ex vivo δοκιμασίες ELISPOT

ΙΡΝ-γ, όπως περιγράφεται παραπάνω για να προσδιοριστεί αποκρίσεις στα αντιγόνα ανάκλησης και το αντιγόνο του όγκου 5Τ4, πριν και μετά την εξάντληση των Treg. Στο σύνολό της, η εξάντληση των Treg αποκάλυψε κάποιες απαντήσεις σε αντιγόνα ανάκλησης σε ασθενείς CRC και τους ελέγχους (Σχήμα 4β). Ωστόσο, στην περίπτωση του όγκου συναφές αντιγόνο 5Τ4, υπήρχε μια έντονη διαφορά ανάμεσα στους ελέγχους και τους ασθενείς CRC. Μια 5Τ4-ειδικό

ex vivo

απάντηση βρέθηκε στο 1/11 των υγιών μαρτύρων και η εξάντληση των Treg ενισχυμένη αυτή την απάντηση. Ενώ η εξάντληση των Treg επαυξημένης το 5Τ4-ειδική απόκριση σε 1/14 των ασθενών CRC, η εξάντληση του πληθυσμού αυτού οδήγησε στην

αποκάλυψη

μιας απόκρισης 5Τ4 σε 5/14 των ασθενών που δοκιμάστηκαν (95% διάστημα εμπιστοσύνης για ζεύγη διαφορών είναι -0,83 -0,22 να αποκαλύπτουν μια σημαντική διαφορά σε 5Τ4 αποκρίσεις μεταξύ των ασθενών CRC και υγιείς μάρτυρες). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι Treg οι καταστολή των αντι-5Τ4 ανοσοαποκρίσεις ειδικά σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Αυτοί οι έξι ασθενείς οι οποίοι επέδειξαν αυξημένες αποκρίσεις 5Τ4 είχαν παρόμοιες συχνότητες Treg στο περιφερικό αίμα (εύρος 0,82 έως 2,35% μέσο 1,14%) στις συχνότητες μετρήθηκαν σε ολόκληρο τον πληθυσμό CRC (μέση τιμή 1,13%). Ενώ IFN-γ-απελευθέρωσης, που μετράται απευθείας

ex vivo

, επέτρεψε απαντήσεις αντι-5Τ4 να εντοπιστεί, δεν βρήκαμε έντονη πολλαπλασιαστικές αποκρίσεις σε 5Τ4 είτε CRC ασθενείς ή τους μάρτυρες. Ωστόσο, με διάφορους γύρους επαναδιέγερση και την προσθήκη του IL-2, έχουμε μεγαλώσει έξω HLA-DR-περιορισμένο 5Τ4-ειδικές γραμμές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) PBMC καθαρίστηκαν και δύο δείγματα που παρασκευάστηκαν: ολόκληρη PBMC και PBMC εξαντλημένο των CD25

hi κύτταρα. (B) Σύνολο PBMC και CD25

hi-εξαντλημένο PBMC από 11 ελέγχους της ίδιας ηλικίας (ανοιχτό μπαρ) και 14 ασθενείς CRC (μπάρες) είχαν συσταθεί παράλληλα με μια IFN-γ δοκιμασία ELISPOT (3.5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) με PPD (άνω γραφική παράσταση), ΗΑ (μεσαίο διάγραμμα) ή 5Τ4 (κάτω διάγραμμα). Ο αριθμός των ασθενών που ανταποκρίθηκαν δείχνεται για κάθε αντιγόνο. Σε κάθε περίπτωση, το ποσοστό στα αριστερά είναι η συχνότητα των διασωστών που αυξήθηκαν μετά την εξάντληση Treg (Αύξηση), το ποσοστό στη μέση είναι η συχνότητα της μη ανταποκρινόμενοι που είχε μια απάντηση μετά την εξάντληση (Νέα Response) και σχετικά με το δικαίωμα της συχνότητα των διασωστών που έδειξαν μείωση ή καμία αλλαγή στην απόκριση μετά την εξάντληση Treg (μείωση /NC). Το 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης για τις συζευγμένες διαφορές των αναλογιών μεταξύ ασθενών και μαρτύρων είναι -0,83 έως -0,22 αποκαλύπτοντας μια σημαντική διαφορά για 5Τ4 απαντήσεις. (Γ) Οι 6 ασθενείς CRC με αποκρίσεις σε 5Τ4 φαίνονται με περισσότερες λεπτομέρειες. Οι μπάρες αντιπροσωπεύουν τα κύτταρα που σχηματίζουν κηλίδες /10

6 PBMC μετά την αφαίρεση των κηλίδων φόντου, ολόκληρο το PBMC (ανοιχτό γκρι) και CD25

hi-εξαντλημένο PBMC (σκούρο γκρι). Απαντήσεις παρατηρήθηκαν μόνο σε CD25

hi-εξαντλημένο PBMC των ασθενών 1-5, ενώ παρατηρήθηκε μια απάντηση και στους δύο πληθυσμούς PBMC από ασθενή 6. Σε όλες τις αναλύσεις, τα φρεάτια στήθηκαν εις διπλούν.

Η

Συζήτηση

Είμαστε σε σύγκριση με τη συχνότητα των προσεκτικά ορίζεται CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Treg) σε ασθενείς CRC με υγιείς μάρτυρες ίδιας ηλικίας και οι ασθενείς IBD. ασθενείς CRC έχουν αυξημένη συχνότητα Treg και υπάρχουν ενδείξεις ότι αυτές οι αντικαρκινικές ανοσολογικές αποκρίσεις στόχο Treg.

αξιολογηθεί κατά πόσο ενισχυμένη αριθμούς των Treg στους ασθενείς CRC συσχετίζεται με τη γενική ανοσοκαταστολή. Ένας συνδυασμός ΙΡΝ-γ προσδιορισμούς ELISPOT και προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού για την παρακολούθηση αποκρίσεων στην ανάκληση αντιγόνα PPD και ΗΑ, αποδεικνύεται εξίσου ισχυρή αποκρίσεις σε ασθενείς CRC και υγιείς μάρτυρες, υποδεικνύοντας ότι ανοσοαποκρίσεις προς αντιγόνα μη-όγκου είναι άμεμπτης σε ασθενείς CRC.

το μοτίβο της ανοσολογικής αντιδραστικότητας ήταν εντυπωσιακά διαφορετική μεταξύ CRC ασθενείς και υγιείς μάρτυρες όταν ανοσοαποκρίσεων προς το σχετιζόμενο με όγκο ογκο-εμβρυϊκού αντιγόνου, 5Τ4, συγκρίθηκαν. 5Τ4-ειδικές αποκρίσεις παρατηρήθηκαν σε αναλογία υγιών ελέγχων, αλλά αυτές οι αποκρίσεις ήταν σε μεγάλο βαθμό αναλλοίωτη από εξάντληση Treg. Σε αντίθεση, μία 5Τ4-ειδική απόκριση ανιχνεύθηκε σε περισσότερο από το ένα τρίτο των ασθενών CRC μόνο μετά την αφαίρεση των Treg, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι Treg εις το CRC ασθενείς καταστέλλουν την ογκο-ειδική ανοσολογική απόκριση. Αυτή η ομάδα των ασθενών CRC που διαδήλωσαν απαντήσεις αντι-5Τ4 μετά την εξάντληση Treg φαίνεται να έχουν παρόμοιες συχνότητες Treg σε σύγκριση με τη συνολική ομάδα CRC, αν και μεγαλύτερες μελέτες θα πρέπει να το επιβεβαιώσει. Από 5Τ4-αποκρίσεις δεν αποκάλυψε με εξάντληση Treg σε υγιείς ελέγχους, αυτά τα δεδομένα δείχνουν επίσης ότι τα κύτταρα Treg ικανά να καταστείλουν 5Τ4-ειδικές αποκρίσεις αναπτυχθεί σε απόκριση προς τον όγκο. Ο ακριβής μηχανισμός μέσω του οποίου αυτό συμβαίνει δεν είναι σαφής επί του παρόντος, αλλά είναι πιθανό ότι το περιβάλλον κυτοκίνη εντός του όγκου προάγει την παραγωγή των Treg αναγνωρίζουν αντιγόνα που σχετίζονται με όγκους. Πρόσφατες αναφορές δείχνουν ένα ρόλο για τον ΤΟΡβ στην επέκταση της Treg [24], [25]. Σε ένα μοντέλο όγκου τρωκτικού έχει δειχθεί ότι μόνο τα δενδριτικά κύτταρα (DCs) από φέροντα όγκο, αλλά όχι χωρίς όγκο ζώα προάγει πολλαπλασιασμό Treg. Ενδιαφέρον ΑΧ από ζώα άνευ όγκου θα μπορούσε να επεκταθεί Treg, αλλά μόνο αν προ-επωάστηκαν με τα υπερκείμενα των κυττάρων του όγκου. θα μπορούσε να ανασταλεί Αυτά τα αποτελέσματα

in vitro

χρησιμοποιώντας αντι-ΤΟΡβ αντισώματα [26]. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι Treg απαιτούν τόσο ενός όγκου αντιγόνου-ειδική διέγερση και κυτοκίνες, όπως ΤΟΡβ, προκειμένου να πολλαπλασιαστούν και να καταστείλει αντικαρκινικές ανοσοαπαντήσεις.

5Τ4 είναι ένας ελκυστικός υποψήφιος για εμβόλια όγκου, όπως είναι εκφράζεται σε πολλούς επιθηλιακούς όγκους. Ωστόσο, αυτή η μελέτη προτείνει ότι Treg αναγνωρίζουν το αντιγόνο και ενδεχομένως να παίζει ρόλο στην καταστολή αποκρίσεων κατά του όγκου, προφανώς εις βάρος του ατόμου. Δύο άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι Treg αναγνωρίζουν αντιγόνα όγκου (LAGE-1 και ARTC-1) σε υποκείμενα με μελάνωμα [27], [28]. Είναι σημαντικό να εξασφαλιστεί ότι οι στρατηγικές εμβολίου με χρήση αντιγόνων που σχετίζονται με όγκο δεν ενισχύσει το ρυθμιστικό βραχίονα του ανοσοποιητικού συστήματος αναστέλλοντας έτσι τις πιθανές ανοσία κατά του όγκου. Μια προσέγγιση μπορεί να είναι να καταστρέφουν Treg πριν από τον εμβολιασμό, όπως αποδείχθηκε πρόσφατα για το καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων [29]. Θα είναι μεγάλο ενδιαφέρον, επομένως, να καθοριστεί σε μελλοντικές μελέτες κατά πόσον μια τέτοια στρατηγική θα οδηγήσει σε μετρήσιμες κλινικές αποκρίσεις σε ασθενείς με CRC.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελα να ευχαριστήσω τον καθηγητή Robert Newcombe, Τμήμα Επιδημιολογίας, στατιστικής και Δημόσιας Υγείας του Πανεπιστημίου του Κάρντιφ για στατιστικούς συμβουλές.