Αφηρημένο

Σε ανθρώπινους καρκίνους, η μεθυλίωση της μακράς διάσπαρτες πυρηνικό στοιχείο -1 ρετροτρανσποζόνια (L1 LINE-1 ή) μειώνεται. Αυτό συμβαίνει στο πλαίσιο του γονιδιώματος ευρείας υπομεθυλίωσης, και παρόλο που είναι κοινός, ο ρόλος του είναι ελάχιστα κατανοητή. L1s διανέμονται ευρέως τόσο εντός όσο και εκτός των γονιδίων, ενδογονικοί και διαγονιδιακή, αντίστοιχα. Είναι ενδιαφέρον ότι η εισαγωγή των ενεργών αλληλουχιών L1 πλήρους μήκους σε ιντρόνια γονίδιο ξενιστή διαταράσσει την έκφραση του γονιδίου. Εδώ, θα αξιολογηθεί αν ενδογονικοί L1 υπομεθυλίωση επηρεάζει την έκφρασή τους γονίδιο υποδοχής στον καρκίνο. Πρώτον, έχουμε εξάγονται δεδομένα από L1base (https://l1base.molgen.mpg.de), μια βάση δεδομένων που περιέχει πιθανώς ενεργά παρεμβολές L1, και σε σύγκριση ενδογονικοί και διαγονιδιακές χαρακτήρες L1. Βρήκαμε ότι οι ενδογονικοί αλληλουχίες L1 συντηρηθεί σε όλη την εξελικτική χρονικά σε σχέση με μεταγραφική δραστηριότητα και θέσεις δινουκλεοτίδιο CpG για μεθυλίωσης του DNA των θηλαστικών. Στη συνέχεια, συγκρίναμε ρυθμίζονται τα επίπεδα mRNA των κυττάρων από δύο διαφορετικά πειράματα διαθέσιμα από την έκφραση γονιδίων Omnibus (GEO), μια αποθήκη βάση δεδομένων γονιδιακής έκφρασης υψηλής απόδοσης, (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) από chi-square. Η αναλογία πιθανοτήτων των γονιδίων κάτω-ρυθμίζονται μεταξύ απομεθυλιωμένο φυσιολογικό βρογχικό επιθήλιο και καρκίνο του πνεύμονα ήταν υψηλή (p & lt? 1Ε

-27? OR = 3,14? 95% CI = 2,54 – 3,88), γεγονός που υποδηλώνει γονιδιώματος του καρκίνου ευρύ υπομεθυλίωση κάτω ρύθμισης του γονιδίου έκφραση. Πλήρης ανάλυση μεταξύ των θέσεων L1 και την έκφραση του γονιδίου έδειξαν ότι η έκφραση των γονιδίων που περιέχουν L1s είχαν σημαντικά μεγαλύτερη πιθανότητα να κατασταλεί στον καρκίνο και υπο-μεθυλιώνεται φυσιολογικά κύτταρα. Σε αντίθεση, πολλά mRNAs που προέρχονται από γονίδια που περιέχουν L1s αυξημένα σε Argonaute 2 (ago2 ή EIF2C2) -depleted κύτταρα. αύξηση μεθυλιωμένος L1s επιπέδων L1 mRNA. Τέλος, βρήκαμε ότι οι στόχοι ago2 ιντρονική L1 pre-mRNA σύμπλοκα και καταστέλλει τα γονίδια του καρκίνου. Τα ευρήματα αυτά αντιπροσωπεύουν έναν από τους μηχανισμούς της έκφρασης του γονιδίου αλλοίωσης ευρύ υπομεθυλίωσης γονιδιώματος του καρκίνου. Μεθυλιωμένος ενδογονικοί L1s είναι μια πυρηνική siRNA μεσολαβεί

cis-ρυθμιστικών

στοιχείο που μπορεί να καταστείλουν τα γονίδια. Αυτή η επιγενετική ρύθμιση της ρετροτρανσποζόνια πιθανό επιρροές πολλές πτυχές της γονιδιωματικής βιολογίας

Παράθεση:. Aporntewan C, Phokaew C, Piriyapongsa J, Ngamphiw C, Ittiwut C, Tongsima S, et al. (2011) υπομεθυλίωση του ενδογονικοί LINE-1 καταστέλλει τη μεταγραφή σε καρκινικά κύτταρα μέσω ago2. PLoS ONE 6 (3): e17934. doi: 10.1371 /journal.pone.0017934

Επιμέλεια: Esteban Ballestar, Bellvitge Ινστιτούτο Βιοϊατρικών Ερευνών (IDIBELL), Ισπανία

Ελήφθη: 14 του Σεπτέμβρη του 2010? Αποδεκτές: 18η Φεβρουαρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 15 Μάρτη, 2011

Copyright: © 2011 Aporntewan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή υποστηρίζεται εν μέρει από το Ταμείο Ταϊλάνδη Έρευνας (TRF), το Εθνικό Κέντρο Γενετικής της Εθνικής Υπηρεσίας Επιστήμης και Τεχνολογίας Ανάπτυξης Μηχανικής και Βιοτεχνολογίας (BIOTEC), (NSTDA), το Four Seasons Hotel Bangkok και της Ταϊλάνδης Ερυθρού Σταυρού 4ο Cancer Care φιλανθρωπία και το Πανεπιστήμιο Chulalongkorn. Chureerat Phokaew υποστηρίζεται από ένα διδακτορικό Βασιλικό Χρυσό Ιωβηλαίο επιχορήγησης (PHD /0190/2550), η γαλλική πρεσβεία στην Ταϊλάνδη και το Πανεπιστήμιο Chulalongkorn. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

στον καρκίνο, μεθυλίωση του DNA στο υπόλοιπο του γονιδιώματος, ιδιαίτερα σε μια μακρά διανθίζονται στοιχείο-1 (LINE-1 ή L1) ρετρομεταθετόνιου πυρηνικών, γενικά εξαντληθεί και το γεγονός αυτό συμβαίνει στο πλαίσιο του γονιδιώματος ευρείας ή παγκόσμια υπομεθυλίωση [1], [2], [3]. Παγκόσμια υπομεθυλίωση μπορεί να παίξει διάφορους ρόλους στην πολυσταδιακή καρκινογένεση. Συνηθέστερα αναγνωρισμένος αποτέλεσμα είναι να διευκολύνει χρωμοσωμική αστάθεια [4], πιθανώς με τη μεσολάβηση μεθυλιωμένος γονιδιώματος που συνδέεται αντιγραφή ανεξάρτητη σφάλμα διάλειμμα DNA διπλής έλικος επιρρεπείς επισκευή [5], [6]. Πρόσφατα, υπάρχει μια αναφορά ότι υπομεθυλίωση ενός L1 ενεργοποιεί εναλλακτική υποστηρικτής της ΚΟΑ ογκογονιδίου [7]. Ωστόσο, ο ρόλος του παγκόσμιου μεθυλίωσης L1, επί της έκφρασης γονιδίου ευρύ γονιδιώματος, λιγότερο συχνά μελετηθεί και ως εκ τούτου δεν είναι καλά χαρακτηρισμένα.

μεθυλίωση του DNA είναι ένα θεμελιώδες χαρακτηριστικό μοριακό του ανθρώπινου γονιδιώματος, και τις μεταβολές του παρόντος επιγενετική ρύθμιση σχετίζεται με καρκίνους [2]. Οι επιδράσεις της μεθυλίωσης υποκινητή με τη διαμόρφωση της χρωματίνης και της μεταγραφής γονιδίου έχουν καλά τεκμηριωμένες [8]. Σε αντίθεση, οι μηχανισμοί, πως μεθυλίωσης του DNA εντός ενός γονιδίου (γονίδιο μεθυλίωσης σώμα) ελέγχει την έκφραση του γονιδίου, είναι λιγότερο γνωστά. γονιδιακές αλλαγές σώμα μεθυλίωσης μπορεί να έχουν πολλές συνέπειες. Οι Μοναδικές μεθυλιωμένες αλληλουχίες σε εσώνια βρίσκονται συχνά σε εντόνως εκφρασμένα γονίδια [9]. Σε αντίθεση, ο σχηματισμός ετεροχρωματίνης από πυκνά ενδογονικοί μεθυλίωσης του DNA περιορίζει την αποτελεσματικότητα της RNA πολυμεράσης [10]. Παρ ‘όλα αυτά, αυτές οι αποδείξεις υπονοείται ότι η μεθυλίωση του ενδογονικοί επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, συμπεριλαμβανομένων L1s, μπορεί επίσης να είναι σημαντική για τη διατήρηση της φυσιολογικής λειτουργίας των συνδεδεμένων γενωμικού loci.

L1s επίσης ευρέως κατανεμημένη στο γονιδίωμα [11]. εισαγωγή L1 έχει αρκετά δυνητικά λειτουργικές συνέπειες [12]. Είναι αξιοσημείωτο ότι L1s δεν είναι ομοιόμορφα κατανεμημένη [11] και πολλοί εξαιρούνται από περιοχές του γονιδιώματος που περιέχουν γονίδια καθαριότητας [13]. Ένα γενετικά in vitro μελέτη απέδειξαν ότι η εισαγωγή των ενεργών αλληλουχιών L1 σε ιντρόνια γονίδιο ξενιστή διαταράσσει την έκφραση του γονιδίου [14]. Καθ ‘όλη την εξέλιξη, γεγονότα ρετρομετάθεσης παράγονται & gt? 500.000 αντίγραφα του L1 στο ανθρώπινο γονιδίωμα [15]. Ωστόσο, δεν είναι όλες οι L1s είναι πλήρους μήκους και ενεργό? πιο περικόπτονται. Υπάρχουν 80-100 ρετρομετάθεση-αρμόδιες L1s στο ανθρώπινο γονιδίωμα, αλλά μόνο έξι από αυτές πιστεύεται ότι αποτελούν τη βάση όλων των ιστορικών γεγονότων ρετρομετάθεσης [16]. Περισσότεροι από 10.000 L1s είναι μεγαλύτερο από 4,5 kb και περιέχει ένα 5 ‘UTR, δύο ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης και ένα 3’ UTR που διαθέτει ένα σήμα πολυαδενυλίωσης [17]. Περισσότεροι από 2.000 από αυτούς L1s είναι ενδογονικοί, και κατοικούν σε περισσότερες από 1.000 γονίδια.

Πρόσφατα, αξιολογήσαμε τα μοτίβα μεθυλίωσης των 5 ‘UTRs της L1 αλληλουχιών [1], [18] και διαπίστωσε ότι η μεθυλίωση επίπεδα ποικίλουν σε κάθε τόπο και σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων σε κύτταρα άγριου τύπου. Σε ανθρώπινους καρκίνους, η μεθυλίωση του L1 ρετροτρανσποζόνια μειώνεται μεταβλητά [1], [18], [19]. Η απώλεια του γονιδιώματος ευρείας L1 μεθυλίωση σε καρκινικά κύτταρα παρουσιάζεται ως μια γενικευμένη διαδικασία. Ωστόσο, το L1 μεθυλίωση επηρεάζεται από τη θέση του στο γονιδίωμα [18]. Για παράδειγμα, σε διαφορετικές L1s εσώνια των ίδιων γονιδίων είναι γενικά τροποποιημένα με παρόμοιο τρόπο [18]. L1 υπομεθυλίωση συσχετίζεται με ορισμένες κυτταρικές φαινοτύπους. Στον καρκίνο, το L1 υπομεθυλίωση συνδέεται άμεσα με πολυσταδιακή καρκινογένεση και επιθετικών καρκίνων με φτωχή πρόγνωση [1], [20], [21], [22], [23], [24]. Επιπλέον, σε φυσιολογικά κύτταρα μεθυλίωση της L1 μπορεί να μεταβληθεί σε σχέση με ορισμένες κυτταρικές φαινότυπους όπως υψηλού κινδύνου καρκίνου, διαφοροποίηση ιστών και διαιτητικά [25], [26], [27], [28], [29], [30] , [31], [32], [33]. Είναι ενδιαφέρον, διασπείρω επαναλαμβανόμενη αλληλουχία (IRS) τα πρότυπα υπομεθυλίωση είναι διαφορετικά σε κύτταρα με διαφορετικούς φαινοτύπους. Για παράδειγμα, Alu υπομεθυλίωση βρίσκεται συνήθως σε γήρανση κύτταρα, αλλά L1 υπομεθυλίωση δεν είναι [34]. Αυτές οι γραμμές των αποδεικτικών στοιχείων μας οδηγεί να υποθέσουμε ότι χιλιάδες γονίδια μπορούν να ρυθμίζονται από ενδογονικοί υπομεθυλίωση L1 σε καρκινικά κύτταρα.

Εδώ, έχουμε εξαγάγει τα δεδομένα από L1base (https://l1base.molgen.mpg.de) [ ,,,0],17], μια βάση δεδομένων που περιέχει υποθετικά ενεργό παρεμβολές L1, να συγκρίνουν ενδογονικοί και διαγονιδιακές χαρακτήρες L1. Στη συνέχεια, σε σύγκριση με τα επίπεδα του mRNA από μεθυλιωμένος φυσιολογικά κύτταρα και βιβλιοθήκες σειρά έκφρασης του καρκίνου, που διατίθεται από την έκφραση γονιδίων Omnibus (GEO), μια αποθήκη βάση δεδομένων γονιδιακής έκφρασης υψηλής απόδοσης, (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) [35], [36]. Τέλος, πλήρης αναλύσεις μεταξύ τοποθεσιών L1 και το γονιδίωμα ευρύ γονιδιακής έκφρασης διεξήχθησαν για να αξιολογηθεί γονίδιο ρυθμιστικών μηχανισμών της διαγονιδιακής L1s στον καρκίνο.

Αποτελέσματα

ενδογονικοί και διαγονιδιακές αλληλουχίες L1 δείχνουν διακριτά δομικά χαρακτηριστικά

παραλλαγές Ακολουθία του κάθε καιρό L1 ταξινομούνται σύμφωνα με την εξελικτική περίοδο και τη δραστηριότητα ρετρομετάθεση [17]. Εδώ, αναλύσαμε εάν L1s διακρίνονται ανάλογα με τις θέσεις, εάν οι αλληλουχίες είναι εντός γονίδια, ενδογονικοί, ή μεταξύ γονιδίων, διαγονιδιακή (Εικ. 1Α). Διάφορα χαρακτηριστικά που περιγράφονται στο L1base [17], συμπεριλαμβανομένων χρωμοσωμική τοποθεσία, υποοικογένεια, ακολουθία και νησίδες CpG, του 9355 διαγονιδιακή L1s και 2546 ενδογονικοί L1s βρέθηκαν σε 1.454 γονίδια αξιολογήθηκαν με 218 chi-square τεστ και 18 t-tests (Στήριξη Πίνακας S1 και S2). Παραδείγματα ενός τεστ chi-square και ένα t-test αποδείχθηκε (Εικ. 1Β και 1Γ). Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι υπάρχουν πολλά διαρθρωτικά χαρακτηριστικά της ενδογονικοί L1s που είναι διακριτές από διαγονιδιακές L1s (Εικ. 1 και Υποστήριξη Πίνακας S2). 100 εξετάσεις chi-square αναλύονται παραλλαγές των αλληλουχιών που καθορίζουν L1 μεταγραφικές και retrotranspositional δραστηριότητα και την παρουσία των CpG νησίδων και 57 των δοκιμών ήταν σημαντικά διαφορετικές σε τιμές ρ & lt? 0.001 (Εικ. 1 D και Υποστήριξη Πίνακας S2). Αυτές οι δοκιμές έδειξαν την επικράτηση των συντηρημένων αλληλουχιών των ενδογονικοί L1s ήταν πάντα υψηλότερες από διαγονιδιακές L1s ενώ όλες οι μεταλλαγμένες αλληλουχίες ήταν πιο συχνές σε διαγονιδιακές L1s (Εικ. 1D και Στήριξη Πίνακας S2). Επιπλέον, συχνότερες CpG νησίδες παρατηρήθηκαν σε ενδογονικοί L1s (Εικ. 1 D και Υποστήριξη Πίνακας S2). Το εύρημα αυτό υποστηρίχθηκε με σύγκριση βοήθεια 18 χαρακτηριστικά με t-test (Εικ. 1 C, 1 Ε και Υποστήριξη Πίνακας S2). Διαγονιδιακές L1s περιέχουν περισσότερα νουκλεοτίδια, μετατοπίσεις πλαισίου, κενά Α και Τ και κωδικόνια τερματισμού. Σε αντίθεση, ενδογονικοί L1s περιέχουν υψηλότερα περιεχόμενα G-C και βαθμολογία ακεραιότητα (Εικ. 1 Ε και Υποστήριξη Πίνακας S2). Εν κατακλείδι, οι ενδογονικοί αλληλουχίες L1 συντηρηθεί σε όλη την εξελικτική χρονικά σε σχέση με μεταγραφική δραστηριότητα και θέσεις δινουκλεοτίδιο CpG για μεθυλίωσης του DNA των θηλαστικών. Τα ευρήματα αυτά σιωπηρή φυσιολογικές λειτουργίες του ενδογονικοί L1 μεθυλίωσης.

Α) L1s χωρίστηκαν σε δύο κατηγορίες, ενδογονικοί και διαγονιδιακές L1s που αντιπροσωπεύονται από μπλε και κόκκινα βέλη, αντίστοιχα. Β) Οι διαφορές στα δομικά χαρακτηριστικά μεταξύ των ομάδων L1 αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ chi-square, για την κατηγορηματική χαρακτηριστικά και C) homoscedastic

t-test

για μη κατηγορηματική χαρακτηριστικά. Δ) 100 p-τιμές του chi-square τεστ των τριών κατηγοριών L1 χαρακτήρες ακολουθίας, οι συντηρημένες ακολουθίες, οι μεταλλαγμένες αλληλουχίες και η παρουσία των CpG νησίδων, που βρίσκονται υπερεκπροσωπούνται ή υποεκπροσωπούνται σε ενδογονικοί L1s είχαν εμφανιστεί, ενδογονικοί L1s & gt? Διαγονιδιακές L1s και διαγονιδιακές L1s & gt? ενδογονικοί L1s, αντίστοιχα. Ε) 18 p-τιμές του t-τεστ του L1 χαρακτήρες που υπερεκπροσωπούνται και υποεκπροσωπούνται στην ενδογονικοί L1s παρουσιάστηκαν σε μπλε, εντός & gt? Μεταξύ, και κόκκινο χρώμα, μεταξύ & gt? Ενδο, αντίστοιχα

Η

ενδογονικοί. L1s καταστέλλουν τα γονίδια στα κύτταρα του καρκίνου

L1s είναι μεθυλιωμένος σε πολλές μορφές καρκίνου [1]. Για να διερευνηθεί κατά πόσο ενδογονικοί γονίδια υποδοχής έλεγχο L1s στην L1 μεθυλιωμένος καρκινικά κύτταρα, συγκρίναμε την έκφραση του γονιδίου σε καρκίνο μεταξύ των γονιδίων που έχουν ενδογονικοί L1s και τα υπόλοιπα. Γονίδια που έχουν L1s προσδιορίστηκαν από L1base [17] και τα δεδομένα μικροσυστοιχιών έκφραση είναι δημοσίως διαθέσιμα δεδομένα από την GEO [35], [36]. Κάθε γονίδιο που ταξινομούνται από 2 φοιτητή t-tests, πάνω και κάτω κανονισμούς. Αν ο μέσος όρος της ομάδας του καρκίνου ήταν στατιστικά υψηλότερη ή χαμηλότερη από την κανονική ομάδα, το γονίδιο ταξινομήθηκε ως ανάντη ή προς τα κάτω ρυθμισμένα, αντίστοιχα. Αν t-test δεν ήταν στατιστικά σημαντική, το γονίδιο είχε χαρακτηριστεί ως μη προηγούμενους ή όχι προς τα κάτω ρυθμισμένα, αντίστοιχα. Η κατανομή των γονιδίων που διαθέτουν L1s η οποία έδειξε την αυξημένη έκφραση σε καρκινικά συγκρίθηκε με την υπόλοιπη γονιδίου καθορίζεται από chi-square τεστ (Εικ. 2Α). Η ίδια ανάλυση πραγματοποιήθηκε για τα γονίδια με μειωμένη έκφραση στον καρκίνο (Σχ. 2Β). Το Σχήμα 2Α και 2Β καταδεικνύεται παραδείγματα chi-square τεστ της γονιδιακής έκφρασης σε καρκίνο του στομάχου. Γονίδια που διαθέτουν ενδογονικοί L1s βρέθηκαν λιγότερο πιθανό να είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα (αναλογία πιθανοτήτων (OR) = 0.61, ρ = 3.04E-06) (Σχ. 2Α). Επιπλέον, η έκφραση των γονιδίων που περιέχουν L1s ήταν πιο συχνά μειωμένη (OR = 1.64, ρ = 2.66E-13) (Εικ. 2Β). Ενδογονικοί L1s μπορεί να ελέγχει εκατοντάδες γονίδια. Μεταξύ 1340 γονιδίων που περιέχουν L1s, 1242 γονίδια δεν είχαν επάνω ρυθμισμένη και 304 γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω (Σχ. 2Α και 2Β). Ανάλυση ενός αριθμού συστοιχιών έκφρασης έδειξε παρόμοια αποτελέσματα. Δοκιμάσαμε κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, τα κύτταρα των πνευμόνων adrenocarcinoma, καρκίνο του ήπατος, κύτταρα καρκίνου του μαστού, πορογενές και λοβιακό καρκίνο του μαστού, situ καρκίνωμα της ουροδόχου κύστεως, μικροδορυφόρων ασταθή γαστρικό καρκίνο, μετάσταση καρκίνου του προστάτη. Βρήκαμε ότι τα γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω σε καρκίνο του τραχήλου, κύτταρα πνεύμονα adrenocarcinoma, κύτταρα καρκίνου του μαστού, πορογενές και λοβιακό καρκίνο του μαστού, situ καρκίνωμα της ουροδόχου κύστεως, μικροδορυφόρων ασταθή γαστρικού καρκίνου είναι πιο πιθανό να περιέχουν L1s. Επιπλέον, τα γονίδια με υψηλότερα επίπεδα έκφρασης στο κεφάλι και το λαιμό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα, ο καρκίνος του ήπατος, κύτταρα καρκίνου του μαστού, situ καρκινώματος της ουροδόχου κύστης, μικροδορυφόρων ασταθή γαστρικό καρκίνο, μετάσταση καρκίνου του προστάτη είναι λιγότερο πιθανό να έχουν L1s (Υποστηρικτικά Πίνακας S3 και το Σχ . 2C). Ως εκ τούτου, ενδογονικοί L1s μπορεί να καταστείλουν γονίδια υποδοχής σε αυτούς τους καρκίνους. Αν και in vitro εισαγωγή δραστικών αλληλουχιών L1 σε ιντρόνια γονίδιο ξενιστή διαταράσσεται γονιδιακή έκφραση [14], τα περισσότερα επίπεδα mRNA από τα γονίδια που περιέχουν L1 δεν ήταν απούσες (Υποστηρικτικά Εικ. S1). Εξάλλου, η σύγκριση των γονιδίων στον καρκίνο, όπως περιγράφεται στη στήριξη πίνακα S3.1 S3.9-, έδειξε ότι η πιθανότητα των γονιδίων που περιέχουν L1 να είναι συνήθως ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ανεξάρτητα πειράματα είναι υψηλότερη από γονίδια χωρίς L1 (ρ-τιμή = 7.99E-08, μέση L1 = 1,6642, σημαίνει ότι δεν L1 = 1,4861) (Υποστήριξη Εικ. S2). Αυτές οι αναλύσεις που υποστηρίζονται βιολογική σημασία της ενδογονικοί L1s στη ρύθμιση των γονιδίων στον καρκίνο.

Α) και Β) είναι chi-τετράγωνο 2 × 2 πίνακες, σ τιμές και αναλογίες πιθανοτήτων, συγκρίνοντας τις αναλογίες του γαστρικού γονίδια του καρκίνου που έχουν L1s μεταξύ up – ( «Up») ή κατάντη ( «Down») ρυθμίζονται και όχι πάνω ή προς τα κάτω δεν ρυθμίζονται ομάδες, αντίστοιχα. C) Ποσοστό L1 περιέχουν mRNAs που είναι ανάντη ή προς τα κάτω ρυθμισμένα σε διάφορους τύπους καρκίνου. Δ) EPHA3 mRNA και L1-EPHA3-IVS5 και IVS15 επίπεδα μεθυλίωσης στα κύτταρα WSU-ΗΝ και Aza-dC επεξεργασμένο WSU-HN17s. Ε) Δύο chi-τετράγωνο 2 × 2 πίνακες, σ τιμές και αναλογίες πιθανοτήτων, συγκρίνοντας αναλογίες hBECs Aza-ΟΟ-επεξεργασμένα ή hMSCs γονίδια που έχουν L1s μεταξύ ρυθμίζεται προς τα κάτω ( «Down») και όχι προς τα κάτω-ρυθμίζονται ομάδες, αντίστοιχα. ΣΤ)% των mRNAs από τα γονίδια που περιέχουν L1s σε Αζα-dC επεξεργασμένου hBECs και ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού. «Up» και «Down» δείχνουν αυξημένη και μειωμένη έκφραση, αντίστοιχα. GSE αρχεία, τα δείγματα GSM και το είδος των

t-test

και 2 × 2 πίνακες του chi-square δοκιμές που προβλέπονται για τη Στήριξη Πίνακα S3.

Η

Για να αποδείξει το μοτίβο σχέση μεταξύ L1 επίπεδα μεθυλίωσης και γονιδιακής έκφρασης, μετρήσαμε ενδογονικοί επίπεδα μεθυλίωσης L1 και επίπεδο mRNA του γονιδίου ξενιστή. Προηγουμένως, αξιολογήσαμε τα επίπεδα μεθυλίωσης της 17ης ενδογονικοί loci L1 και διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα μεθυλίωσης L1 του L1-EPHA3-IVS5 και L1-EPHA3-IVS15 συσχετίζονται ισχυρώς σε καρκινικά κύτταρα, υποδηλώνοντας locus ειδικός μηχανισμός [18]. Μέτρηση της ενδογονικοί επίπεδα L1-EPHA3 μεθυλίωση και EPHA3 mRNA σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου πλακωδών κυττάρων (HNSCC) κυτταρικές σειρές (WSU-HNS) αποκάλυψε ότι τα χαμηλότερα επίπεδα διαγονιδιακής L1-EPHA3-IVS5 και L1-EPHA3-IVS15 μεθυλίωσης συσχετίζεται με χαμηλότερη EPHA3 επίπεδα του mRNA (Pearson r = 0,7961 και 0,7638, αντίστοιχα? Σχ. 2D). EPHA3 mRNA σε κύτταρα WSU-HN17 ήταν επίσης σημαντικά χαμηλότερη όταν L1-EPHA3 ήταν μεθυλιωμένος (ζεύγη

t-test

? P & lt? 0.001? Σχ. 2D). Ως εκ τούτου, το επίπεδο του mRNA μπορεί να συσχετιστεί άμεσα με ενδογονικοί L1 μεθυλίωσης.

Απώλεια μεθυλίωσης σε κανονικό κύτταρο καταστέλλει τα γονίδια που φιλοξενούν L1s

Μια ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης σε ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (hBECs ) και ανθρώπινα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (hMSCs) μετά από ευρεία απομεθυλίωση γονιδιώματος με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (αζα-dC) θεραπεία εμφάνισε μεγαλύτερη επικράτηση της διαγονιδιακής L1s σε γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω (OR = 1.52, ρ = 0.0017 και OR = 1,62, p = 0,0069, αντίστοιχα) (Σχ. 2Ε, 2F και Υποστήριξη πίνακα S3), κατά τρόπο ενδιαφέροντα, ένα παρόμοιο μοτίβο όπως βρέθηκε στον καρκίνο (Σχ. 2C). Εμείς διερευνηθεί περαιτέρω εάν γονιδιώματος μεγάλη υπομεθυλίωσης γονιδίων που ρυθμίζονται σε καρκίνο. Πραγματοποιήσαμε μια δοκιμή chi-square να προσδιοριστεί η σημασία της επικάλυψης μεταξύ ρυθμισμένα προς τα κάτω γονιδίων σε απομεθυλιωμένο hBECs και στον καρκίνο του πνεύμονα. Γονίδια τα οποία ρυθμίζεται προς τα κάτω σε θεραπεία Αζα-DC στο hBECs βρέθηκαν να έχουν κατά προτίμηση χαμηλότερα επίπεδα mRNA στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα (ρ = 2.67E-28? OR = 3,14? 95% CI = 2,54 – 3,88? Σχήμα 3Α και 3Β και Υποστήριξη Πίνακας S4). Αυτό υποστηρίζει την υπόθεση ότι υπομεθυλίωση κάτω ρυθμίζει γονίδια για τον καρκίνο.

Α) 2 × 2 πίνακες, σ τιμές και τις αποδόσεις αναλογίες και Β) λόγος πιθανοτήτων για mRNAs που υποεκφραζόμενου ( «Down») στον καρκίνο του πνεύμονα και Αζα-dC-κατεργασμένα κύτταρα HBEC σε σύγκριση με μη-Αζα-άΟ-κατεργασμένα κύτταρα HBEC για το (Α και Β) όλων των γονιδίων, (Β) τα γονίδια με L1s (L1) και γονίδια χωρίς L1s (αριθ L1). Β) Η μέση, πάνω και κάτω γραμμές του κάθε κουτιού δύο χρωμάτων είναι η αναλογία πιθανοτήτων και άνω και κάτω του 95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI), αντίστοιχα. Γ) 2 × 2 πίνακες, οι τιμές ρ και αναλογίες πιθανοτήτων και Δ) τα ποσοστά των mRNA που υπο-εκφράζονται ( «Down») και στα δύο Αζα-άΟ-κατεργασμένα κύτταρα και τα καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα γονίδια που δεν ρυθμίζεται προς τα κάτω σε Aza-dC κύτταρα κατεργασμένα ή καρκίνο, για τα γονίδια με και χωρίς L1s (L1 και αριθ L1). Οι αντίστοιχες 2 × 2 πίνακες έκτακτης ανάγκης για Α) και Β) και Γ) και Δ) που παρέχονται για τη στήριξη Πίνακας S4 και S5, αντίστοιχα.

Η

Είναι ενδιαφέρον, υπομεθυλίωση κάτω ρυθμίζει τις δύο ομάδες γονιδίων , με L1 (ρ & lt? 2.59E-04? OR = 3,24? 95% CI = 1,73 – 6,05? Στήριξη Πίνακας S4) και χωρίς L1 (ρ & lt? 2.34E-24? OR = 3,09? 95% CI = 2,46 – 3,87? Στήριξη Πίνακας S4). Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι εκτός από την L1 υπάρχουν και άλλα στοιχεία του DNA μεθυλιωμένο σώμα γονίδιο που ρυθμιζόμενη γονιδιακή έκφραση. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από μία πρόσφατη έκθεση ότι, στη γονιδιακή σώμα, μοναδικές ακολουθίες μεθυλιωμένου είναι πιο επικράτηση σε εντόνως εκφρασμένα γονίδια [9]. Για την περαιτέρω διαφοροποίηση του ρόλου των L1s, συγκρίναμε μεταξύ των γονιδίων με και χωρίς L1s. Βρήκαμε ότι η εκδήλωση του κάτω-ρύθμιση των γονιδίων τόσο Αζα-dC αγωγή hBECs και καρκίνο του πνεύμονα είναι περισσότερο διαδεδομένη σε γονίδια που περιέχουν L1s ό, τι σε γονίδια χωρίς L1. (OR = 2,08, p = 0,009? Σχ. 3C και 3D και Υποστήριξη Πίνακας S5). Ως εκ τούτου, υπομεθυλίωση μειώνει την έκφραση πολλών γονιδίων στον καρκίνο, και ενδογονικοί L1s ενεργεί ως

cis-ρυθμιστικών

στοιχείο μεθυλίωση με μεσολάβηση.

Πολλά γονίδια συχνά μειωτικά σε απεικόνιση του καρκίνου υπερμεθυλιωμένο υποκινητές [8] . Ωστόσο, βρήκαμε καμία σχέση μεταξύ υπερμεθυλίωση προαγωγού στον καρκίνο και την παρουσία ενδογονικοί L1s. Γονίδια με υπερμεθυλιωμένων υποκινητή δειχθεί ότι ρυθμίζονται όταν απομεθυλιώνεται κύτταρα. Η έκφραση των γονιδίων με L1 δεν αυξήθηκε συχνά όταν τα καρκινικά κύτταρα απομεθυλιούνται (Στήριξη Πίνακας S6.1 και S6.2).

L1 υπομεθυλίωση αυξάνει τα επίπεδα L1 RNA

Μέτρηση

μεθυλίωσης και RNA επίπεδα έδειξε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του γονιδιώματος μεγάλη L1 μεθυλίωση και L1 RNA (Pearson r = -0,6955? Σχ. 4Α). Το εύρημα αυτό υποστηρίζει την υπόθεση ότι L1 υπομεθυλίωση αυξάνει RNA μεταγραφή L1 [37]. Οι ιντρονικές γονίδια έχουν προταθεί για να σχηματίσουν σύμπλοκα παρεκκλίνουσα RNA με γονίδια του ξενιστή και, κατά συνέπεια, απενεργοποιούν το γονίδιο ξενιστή μεταγραφής [38]. L1s είναι ρετροενδομετάθεσης στοιχεία που μπορεί να εξακολουθούν να έχουν μεταγραφική δραστικότητα σε ένα σημαντικό αριθμό τόπων [29]. Επιπλέον, ορισμένες L1s μεταγράφονται πέρα ​​θέσεις προσθήκης πολυΑ τους και κατά συνέπεια την παραγωγή χιμαιρικών RNAs που περιλαμβάνουν τόσο L1 ​​και μοναδικά ιντρονικές αλληλουχίες [39]. Θα προβληθεί και βρήκαν L1-EPHA3 RNA από ιντρόνιο 15 του γονιδίου EPHA3 και παρατηρείται μια σημαντική αντίστροφη σχέση μεταξύ L1-EPHA3 RNA και L1-EPHA3 μεθυλίωσης (Pearson r = -0,8686? Εικ. 4Β). Ως εκ τούτου, L1 υπομεθυλίωση οδηγεί σε αυξημένη μεταγραφή L1 και, κατά συνέπεια, παράγει περισσότερο εσωνίου L1 RNA.

Α) Γονιδιώματος μεγάλη L1 μεθυλίωσης και των επιπέδων L1 RNA στα κύτταρα WSU-ΠΝ. Β) Τα επίπεδα L1-EPHA3 μεθυλίωση και L1-EPHA3 RNA.

Η

ενδογονικοί LINE-1 στοιχεία καταστέλλουν τη μεταγραφή στα καρκινικά κύτταρα μέσω ago2

ρετρομεταθετού RNAs ή μεταγραφές που σχηματίζουν δομές dsRNA προκαλέσει συνέλευση RISC [40]. Μετά τη σύνδεση μικρών RNAs παρεμβολής (siRNA), RISC αναγνωρίζει και διασπά συμπληρωματικά μόρια RNA [41]. L1s διαθέτουν μέχρι και τρεις εσωτερικές υποκινητές, στο 5 ‘και 3’ άκρα και στην 5 ‘κατεύθυνση αντινόημα [42], [43], [44]. Οι προαγωγοί και αντιπληροφοριακοί στην 5 ‘UTR παράγουν αμφίδρομη μεταγραφές τα οποία στη συνέχεια υποβάλλονται σε επεξεργασία σε siRNAs για την πρόληψη ρετρομετάθεση [40]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι L1 RNA και ιντρονικές pre-mRNA των γονιδίων που περιέχουν L1s, λόγω της συμπληρωματικότητας των δύο αλληλουχιών, σχηματίζουν dsRNA που μπορεί να στοχεύονται με RISC, συνεπώς καταστρέφουν την ποσότητα του mRNA που προέρχεται από τα γονίδια που περιέχουν L1s. Το συγκρότημα RISC αποτελείται από Dicer, Argonaute και siRNA. Ένα παρόμοιο συγκρότημα με ago2 ενεργεί για να φιμώσουν μεταγραφή του γονιδίου στον πυρήνα [45], [46].

Αν ενδογονικοί L1 RNA μειώνει mRNA του γονιδίου υποδοχής μέσω ago2, ago2 στέρηση πρωτεϊνών θα έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων του mRNA των γονιδίων που φιλοξενεί L1s. Ανάλυση των mRNA μικροσυστοιχιών του ago2 κάτω ρυθμισμένα κύτταρα, AGO2sh [47], έδειξαν ότι η περιορισμένη έκφραση του ago2 σε ένα ανθρώπινο σειρά εμβρυϊκού νεφρού (ΗΕΚ293Τ) οδήγησε σε ένα πρότυπο έκφρασης του γονιδίου που περιέχει L1s που ήταν απέναντι από εκείνη που παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια της L1 υπομεθυλίωση? δηλαδή, ήταν πιο πιθανό να είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα (OR = 1.44, ρ = 0,0004? Σχ. 5Α και 5Β και Υποστήριξη Πίνακας S3). Η Τα siRNAs της DICER1, ago1, AGO3 και AGO4 δεν ρυθμίζουν προς τα πάνω γονίδια με L1 (Στήριξη Πίνακας S6.3-S6.7). Αυτό πρότεινε ότι ago2 περιορίζει κατά προτίμηση την συγκέντρωση των mRNAs που προέρχονται από γονίδια που περιέχουν L1s. Αξιολογήσαμε περαιτέρω ένα πείραμα mRNA μικροσυστοιχιών υβριδοποιήθηκε με ago2 καθιζάνει RNA [48] και διαπίστωσε ότι ago2 δεν μπορεί να υποβαθμίσει άμεσα mRNAs που προέρχονται από γονίδια που περιέχουν L1s. Αν και RISC δεσμεύει και υποβαθμίζει mRNA, mRNAs που προέρχονται από γονίδια που περιέχουν L1s ήταν λιγότερο πιθανό να δεσμεύεται από ago2 (OR = 0.64, ρ = 0.009? Σχ. 5Α και 5Β και Υποστήριξη Πίνακας S3), η οποία ήταν αρχικά έκπληξη δεδομένου τα αποτελέσματα της AGO2sh πειράματα (Σχ. 5Α και 5Β και Υποστήριξη πίνακα S3).

Α) 2 × 2 πίνακες, σ τιμές και αναλογίες πιθανοτήτων και Β) τα ποσοστά της L1 που περιέχουν γονίδια που παρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα mRNA σε AGO2sh επεξεργασμένο κύτταρα ( «Up») ή δεσμεύονται από ago2 σε AGO2IP ( «Bound»), αντίστοιχα. Γ) 2 × 2 πίνακες, σ τιμές και τις αποδόσεις αναλογίες και Δ) αναλογίες πιθανοτήτων (95% CI) συγκρίνοντας ΗΕΚ293Τ mRNA μεταξύ up-ρυθμιζόμενων γονιδίων και δεν up-γονιδίων που ρυθμίζονται κατά AGO2sh και δεσμεύεται από τις πρωτεΐνες ago2 για όλα τα γονίδια (D), γονίδια με L1s (L1) και γονίδια χωρίς L1s (αριθ L1), (C και D). Δ) Η μέση, πάνω και κάτω γραμμές του κάθε κουτιού δύο χρωμάτων είναι οι λόγοι πιθανοτήτων και άνω και κάτω του 95% ΠΙ, αντίστοιχα. Ε) Επίπεδα ago2, EPHA3 mRNA και L1RNA στα κύτταρα WSU-HN17 AGO2si. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SEM. GSE αρχεία, τα δείγματα GSM, το είδος του

t-test

για Α) και Β) δίνονται στον Πίνακα Υποστήριξη S3. Τα 2 × 2 πίνακες έκτακτης ανάγκης για την γ) και δ) δίνονται στον Πίνακα Υποστήριξη S4. ΣΤ) Δύο σενάρια της δέσμευσης αντανακλούν σε διαφορετικά αποτελέσματα σειρά mRNA κατά τη χρήση ago2-IP και AGO2sh ως ανιχνευτές ago2-στόχο. Αρνητικό αποτέλεσμα ήταν αναμενόμενο από mRNA μικροσυστοιχιών έκφρασης χρησιμοποιώντας ago2-IP RNA ως ανιχνευτές, ( «συστοιχία + mRNA ago2-ΠΕ»), όταν στοχευμένη εσώνια του pre-mRNA. Ωστόσο, το θετικό αποτέλεσμα ήταν αναμενόμενο από μικροσυστοιχιών έκφραση του mRNA χρησιμοποιώντας mRNA από AGO2sh ως ανιχνευτές, ( «συστοιχία AGO2sh + mRNA»), ανεξάρτητα από τους στόχους ago2 προ-mRNA ή mRNA.

Η

Κατά τη σύγκριση ago2-δεσμεύεται mRNAs