Αφηρημένο

Το ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) αντιπροσωπεύει βιολογικά επιθετική και χημειο-ανθεκτικά καρκίνους. Λόγω της χαμηλής συγγένειας με τον αποπτωτικό παράγοντα Mcl-1, το ΒΗ3 μιμητικό φάρμακο ΑΒΤ-737 παρέλειψε να ασκήσει ισχυρές δραστηριότητες τον καρκίνο σε ποικιλία μοντέλων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του HCC. Η τρέχουσα μελέτη κατέδειξε ότι ο συνδυασμός ΑΒΤ-737 και Celastrol κατέστειλε συνεργιστικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCC, και απόπτωση που επάγεται η οποία συνοδεύτηκε με την ενεργοποίηση της κασπάσης καταρράκτη και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια. Περαιτέρω μελέτη αποκάλυψε ότι η ενισχυμένη Noxa προκαλείται από Celastrol ήταν ο βασικός παράγοντας για τη συνέργεια, δεδομένου ότι μικρά παρεμβαλλόμενα RNA μεσολάβηση νοκ ντάουν της έκφρασης Noxa στα κύτταρα HCC οδήγησε σε μειωμένη απόπτωση και εξασθενημένα αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις του συνδυασμού. Επιπλέον, η μελέτη μας κατέρρευσε ότι, κατά την έκθεση Celastrol, η ενεργοποίηση του ενδοπλασματικού δικτύου (ER) άγχος, συγκεκριμένα, η οδός eIF2α-ATF4 έπαιξε απαραίτητη ρόλους στην ενεργοποίηση του Noxa, το οποίο ελέγχθηκε από την παρατήρηση ότι η εξάντληση των ATF4 κατήργησε σημαντικά η ανύψωση Noxa από Celastrol. Τα ευρήματά μας αναδεικνύουν ένα μονοπάτι μυθιστόρημα σηματοδότησης μέσω του οποίου Celastrol αυξάνουν την έκφραση Noxa, και προτείνουν την πιθανή χρήση των ATF4 μεσολάβηση ρύθμιση Noxa ως μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για τη βελτίωση των δραστηριοτήτων κατά του καρκίνου του ΑΒΤ-737

Αιτιολογική αναφορά.: Zhu Η, Yang W, Ο Lj, Ding Wj, Zheng L, Liao SD, et al. (2012) προς τα πάνω ρύθμιση Noxa από ER στρες, Celastrol Ασκεί Synergistic Αντικαρκινική Δραστηριότητα σε Συνδυασμό με ΑΒΤ-737 στην Ανθρώπινη ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα κύτταρα. PLoS ONE 7 (12): e52333. doi: 10.1371 /journal.pone.0052333

Επιμέλεια: Tetsuo Takehara, Osaka University Graduate School of Medicine, Ιαπωνία

Ελήφθη: έβδομης Αύγ 2012? Αποδεκτές: 12 του Νοεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 20 του Δεκεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Zhu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν με ευγνωμοσύνη χρηματοδοτική στήριξη από τα θεμελιώδη Κονδυλίων Έρευνας για τις Κεντρικές πανεπιστήμια (Αρ 2011FZA7008) και Zhejiang Provincial Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ Y2110933). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ABT-737 είναι ένας ισχυρός αναστολέας μικρού μορίου, το οποίο στοχεύει το Bcl-2-ρυθμίζονται μονοπάτι της απόπτωσης, που χρησιμεύει ως μια κακή-όπως ΒΗ3 μιμητική. Συνορεύει επιλεκτικά σε Bcl-2, Bcl-XL και Bcl-W, αλλά δεν Mcl-1 και Bfl-1 /Α1. Σε προκλινικές μελέτες, ΑΒΤ-737 έχει δείξει δραστικότητα μονοθεραπεία έναντι διαφόρων λευχαιμία [1], λέμφωμα [2], και μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [3]. Ενώ ΑΒΤ-737 έχει δειχθεί ότι είναι ένας ελπιδοφόρος θεραπευτικός παράγοντας, είναι απίθανο να είναι αποτελεσματική ως μονοθεραπεία σε συμπαγείς όγκους προέκυψε από χαμηλή συγγένεια του με Mcl-1 και υψηλό επίπεδο Mcl-1 έκφραση σε καρκινικά κύτταρα [4] – [7]. Αυτό καθιστά την εξερεύνηση των στρατηγικών συνδυασμού ζωτικής σημασίας για τη βελτίωση της τρέχουσας θεραπείας του ΑΒΤ-737 έναντι του καρκίνου, εκ των οποίων το καυτό ζήτημα είναι να συνδυάσει ΑΒΤ-737 με άλλα φάρμακα τα οποία έχουν την ικανότητα να ρυθμίζουν Mcl-1. Σε προηγούμενες μελέτες μας, βρήκαμε ότι gemcitabine θα μπορούσαν να ενισχύσουν ουβικιτινίωση και την επακόλουθη αποικοδόμηση του Mcl-1, ως εκ τούτου εμφάνισαν συνεργιστική κυτταροτοξικότητα με ΑΒΤ-737 σε πολλαπλούς τύπους καρκινικών κυττάρων [6]. Ομοίως, GDC-0941-προώθηση υποβάθμιση των Mcl-1 ήταν επίσης υπεύθυνη για την συνεργική θανάτωση του καρκίνου του μαστού με ABT-737 [5]. Ως εκ τούτου, η τροποποίηση στις Mcl-1 θα προκαλέσει ευαισθητοποίηση των ΑΒΤ-737 στην ακύρωση κύτταρα.

Η ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνη Noxa είναι σε θέση να αλληλεπιδρούν επιλεκτικά με Mcl-1, στη συνέχεια, αφήστε Bak ή Βαχ από Mcl- 1 για να ενεργοποιηθεί η μιτοχονδριακή μονοπάτι απόπτωσης ή προς στόχους για την αποικοδόμηση του πρωτεασώματος [5] – [8]. Λόγω τυπικό χαρακτηριστικό της, Noxa έχει επισημανθεί ως ένα αποτελεσματικό παράγοντα για την αναστροφή της αντίστασης σε ΑΒΤ-737 η οποία προκαλείται από Mcl-1. Lucas KM et al έδειξε ότι η υπερέκφραση της Noxa ξεπέρασε σε μεγάλο βαθμό αντίστασης ABT-737 σε κύτταρα μελανώματος [9]. Εκτός αυτού, παράγοντες που επάγουν Noxa έχουν επίσης αναφερθεί να ευαισθητοποιούν καρκινικά κύτταρα σε ΑΒΤ-737, συμπεριλαμβανομένων Bortezomib [10], φλουδαραβίνη [11], οξαλιπλατίνη [12], κλπ Πρόσφατα, Dai Y et al κατέδειξαν ότι Celastrol, ένα φυσικό εκχύλισμα με ισχυρή ικανότητες κατά του καρκίνου, μπορεί να οδηγήσει σε επαγωγή Noxa και διάσπαση των Mcl-1 [13], το οποίο προσέλκυσε την προσοχή μας για να εξετάσει τα αποτελέσματα όταν συνδυάζουν αυτό το μέσο με το ABT-737, των οποίων οι δραστηριότητες κατά του καρκίνου ήταν στενά συνδεδεμένη με Mcl -1.

Celastrol είναι μια φαρμακολογικά δραστική ένωση ταυτοποιήθηκε αρχικά από την παραδοσιακή κινεζική ιατρική βροντή του Θεού Αμπέλου εκχυλίσματα ρίζας, και έχει χρησιμοποιηθεί ως φυσική θεραπεία για φλεγμονώδεις καταστάσεις και αντικαρκινική θεραπεία για χρόνια [14]. Ως αναστολέας της HSP90, HSP90 Celastrol διαταράσσεται-Cdc37 αλληλεπίδραση έναντι παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [15], [16], και επέβαλε επιρροή στην απόκριση ER-στρες [17]. Επιπλέον, Celastrol θα μπορούσε να επάγει απόπτωση ενεργοποιώντας Noxa και διαμόρφωση Mcl-1 [13], με λεπτομερείς μηχανισμούς άγνωστη, και η πιθανή εφαρμογή παραμένουν ασαφείς.

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τα δυνητικά συνεργιστική ικανότητες των ABT- 737 σε συνδυασμό με Celastrol σε ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό κυτταρικές γραμμές καρκινώματος, στο οποίο ως επί το πλείστον λιμάνι υψηλό επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης Mcl-1 [18]. Οι συνδυασμός δείκτης (CI) τιμές των αντι-πολλαπλασιαστική δυνατότητες σε δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου ήπατος Bel-7402 και HepG2 ήταν λιγότερο από 0,7, υποδεικνύοντας την συνέργεια του συνδυασμού ΑΒΤ-737 και Celastrol. Επιπλέον, Celastrol ενίσχυσε σημαντικά ΑΒΤ-737 με τη μεσολάβηση απόπτωση σε Bel-7402 και κύτταρα HepG2 με διέγερση έκφρασης Noxa και την αλληλεπίδρασή της με Mcl-1, η οποία εξαρτιόταν από την επαγωγή της απόκρισης ER στρες, συγκεκριμένα, η ενεργοποίηση των ATF4. Σε γενικές γραμμές, η μελέτη μας προσδιορίζεται κατ ‘αρχάς τα συνεργιστικά αποτελέσματα του ΑΒΤ-737 συν Celastrol σε κύτταρα ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, ανοίγοντας τη δυνατότητα του συνδυασμού αυτών των δύο παραγόντων ως ισχυρός θεραπευτικός συνδυασμός, και υπονοώντας ότι η ενεργοποίηση των ER στρες που οδηγούν στο χειρισμό επί Noxa θα μπορούσε χρησίμευσε ως αποτελεσματική στρατηγική για την αναστολή Mcl-1 και έτσι να αυξήσουν τις δραστηριότητες κατά του καρκίνου του ΑΒΤ-737.

προσδιορισμοί ΜΤΤ χρησιμοποιήθηκαν για να εξετάσουν τις ανασταλτικές δραστηριότητες κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε ανθρώπινα καρκίνο του ήπατος Bel-7402 ( Α) και τα κύτταρα HepG2 (Β). Κύτταρα σε πλάκες των 96 φρεατίων είχαν εκτεθεί σε σειριακές συγκεντρώσεις ΑΒΤ-737, Celastrol ή το μείγμα σταθερής αναλογίας αυτών των δύο για 72 ώρες. Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 1,25 έως 10 μΜ για ΑΒΤ-737, 0,16 έως 1,25 μΜ για Celastrol. παρουσιάστηκαν καμπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης των δύο κυτταρικών σειρών προς ΑΒΤ-737, Celastrol και του συνδυασμού. Τρία ανεξάρτητα πειράματα, και τυπική απόκλιση παρουσιάστηκε ως ράβδοι σφάλματος. Οι τιμές CI καταδείχθηκαν στον Πίνακα 1.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

1. Χημικές ουσίες και Αντιδραστήρια

ΑΒΤ-737 αγοράστηκε από Σέλεκ χημικές ουσίες (Houston, TX). Celastrol συντέθηκε από τον καθηγητή Wei Lu (Ανατολική Κίνα Normal University) με καθαρότητα μεγαλύτερη από 99%. Τόσο ΑΒΤ-737 και Celastrol διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο σε συγκέντρωση αποθέματος 20 mM (DMSO). Τα πρωτογενή αντισώματα έναντι PARP, προ-κασπάση-3, Bax, Bim, Bcl-xL, ουβικιτίνη, ακτίνη και HRP-επισημασμένο δευτερογενές αντι-κατσίκας, αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)? τα πρωτογενή αντισώματα εναντίον διασπάστηκε-κασπάσης-3, Puma, κυτόχρωμα c, Bcl-2, Mcl-1, ATF4, μπριζόλα, ρ-eIF2α (ser51), eIF2α, HSP70, ρ-ΕΚΚ, ERK, και CDK4 αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ)? τα πρωτογενή αντισώματα εναντίον Noxa αγοράστηκε από την Calbiochem (Darmstadt, Germany).

2. Cell Culture

Ανθρώπινο κυτταρικές γραμμές καρκινώματος ηπατοκυτταρικού Bel-7402 και HepG2 αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Ινστιτούτο Βιοχημείας και Κυτταρικής Βιολογίας (Σαγκάη, Κίνα) και διατηρήθηκε σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C. Bel-7402 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και τα κύτταρα HepG2 σε τροποποιημένο Dulbecco μέσο Eagle συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό.

A. Τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με 10 μΜ ΑΒΤ-737, 1.25 μΜ Celastrol και τον συνδυασμό για 24, 48, 72 ώρες και η απόπτωση ελέγχθηκε με χρώση ιωδιούχου προπιδίου λυθέντων κυτταρικών πυρήνων, αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. B. Μετά την επεξεργασία 10 μΜ ΑΒΤ-737, 1.25 μΜ Celastrol και ο συνδυασμός για 72 ώρες, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ και παρατηρήθηκαν από την Leica DMI 400B Xuorescence μικροσκόπιο. Τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με 10 μΜ ΑΒΤ-737, 1.25 μΜ Celastrol και του συνδυασμού για 24 ώρες? Γ κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και immunobloted με κασπάση 3, διασπασμένη κασπάση-3 και PARP αντισώματα? δραστηριότητα Δ κασπάσης-3 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το ειδικό υπόστρωμα Ac-DEVDPNA? Κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10 μΜ ΑΒΤ-737, 1.25 μΜ Celastrol και του συνδυασμού για 24 ώρες. E. Bel-7402 και HepG2 κύτταρα βάφτηκαν με JC-1, στη συνέχεια, παρατήρησε από την Leica DMI 400B Xuorescence μικροσκόπιο? επίπεδα F. πρωτεΐνης Bax, Bcl-2, Bcl-xL και Mcl-1 σε HepG2 και Bel-7402 κύτταρα ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western ανάλυση. Η πυκνότητα της ζώνης πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη χρήση Bio-Rad Ποσότητα Ένα λογισμικό απεικόνισης? Γ ο διαχωρισμός του κυτοσολίου επιτεύχθηκε. Τα κυτοσόλιο δείγματα αναλύθηκαν, και η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western ανάλυση. Τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. *,

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt?. 0.01

Η

3. Κυττάρων Δοκιμασία Επιβίωσης

Η κυτταρική επιβίωση αποτιμήθηκε με προσδιορισμό κυτταρικής βιωσιμότητας ΜΤΤ. Εν συντομία, εκθετικώς αναπτυσσόμενα Bel-7402 και HepG2 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C πριν από τη θεραπεία του εκτίθενται σε DMSO όχημα, σειριακές συγκεντρώσεις ΑΒΤ-737, Celastrol ή ο συνδυασμός για 72 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με ΜΤΤ (5 mg /ml, 20 μΙ /φρεάτιο) για 4 ώρες και οι κόκκοι φορμαζάνης που παράγεται από ζωντανά κύτταρα διαλύθηκαν σε DMSO. Η απορρόφηση στα 570 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Multiscan φάσμα (Thermo Electron Corporation Marietta, ΟΗ). Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

4. Ανάλυση απόπτωσης με ϋΑΡΙ Χρώση

Εκθετικά αναπτυσσόμενα Bel-7402 και τα κύτταρα HepG2 σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C πριν από την επεξεργασία του φορέα DMSO, σειριακές συγκεντρώσεις ΑΒΤ-737, Celastrol ή του συνδυασμού για 72 ώρες. Τα συλλεγμένα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS, επωάστηκαν με 0.1% Triton και 0.1% ϋΑΡΙ σε θερμοκρασία δωματίου για 3 λεπτά, κατόπιν πλύθηκαν δύο φορές με PBS και απεικονίστηκαν με Leica DMI 400B μικροσκόπιο φθορισμού.

A. Bel-7402 κύτταρα επεξεργάστηκαν με 10 μΜ ΑΒΤ-737, 1.25 μΜ Celastrol και του συνδυασμού για 3, 6, 12 ώρες. κύτταρα Β HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή with10 μΜ ΑΒΤ-737, 1,25 μΜ Celastrol για 12, 24, 48 ώρες. Στη συνέχεια, λύματα συλλέχθηκαν και immunobloted με NOXA, Bim, PUMA και PARP αντισώματα.

Η

5. Ανάλυση απόπτωσης με ΡΙ Χρώση

Εκθετικά αναπτυσσόμενα Bel-7402 και κύτταρα HepG2 σπάρθηκαν και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C πριν από την επεξεργασία του φορέα DMSO, σειριακές συγκεντρώσεις ABT- 737, Celastrol ή ο συνδυασμός για 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες. Τα συλλεγμένα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS και σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή 70% αιθανόλη στους -20 ° C για τουλάχιστον 2 ώρες. Τα σταθεροποιημένα κύτταρα εκπλύθηκαν δύο φορές με PBS και επαναιωρήθηκαν σε PBS που περιείχε 40 μg /mL RNase Α στους 37 ° C για 30 λεπτά και /mL ιωδιούχου προπιδίου 10 μg σε σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε σε ΡΑΟδοβη (BD Biosciences, San Jose, CA).

6. Προσδιορισμός της μιτοχονδριακής μεμβράνης Εκπόλωση

Εκθετικά αναπτυσσόμενα Bel-7402 και HepG2 κύτταρα σπάρθηκαν και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C πριν από την επεξεργασία του φορέα DMSO, σειριακές συγκεντρώσεις ΑΒΤ-737 , Celastrol ή ο συνδυασμός για 24 ώρες. Τα συλλεγμένα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS και επαναιωρήθηκαν σε PBS που περιείχε 10 μg /mL JC-1 (5,5 ‘, 6,6′-τετραχλωρο-1,1′, 3,3’- ιωδιούχο tetraethylbenzimidazolyl-arbocyanine). Μετά incubationat 37 ° C για 20 λεπτά, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, στη συνέχεια απεικονίστηκε με Leica DMI 400B μικροσκόπιο φθορισμού ή αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

κύτταρα HepG2 επιμολύνθηκαν με NOXA siRNA σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία with10 μΜ ΑΒΤ-737, 1.25 μΜ Celastrol και του συνδυασμού επί 48 ώρες. A. Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και immunobloted με NOXA αντίσωμα. B. Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και immunobloted με διασπασμένη κασπάση-3 και PARP αντισώματα. C. Οι αναλογίες των διασπώνται-κασπάσης 3 /β-ακτίνης. D. Οι αναλογίες των διασπασμένης PARP /ακτίνης. Η πυκνότητα της ζώνης πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη χρήση Bio-Rad Ποσότητα Ένα λογισμικό απεικόνισης. E. Τα κλάσματα κυτταρικής επιβίωσης ανιχνεύθηκαν με δοκιμασία ΜΤΤ. *,

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt?. 0.01

Η

7. Ανάλυση Western Blot

Bel-7402 και τα κύτταρα HepG2 συλλέχθηκαν, πλύθηκαν μία φορά με PBS, και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,5% δεοξυχολικό οξύ, 0,02% αζίδιο του νατρίου, 1% ΝΡ-40, 2,0 μg /ml απρωτινίνη, 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο) σε πάγο για 30 λεπτά. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στις 13.000 rpm για 30 λεπτά στους 4 ° C. Οι συγκεντρώσεις της ολικής πρωτεΐνης κυτταρολύματος ανιχνεύθηκαν με πρότυπη δοκιμασία Bradford (Bio-Rad, San Diego, CA). Για ανάλυση στυπώματος Western, 40-100 μg των πρωτεϊνών σε ηλεκτροφόρηση με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Pierce Chemical) και ανιχνεύθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα ακολουθούμενη από υπεροξειδάση αρμορακίας-συζευγμένο δευτερεύον αντισώματα σε 1:5000 αραίωση. Πρωτεΐνες έγιναν ορατές με τη χρήση ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL), συν την εξάρτηση από την Amersham Biosciences (UK).

8. Μέτρηση της κασπάσης-3 Δραστηριότητα

Η δράση της κασπάσης-3 μετρήθηκε με διάσπαση εκλεκτικό υπόστρωμα ακετυλο-Asp-Glu-Val-Asp Ρ-νιτροανιλιδίου (Ac-DEVDPNA) (Beyotime ινστιτούτο της βιοτεχνολογίας). Τα κύτταρα λύθηκαν και η συγκέντρωση πρωτεΐνης των υπερκειμένων μετρήθηκε με τη μέθοδο Bradford και ίσες ποσότητες πρωτεϊνών (10 μL) επωάστηκαν σε ένα συνολικό όγκο 100 μL ρυθμιστικού διαλύματος που αποτελείται από 80 μι ανίχνευσης. Η αντίδραση ξεκίνησε με την προσθήκη της κασπάσης-3 υποστρώματα Ac-DEVD-ΡΝΑ (10 μL). Μετά από επώαση για 60 λεπτά στους 37 ° C, η διάσπαση του υποστρώματος ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα Multiscan φάσμα (Thermo Electron Corporation Marietta, ΟΗ) σε μήκος κύματος 405 nm. Δραστηριότητες της κασπάσης-3 εκφράστηκαν ως μεταβολές στην DEVDase δραστηριότητα.

9. Ανίχνευση απελευθέρωση του κυτοχρώματος c

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν μία φορά με PBS, και επαναιωρήθηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης [20 mmol /L HEPES (ρΗ 7.5), 1.5 mmol /L MgCl

2, 10 mmol /L ΚΟΙ, 1 mmol /L EGTA, 1 mmol /L EDTA, 250 mmol /L σακχαρόζη, 0,1 mmol /L φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο και 1 mmol /L ϋΤΤ], και ομογενοποιείται χρησιμοποιώντας ένα microhomogenizer. Τα ομογενοποιήματα φυγοκεντρήθηκαν στα 750 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Στη συνέχεια, τα υπερκείμενα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 10,000 χ g για 15 λεπτά στους 4 ° C, και τα υπόλοιπα υπερκείμενα θεωρηθεί ως κλάσμα cytosol. Μετά την ανάλυση κηλίδος Western, αντι-κυτοχρώματος c αντισώματα (Cell Signaling Technology) χρησιμοποιήθηκαν για να ανιχνεύσει το μιτοχονδριακό απελευθέρωση του κυτοχρώματος c.

Μετά την επεξεργασία του 10 μΜ ΑΒΤ-737, 1.25 μΜ Celastrol και του συνδυασμού για 24 ώρες , κυτταρικά εκχυλίσματα ανοσοκαταβυθίστηκαν με Mcl-1 (Α) ή Noxa (Β) αντισωμάτων. Τα ανοσοϊζήματα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και ανιχνεύθηκαν με Noxa (Α) ή αντισώματα Mcl-1 (Β). Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και immunobloted με Mcl-1, Noxa και ακτίνη αντισώματα.

Η

Α και Β Bel-7402 και τα κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία 1,25, 2,5, 5 μΜ Celastrol για 3 ώρες, τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και immunobloted με Hsp70, π-ERK, CDK4 και αντισώματα UB. κύτταρα C. HepG2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία 1,25, 2,5, 5 μΜ Celastrol για 3 ώρες, προϊόντα λύσης συλλέχθηκαν και immunobloted με ρ-eIF2a και ATF4. κύτταρα HepG2 Δ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 1,25 μΜ Celastrol ή συν 10 μΜ ΑΒΤ-737 για 12 ώρες. επίπεδα Noxa mRNA προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR σε σχέση προς GAPDH ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Κύτταρα Ε HepG2 επιμολύνθηκαν με ATF4 siRNA σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, λύματα συλλέχθηκαν και immunobloted με αντίσωμα ATF4. F. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1,25 μΜ Celastrol για 24 ώρες. επίπεδα Noxa mRNA προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR σε σχέση προς GAPDH ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. *,

σ

& lt?. 0.05

Η

10. Η αντίστροφη μεταγραφή PCR Δοκιμασία

Ολικό RNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το ΤπζοΙ, καθιζάνει με ισοπροπυλική αλκοόλη και ξεπλένεται με 70% αιθανόλη. Single-κλώνου cDNA παρασκευάστηκε από το καθαρισμένο RNA χρησιμοποιώντας ολίγο (dT) εκκινήσεως (κιτ Thermoscript RT? Invitrogen), που ακολουθείται από SYBR-Πράσινο πραγματικού χρόνου PCR (Qiagen). Οι εκκινητές ήταν ως ακολούθως: Noxa, 5′-ATGAATGCACCTTCACATTCCTCT-3 ‘, 5′-TCCAGCAGAGCTGGAAGTCGAGTGT-3′ [19]? GAPDH, 5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 ‘, 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′ [20]. Σχετικά επίπεδα έκφρασης των γονιδίων στόχων ομαλοποιήθηκαν με το γονίδιο ελέγχου GAPDH. Για την ανίχνευση του Xbp1 ματίσματος, οι συνθήκες που χρησιμοποιούνται για αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ ήταν ως εξής: 10 λεπτά στους 25 ° C, 60 λεπτά στους 42 ° C και 15 λεπτά στους 72 ° C. Το cDNA υποβλήθηκε σε ενίσχυση PCR χρησιμοποιώντας την ακόλουθη προς τα εμπρός και αντίστροφο εκκινητή: Xbp1, προς τα εμπρός εκκινητής: 5’-CCTTG TAGTTGAGAACCAGG-3 ‘και αντίστροφος εκκινητής: 5′-GGGGCTTGGTATATATGTG G-3’ [21]. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε γέλη αγαρόζης 1,0% και οπτικοποιήθηκαν με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου. Πηκτώματα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αναλυτή εικόνας Gel DOC 2000 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

11. Αποσιώπηση of Gene Expression με μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA)

Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (4 χ 10

4 /φρεάτιο) και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C. Στη συνέχεια, το μέσο αντικαταστάθηκε με Ορίί-ΜΕΜ Ι μειωμένου ορού (Gibco) που περιέχει 20,0 ηΜ Mcl-1 ή ATF4 siRNA (GenePharma, Κίνα) και Oligofectamine αντιδραστήριο (Invitrogen Corporation) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Οι αλληλουχίες αίσθηση του siRNA ήταν ως ακολούθως: NOXA: 5′-UCAGUCUACUGAUUUACUGG-3 ‘[22]? ATF4: 5’-GCGUAGUUCGCUAAGGUGAdTdT-3 ‘[23]. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν ή σε επεξεργασία με φορέα DMSO, σειριακές συγκεντρώσεις ΑΒΤ-737, Celastrol ή συνδυασμού.

12. Ανοσοκαταβύθιση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε καθολική λύσης /ρυθμιστικού διαλύματος ανοσοκατακρημνίσεως, (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 25 mM NaF, 25 mM β-γλυκεροφωσφορικό, ρΗ 7.5, 0.1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 0,1 mM PMSF, 5 μg /ml λευπεπτίνη, 0,2% Triton Χ-100, 0.5% Nonidet Ρ-40) σε πάγο για 30 λεπτά. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στις 13.000 rpm για 30 λεπτά στους 4 ° C. 300 μg κυτταρικές πρωτείνες προδιαυγάστηκε με προσθήκη 1 μα φυσιολογική ανοσοσφαιρίνη G μαζί με 50 μλ της κατάλληλης πρωτεΐνης Α + συζυγούς G-αγαρόζης (Santa Cruz) για 1 ώρα στους 4 ° C. Οι ανοσοκαταβυθίσεις διεξήχθησαν με το κατάλληλο πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Συγκροτήματα δεσμευμένο στην πρωτεΐνη Α + G-αγαρόζης συζυγούς πλύθηκαν επτά φορές με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης καθολικής /ανοσοκαταβύθιση και κλασματοποιείται με SDS-PAGE. Η ανάλυση στυπώματος Western στη συνέχεια διεξήχθη.

13. Στατιστική Ανάλυση

δείκτη συνδυασμού (CI) είναι ευρέως αποδεκτή για ποσόστωση συνεργισμού φάρμακο με βάση την εξίσωση πολλαπλάσιο αποτέλεσμα φαρμάκου του Chou-Talalay [24]. Στη μελέτη μας, τα ΠΙ για κάθε συγκέντρωση της ΑΒΤ-737, Celastrol και του συνδυασμού σε δοκιμασίες κυτταρικής επιβίωσης υπολογίστηκαν από CalcuSyn Λογισμικού (Biosoft, Κέιμπριτζ, Ηνωμένο Βασίλειο). Μια CI μικρότερο από 0.9 υποδεικνύει συνέργεια? μια CI από 0,9 έως 1,10 δείχνει πρόσθετο? και ένα CI μεγαλύτερη από 1,10 υποδεικνύει ανταγωνισμό

Οι διαφορές στον πληθυσμό υπο-G1, κασπάσης-3 δραστηριότητα και Bax /Bcl-2 ratiofor κάθε δύο ομάδες (συνδυασμός

vs

ΑΒΤ-737..? συνδυασμός

vs.

Celastrol), και οι διαφορές στην διασπασμένης κασπάσης-3 /ακτίνης, διασπασμένη PARP /ακτίνη, και το ποσοστό επιβίωσης του συνδυασμού ομάδα Noxa σιγήσει κύτταρα

vs.

ελέγχουν κύτταρα siRNA, διπλώστε . αλλαγή σε Noxa mRNA της Celastrol-κατεργασμένων κυττάρων σε κύτταρα ATF4 siRNA

vs

ελέγχουν κύτταρα siRNA, αξιολογήθηκαν από t-test unpaired δύο όψεων του Student και επισημαίνονται με ** για την p & lt? 0.01 και * για την p & lt? 0.05. Για κάθε ανάλυση, τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν για την απόκτηση των στοιχείων.

Αποτελέσματα

1 κυτταροτοξικότητα του συνδυασμού ΑΒΤ-737 και Celastrol ανθρώπων ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα κυτταρικών γραμμών

Κατ ‘αρχάς , με τη χρήση ΜΤΤ δοκιμασία αξιολογήσαμε την κυτταροτοξικότητα της ΑΒΤ-737, Celastrol και ο συνδυασμός στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 72 ώρες σε δύο κυτταρικές σειρές HCC Bel-7402 και HepG2. Αντίστοιχες καμπύλες κλάσμα επιβίωσης που φαίνεται στο Σχ. 1. Σε σύγκριση με την ΑΒΤ-737 ή Celastrol μόνη της, ο συνδυασμός των ΑΒΤ-737 και Celastrol ασκείται πιο σημαντικές επιπτώσεις αντι-πολλαπλασιασμού τόσο Bel-7402 και HepG2. Τιμές CI υπολογίστηκαν με CalcuSyn Software στις συγκεντρώσεις σταθερής αναλογίας ΑΒΤ-737 και Celastrol (Πίνακας 1). Synergy (CI & lt? 0,70) ή ισχυρή συνέργεια (CI & lt? 0,30). Παρατηρήθηκε και στις δύο δοκιμαστεί κυτταρικές σειρές καρκίνου του

2 ABT-737 synergized με Celastrol να Trigger απόπτωση

2.1 ΑΒΤ-737 plus celastrol προκαλείται από αυξημένη απόπτωση.

Τόσο η ΑΒΤ-737 και celastrol αναφερθεί ότι διαμορφώνουν την απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα, έτσι εμπνεόμαστε για τον προσδιορισμό των συνεργιστικά αποτελέσματα της ΑΒΤ-737 συν Celastrol στην απόπτωση στο Bel-7402 και τα κύτταρα HepG2 . Πρώτον, χρώση ΡΙ για ανάλυση περιεχομένου Sub-G1 χρησιμοποιήθηκε για να χαρακτηρίσει την απόπτωση σε Bel-7402 και τα κύτταρα HepG2 σε επεξεργασία με 10 μΜ ΑΒΤ-737, 1.25 μΜ Celastrol ή συνδυασμού για 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, ΑΒΤ-737 σε συνδυασμό με Celastrol οδήγησε σε μεγαλύτερη απόπτωση από τις ομάδες μονο-θεραπεία? κύτταρα που πάσχουν από την απόπτωση μετά από θεραπεία συνδυασμού αυξημένο χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Οι διαφορές των αποπτωτικών κυττάρων μεταξύ της θεραπείας συνδυασμού έναντι των ομάδων μονο-θεραπεία ήταν στατιστικά σημαντική τόσο Bel-7402 και τα κύτταρα HepG2 (*,

σ

& lt? 0,05? **,

σ

& lt? 0,01) (Σχ. 2Α). Τυπικά μορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης, συμπεριλαμβανομένης συμπύκνωσης χρωματίνης, πυρηνική κατακερματισμό και σχηματισμό αποπτωτικών σωμάτων, παρατηρήθηκαν επίσης σε 10 μΜ ΑΒΤ-737, 1.25 μΜ Celastrol ή συνδυασμού επεξεργασμένο Bel-7402 και κύτταρα HepG2 με χρώση ϋΑΡΙ. 10 μΜ ΑΒΤ-737 σε συνδυασμό με 1,25 μΜ Celastrol επάγεται περισσότερο αποπτωτικά σώματα από τα μονο-θεραπείες (Σχ. 2Β). Caspase-3 είναι ένα κρίσιμο τελεστής κασπάσες στο αποπτωτικών οδών, εκ των οποίων η κλασική υπόστρωμα είναι πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) [25]. Χρησιμοποιώντας την ανάλυση στυπώματος western, ανιχνεύσαμε την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και διάσπαση της PARP. Και στις δύο Bel-7402 και τα κύτταρα HepG2, αν και ΑΒΤ-737 και Celastrol είχε μικρή επίδραση στην κασπάση-3 και PARP, ο συνδυασμός προκάλεσε πολύ πιο σημαντική διάσπαση της κασπάσης-3 και PARP (Σχ. 2C). Σε κύτταρα HepG2, με την εισαγωγή της κασπάσης-3 ειδικό υπόστρωμα Ac-DEVDPNA, ΑΒΤ-737 και Celastrol συν-θεραπεία αποδείχθηκε για να προκαλέσει μια σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα της κασπάσης-3 (4,2 φορές σε σύγκριση με ομάδα ελέγχου) (Εικ. 2D) , ενώ οι ομάδες μονο-θεραπεία δεν παρουσίασαν εμφανή την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 (1,1-φορές και 1,0-φορές, σε Celastrol- και ΑΒΤ-737-ομάδες, αντίστοιχα), το οποίο ήταν σε συμφωνία με την παρατήρηση στο Σχ. 2C, δείχνοντας περαιτέρω την απόπτωση συνεργιστικά που προκαλείται από ABT-737 και Celastrol. Γενικά, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι ο συνδυασμός του ΑΒΤ-737 και Celastrol οδήγησε σε αυξημένη απόπτωση σε Bel-7402 και HepG2 κύτταρα.

2.2 Ενεργοποίηση του μιτοχονδριακού που βασίζονται αποπτωτική οδό πυροδοτήθηκε από το συνδυασμό του ΑΒΤ-737 και celastrol.

στη συνέχεια, το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης στην έκθεση των κυττάρων σε ABT-737, Celastrol ή το συνδυασμό εξετάστηκε με χρώση JC-1. Ο αριθμός των κυττάρων μετατοπίζεται από κόκκινο σε πράσινο φθορισμό υποδηλώνει την συχνότητα των κυττάρων που εμφανίζουν μιτοχονδριακής αποπόλωση. Σε 24 ώρες επεξεργασμένο Bel-7402 και τα κύτταρα HepG2, μέτρια πράσινος φθορισμός παρατηρήθηκε μετά τις μονο-θεραπείες, ενώ ο πράσινος φθορισμός αντικαθίσταται πιο κόκκινο φθορισμό μετά την θεραπεία συνδυασμού ΑΒΤ-737 και Celastrol (Σχ. 2Ε). Επιπλέον, ανιχνεύονται τα επίπεδα πρωτεΐνης Bax, Bcl-2, Bcl-xL, καθώς επίσης και την μιτοχονδριακή απελευθέρωση του κυτοχρώματος c (Σχ. 2F και 2G). Σε αμφότερα HepG2 και Bel-7402 κύτταρα, η συσσώρευση του Βαχ ανιχνεύθηκε μετά από επεξεργασία του ΑΒΤ-737 και Celastrol για 24 ώρες, στην αντίθεση, Bcl-2 και Bcl-xL μειώθηκαν μετά την θεραπεία συνδυασμού. Στη συνέχεια αξιολογείται η αναλογία του Βαχ /Bcl-2 και Bax /Bcl-xL σε κύτταρα HepG2, τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στην εμφάνιση της απόπτωσης [26]. Ο συνδυασμός του ΑΒΤ-737 και Celastrol ρυθμίζεται αυξητικά σημαντικά την αναλογία του Βαχ /Bcl-2 και Bax /Bcl-xL, αυξάνεται από 0,35 να 2,49 (Βαχ /Bcl-2) και 0,55 να 3,91 (Βαχ /Bcl-XL), respectivley (Σχ. 2F). Επιπλέον, εμφανής απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από το μιτοχονδριακό να κυτταρόπλασμα επίσης προκαλείται από την ΑΒΤ-737 συν Celastrol συνδυασμό (Σχ. 2G). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υπέδειξαν το μιτοχονδριακό μονοπάτι ενεπλάκη στην απόπτωση που προκλήθηκε από το συνδυασμό της ΑΒΤ-737 και Celastrol.

3 Κινητική Noxa επαγωγής Συναφές με την ενεργοποίηση του αποπτωτικού μηχανισμού από το συνδυασμό του ΑΒΤ-737 και Celastrol

για να χαρακτηριστεί η συνεργιστική αποπτωτικό μηχανισμό του ΑΒΤ-737 και Celastrol, ανάλυση κηλίδος Western επί Bel-7402 και HepG2 κύτταρα μετά από έκθεση σε 10 μΜ ΑΒΤ-737, 1.25 μΜ Celastrol ή του συνδυασμού για διάφορα χρονικά χρονικά διαστήματα. Σε Bel-7402 κύτταρα, κινητική ανάλυση που παρουσιάζεται ότι η επαγωγή των πρωτεϊνών Noxa έγινε ανιχνεύσιμο μετά από έκθεση σε 1.25 μΜ Celastrol ή του συνδυασμού για 3 ώρες. Εν τω μεταξύ, παρατηρήσαμε ότι η διάσπαση της PARP (που υποδεικνύει την ενεργοποίηση της κασπάσης) με τον συνδυασμό έγινε ορατή μετά από 6 ώρες (Σχ. 3Α). Σε κύτταρα HepG2, η επαγωγή της Noxa από 1,25 μΜ Celastrol ή του συνδυασμού, σε σύγκριση με Bel-7402 κύτταρα, καθυστέρησε με εμφάνιση μετά από 24 ώρες, που ακολουθείται από λιγότερο ευαίσθητη διάσπαση PARP (Σχ. 3Β). Αισθητά, στις δύο δοκιμάστηκαν καρκινικές κυτταρικές γραμμές, αν και η χρονική στιγμή της ενεργοποίησης κασπάσης και Noxa πάνω ρύθμιση ήταν διαφορετικό από κάθε άλλο, επαγωγή Noxa ήταν σίγουρα παρατηρήθηκε νωρίτερα από την ενεργοποίηση της κασπάσης, η οποία συνεπάγεται ότι κάτω από τη θεραπεία της ΑΒΤ-737, Celastrol ή ο συνδυασμός, Noxa αύξηση πυροδοτήθηκε πριν από τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, αυξάνοντας την πιθανότητα ότι η επαγωγή Noxa έπαιξε ρόλο στην απόπτωση που προκαλείται από ΑΒΤ-737 συν Celastrol.

Εκτός Noxa, διαπιστώσαμε ότι η έκφραση του άλλου δύο ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες Bim και PUMA επίσης ρυθμίζεται αυξητικά από τον συνδυασμό του ΑΒΤ-737 και Celastrol (Σχ. 3Α και 3Β), εμπλέκοντας ότι αυτά τα δύο παράγοντας μπορεί να βοηθήσει στην προώθηση της συνεργιστική αποπτωτική επαγωγή από το συνδυασμό.

4 Noxa απαιτείτο Ισχυροί Αύξηση της ΑΒΤ-737-θανάτωση από Celastrol

Όπως προαναφέρθηκε, Noxa πιθανόν να συμμετέχουν στην απόπτωση που προκαλείται από συνδυασμό θεραπειών της ΑΒΤ-737 και Celastrol. Για τον προσδιορισμό της συμμετοχής των Noxa και το ρόλο του στην απόπτωση, έχουμε καταρχάς γκρέμισε Noxa με επιμόλυνση με Noxa ειδικά siRNA σε κύτταρα HepG2 επί 48 ώρες. Η έκφραση του Noxa μειώθηκε σημαντικά μετά από διαμόλυνση με Noxa siRNA (Σχ. 4Α). Στη συνέχεια, τα κύτταρα HepG2 επιμόλυνση Noxa siRNA υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 μΜ ΑΒΤ-737, 1.25 μΜ Celastrol ή το συνδυασμό για ένα άλλο 48 ώρες. Σύκο. 4Β έδειξε ότι Noxa ειδικό siRNA μείωσε σημαντικά τη διάσπαση της κασπάσης-3 και PARP με ΑΒΤ-737 σε συνδυασμό με Celastrol. Από τρία ανεξάρτητα πειράματα, ο λόγος των διασπασμένης κασπάσης-3 /β-ακτίνης και διασπάστηκε-PARP /β-ακτίνης αναλύθηκαν (Σχ. 4C και 4D), η οποία αποκάλυψε ότι knockdown του Noxa προφανώς ως αποτέλεσμα την μείωση των αναλογιών, γεγονός που υποδηλώνει τη μειωμένη αποπτωτική ισχυροί της ΑΒΤ-737 συν Celastrol συνδυασμό με Noxa-σιγήσει κύτταρα. Επιπροσθέτως, η επιμόλυνση του Noxa siRNA ακυρωθεί επίσης τη συνεργιστική αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση από το συνδυασμό της ΑΒΤ-737 και Celastrol στα κύτταρα HepG2, με το κλάσμα κυτταρικής επιβίωσης aggrandizing από 57,14% έως 93,56% (Σχ. 4Ε). Αυτά τα δεδομένα κατέδειξαν ότι ο συνεταιρισμός αντικαρκινικές επιδράσεις από ΑΒΤ-737 και Celastrol απαιτούνται Noxa, εκ των οποίων knockdown εξασθένισε την κυτταροτοξικότητα και αποπτωτικά αποτελέσματα του ΑΒΤ-737 συν Celastrol.

5 Celastrol Προωθείται η δέσμευση του Noxa να Mcl -1

Η μεγάλη αντίσταση στην ABT-737 πιστεύεται ότι είναι χαμηλής συγγένειας του με Mcl-1. Noxa είναι ένα BH3-μόνο πρωτεΐνη η οποία μπορεί αποτελεσματικά δεσμεύονται με Mcl-1 και αναστέλλει τα αποτελέσματα προ-επιβίωσης των Mcl-1. Δεδομένης της επαγωγής Noxa από Celastrol και τη θεραπεία συνδυασμού, προσδιορίσαμε την αλληλεπίδραση μεταξύ Noxa και εταίρος υψηλής συγγένειας του Mcl-1 που είχε ως αποτέλεσμα Noxa /Mcl-1 σύμπλοκα. Για να διευκρινιστεί αυτό το θέμα, μπορούμε ανοσοκατακρημνίσθηκε πρωτεΐνη Mcl-1 και ανιχνεύτηκαν για Noxa σε κύτταρα HepG2 σε επεξεργασία με 10 μΜ ΑΒΤ-737, 1.25 μΜ Celastrol ή συνδυασμού για 24 ώρες. Όπως αποκαλύπτεται στο Σχ. 5Α, Celastrol μονο-θεραπεία βελτίωσε την αλληλεπίδραση των Mcl-1 και Noxa σε κύτταρα HepG2 και δεσμευτική Noxa να Mcl-1 είναι σημαντικά αυξημένα μετά την αγωγή συνδυασμού? Εν τω μεταξύ, τα επίπεδα πρωτεΐνης Mcl-1 μειώθηκε σε Celastrol επεξεργασμένα και τα κύτταρα HepG2 συνδυασμός επεξεργασία. Διεξάγουμε περαιτέρω μια αντίστροφη IP χρησιμοποιώντας αντι-Noxa αντισώματα, και επίσης παρατηρήσει μια αύξηση των Mcl-1 δεσμεύεται με Noxa (Εικ. 5Β). Στο σύνολό τους, επαγωγή Noxa με Celastrol ενθάρρυνε την αλληλεπίδραση του Noxa και Mcl-1, είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του Mcl-1, η οποία μπορεί να συμβάλλει στην αύξηση της απόπτωσης που επάγεται από συνδυασμό ΑΒΤ-737 και Celastrol.

6 Celastrol-προκάλεσε Hsp90 Αναστολή και ER-Stress Ανταπόκριση οδήγησε στην αύξηση των Noxa

6.1 Celastrol που προκαλείται υποβάθμιση των πρωτεϊνών πελάτη Hsp90.

για να διευκρινιστεί η συσχέτιση μεταξύ των αποτελεσμάτων HSP90 στόχευση [ ,,,0],27] και η επαγωγή Noxa σε Celastrol εκτεθειμένο κύτταρα, η αποικοδόμηση των πρωτεϊνών πελάτη Hsp90, όπως φωσφο ERK1 /2 και CDK4, παρακολουθήθηκε με κηλίδωση western τόσο Bel-7402 και τα κύτταρα HepG2 με σειριακές συγκεντρώσεις celastrol για 3 h ( Σχ. 6Α και 6Β). Επιπλέον, σύμφωνα με την προηγούμενη έκθεση, Celastrol αύξησε επίσης την έκφραση Hsp70, το οποίο είναι ένα σήμα κατατεθέν της αναστολής Hsp90 [28]. Δεδομένου ότι οι πρωτεΐνες πελάτη Hsp90 γίνει misfolded και ουβικουιτινωμένης από την αναστολή Hsp90 και στη συνέχεια προς τα κάτω-ρυθμίζονται από την υποβάθμιση του πρωτεασώματος [29], τότε να ανιχνευθεί αν Celastrol θα μπορούσε να προκαλέσει ουμπικουιτίνωση πρωτεΐνης που ακολουθείται από την υποβάθμιση του πρωτεασώματος. Όπως φαίνεται στο Σχ.