Abstract

Η οδός mTOR είναι παρεκκλίνοντα διεγείρεται σε πολλά καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων του αδενοκαρκινώματος παγκρεατικού πόρου (PDAC) και έτσι είναι ένας πιθανός στόχος για θεραπεία. Ωστόσο, ο άξονας /S6K mTORC1 μεσολαβεί επίσης αρνητικές βρόχους ανάδρασης που εξασθενούν τη σηματοδότηση μέσω ινσουλίνη /IGF υποδοχέα και άλλους υποδοχείς τυροσινικής κινάσης. Η καταστολή αυτών των feed-back βρόχους εξαπολύει υπερ-ενεργοποίηση των ανάντη οδούς που ενδεχομένως να αντισταθμίσουν τις αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις των αναστολέων mTOR. Εδώ, επιδεικνύουμε ότι η θεραπεία των PANC-1 ή MiaPaCa-2 καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος είτε με ραπαμυκίνη ή δραστική θέση αναστολείς mTOR κατέστειλε φωσφορυλίωση S6K και S6 διεγείρεται από την ινσουλίνη και την νευροτενσίνη συναγωνιστή GPCR. Η ραπαμυκίνη προκάλεσε μια εντυπωσιακή αύξηση της φωσφορυλίωσης της Akt σε Ser

473, ενώ οι αναστολείς της δραστικής θέσης του mTOR (KU63794 και PP242) καταργείται εντελώς η φωσφορυλίωση της Akt σε αυτό το site. Αντιστρόφως, οι αναστολείς ενεργού θέσεως του mTOR προκαλέσει μια σημαντική αύξηση στην ενεργοποίηση ERK ενώ η ραπαμυκίνη δεν είχε καμία διεγερτική επίδραση στην ενεργοποίηση ERK. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι πρώτης και δεύτερης γενιάς των αναστολέων mTOR προωθούν υπερ-ενεργοποίηση των διαφόρων προ-ογκογόνο περιόδων PDAC κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η καταστολή της ανατροφοδότησης βρόχους θα πρέπει να είναι μια σημαντική εκτίμηση στη χρήση αυτών των αναστολέων για τη θεραπεία PDAC. Σε αντίθεση, η μετφορμίνη καταργηθεί η ενεργοποίηση mTORC1 χωρίς υπερβολική τόνωση της φωσφορυλίωσης της Akt σε Ser

473 και εμπόδισε την ενεργοποίηση ERK μιτογόνο διεγείρεται στα κύτταρα PDAC. Η μετφορμίνη προκάλεσε μία πιο έντονη αναστολή του πολλαπλασιασμού είτε από KU63794 ή ραπαμυκίνη, ενώ, ο αναστολέας mTOR δραστική θέση ήταν πιο αποτελεσματικό από τη ραπαμυκίνη. Έτσι, οι επιπτώσεις της μετφορμίνης σε Akt και ενεργοποίηση ERK είναι εντυπωσιακά διαφορετική από αλλοστερική ή δραστική θέση αναστολείς mTOR στην PDAC κυττάρων, αν όλοι αυτοί οι παράγοντες αναστέλλεται ισχυρά τον άξονα /S6K mTORC1

Παράθεση:. Soares HP, Ni Υ, Kisfalvi Κ, Σίνετ-Smith J, Rozengurt Ε (2013) διαφορετικά σχέδια της Akt και ERK Σχόλια ενεργοποίηση σε απόκριση ραπαμυκίνη, Αναστολείς Active-Site mTOR και μετφορμίνη σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 8 (2): e57289. doi: 10.1371 /journal.pone.0057289

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Αυγούστου 2012? Αποδεκτές: 20 του Γενάρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 21 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Soares et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας επιχορηγήσεις P30DK41301, P01CA163200 και R01DK55003, Department of Veterans υπόθεση Grant 1I01BX001473 και κονδύλια από το προικισμένο Ronald S. Hirshberg πρόεδρος του παγκρέατος Cancer Research ‘όλα να ER. (https://www.nih.gov/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) είναι μια εξαιρετικά εξελικτικά διατηρημένη πρωτεΐνη κινάση που παίζει καθοριστικό ρόλο στην ενσωμάτωση του παράγοντα ανάπτυξης, θρεπτικών ουσιών και την κατάσταση ενέργειας των κυττάρων [1]. λειτουργίες mTOR ως καταλυτική υπομονάδα σε δύο διακριτές πολυπρωτεϊνικό συγκροτήματα, mTOR σύμπλοκο 1 (mTORC1) και mTORC2. mTORC1, που χαρακτηρίζεται από την ρυθμιστική υπομονάδα Raptor, ελέγχει τουλάχιστον δύο ρυθμιστές της πρωτεϊνοσύνθεσης, οι 40S ριβοσωμική υπομονάδα πρωτεΐνης S6 κινάση (S6K) και το ευκαρυωτικό παράγοντα έναρξης μετάφρασης 4Ε (eIF4E) -σύνδεση πρωτεΐνη 1, που αναφέρεται ως 4Ε-ΒΡ1 [1 ], [2]. Το ετεροδιμερές του καταστολέα όγκου TSC2 (tuberin) και TSC1 (hamartin) καταστέλλει σηματοδότηση mTORC1 ενεργώντας ως πρωτεΐνη ΟΤΡάσης-ενεργοποιητής για τη μικρή πρωτεΐνη G Rheb (Ras ομόλογο εμπλουτισμένο σε εγκέφαλο), ένας ισχυρός ενεργοποιητής της mTORC1 σηματοδότησης σε GTP- του δεσμεύεται κράτους [3], [4]. Φωσφορυλίωση της TSC2 από Akt και /ή ERK /p90RSK καταστέλλει δραστηριότητα ενεργοποίησης ΟΤΡάσης της προς Rheb, οδηγώντας σε ενεργοποίηση mTORC1 [5]. mTORC1 είναι έντονα και αλλοστερικά ανεστάλη από τη ραπαμυκίνη μέσω σύνδεσης προς FKBP12. mTORC2, που χαρακτηρίζεται από Rictor, δεν αναστέλλεται από τη βραχυχρόνια θεραπεία με αυτόν τον παράγοντα και φωσφορυλιώνει διάφορες πρωτεϊνικές κινάσες AGC, συμπεριλαμβανομένης της Akt σε Ser

473 [6], [7]. Το μονοπάτι mTORC1 διαδραματίζει βασικό ρόλο στην υποδοχέα ινσουλίνης /ΙΟΡ σηματοδότηση [8], [9] και παρεκκλίνοντα ενεργοποιείται σε πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του αδενοκαρκινώματος παγκρεατικού πόρου (PDAC), μια από τις πιο θανατηφόρες ασθένειες του ανθρώπου. Κατά συνέπεια, PDAC κύτταρα εκφράζουν ινσουλίνη και IGF-1 υποδοχέων και υπερ-εκφράζουν IRS-1 και IRS-2 [10] – [12] και PDAC (αλλά όχι κανονικό) απεικόνιση ιστό ενεργοποιημένα (φωσφορυλιωμένη) IGF-1 R [13]. Οι παραλλαγές γονιδίου στο σύστημα σηματοδότησης IGF-1 έχουν συσχετισθεί προς χειρότερη επιβίωση σε ασθενείς με PDAC [14]. Η απενεργοποίηση του ρ53, όπως φαίνεται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του 50-70% του PDAC, up-ρυθμίζει την ινσουλίνη /IGF-1 /mTORC1 μονοπάτι [15]. Παρεμβολή μεταξύ ινσουλίνη /IGF-1 υποδοχέων και του υποδοχέα που συζευγνύονται με πρωτεΐνη G (GPCR) συστήματα σηματοδότησης ισχυρώς διεγείρει mTORC1, σύνθεση DNA και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ένα πάνελ των κυττάρων PDAC [16] – [20]. σηματοδότηση mTORC1 διαδραματίζει έναν κεντρικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των κυττάρων PDAC [21] και ενεργοποιείται σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς [20], [22] – [24]. Κατά συνέπεια, mTORC1 έχει αναδειχθεί ως ένα ελκυστικό θεραπευτικό στόχο σε PDAC και άλλες κοινές κακοήθειες.

Εκτός από τη σηματοδότηση που προάγουν την ανάπτυξη, mTORC1 /S6K μεσολαβεί επίσης αρνητική ανάδραση βρόχους που περιορίζουν σηματοδότησης μέσω της ινσουλίνης /υποδοχέα IGF και άλλα τυροσίνης υποδοχέων κινάσης μέσω φωσφορυλίωσης και μεταγραφική καταστολή του IRS-1 [25] – [30] και φωσφορυλίωση Grb10 [31], [32]. Κατά συνέπεια, η καταστολή της δραστηριότητας mTORC1 με ραπαμυκίνη παρεμποδίζει ανασταλτικά φωσφορυλιώσεις IRS-1 και αποδόμησης, αυξάνοντας με αυτόν τον τρόπο ΡΙ3Κ /Akt ενεργοποίηση σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων [30], [33] – [35]. Αυτές οι μελέτες υποδηλώνουν ότι το δυναμικό αντικαρκινική δράση της ραπαμυκίνης (ή αναλόγων) μπορεί να αντισταθμιστεί από την απελευθέρωση της αναστολής ανάδρασης της ενεργοποίησης ΡΙ3Κ /Akt [25], [30], [33] – [35]. Επιπλέον, η ραπαμυκίνη αναστέλλει ατελώς 4Ε ΒΡ-1 φωσφορυλίωσης [36] – [40]. Κατά συνέπεια, η κλινική αντικαρκινική δράση της ραπαμυκίνης και τα ανάλογά της (rapalogs) έχει μάλλον περιορισμένη σε πολλούς τύπους καρκίνου [41], [42], συμπεριλαμβανομένων PDAC [43], [44]. Σε μια προσπάθεια να στοχεύουν το μονοπάτι mTOR πιο αποτελεσματικά, έχουν νέοι αναστολείς του mTOR που δρουν στην καταλυτική ενεργή θέση (δραστική θέση αναστολείς mTOR) έχουν ταυτοποιηθεί, συμπεριλαμβανομένων PP242 [37], Torin [45], KU63794 [38] και της αναλογική AZD8055 [46]. Αυτές οι ενώσεις αναστέλλουν 4Ε ΒΡ-1 φωσφορυλίωση στη ραπαμυκίνη ανθεκτικά τοποθεσίες (π.χ. Thr

37/46) και μπλοκάρουν φωσφορυλίωσης Akt σε Ser

473 μέσω αναστολής του mTORC2. Ωστόσο, οι αναστολείς mTOR δραστική θέση εξαλείψει επίσης βρόχους ανάδρασης που αναχαιτίζουν την ενεργοποίηση της PI3K [25] και, κατά συνέπεια, η θεραπευτική αποτελεσματικότητά τους μπορεί επίσης να μειωθεί με την ενεργοποίηση των ανάντη οδούς που αντιτίθενται αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις τους.

mTORC1 είναι επίσης αρνητικά ρυθμίζεται από τη μετφορμίνη, το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο φάρμακο στη θεραπεία του σακχαρώδους διαβήτη τύπου 2 (T2DM). Η μετφορμίνη αναδύεται ως μια πιθανή νέα παράγοντα στην χημειοπροφύλαξη του καρκίνου. Πρόσφατες επιδημιολογικές μελέτες που συνδέονται χορήγηση μετφορμίνης για μειωμένη επίπτωση, επανάληψη και θνησιμότητα μιας ποικιλίας καρκίνων σε ασθενείς T2DM [20], [47] – [56], συμπεριλαμβανομένων PDAC [54], [56]. Σε κυτταρικό επίπεδο, η μετφορμίνη διεγείρει έμμεσα (ΑΜΡΚ) ενεργοποίηση AMP-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση [57], αν και έχουν άλλους μηχανισμούς δράσης έχουν προταθεί σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις αυτής της διγουανίδης. ΑΜΡΚ αναστέλλει την ενεργοποίηση mTORC1 μέσω της διέγερσης της λειτουργίας TSC2 [58] – [60], που οδηγεί σε συσσώρευση του Rheb ΑΕΠ (η ανενεργός μορφή) και με άμεση φωσφορυλίωση Raptor, η οποία διαταράσσει τη σύνδεσή της με mTOR, που οδηγεί σε διάσπαση του συμπλόκου mTORC1 [61]. Η ακριβής συνέπεια της καταστολής της αρνητικής βρόχους ανάδρασης που διαμεσολαβείται από τον άξονα mTORC1 /S6K σε απόκριση μετφορμίνη παραμένει σαφώς καθορισμένο και, ειδικότερα, δεν είναι γνωστό αν οι αναστολείς ραπαμυκίνη, δραστική θέση mTOR και μετφορμίνη οδηγούν σε υπερ-ενεργοποίηση των παρόμοιων ανάντη οδών σε PDAC κύτταρα.

Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι η θεραπεία των PANC-1 ή MiaPaCa-2 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με αναστολείς mTOR είτε ραπαμυκίνη ή δραστική θέση κατέστειλε S6K και S6 φωσφορυλίωση που διεγείρεται από ινσουλίνη, ένας συνδυασμός ινσουλίνης και η νευροτενσίνη συναγωνιστή GPCR ή ορό. Η ραπαμυκίνη προκάλεσε μια εντυπωσιακή αύξηση της φωσφορυλίωσης της Akt σε Ser

473, ενώ οι ενεργές εγκαταστάσεις του mTOR αναστολείς KU63794 και PP242 καταργηθεί εντελώς η φωσφορυλίωση της Akt σε αυτό το site. Ένα κεντρικό χαρακτηριστικό των αποτελεσμάτων που παρουσιάζονται εδώ είναι ότι οι αναστολείς της ενεργού θέσεως του mTOR, σε αντίθεση με ραπαμυκίνη, να προκαλέσει μια σημαντική αύξηση στην ενεργοποίηση ERK σε κύτταρα PDAC. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι πρώτο και δεύτερο αναστολείς mTOR γενιάς προωθούν υπερ-ενεργοποίηση των διαφόρων προ-ογκογόνο περιόδων PDAC κυττάρων, δηλαδή Akt και ERK. Η μετφορμίνη κατάργησε επίσης την ενεργοποίηση mTORC1, αλλά χωρίς υπερβολική τόνωση της φωσφορυλίωσης της Akt σε Ser

473. Επιπλέον, η μετφορμίνη εμπόδισε την ενεργοποίηση της ERK σε απάντηση cross-μιλώντας αγωνιστές στα κύτταρα PDAC. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι επιπτώσεις της μετφορμίνης σε Akt και ενεργοποίηση ERK είναι εντυπωσιακά διαφορετικές από αυτές που επιτυγχάνονται από τους αναστολείς mTOR αλλοστερική ή δραστική θέση, αν και όλοι αυτοί οι παράγοντες αναστέλλεται ισχυρά τον άξονα /S6K mTORC1.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια

Οι ανθρώπινες παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές PANC-1 και MiaPaCa-2 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Αυτές οι κυτταρικές σειρές λιμάνι ενεργοποίηση μεταλλάξεων στο

KRAS

ογκογονίδιο. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο Eagle Medium (DMEM) με 2 mM γλουταμίνη, 1 mM Να-πυροσταφυλικό, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη και 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 10% CO

2.

Western

ανάλυση κηλίδος

Συρρέουσες καλλιέργειες κυττάρων PANC-1 ή ΜΙΑ PaCa-2 αναπτύχθηκαν επί 3 πιάτα cm πλύθηκαν και στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες με DMEM που περιέχει 5 mM γλυκόζη και 1% FBS. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ϋΜΕΜ που περιέχει 5 mM γλυκόζη και επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού για 4 ώρες και στη συνέχεια επεξεργασία όπως περιγράφεται στο επιμέρους πειράματα. Οι καλλιέργειες στη συνέχεια λύθηκαν άμεσα σε 2 χ ρυθμιστικό διάλυμα SDS-PAGE δείγματος [200 mM Tris-HCl (ρΗ 6.8), 2 mM EDTA, 0.1 Μ Να

3νο

4, 6% SDS, 10% γλυκερόλη, και 4% 2-μερκαπτοαιθανόλης], ακολουθούμενη από SDS-PAGE σε γέλες 10% και μεταφορά σε μεμβράνες Immobilon-P (Millipore, Billerica, ΜΑ). Western στυπώματα στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε σε μεμβράνες επωάζονται όλη τη νύκτα με τις καθορισμένες αντισώματα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) που περιέχει 0,1% Tween-20. Οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες ανιχνεύθηκαν με ECL (ενισχυμένη χημειοφωταύγεια) αντιδραστηρίων (GE Healthcare Bio-Sciences Corp, Piscataway, NJ). Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται εντόπισε την φωσφορυλιωμένη κατάσταση S6K σε Thr

389, S6 σε Ser

235/236, 4Ε-BP1 σε Thr

37/46 και Thr

70, Akt σε Ser

473 και Thr

308 και ERK1 /2 σε Thr

202 και Tyr

204 ή τα συνολικά επίπεδα αυτών των πρωτεϊνών.

πολλαπλασιασμό των κυττάρων Anchorage-εξαρτώμενη.

PANC -1 κύτταρα (10

5) τοποθετήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας ιστού 35 mm σε DMEM που περιείχε 10% FBS. Μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 ° C, ομάδες οι καλλιέργειες επωάστηκαν με νευροτενσίνη και ινσουλίνη με ή χωρίς μετφορμίνη σε ϋΜΕΜ που περιέχει 0.25% FBS ή ραπαμυκίνη, KU63794 ή μετφορμίνη σε ϋΜΕΜ που περιέχει 2.5% FBS. Οι καλλιέργειες κατόπιν επωάστηκαν για 4 ημέρες, και ο συνολικός αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε από το ελάχιστο των έξι φρεάτια ανά συνθήκη χρησιμοποιώντας ένα μετρητή Coulter, μετά κύτταρο συσσωματώματα αποσυσσωματώθηκαν με πέρασμα του κυτταρικού εναιωρήματος 10 φορές μέσω 19-gauge, και στη συνέχεια, μια βελόνα 21-gauge.

Υλικά