Αφηρημένο

Συνθετικά τριτερπενοειδή είναι αντιοξειδωτικές ρυθμιστές της φλεγμονής (AIMS) που εμφανίζουν ευρεία αντικαρκινική δράση. ΣΤΟΧΟΙ συνδέονται με KEAP1 και αναστέλλει την ικανότητά του να προωθήσει υποβάθμιση NRF2. Ως αποτέλεσμα, NRF2 αυξάνει μεταγραφή των γονιδίων που επαναφέρουν την ισορροπία οξειδοαναγωγής και τη μείωση της φλεγμονής. ΣΤΟΧΟΙ αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση αυξάνοντας δραστηριότητα NRF2 στο μικροπεριβάλλον του όγκου και με διαμόρφωση της δραστικότητας των ογκογόνων οδών σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του ΝΡ-κΒ, σε καρκινικά κύτταρα. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι η απώλεια KEAP1 ή μετάλλαξη που οδηγεί σε υψηλά επίπεδα υπέστη NRF2 δραστηριότητα μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη του καρκίνου και την αύξηση χημειοαντίσταση. Απώλεια KEAP1 αυξάνει επίσης τα επίπεδα των άλλων ογκογόνο πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένης ΙΚΚβ και BCL2. Η φαινομενική πλεονέκτημα επιβίωσης παρέχονται σε ορισμένα κύτταρα όγκου από την απώλεια των λειτουργικών KEAP1 θέτει το ερώτημα του κατά πόσον η φαρμακολογική αναστολή του KEAP1 θα μπορούσε να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου. Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, χαρακτηρίσαμε τα βασικά επίπεδα της KEAP1 και NRF2 σε μια ομάδα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών και προφίλ της δραστικότητας ενός AIM, RTA 405. Βρήκαμε ότι σε κυτταρικές σειρές όγκου με χαμηλή ή μεταλλαγμένο KEAP1, και

Keap1

– /-

ποντικού εμβρυϊκών ινοβλαστών, πολλαπλούς στόχους KEAP1 συμπεριλαμβανομένων NRF2, ΙΚΚβ και BCL2 ήταν αυξημένα.

Keap1

– /- ποντικού εμβρυϊκών ινοβλαστών είχαν επίσης υψηλότερα ποσοστά πολλαπλασιασμού και σχηματισμό αποικιών από τα αντίστοιχα αγρίου τύπου τους. Σε κύτταρα με λειτουργική KEAP1, RTA 405 αυξημένα επίπεδα NRF2, αλλά όχι τα επίπεδα ΙΚΚβ ή BCL2, και δεν αύξησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή της επιβίωσης. Επιπλέον, RTA 405 ανέστειλε την αύξηση σε παρόμοιες συγκεντρώσεις σε κύτταρα με διαφορετικά επίπεδα βασική δραστικότητα NRF2 και σε κύτταρα με φυσικού τύπου ή μεταλλαγμένη

KRAS

. Τέλος, η προ-θεραπεία με RTA 405 δεν προστατεύουν τα κύτταρα του όγκου από doxorubicin- ή σισπλατίνη μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η φαρμακολογική ενεργοποίηση του NRF2 από στόχους είναι διαφορετική από τη γενετική ενεργοποίησης και δεν προβλέπει μια αύξηση ή πλεονέκτημα επιβίωσης στα καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Probst BL, McCauley L, Trevino Ι, Wigley WC, Ferguson DA (2015) ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων είναι διαφορικά που επηρεάζουν την συστατική ενεργοποίηση των NRF2 από KEAP1 διαγραφή και φαρμακολογική ενεργοποίηση του NRF2 από το Συνθετικό τριτερπενοειδείς, RTA 405. PLoS ONE 10 (8): e0135257. doi: 10.1371 /journal.pone.0135257

Επιμέλεια: Ιρίνα Β Λεμπέντεβα, το Πανεπιστήμιο Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 17η Δεκεμβρίου 2014? Αποδεκτές: 20 Ιούλη 2015? Δημοσιεύθηκε: 24 Αυγ του 2015

Copyright: © 2015 Probst et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:.. το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από Reata Pharmaceuticals που είχε ένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση, και την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: Όλοι οι συγγραφείς είναι νυν ή πρώην υπαλλήλους της Reata Pharmaceuticals. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Συνθετικά triterpenoids oleanane, όπως bardoxolone μεθυλίου και RTA 408, είναι αντιοξειδωτικές ρυθμιστές της φλεγμονής ( AIMS) που εμφανίζουν ευρεία δραστικότητα κατά του όγκου σε μοντέλα της πρόληψης του καρκίνου και τη θεραπεία [1? 2], και είναι καλά ανεκτή σε ασθενείς με προχωρημένο κακοήθειες [3]. Ο πρωταρχικός στόχος των στόχων είναι Kelch-όπως ECH-πρωτεΐνης που συνδέεται με 1 (KEAP1), μια πρωτεΐνη προσαρμογέα υπόστρωμα για το συγκρότημα Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης CUL3-RBX1. Υπό κανονικές συνθήκες, KEAP1 διευκολύνει την ουβικιτινίωση των πρωτεϊνών υποστρώματος της, πράγμα που οδηγεί σε αποικοδόμηση τους από το πρωτεάσωμα [4]. Ένα από αυτά τα υποστρώματα είναι ο πυρηνικός παράγοντας παράγοντας μεταγραφής (ερυθροειδή προερχόμενο 2) -όπως 2 (NFE2L2), επίσης γνωστή ως NRF2. Στοχεύει ισχυρά αυξηθεί η δραστηριότητα NRF2 με σύνδεση προς ένα υπόλειμμα κυστεϊνης αισθητήρα (C151) σε KEAP1, προκαλώντας μια αλλαγή διαμόρφωσης που καθιστά KEAP1 ανίκανη να προωθήσει την υποβάθμιση NRF2 [5-8]. NRF2 συσσωρεύεται και εισέρχεται στον πυρήνα όπου αυξάνει την έκφραση του αντιοξειδωτικού στοιχείου απόκρισης (ARE) που περιέχει γονίδια-στόχους. Τα προϊόντα αυτών των γονιδίων περιλαμβάνουν αντιοξειδωτικό και κυτταροπροστατευτική πρωτεΐνες, οι οποίες αποκαθιστούν την κυτταρική ισορροπία οξειδοαναγωγικά και τη μείωση της φλεγμονής. Κατά συνέπεια, οι στόχοι έχουν επιδείξει ευρύ αντι-φλεγμονώδη και κυτταροπροστατευτική δραστικότητα σε πολλά ζωικά μοντέλα, όπως επίσης και στην κλινική [9? 10].

Η αύξηση στην αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δραστηριότητα που λαμβάνει χώρα κατά την θεραπεία με τους στόχους μειώνει την συχνότητα εμφάνισης όγκου και βάρους στην χημεία και στο γενετικά προκαλείται από τα μοντέλα της καρκινογένεσης [11-14]. Ομοίως, οι στόχοι να μειώσει το οξειδωτικό στρες και φλεγμονή στο μικροπεριβάλλον των εγκατεστημένων όγκων και αναστέλλουν την ανάπτυξη όγκου, μετάσταση, αγγειογένεση, και όγκο ανοσολογική καταστολή [15-20]. Στοχεύει επίσης αναστέλλουν άμεσα τον πολλαπλασιασμό και επάγει την απόπτωση σε κύτταρα όγκου [1? 2? 21? 22]. Αν και ο μηχανισμός που υπογραμμίζει την άμεση αντικαρκινική δράση των στόχων στα κύτταρα του όγκου δεν είναι πλήρως κατανοητός, είναι γνωστό ότι οι στόχοι ρυθμίζουν την δραστηριότητα αρκετών σχετιζόμενων με τον καρκίνο πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένης της κυκλίνης D1 [12? 23], CDKN1A (p21) [23], JAK1 και STAT3 [24? 25]., HER2 [26], και τον πυρηνικό παράγοντα κάπα Β (ΝΡ-κΒ) [27-29]

Αν και NRF2 διαδραματίζει έναν αντικαρκινικό ρόλο στο μικροπεριβάλλον του όγκου, ήταν προτείνεται να έχει το αντίθετο αποτέλεσμα σε κακοήθη κύτταρα [30? 31]. Πρόσφατες γενετικές αναλύσεις των ανθρώπινων όγκων έχουν δείξει ότι μεταλλάξεις στο

KEAP1

ή

NRF2

-τα οποία οδηγούν σε υψηλά επίπεδα υπέστη NRF2 δραστηριότητα που σχετίζεται με αυξημένο πολλαπλασιασμό, χημειοαντίσταση και κακή επιβίωση [30 ? 31]. Άλλοι μηχανισμοί ενεργοποίησης NRF2 έχουν επίσης εντοπιστεί, συμπεριλαμβανομένης της μειωμένης

KEAP1

έκφραση οφείλεται σε υπερμεθυλίωση προαγωγού ή έκφραση των miRNAs [32-34] και η αυξημένη έκφραση του

NRF2

λόγω ενεργοποιημένα ογκογονίδια, όπως KRAS [35]. Έχει προταθεί ότι αυξημένη δραστικότητα NRF2 παρέχει ένα πλεονέκτημα επιβίωσης σε καρκινικά κύτταρα, αυξάνοντας τα επίπεδα αντιοξειδωτικών για τη διαχείριση περίσσεια αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και αντιδρώντα είδη αζώτου (RNS), τα οποία είναι κοινά χαρακτηριστικά του καρκίνου [35]. Οι παρατηρήσεις αυτές θέτουν το ερώτημα του κατά πόσον φαρμακολογικών παραγόντων που ενεργοποιούν NRF2 μέσω αναστολής KEAP1 θα μπορούσε να προωθήσει την ανάπτυξη του καρκίνου ή να αυξήσουν τη θεραπευτική αντίσταση [31? 36? 37]. Το ζήτημα αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό δεδομένου του δυναμικού των NRF2 ενεργοποιητών για την πρόληψη και τη θεραπεία μιας ποικιλίας των χρόνιων φλεγμονωδών και αυτοάνοσων ασθενειών [38-40].

Σύμφωνα με τον γενικό αντικαρκινική δράση των στόχων, δεν υπάρχει καμία απόδειξη ότι Οι ενώσεις αυτές αυξάνουν την συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου σε ζωικά μοντέλα [36? 37]? μάλλον, υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις για το αντίθετο [1? 31]. Ως εκ τούτου, η γενετική επαγωγή NRF2 με απώλεια της λειτουργίας KEAP1 φαίνεται να έχει μια διαφορετική επίδραση από ό, τι AIM-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της NRF2 μέσω αναστολής KEAP1 στην ανάπτυξη του όγκου. Ωστόσο, τόσο οι NRF2 εξαρτώμενη επιδράσεις στο μικροπεριβάλλον του όγκου και οι NRF2-ανεξάρτητες επιδράσεις επί των κυττάρων του όγκου ενδέχεται να συμβάλλει στην αντικαρκινική δράση των στόχων in vivo. Για τις γνώσεις μας, η επίδραση του AIM-μεσολαβούμενη επαγωγή NRF2 στον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και χημειοευαισθησία των απομονωμένων κυττάρων όγκου δεν έχει προηγουμένως αξιολογηθεί.

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της AIM-μεσολαβούμενη επαγωγή NRF2 επί της ανάπτυξης των κυττάρων του όγκου και επιβίωση, χαρακτηρίσαμε πρώτα το βασικό επίπεδο δράσης NRF2 σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών όγκου για την ταυτοποίηση εκείνων που είχαν μια άγριου τύπου KEAP1-NRF2 άξονα (δηλαδή, χαμηλά βασικά επίπεδα NRF2), καθώς και εκείνα που είχαν μια δυσλειτουργική KEAP1-NRF2 άξονα (δηλ., τα υψηλά βασικά επίπεδα NRF2). Με αυτές τις πληροφορίες, αξιολογήσαμε την αντικαρκινική δραστικότητα ενός AIM, RTA 405 (CDDO-αιθυλ αμίδιο) [8? 11? 41-47] σε κυτταρικές γραμμές όγκου όπου θα μπορούσε να προκληθεί δραστηριότητα NRF2 (δηλαδή, εκείνα με KEAP1 άγριου τύπου -NRF2 άξονας) σε σύγκριση με τις κυτταρικές γραμμές όγκου όπου δραστηριότητα NRF2 ήταν ήδη στο μέγιστο επίπεδο (δηλ, αυξημένη δραστηριότητα NRF2 λόγω της απώλειας της λειτουργίας KEAP1). Να συγκρίνουν άμεσα τις επιπτώσεις της απώλειας της λειτουργίας KEAP1 με τα αποτελέσματα των φαρμακολογικών αναστολή KEAP1, θα αντιμετωπίζονται άγριου τύπου (WT) και

Keap1

– /- ποντικού εμβρυϊκών ινοβλαστών με RTA 405 και αξιολογούνται πολλαπλασιασμό και επιβίωση, καθώς και τα επίπεδα της ΙΚΚβ και BCL2-δύο άλλα υποστρώματα KEAP1 που έχουν καρκίνο προώθηση δραστηριοτήτων. Αξιολογήσαμε επίσης την επίδραση της RTA 405-μεσολαβητική ενεργοποίηση NRF2 επί KRAS-επαγόμενο πολλαπλασιασμό και την ευαισθησία των καρκινικών κυτταρικών σειρών σε άλλα χημειοθεραπευτικά. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματα από αυτή τη μελέτη δείχνουν ότι NRF2 επαγωγή με στοχεύει όχι δεν αυξάνει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή την επιβίωση και ότι τα κατάντι επιδράσεις του φαρμακολογική αναστολή KEAP1 με στόχοι είναι διαφορετικές από εκείνες που προκύπτουν από την απώλεια των λειτουργικών KEAP1 σε καρκινικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

RTA 405 (2-κυανο-3,12-dioxooleana-1,9 (11) -διεν-28-οϊκό αμίδιο οξέος) και RTA 402 (μεθυλ 2-κυανο-3,12-διοξοολεαν-1,9-διεν-28-οϊκό άλας) συντέθηκαν με Reata Pharmaceuticals, Inc. (Irving, ΤΧ USA). Εκτός αν σημειώνεται διαφορετικά, όλα τα άλλα χημικά αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis ΜΟ, USA). Άγριου τύπου και

Keap1

– /- εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού (ΠΜΑ) ελήφθησαν από τον Dr. Masayuki Yamamoto (Tohoku University, Ιαπωνία) [48? 49]. LSL-Kras

MEFs G12D ελήφθησαν από το Δρ Tyler Jacks (Τεχνολογικό Ινστιτούτο της Μασαχουσέτης, Cambridge, MA) [50]. Όλες οι άλλες κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA USA). ATCC χρησιμοποιεί ανάλυση σύντομο διαδοχική επανάληψη (STR) ελέγχου όλων των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών για την αυθεντικότητα και την καθαρότητα πριν από τη διανομή. Όλες οι κυτταρικές σειρές πέρασαν για λιγότερο από έξι μήνες μετά την ανάνηψη.

Κυτταρική καλλιέργεια

ΠΜΑ, MCF-7, PANC-1, Α549 και HeLa κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο Eagle Medium ( DMEM), τα κύτταρα SK-N-SH σε Ελάχιστο Απαραίτητο μέσο Eagle (ΕΜΕΜ), και G-361 κύτταρα σε μέσο McCoy 5Α. ΫΜΕΜ και του McCoy 5Α μέσον ελήφθησαν από την Life Technologies, Grand Island, ΝΥ USA. ΕΜΕΜ ελήφθη από την ATCC, Manassas, VA USA. Όλες οι άλλες κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Life Technologies). Το μέσο καλλιέργειας συμπληρώθηκε με 10% FBS και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. FBS που χρησιμοποιούνται στην καλλιέργεια του LSL- Kras

G12D ΠΜΑ ήταν θερμικά απενεργοποιημένο. Οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν με την παρουσία 5% CO

2 στους 37 ° C.

Η κυτταρική ανάπτυξη και κλωνογενείς δοκιμασίες

Για πειράματα μέτρησης κυττάρων, ΠΜΑ (5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων, σε επεξεργασία με RTA 405 την επόμενη ημέρα, και μετρήθηκαν σε διάφορα χρονικά διαστήματα χρησιμοποιώντας αναλυτή Vi-CELL XR κυττάρων (Beckman Coulter, Indianapolis, ΙΝ USA). Για κλωνογονική προσδιορισμούς, άγριου τύπου (1 Χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) και

Keap1

– /- (0,5 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) Οι MEF σπάρθηκαν σε 6 -Λοιπόν πιάτα και, 6 ώρες αργότερα, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RTA 405. Μετά από επτά ημέρες, οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν (1: 7 οξικό οξύ: μεθανόλη) και χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες σε μεθανόλη. Αποικίες ≥50 κύτταρα μετρήθηκαν.

Για να προσδιοριστεί IC

50 και GI

50 τιμές, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RTA 405 σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 50 έως 1000 ηΜ . Η ανάπτυξη των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη χρήση της σουλφοροδαμίνης Β (SRB) δοκιμασία [51]. Εν συντομία, 50 μL παγωμένου 50% (w /v) τριχλωροξεικού οξέος προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες επωάστηκαν στους 4 ° C για 1 ώρα. Τα σταθεροποιημένα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν πέντε φορές με νερό της βρύσης και ξηραίνεται στον αέρα όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα βάφτηκαν με 0,4% (w /v) SRB σε 1% οξικό οξύ σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. Βαμμένα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν πέντε φορές με 1% οξικό οξύ και ξηραίνεται στον αέρα. SRB βαφή διαλυτοποιήθηκε με προσθήκη 200 μL 10 mM Tris Base και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm. Για IC

50 προσδιορισμός, η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε μετά από 48 ώρες ανάπτυξης. Για GI

50 προσδιορισμό, τα κύτταρα σε μια πλάκα σταθεροποιήθηκαν κατά την έναρξη του πειράματος (χρόνος 0) και κυττάρων σε ένα εις διπλούν πλάκα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RTA 405 για 72 ώρες. Το ποσοστό αύξησης των RTA 405-κατεργασμένα κύτταρα σε σχέση με κύτταρα υπό αγωγή με όχημα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: [(Τ

Θα

z) /(CT

z)] χ 100, όπου (Τ

z) είναι η τιμή απορρόφησης σε χρόνο μηδέν, (C) είναι τιμή απορρόφησης από φρεάτια υπό αγωγή με όχημα μετά από 72 ώρες, και (Τ

i) είναι η τιμή απορρόφησης από κατεργασμένα φρεάτια με το φάρμακο. Για πειράματα συνδυασμό με doxorubicin ή σισπλατίνη, τα κύτταρα προ-αγωγή με RTA 405 για 2, 6, ή 24 ώρες και στη συνέχεια κατεργάζεται με δοξορουβικίνη ή κισπλατίνη για επιπλέον 72 ώρες. IC

50 και GI

50 τιμές προσδιορίστηκαν από καμπύλες δόσης-απόκρισης χρησιμοποιώντας GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, Καλιφόρνια ΗΠΑ).

Real-time PCR αντίστροφης μεταγραφής

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα με το RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD ΗΠΑ) και αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας Superscript II (Life Technologies). PCR αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας εκκινητές επικυρωθεί για ειδικότητα και αποτελεσματικότητα ενίσχυσης. Αντίστροφη μεταγραφή και πληροφορίες κύκλος PCR μπορεί να βρεθεί στο S1 πρωτόκολλα και αλληλουχίες εκκινητών PCR παρέχονται στον Πίνακα S1.

ριβοσωμικής πρωτεΐνης S9

(

RPS9

) και

ριβοσωμική πρωτεΐνη L19

(

RPL 19

) χρησιμοποιήθηκαν ως γονίδια αναφοράς για τα δείγματα ανθρώπου και ποντικού, αντίστοιχα. Η σχετική αφθονία του κάθε γονιδίου στόχου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο Ct (ΔΔCt) [52].

KEAP1

και

NRF2

αλληλουχίας

Γονιδιωματική DNA απομονώθηκε από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ DNeasy (Qiagen). PCR ενίσχυση και ανάλυση αλληλουχίας των κωδικοποιητικών εξονίων του

KEAP1

και εξώνιο 2 του

NRF2

εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές όπως περιγράφηκε προηγουμένως [53? 54]. Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ καθαρισμού QIAquick PCR (Qiagen) και η αλληλουχία του με Sequetech Corporation (Mountain View, CA USA). Όλες οι μεταλλάξεις επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση και στις δύο κατευθύνσεις.

κηλίδωση Western

Πειραματικές λεπτομέρειες για την παρασκευή των προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου και πυρηνικά εκχυλίσματα είναι σε S1 πρωτόκολλα. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA USA). Πρωτεΐνες (20 έως 40 μα) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Αντίσωμα πληροφορίες παρέχονται στον Πίνακα S2. Υπεροξειδάσης συζευγμένο δευτερογενή αντισώματα ήταν από Jackson ImmunoResearch (West Grove, ΡΑ USA).

δοκιμασίες ROS και η γλουταθειόνη

επίπεδα Basal ROS μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας CM-H

2DCFDA (Molecular Probes , Eugene, OR ΗΠΑ). Τα συνολικά επίπεδα γλουταθειόνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό GSH-Glo γλουταθειόνης (Promega, Madison, WI USA). επίπεδα γλουταθειόνης κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα κυτταρικής πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας την δοκιμασία SRB. Για τον έλεγχο για την μεταβλητότητα μεταξύ των πειραμάτων, η βασική ROS και το συνολικό επίπεδο της γλουταθειόνης για κάθε κυτταρική σειρά ομαλοποιήθηκε σε NCI-Η460 (οριστεί σε τιμή 1). Επιπρόσθετες πειραματικές λεπτομέρειες για ROS και δοκιμασίες γλουταθειόνη μπορεί να βρεθεί στο S1 πρωτόκολλα.

Caspase-3/7 Δράση

Caspase-3/7 Δράση προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [55] χρησιμοποιώντας DEVD- AFC (EMD Biosciences, Billerica, ΜΑ USA) ως υπόστρωμα. Για τον έλεγχο για την μεταβλητότητα μεταξύ των πειραμάτων, ο φθορισμός κάθε δείγματος ομαλοποιήθηκε με 786-0 (ρυθμιστεί σε μια τιμή των 100).

siRNA

Α549, DU 145, και τα κύτταρα NCI-H460 ανάστροφα επιμολύνθηκαν σε OptiMEM με Lipofectamine RNAiMax (Life Technologies, Grand Island ΝΥ USA) και 20 ηΜ siNRF2 ή 20 ηΜ siNTPool (GE Dharmacon, Lafayette, CO Η.Π.Α.), L-003755-00-0005 και D-001810-10-05 , αντίστοιχα). Mock δείγματα δεν έλαβε siRNA. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 4 χ 10

5 (Α549 και DU 145) ή 8 Χ 10

5 (ΝΟΙ-Η460) κύτταρα ανά φρεάτιο ή σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 8 χ 10

3 1,6 χ 10

4 κύτταρα (NCI-Η460) ανά φρεάτιο σε RPMI (Α549 και DU 145) ή 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή RTA 405. Μετά από 0, 24, 48, και 72 ώρες τα κύτταρα στις πλάκες 96-φρεατίων σταθεροποιήθηκαν με 50% TCA και υποβάλλονται σε επεξεργασία για την δοκιμασία SRB όπως περιγράφηκε παραπάνω. Μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα στις πλάκες 24-φρεατίων πλύθηκαν με στείρο PBS και συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης για κηλίδες Western.

LSL-Kras

G12D ποντικού εμβρυϊκών ινοβλαστών

ανασυνδυασμό του KRAS

LSL-G12D αλληλόμορφο διεξήχθη

in vitro

χρησιμοποιώντας ένα αυτο-αποκοπής Cre ανασυνδυάση. Οι MEF μολύνθηκαν με 500-1000 ΜΟΙ μακέτα, Ad-EGFP ή σωματίδια αδενοϊό Ad-Cre /EGFP (GeneCopoeia, Rockville, MD USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά τη μόλυνση. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το DNeasy Blood & amp? Κιτ ιστού (Qiagen) και PCR διεξήχθη για να αξιολογηθεί ανασυνδυασμού όπως περιγράφεται (https://web.mit.edu/jacks-lab/protocols/KrasCond_tablesTWO.html). Τα επίπεδα του άγριου τύπου και Kras

πρωτεϊνών G12D αξιολογήθηκαν από κηλίδα western.

Στατιστικές Αναλύσεις

Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism 6.0 λογισμικό. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό στατιστική σημασία που περιγράφονται σε κάθε λεζάντα σχήματος.

Αποτελέσματα

Η κατάταξη των ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών όγκου από βασική δραστικότητα NRF2

NRF2 έχει αναφερθεί ότι είναι συστατικώς ενεργά σε όγκους με μεταλλαγμένο KEAP1. Ο κύριος στόχος της μελέτης μας ήταν να διαπιστωθεί αν η ενεργοποίηση NRF2 από RTA 405 αυξάνει την κυτταρική ανάπτυξη ή την επιβίωση σε ανθρώπινες γραμμές όγκου. Εμείς αιτιολογημένη ότι RTA 405 θα είναι σε θέση να αυξήσει τη δραστηριότητα NRF2 σε κυτταρικές γραμμές με χαμηλή ή μεταλλαγμένο KEAP1? Ωστόσο, η κατάσταση της KEAP1 και το βασικό επίπεδο δραστηριότητας των NRF2 έχει αναφερθεί για πολύ λίγα κοινά γραμμές καρκίνου [34? 48? 56]. Επομένως, προκειμένου να αξιολογηθεί η επίδραση της RTA 405, πραγματοποιήσαμε πρώτα μια σειρά πειραμάτων για να χαρακτηρίσει την κατάσταση του KEAP1 και NRF2 σε ένα πάνελ είκοσι ανθρώπινες γραμμές όγκου (Πίνακας 1). Για να επιτευχθεί αυτό, θα αλληλουχία όλα κωδικοποίησης εξώνια του

KEAP1

και εξόνιο 2 του

NFE2L2

να διαπιστωθεί αν κάποια από τις κυτταρικές σειρές είχαν μεταλλάξεις σε αυτά τα γονίδια. Εμείς περιορίζεται

NFE2L2

αλληλούχισης στο εξώνιο 2, επειδή δίδει τον κώδικα της περιοχής KEAP1 αλληλεπιδρώντα και έχει προηγουμένως δειχθεί ότι φιλοξενούν ενεργοποίηση μεταλλάξεων [30? 53]. Αποτελέσματα αλληλούχισης μας επιβεβαίωσαν τα αναγνωρισμένα

KEAP1

μεταλλάξεις στο Α549 και ΝΟΙ-Η460 μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές [54] και πιστοποιήσει μία νέα μετάλλαξη (Q193H) στην κυτταρική σειρά ΝΟΙ-Η23, η οποία προέρχεται επίσης από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (Πίνακας 1). Εμείς δεν βρήκε μεταλλάξεις στο εξόνιο 2 του

NFE2L2

σε αυτό το πάνελ των κυτταρικών σειρών.

Η

Εκτός από

KEAP1

και

NFE2L2

μεταλλάξεις , άλλοι μηχανισμοί, όπως υπερμεθυλίωση υποκινητή, έκφραση miRNA, και ογκογόνο σηματοδότηση-μπορεί να οδηγήσει σε υψηλά επίπεδα συστατική δραστηριότητα NRF2 [32-35]. Για να προσδιορίσετε αν κάποια από τις κυτταρικές σειρές, χωρίς να

KEAP1

ή

NFE2L2

μεταλλάξεις είχαν υψηλά επίπεδα της βασικής δραστηριότητας NRF2, μετρήσαμε KEAP1, πυρηνική NRF2 και NQO1 (α πρωτότυπη γονίδιο στόχο NRF2) πρωτεΐνη επίπεδα με κηλίδα western. Βρήκαμε ότι, παρά το γεγονός ότι άγριου τύπου

KEAP1

και

NFE2L2

γονίδια, αρκετές από τις κυτταρικές σειρές είχαν τα χαρακτηριστικά των αυξημένων δραστηριοτήτων NRF2. Για να διευκολυνθεί η ανάλυση, θα ομαδοποιούνται τις κυτταρικές σειρές σε τρεις κατηγορίες: εκείνους με χαμηλή, μέτρια ή υψηλή βασική δραστηριότητα NRF2 (Σχήμα 1Α? Uncropped κηλίδες είναι στο S1 σχήμα). Σε κυτταρικές γραμμές με χαμηλή βασική δραστηριότητα NRF2 (

n

= 8), η δραστηριότητα του KEAP1 εμφανίστηκε επαρκείς για να προάγουν αποικοδόμηση NRF2, με αποτέλεσμα χαμηλά επίπεδα NQO 1 (Σχήμα 1Α και 1Β, το άνω πάνελ). Σε κυτταρικές σειρές με μέτρια βασική δραστηριότητα NRF2 (

n

= 5), άγριου τύπου KEAP1 ήταν ανιχνεύσιμη, αλλά φάνηκε να είναι ανεπαρκής για να καταστείλει εντελώς δραστηριότητα NRF2, με αποτέλεσμα ανιχνεύσιμα επίπεδα του NQO1 (Σχήμα 1Α και 1Β , μεσαίο πάνελ). Κυτταρικές γραμμές με υψηλή βασική δραστηριότητα NRF2 (

n

= 7) είτε είχαν μεταλλαγμένο ή χαμηλά επίπεδα KEAP1, η οποία εμφανίστηκε για να καταστήσει ανίκανο να στοχεύσει NRF2 για την αποικοδόμηση (Εικόνα 1Α και 1Β, κάτω πάνελ). Ως αποτέλεσμα, τα υψηλά επίπεδα της πυρηνικής NRF2 και NQO1 ανιχνεύθηκαν σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές.

A. Σχηματικό διάγραμμα που δείχνει τα χαρακτηριστικά των κυτταρικών σειρών με χαμηλό (άνω πάνελ), μέτρια (μεσαίο πάνελ), ή υψηλή (κάτω πίνακας) βασική δραστηριότητα NRF2. B. επίπεδα πρωτεΐνης του KEAP1 και NQO1 (προϊόν λύσης ολικού κυττάρου), και NRF2 (πυρηνικό κλάσμα), αξιολογήθηκαν με στύπωμα Western. Ακτίνη (προϊόν λύσης ολικού κυττάρου) και HDAC2 (πυρηνικό κλάσμα) χρησίμευσαν ως μάρτυρες φόρτωσης. Με βάση την KEAP1, NRF2, και τα επίπεδα της πρωτεΐνης NQO 1, κυτταρικές γραμμές κατηγοριοποιούνται ανάλογα με βασική δραστικότητα NRF2 τους

Η

Η πλειονότητα των κυτταρικών γραμμών θα μπορούσαν να ταξινομηθούν σε μία από τις τρεις ομάδες.? Ωστόσο, μερικά κατείχε χαρακτηριστικά περισσότερες από μία ομάδες. Για παράδειγμα, σε σύγκριση με άλλες κυτταρικές γραμμές στην χαμηλή βασική ομάδα δραστηριότητα NRF2, η γραμμή SK-N-SH είχαν σχετικά χαμηλά επίπεδα KEAP1 (Σχήμα 1Β, άνω πίνακας). Ωστόσο, με βάση τα χαμηλά επίπεδα των πυρηνικών NRF2 και NQO1, τα επίπεδα KEAP1 σε αυτή τη γραμμή φαίνεται να είναι επαρκείς για να προάγουν αποικοδόμηση NRF2. Αντιστρόφως, σε σύγκριση με τις άλλες κυτταρικές γραμμές στην υψηλή βασική ομάδα δραστηριότητα NRF2, η γραμμή NCI-Η460 είχε σχετικά υψηλά επίπεδα KEAP1 (Σχήμα 1Β, κάτω πίνακας). Ωστόσο, είναι γνωστό ότι το

KEAP1

είναι μεταλλαγμένο (D236H) σε κύτταρα NCI-H460 και ότι NRF2 είναι ουσιαστικά δραστική [54]. Παρά την πολύ υψηλά επίπεδα πυρηνικής NRF2 στην Α498 κυτταρική γραμμή, εντοπίστηκαν σχετικά χαμηλά επίπεδα NQO1. Ωστόσο, αυτή η κυτταρική σειρά εμφάνισε διάφορα άλλα χαρακτηριστικά που ήταν σύμφωνες με υψηλή βασική δραστικότητα NRF2 (βλέπε παρακάτω)? γεγονός που υποδηλώνει ότι η ίδια η NQO1 μπορεί να χαθεί ή να μεταλλαχθεί. Τέλος, αν και KEAP1 ήταν μεταλλαγμένη (Q193H) στην κυτταρική σειρά ΝΟΙ-Η23 (Πίνακας 1), δραστικότητα NRF2 φάνηκε να είναι χαμηλή, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μετάλλαξη Q193H μπορεί να είναι ένας πολυμορφισμός που δεν μειώνει τη λειτουργία KEAP1. Αυτό είναι σύμφωνο με αποτελέσματα από μία πρόσφατη μελέτη όπου 4 από 18 μεταλλάξεις KEAP1 προσδιορίζονται σε δείγματα καρκίνου του πνεύμονα δεν επηρέασε την ικανότητα του KEAP1 για την προώθηση NRF2 αποικοδόμησιν [57].

Χαρακτηρισμός ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές όγκου με διαφορετικά επίπεδα της βασικής δραστηριότητας NRF2

Για να επικυρώσετε περαιτέρω την ταξινόμηση των κυτταρικών σειρών, μετρήσαμε τα επίπεδα των άλλων βιοδεικτών της δραστηριότητας NRF2, συμπεριλαμβανομένων των

NQO1

mRNA, ROS, και τα επίπεδα της γλουταθειόνης. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω,

NQO 1

είναι μια πρωτότυπη γονίδιο στόχος NRF2 και θα περίμενε κανείς την μεταγραφή του να είναι αυξημένα σε κυτταρικές σειρές με υψηλή βασική δραστικότητα NRF2. Σε σύγκριση με κυτταρικές γραμμές με χαμηλή βασική δραστηριότητα NRF2, εκείνοι με μέτρια και υψηλή βασική δραστικότητα NRF2 είχε διαδοχικά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης NQO1 (σχήμα 2Α και S2 Εικ). Εκτός από την

NQO1

, NRF2 ρυθμίζει επίσης την έκφραση αρκετών γονιδίων που εμπλέκονται στη σύνθεση της γλουταθειόνης και αυξήσεις κυτταρικά επίπεδα γλουταθειόνης [58]. Σε συμφωνία με αυτό, τα συνολικά επίπεδα γλουταθειόνης ήταν σημαντικά αυξημένα σε κυτταρικές σειρές με υψηλή βασική δραστικότητα NRF2 σε σύγκριση με εκείνους με χαμηλή ή μέτρια βασική δραστικότητα NRF2 (Σχ 2Β και S2 Εικ). Με την αύξηση των επιπέδων της γλουταθειόνης καθώς και την έκφραση άλλων γονιδίων αντιοξειδωτικό, NRF2 μειώνει το οξειδωτικό στρες. Για να αξιολογηθεί το επίπεδο του οξειδωτικού στρες σε κάθε κυτταρική γραμμή όγκου, μετρήσαμε τα επίπεδα ROS χρησιμοποιώντας ένα φθορίζοντα ανιχνευτή. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα ROS ήταν χαμηλότερα στις κυτταρικές γραμμές με υψηλή βασική δραστικότητα NRF2 (Σχ 2C και S2 Εικ). Συνεπώς, συνοπτικά, κυτταρικές σειρές με υψηλή βασική δραστικότητα NRF2 είχαν υψηλά επίπεδα NQO 1 mRNA, τα υψηλά επίπεδα γλουταθειόνης, και χαμηλά επίπεδα ROS. Επιπλέον, NQO1 και η γλουταθειόνη επίπεδα αυξάνεται κατ ‘αναλογία με το επίπεδο της βασικής δραστηριότητας NRF2. Σε αντίθεση, τα επίπεδα ROS δεν ακολούθησε παρόμοια τάση: δεν υπήρχε καμία διαφορά μεταξύ των κυτταρικών σειρών με χαμηλά και μέτρια επίπεδα δραστηριότητας NRF2. Αυτό υποδηλώνει ότι η μέτρια ενεργοποίηση NRF2 είναι επαρκής για να αυξήσει την έκφραση του γονιδίου-στόχου και τη σύνθεση της γλουταθειόνης, αλλά δραστηριότητα NRF2 πρέπει να φθάσουν ένα ορισμένο όριο, το οποίο μπορεί να επιτευχθεί μόνο όταν KEAP1 απουσιάζει ή ανενεργό, έτσι ώστε να μειωθούν τα επίπεδα ROS.

Ένα.

NQO1

επίπεδα mRNA για μεμονωμένες γραμμές κυττάρων μετρήθηκαν με qPCR και ομαλοποιούνται στη μέση βασική

NQO1

επίπεδο για όλες τις κυτταρικές γραμμές με χαμηλή βασική δραστηριότητα NRF2. B. Τα συνολικά επίπεδα γλουταθειόνης για μεμονωμένες κυτταρικές σειρές ομαλοποιήθηκαν σε ΝΟΙ-Η460 (οριστεί σε τιμή 1), η οποία λειτουργεί ως αναφορά σε κάθε πείραμα. Οι τιμές που παρουσιάζονται κανονικοποιήθηκαν με το μέσο βασικό επίπεδο γλουταθειόνης για όλες τις κυτταρικές γραμμές με χαμηλή βασική δραστηριότητα NRF2. Γ Αντιδραστικά είδη οξυγόνου επίπεδα (ROS) για μεμονωμένες κυτταρικές σειρές ομαλοποιήθηκαν σε ΝΟΙ-Η460 (οριστεί σε τιμή 1), η οποία λειτουργεί ως αναφορά σε κάθε πείραμα. Οι τιμές που παρουσιάζονται ομαλοποιήθηκαν με το μέσο επίπεδο των βασικών ROS για όλες τις κυτταρικές γραμμές με χαμηλή βασική δραστηριότητα NRF2. D-E. Basal ΙΚΚβ (D) και BCL2 (Ε) τα επίπεδα πρωτεΐνης σε ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές όγκου με χαμηλή, μέτρια ή υψηλή βασική δραστικότητα NRF2. γραμμές σφάλματος στην Α-C είναι SEM. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με Mann-Whitney test. *,

P

& lt? .05? **

P

& lt? .01? ***

P

& lt? . .001

Η

Εκτός από NRF2, KEAP1 ρυθμίζει τα επίπεδα άλλων πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων ΙΚΚβ και BCL2 [59? 60]. KEAP1 συνδέεται ευθέως και να διευκολύνει την ουμπικουιτίνωση της ΙΚΚβ και BCL2 από το συγκρότημα Ε3 λιγάση CUL3 /RBX1. Αυτό οδηγεί σε υποβάθμιση των ΙΚΚβ και BCL2 από το πρωτεόσωμα. Κατά συνέπεια, η απώλεια της KEAP1 στις γραμμές κυττάρων οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα ΙΚΚβ και BCL2 [59? 60], και τα επίπεδα είναι αυξημένα ΙΚΚβ σε ανθρώπινους όγκους με χαμηλά επίπεδα KEAP1 /CUL3 [59? 61]. ΙΚΚβ είναι μία κινάση που προάγει αποικοδόμηση του πυρηνικού παράγοντα του ενισχυτή γονιδίου του πολυπεπτιδίου κάππα ελαφριάς σε Β-κύτταρα αναστολέα, άλφα (NFKBIA ή ΙκΒα), ένα καταστολέα του παράγοντα μεταγραφής ΝΡ-κΒ η οποία ελέγχει την έκφραση πολλών γονιδίων που εμπλέκονται στην επιβίωση, και BCL2 είναι ένα ογκογονίδιο με αντι-αποπτωτική δραστικότητα. Λόγω της σχέσης μεταξύ KEAP1, ΙΚΚβ, BCL2, και ο καρκίνος, ερευνήσαμε κατά πόσο οι κυτταρικές γραμμές όγκου με υψηλή βασική δραστικότητα NRF2 επίσης είχαν αυξημένα επίπεδα ΙΚΚβ και πρωτεΐνη BCL2. Βρήκαμε ότι πολλές κυτταρικές σειρές στον πίνακα έτειναν να έχουν υψηλά επίπεδα ΙΚΚβ (S3 Εικ). Ωστόσο, τα επίπεδα ΙΚΚβ ήταν αυξημένα στο 100% των κυτταρικών γραμμών με υψηλή βασική δραστικότητα NRF2, σε σύγκριση με το 80% των κυτταρικών σειρών με μέτρια δραστηριότητα NRF2, και 62,5% των κυτταρικών γραμμών με χαμηλή δραστηριότητα NRF2 (Σχήμα 2D). Όταν ερευνήσαμε BCL2, βρήκαμε ότι λιγότερες από τις κυτταρικές γραμμές είχαν αυξημένα επίπεδα BCL2 (S3 Εικ). Στις κυτταρικές σειρές με υψηλή βασική δραστικότητα NRF2, 71% είχαν επίσης υψηλά επίπεδα BCL2, σε σύγκριση με 37,5% και 20% των κυτταρικών γραμμών με χαμηλή και μέτρια δραστηριότητα NRF2, αντίστοιχα. Όπως και τα επίπεδα της γλουταθειόνης, τα επίπεδα ΙΚΚβ αυξάνεται κατ ‘αναλογία με τα επίπεδα της βασικής δραστηριότητας NRF2, ενώ BCL2 τα επίπεδα ήταν αυξημένα σε μεγαλύτερο κλάσμα των κυτταρικών σειρών που είχαν υψηλή δραστηριότητα NRF2, σε σύγκριση με εκείνους με χαμηλή ή μέτρια δραστηριότητα NRF2. Αυτό υποδηλώνει ότι διαφορετικά υποστρώματα KEAP1 μπορεί να έχουν διαφορετικές ευαισθησίες σε αλλαγές στη λειτουργία KEAP1. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα είναι συνεπή με την άποψη ότι η απώλεια του KEAP1 επηρεάζει πολλούς στόχους που είναι σχετικοί με την καρκινική κυτταρική βιολογία, συμπεριλαμβανομένων όχι μόνο NRF2, αλλά και ΙΚΚβ και BCL2 [62].

ΙΚΚβ και BCL2 επίπεδα σε

Keap1

– /- ποντικού εμβρυϊκών ινοβλαστών

Έχουμε δείξει ότι τα επίπεδα της ΙΚΚβ και BCL2 τείνουν να είναι υψηλότερα σε κυτταρικές σειρές όγκων που έχουν υψηλή βασική δραστηριότητα NRF2, γεγονός που υποδηλώνει ότι μεταλλαγμένα ή χαμηλή /απούσα επίπεδα KEAP1 μπορεί να συμβάλει σε υψηλά επίπεδα ΙΚΚβ και BCL2. Χρησιμοποιήσαμε το επόμενο άγριου τύπου (WT) και

Keap1

– /- εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού (ΠΜΑ) ως μοντέλο για την εκτίμηση άμεσα τη σχέση μεταξύ KEAP1, ΙΚΚβ, και τα επίπεδα BCL2. Όπως έχει ήδη αναφερθεί [49], NRF2 ανυψώθηκε σε

Keap1

– /- ΠΜΑ (S4 σχήμα). Η θεραπεία με RTA 405 αυξημένα επίπεδα NRF2 στο WT ΠΜΑ, αλλά όχι σε

Keap1

– /- ΠΜΑ (S4 σχήμα). Συνεπής με την ενεργοποίηση NRF2, η πρωτεΐνη (Α) και του mRNA (σχήμα 3Β) επίπεδα NQO 1 και GCLM, δύο γονίδια στόχους NRF2, ήταν αυξημένα σε

Keap1

– /-

MEFs . Εκτός από αυξημένα επίπεδα NRF2 και κατάντη γονίδια στόχους της, βρήκαμε επίσης ότι τα επίπεδα του ΙΚΚβ και BCL2 ήταν υψηλότερα σε

Keap1

– /- σε σχέση με το MEFs WT ΠΜΑ (Σχήμα 3Α). Για να καθοριστεί εάν τα αυξημένα επίπεδα ΙΚΚβ συσχετίζεται με μία αύξηση της δραστηριότητας του, αξιολογήσαμε τα επίπεδα κατάντη συστατικών του μονοπατιού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ. ΙΚΚβ φωσφορυλιώνει ΙκΒα, η οποία οδηγεί σε υποβάθμιση της και την επακόλουθη ενεργοποίηση του παράγοντα μεταγραφής ΝΡ-κΒ. Συνεπής με υψηλότερη δραστικότητα ΙΚΚβ, παρατηρήσαμε χαμηλότερα επίπεδα ΙκΒα (Σχήμα 3Α) και σημαντικά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης διαφόρων γονιδίων στόχου ΝΡ-κΒ, συμπεριλαμβανομένων

CCND1

,

ΜΜΡ9

,

Ptgs2

,

VEGF

,

και Bcl2l1

, στο

Keap1

– /- ΠΜΑ σε σύγκριση με WT ΠΜΑ (Σχήμα 3C και S5 σχήμα). Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην

CCL2

,

Birc3

ή

Il1b

επίπεδα, και για άγνωστους λόγους

CCL5

επίπεδα ήταν σημαντικά υψηλότερα σε αυτοφυείς από στο

Keap1

– /- ΠΜΑ (S5 σχήμα). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η απώλεια των αποτελεσμάτων KEAP1 σε υψηλότερα επίπεδα ΙΚΚβ και BCL2, και ότι το αυξημένο επίπεδο ΙΚΚβ οδηγεί σε αύξηση της δραστικότητας μεταγραφικής ΝΡ-κΒ. Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με την παρατήρηση ότι η απώλεια του KEAP1 συσχετίστηκε με υψηλότερη δραστικότητα μεταγραφικής ΝΡ-κΒ σε ανθρώπινους όγκους [61].

A. Τα βασικά επίπεδα των πρωτεϊνών KEAP1-αλληλεπιδρούν και κατάντη στόχους αξιολογήθηκαν σε WT και

Keap1

– /- ΠΜΑ με κηλίδα western. GAPDH χρησίμευσε ως μάρτυρας φόρτωσης. επίπεδα Β Βασικό mRNA της

NQO1

και

Gclm

στο WT και

Keap1

– /- ΠΜΑ μετράται με qPCR. τα επίπεδα mRNA σε

Keap1

– /- κύτταρα ομαλοποιήθηκαν σε WT κύτταρα. *,

P

& lt? .05? **

P

& lt? 0,01 vs. WT από ζεύγη t-test. επίπεδα Γ Βασικό mRNA της

CCND1

,

ΜΜΡ9

,

Ptgs2

, και

VEGF

στο WT και

Keap1

– /- MEFs μετρήθηκε με qPCR. τα επίπεδα mRNA σε

Keap1

– /- κύτταρα ομαλοποιήθηκαν σε WT κύτταρα. ***

P

& lt? .001? ****,

P

& lt? 0,0001 έναντι WT με t-test. Για όλα τα πάνελ, τα σημεία των δεδομένων είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι SD

Η

ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων με διαφορετικά επίπεδα της βασικής δραστηριότητας NRF2

Απώλεια KEAP1 έχει αναφερθεί ότι αυξάνει το ρυθμό πολλαπλασιασμού των ΠΜΑ. [48? 63]. Για να επιβεβαιώσετε και να επεκτείνουν τις μελέτες αυτές, μετρήσαμε τον αριθμό των βιώσιμων WT και

Keap1

– /- ΠΜΑ σε διαστήματα 24 ωρών μετά τη σπορά. 0,01? 0.0001. 0,05? 0,01? 0,0001? ns, δεν είναι σημαντική. 0,01? 0.001. 0,05? 0,05? 0,05? 0,01?