Αφηρημένο

Ιστορικό

Παρά τα στοιχεία που ενεργοποιημένα μακροφάγα πράξη σε μια φλεγμονώδη μικροπεριβάλλον για την προώθηση γαστρική καρκινογένεση μέσω της σηματοδότησης β-κατενίνης, τα αποτελέσματα της σηματοδότησης β-κατενίνης σε γαστρικό μετάσταση των καρκινικών κυττάρων και η σχέση αυτών των κυττάρων με τις γύρω μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους που δεν έχουν άμεσα μελετηθεί.

Μέθοδοι

η ανοσοϊστοχημική χρώση χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση 103 ασθενείς. Μία δοκιμασία εισβολή χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της σχέσης μεταξύ μακροφάγων και γαστρικού καρκίνου κύτταρα. β-κατενίνης κέρδος-of-λειτουργίας και απώλειας λειτουργίας προσεγγίσεις έγιναν. Για να αξιολογηθεί ο μηχανισμός ρύθμισης της β-κατενίνης στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα, Western και αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής χρησιμοποιήθηκαν.

Αποτελέσματα

Η αύξηση της πυκνότητας των μακροφάγων σχετίστηκε με προχωρημένο στάδιο και κακή επιβίωση . Κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου συν-καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα ρυθμισμένο μέσο έδειξαν αυξημένη πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης και αυξημένη ικανότητα εισβολής. ΑΚΤ αλλά δεν ERK οργανωμένη μετακίνηση της β-κατενίνης. ΜΜΡ7 και CD44, και οι δύο β-κατενίνης κατάντη γονίδια, συμμετείχαν σε μακροφάγα ενεργοποιημένα γαστρικού καρκίνου κυτταρική εισβολή.

Συμπέρασμα (ες)

Συλλογικά, τα κλινικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι διήθηση μακροφάγων συσχετίζεται με αυξημένο βαθμό και κακή πρόγνωση για τους ασθενείς με γαστρικό καρκίνο που υποβλήθηκαν σε ριζική εκτομή. Μακροφάγα μπορεί να προκαλέσει εισβολής με την ενεργοποίηση του μονοπατιού β-κατενίνης

Παράθεση:. Wu MH, Lee WJ, Hua KT, Kuo ML, Lin MT (2015) διήθηση μακροφάγων Προκαλεί γαστρικός καρκίνος ικανότητα εισβολής με την ενεργοποίηση της β-κατενίνης Pathway . PLoS ONE 10 (7): e0134122. doi: 10.1371 /journal.pone.0134122

Επιμέλεια: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, Ιταλία

Ελήφθη: 16 Σεπ, 2014? Αποδεκτές: 6 Ιούλη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 30 Ιουλίου του 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:.. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν (NSC 98 έως 2314-B-002-055-MY2)

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι από τις πιο συχνές μορφές καρκίνου σε όλο τον κόσμο και σχεδόν τα δύο τρίτα αυτών των ασθενών θα πεθάνουν από. νόσου τους. [1] GC συνδέεται στενά με το

Helicobacter pylori

μόλυνση, η οποία οδηγεί σε χρόνια φλεγμονή. [2] η φλεγμονώδης μικροπεριβάλλον χαρακτηρίζεται από την παρουσία των λευκοκυττάρων ξενιστή με κυρίως μακροφάγα τόσο στην υποστήριξη στρώματος και ιστούς όγκων. [3] Έρευνες δείχνουν ότι σχετίζονται με όγκους φλεγμονώδεις αποκρίσεις, τόσο σε τοπικό όσο και συστημική, είναι σημαντικοί ανεξάρτητους παράγοντες στην πρόοδο του όγκου και τη μετάσταση. [4, 5] Ωστόσο, οι δεσμοί μεταξύ αυτών των μοριακών μεσολαβητών και χρόνια φλεγμονή δεν είναι πλήρως κατανοητός .

η ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt είναι ένα σημαντικό βήμα στην καρκινογένεση. Μεταλλάξεις κατά μήκος του μονοπατιού Wnt-β-κατενίνης συμβαίνουν σε περίπου 90% του παχέος και του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος και σε περίπου 30% των GCs. [6, 7] Επιπλέον, παράγοντα νέκρωσης όγκων-α (TNF-α) που προέρχεται από ενεργοποιημένα μακροφάγα προάγει δραστικότητα β-κατενίνης σε κύτταρα GC. [8, 9] Ωστόσο, παρά τα στοιχεία που ενεργοποιημένα μακροφάγα πράξη σε μια φλεγμονώδη μικροπεριβάλλον για την προώθηση της γαστρικής ογκογένεση μέσω σηματοδότησης β-κατενίνης, τα αποτελέσματα των ενεργοποιημένων σηματοδότησης β-κατενίνης στην κυτταρική GC μετάσταση και τη σχέση αυτών των κυττάρων με τις γύρω μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ) που δεν έχουν άμεσα μελετηθεί.

με βάση την ανωτέρω συμπεράσματα, υποθέσαμε ότι η οδός β-κατενίνης μπορεί επίσης να εμπλέκεται στη ρύθμιση των μακροφάγων που προκαλείται από τη μετάσταση GC. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε πρώτα την πυκνότητα των διείσδυσε μακροφάγων και την έκφραση της β-κατενίνης σε ιστούς γαστρικό καρκίνωμα χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία (IHC). Τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά του γαστρικού καρκινώματος και την πρόγνωση αποδείχθηκε. Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα μακροφάγα διεγείρουν πυρηνική μετατόπιση του β-κατενίνης και να ενισχύσει την ικανότητα εισβολής των κυττάρων GC. Τα ευρήματά μας αποδεικνύουν και περαιτέρω να υποστηρίξει μια σημαντική σχέση μεταξύ της TAM και κατάντη μεσολαβητή σηματοδότησης της β-κατενίνης, στη ρύθμιση μετάσταση GC.

Υλικό και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα

η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο και την ανθρώπινη ηθική Επιτροπής Θεσμικών αναθεώρηση του Εθνικού Ταϊβάν Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο. Γραπτή συγκατάθεση για τη χρήση των δειγμάτων για ερευνητικούς σκοπούς λήφθηκε από όλους τους ασθενείς πριν από το χειρουργείο. την πληροφόρηση των ασθενών ήταν ανώνυμες και αποχαρακτηριστούν πριν από την ανάλυση.

Η μελέτη αναδρομικά συμμετείχαν 205 ασθενείς που διαγιγνώσκονται με GC που έλαβαν ριζική χειρουργική εκτομή στο Τμήμα Γενικής Χειρουργικής, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν από τον Ιανουάριο 1998 έως τον Ιανουάριο του 2002. Από αυτούς, 102 ασθενείς οι οποίοι δεν διέθεταν στοιχεία παρακολούθησης ή ο οποίος πέθανε από επιπλοκές περιεγχειρητική εξαιρέθηκαν και οι υπόλοιποι 103 ασθενείς συμπεριλήφθηκαν στις αναλύσεις. Κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές ταξινομούνται σύμφωνα με την ταξινόμηση ΤΝΜ (5η έκδοση, 1997) και τα χαρακτηριστικά συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Η συνολική επιβίωση (OS) ορίστηκε ως το διάστημα μεταξύ χειρουργική επέμβαση και θανάτου ή μεταξύ χειρουργική επέμβαση και την τελευταία παρακολούθηση για την επιβίωση των ασθενών.

Τα μονοκλωνικά αντισώματα και IHC

Οι εκτομή δείγματα GC μονιμοποιήθηκαν σε φορμόλη και ενσωματωμένο σε παραφίνη. Οι τομές εξετάστηκαν για ΤΑΜ διήθηση και β-κατενίνης χρησιμοποιώντας μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-CD68 (κλώνος KP1, DakoCytomation, Glostrup, Denmark) και μονοκλωνικά β-κατενίνης αντίσωμα (κλώνος 15Β8, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), αντιστοίχως.

Αξιολόγηση των ανοσοβαφή

Για να αξιολογήσουμε την πυκνότητα των ιστών που διηθούν CD68 + μακροφάγα, τμήματα ιστού εξετάστηκαν από μια σκάφους επικυρωμένο παθολόγο (CI Ιαν) σε χαμηλή ισχύ (100 ×) και των πέντε πιο αντιπροσωπευτικά πεδία επιλέχθηκαν σε 400 × μεγέθυνση. Τα αποτελέσματα μετρήθηκαν με το χέρι και εκφράστηκαν ως το άθροισμα του αριθμού των κυττάρων σε πέντε 400 × μικροσκοπικά πεδία για κάθε περιοχή του κάθε δείγματος.

Cell Culture

κύτταρα GC AGS, Ν87 (αγορασμένο από την American Type Culture Collection (Manassas, VA)), ΜΚΝ45 (που αγοράστηκε από την Science Research Τράπεζα Health Resources (Osaka, Japan)) και TSGH (που αγοράστηκε από τη Συλλογή Bioresource και Research Center (Hsinchu, Ταϊβάν)) και ανθρώπινη μονοκυτταρική γραμμή ΤΗΡ-1 (που αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (Manassas, VA)) κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI-1640 (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, Life Technologies, Inc. ) και 2 mM Ε-γλουταμίνη (Life Technologies, Inc.).

κύτταρα ΤΗΡ-1 σπάρθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας και διεγείρονται για να διαφοροποιηθούν σε μακροφάγα με επώαση με 100 ng /ml 12-Ο-δεκατετρανοϋλοφορβόλης-13 -οξικό (ΤΡΑ, Sigma-Aldrich) για 24 ώρες. Τα μακροφάγα πλύθηκαν τρεις φορές με μέσο RPMI που περιείχε 10% FBS, επωάζονται στο μέσο αυτό για άλλες 24 ώρες για να εξαλειφθεί η επίδραση του ΤΡΑ και επωάστηκαν σε μέσα ελεύθερα ορού για άλλες 24 ώρες. Τα συλλεγέντα και συνενωμένα υπερκείμενα καλλιέργειας χρησιμοποιήθηκαν όπως μακροφάγων ρυθμισμένο μέσο (CM) όπως περιγράφηκε προηγουμένως. [5, 10]

Πολλαπλασιασμού /Βιωσιμότητας Δοκιμασία

κύτταρα GC σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και συν-καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς CM μακροφάγων. Ο πολλαπλασιασμός /βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με χρωματομετρική δοκιμασία χρησιμοποιώντας 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) (Sigma-Aldrich).

Δοκιμασία Ιη Vitro Εισβολή

Η δοκιμασία εισβολή διεξήχθη χρησιμοποιώντας Transwell θαλάμων κυτταροκαλλιέργειας (Millipore Corp., Billerica, ΜΑ). Τα εισβάλλοντα κύτταρα μετρήθηκαν στα 400 χ μεγέθυνση σε 10 διαφορετικά πεδία για κάθε ένθετο. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

RNA Εκχύλιση και RT-PCR

Μετά την διέγερση με ή χωρίς CM μακροφάγων για 6 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν GC και το συνολικό RNA εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίου ΤπζοΙ ( Invitrogen, Carlsbad, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA ενισχύθηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιώντας εκκινητές για ΜΜΡ7 (προς τα εμπρός: 5′-AGTCAATCCTGCCTTCTTAGCC, αντίστροφη: 5′-GCTCCCACCTTCCCTCTTGG), CD44 (προς τα εμπρός: 5′-TGCCGCTTTGCAGGTGTAT, αντίστροφη: 5′-TCCCATGTGAGTGTCTGGTAGC), κυκλίνη D1 ( προς τα εμπρός: 5′-CCCAGCCATGGAACACCA, αντίστροφη: 5′-GGAGGGCGGATTGGAAATGA), c-myc (εμπρός: 5′-AAAGAAGGTGTTGGGGTCGG, αντίστροφη: 5′-TGGCTCCCCCTGTTATTTGG) και GAPDH (προς τα εμπρός: 5′-GGGTGATGCAGGTGCTACTT, αντίστροφη: 5′-GGCAGGTTTCTCAAGACGGA) .

Πυρηνική και κυτταροπλασματικά Κλασμάτωση

Μετά την διέγερση με ή χωρίς CM μακροφάγων για 6 ώρες, τα κύτταρα GC λύθηκαν σε 300 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης σε πάγο και φυγοκέντρηση σε 5400 rpm. Το υπερκείμενο συλλέγεται ως κυτοσολικό κλάσμα. Πυρηνική κλάσματα συλλέχθηκαν, τότε εκτελείται σε ηλεκτροφόρηση δωδεκυλθειικού νατρίου πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) για ανάλυση στυπώματος Western.

Western Blotting Ανάλυση

μετά από διέγερση με CM μακροφάγα, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS , αποξέστηκαν σε RIPA ρυθμιστικό διάλυμα και φυγοκεντρήθηκε. Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Millipore Corp.) Η μεμβράνη ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα για β-κατενίνης, ΑΚΤ, ERK, JNK (SC1496, SC8312, SC154, SC474, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA, USA), ΜΜΡ7 (MAB3322, CHEMICON, Temecula, CA, USA), CD44 (ab51037, Abcam, Cambridge, MA, USA), c-myc (GTX103436, GeneTex, Hsinchu Πόλη , Ταϊβάν), κυκλίνη D1 (SC246, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA), β-ακτίνη (ab8226, Abcam), HDAC1, π-ΑΚΤ, π-ΕΚΚ, π-JNK (SC7872, SC7985-R, SC7383, SC6254, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA) και δευτερεύον αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology).

Ανοσοκυτοχημεία

Anti-συνολικών αντισωμάτων β-κατενίνης χρησιμοποιήθηκε ως πρωτογενές αντίσωμα, και αντι- ποντίκι ανοσοσφαιρίνη G (IgG) Alexa 594 χρησιμοποιήθηκε σαν το δευτερογενές αντίσωμα. Καλυπτρίδες στη συνέχεια τοποθετούνται χρησιμοποιώντας μέσο στερέωσης περιέχει DAPI για την πυρηνική χρώση.

λεντοϊών παραγωγή και μόλυνση

Σύντομη φουρκέτα RNAs (Τα siRNAs) αγοράστηκαν από τον πυρήνα Εθνικού Μηχανισμού RNAi στο Ακαδημαϊκό Sinica (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Η αλληλουχία στόχος του β-κατενίνης shRNA 1 ήταν 5′-CCGGTCTAACCTCACTTGCAATAATCTCGAGATTATTGCAAGTGAGGTTAGATTTTTG-3 ‘? εκείνη της β-κατενίνης shRNA 2 ήταν 5’-CCGGTTGTTATCAGAGGACT-AAATACTCGAGTATTTAGTCCTCTGATAACAATTTTTG-3 ‘. Η βραδέος ιού φορέα και οι φορείς της συσκευασίας του διαμολύνθηκαν σε κύτταρα 293Τ συσκευασίας με διαμόλυνση φωσφορικού ασβεστίου. Εν συντομία, 293Τ κύτταρα χωρίστηκαν (10

6) σε 10 εκατοστά

2 πιάτα 1 ημέρα πριν την επιμόλυνση. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 10 μγρ φορείς shRNA και 10 μg pCMVΔR8.91 (ο φορέας συσκευασίας) και 1 μg του pMD.G (ο φορέας φακέλου). Μετά από 5 ώρες επώασης, μέσου διαμόλυνσης αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, μέσο φακοϊό περιέχει συλλέχθηκε από την επιμόλυνση και φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm για 5 λεπτά ώστε να ιζηματοποιηθούν τα συντρίμματα των κυττάρων, το υπερκείμενο διηθείται μέσω ενός φίλτρου 0,45 μm και κύτταρα-στόχοι μολύνθηκαν με φρέσκο ​​φακοϊό περιέχουν μέσο (συμπληρωμένο με 8 μg /ml polybrene) για 24 ώρες.

Στατιστική ανάλυση

η στατιστική ανάλυση των κλινικών χαρακτηριστικών έγινε με τη χρήση του χ

2 δοκιμών και ο βαθμός διείσδυσης μεταξύ οι δύο ομάδες συγκρίθηκε με τη χρήση t-test. Οι καμπύλες επιβίωσης κατασκευάσθηκαν με τη χρήση της μεθόδου Kaplan-Meier και η στατιστική σημαντικότητα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το τεστ log-rank. Μια ρ-τιμή μικρότερη του 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Συσχέτιση Ανοσοϊστοχημική μεταβλητές με κλινικοπαθολογική Χαρακτηριστικά σε GC ασθενείς

Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε μια κυτταροπλασματική πρότυπο χρώσης CD68 για μακροφάγα. CD68 + μακροφάγα διανεμήθηκαν σε όλη περινεοπλασματικής και εντός του όγκου των ιστών, αλλά μόνο αραιά διασκορπισμένα στην κανονική βλεννογόνο (Σχήμα 1Α-1C). Η πυκνότητα των μακροφάγων CD68 + ήταν ιδιαίτερα υψηλό σε παθολογικές όγκου στάδιο 4 αλλοιώσεις (pT4) όγκου σε σύγκριση με ρΤ1 βλάβες (Σχήμα 1D). Για να προσδιοριστεί η σχέση μεταξύ των κλινικών χαρακτηριστικών και CD68 + μακροφάγων πυκνότητα, μετρήσεις CD68 + μακροφάγα χωρίστηκαν σε εκείνους πάνω και κάτω από τις μέσες τιμές. Ο αριθμός των CD68 + μακροφάγων βρέθηκε να σχετίζεται με το βάθος του όγκου και το στάδιο (ρ = 0,001 και ρ = 0,043, αντίστοιχα) (Πίνακας 1). Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι CD68 + μακροφάγα μπορεί να είναι σημαντική για την προώθηση της εισβολής όγκου. Για περαιτέρω ανάλυση, καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier απεικονίσθηκαν για να προσδιοριστεί η σύνδεση των μακροφάγων με την επιβίωση (Σχήμα 2). Η πυκνότητα του CD68 + μακροφάγων στον ιστό του όγκου αρνητικά που συνδέονται με τη συνολική επιβίωση (ρ = 0,0073). Οι ασθενείς με υψηλούς αριθμούς καρκινικών CD68 + μακροφάγα είχαν μικρότερη συνολική επιβίωση από εκείνους με χαμηλό αριθμό CD68 + μακροφάγων.

Η ανοσοχρώση έναντι CD68 πραγματοποιήθηκε σε πλάκες των ιστών από ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. χρώση CD68 + μακροφάγων ήταν αραιή στην κανονική γαστρικό βλεννογόνο (Α). CD68 + κύτταρα ανιχνεύθηκαν τόσο στο στρώμα και όγκου φωλιά (Β & amp? C). Η πυκνότητα των CD68 + μακροφάγων σε παθολογικές όγκου στάσης (PT) 1 (Δ) και pT4 (Ε) αλλοιώσεων του όγκου.

Η

Η αυξημένη έκφραση και ισχυρότερο σήμα της β-κατενίνης παρατηρήθηκαν με χρώση IHC σε όγκους. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η έκφραση β-κατενίνης ήταν κατά κύριο λόγο βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 3Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, η ισχυρή πυρηνική χρώση των κυττάρων GC β-κατενίνης συνδέθηκε με CD68 + μακροφάγα στις αλλοιώσεις του όγκου, ειδικά μπροστά από την εισβολή του όγκου (Σχήμα 3Β). Με βάση τα αποτελέσματα αυτά, υποθέσαμε ότι διήθηση μακροφάγων μπορεί να ενεργοποιήσει σηματοδότηση β-κατενίνης στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα, τα οποία στη συνέχεια πιθανόν οδηγεί στην εισβολή στο γαστρικό κακοήθεια.

β-κατενίνης ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται σε όγκους. (Α) Στις περισσότερες περιπτώσεις, η έκφραση β-κατενίνης ήταν κατά κύριο λόγο βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα. Ωστόσο, (Β) ισχυρή πυρηνική χρώση των β-κατενίνης στα κύτταρα GC συσχετιζόταν θετικά με CD68 + μακροφάγα στις καρκινικές βλάβες.

Η

Απαίτηση μακροφάγα για Όγκων εισβολή στο GC και Activated μακροφάγων-Induced Εισβολή GC κύτταρα

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω κλινικά ευρήματα μας

in vitro

, πρέπει πρώτα συν-καλλιεργημένα μακροφάγα με διαφορετικές κυτταρικές γραμμές GC (AGS, Ν87, ΜΚΝ-45 και TSGH). Όλες οι κυτταρικές GC σειρές που δοκιμάστηκαν θα προσλάβουν τα μακροφάγα να μεταναστεύσουν και η ικανότητα μακροφάγων πρόσληψη ήταν εξαρτάται από το βαθμό κακοήθειας των καρκινικών κυττάρων, όπως προσδιορίζεται με διεισδυτικότητα τους (Σχήμα 4Α). [11] Για να αξιολογηθεί το κατά πόσον επιθετικότητα ή τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC μπορεί να ρυθμίζεται από τα μακροφάγα, AGS, Ν87, ΜΚΝ45 και TSGH συν-καλλιεργήθηκαν με και χωρίς μακροφάγα ή CM από μακροφάγα για 24 ώρες και εισβολή και πολλαπλασιασμό τις ικανότητές τους δοκιμάστηκαν. Όλοι οι τύποι κυττάρων συν-καλλιεργήθηκαν με μακροφάγων ή CM από μακροφάγα εμφάνισαν σχεδόν 2-πλάσια αύξηση στον αριθμό των εισβάλλοντα κύτταρα (σε σύγκριση με τους αρνητικούς μάρτυρες, ρ & lt? 0,05), η οποία δεν σχετίζεται με την ικανότητα πολλαπλασιασμού τους (Σχήμα 4Β-4D ).

(Α) μετανάστευση δραστικότητα του ΤΗΡ-1 μονοκύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με διαφορετικές κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (AGS, Ν87, ΜΚΝ-45 και TSGH). ΤΗΡ-1 μονοκυττάρων θα προσληφθούν από διαφορετικές κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και η ικανότητα πρόσληψης εξαρτάται από τον βαθμό της κακοήθειας. (Β) Εισβολή ικανότητα των κυττάρων GC αντιμετωπίζονται από CM μακροφάγων. Τέσσερις διαφορετικοί τύποι κυττάρων GC (AGS, ΜΚΝ45, Ν87 και TSGH) σπάρθηκαν σε ένα θάλαμο Boyden και συν-καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς κύτταρα μακροφάγων ή CM μακροφάγων για 24 ώρες. ικανότητες Εισβολή της κάθε κυτταρικής σειράς μετρήθηκαν

in vitro

για 24 ώρες. Όλα τα δεδομένα που αντιπροσωπεύουν ο αριθμητικός μέσος όρος ± SEM. * P & lt? 0.05, ** p & lt? 0.01. (C) Επίδραση της CM μακροφάγων συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα. Ν87 και AGS κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με CM μακροφάγων, αντίστοιχα, για 24 ώρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ.

Η

Πυρηνική μετατόπιση του β-κατενίνης σε κύτταρα GC από ενεργοποιημένα μακροφάγα

Πραγματοποιήσαμε ένα πείραμα in vitro να καταλάβει αν σηματοδότηση β-κατενίνης είχε εμπλακεί σε μακροφάγων κυττάρων ενεργοποιημένων GC εισβολή. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, β-κατενίνης ανοσοαντιδραστικότητα βρέθηκε στο πυρηνικό κλάσμα κυττάρων Ν87 νωρίς, σε 15 λεπτά μετά την αγωγή CM μακροφάγων, και την ποσότητα της πρωτεΐνης πυρηνικής β-κατενίνης αυξήθηκαν σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, ανοσοφθορισμό έδειξαν συσσώρευση και την πυρηνική εντόπιση του β-κατενίνης σε κύτταρα GC συν-καλλιεργήθηκαν με CM μακροφάγων σε σύγκριση με μάρτυρες καλλιεργήθηκαν σε Ν87 (Σχήμα 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι οι διαλυτοί παράγοντες που προέρχονται από μακροφάγα βοηθήσει μεσολαβούν την συσσώρευση και την πυρηνική μετατόπιση της β-κατενίνης σε κύτταρα GC. Είμαστε παροδικά γκρέμισε β-κατενίνης από shRNA και βρήκε μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης β-κατενίνης μέσα σε 24 ώρες. Γενετική εκτομή του β-κατενίνης σε κύτταρα Ν87 αποτυγχάνει να αυξήσουν την ικανότητά τους επεμβατική θεραπεία μετά CM μακροφάγων. Αντίθετα, μη επιμολυσμένα και ελέγχου shRNA δεν είχε καμία αλλαγή στην επεμβατική δυνατότητα στα κύτταρα Ν87 υπό θεραπεία CM μακροφάγων (Σχήμα 5C). Η ποσότητα της πρωτεΐνης πυρηνικής β-κατενίνης ήταν επίσης αυξημένη σε ΕΕΑ και ΜΚΝ45 κυττάρων μετά κατεργασία CM μακροφάγων (S1 Σχήμα).

(Α) β-κατενίνης συσσωρεύεται στον πυρήνα μετά από θεραπεία με CM μακροφάγων για 30 λεπτά σε κύτταρα Ν87. (Β) Immunofiuorescent εικόνες παρατηρήθηκαν με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο. θετικών κυττάρων β-κατενίνης αναλύθηκαν με τη χρήση ενός αντισώματος αντι-β-κατενίνης, η οποία αναγνωρίζεται από δεύτερο αντίσωμα κουνελιού συζευγμένο με FITC, απεικονίζεται με πράσινο φθορισμό? Πυρηνική χρώση εντοπίστηκε από αντικηλίδωση κύτταρα με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI), που απεικονίζεται ως μπλε φθορισμό. Συν-καλλιέργεια με CM μακροφάγων, χρώση immunofiuorescence έδειξε σύμπλοκα β-κατενίνης-FITC μετατοπίζεται σε πυρήνα. (C) Εισβολή ικανότητα των κυττάρων GC αντιμετωπίζονται από CM μακροφάγων.

Η

Επιπτώσεις των μακροφάγων στην έκφραση της β-κατενίνης και οι μεταγενέστεροι Γονίδια στο Ν87 κύτταρα

Αξιολογήσαμε την παραδοσιακή Wnt /β-κατενίνης κατάντη γονίδια ΜΜΡ7, CD44, c-myc και κυκλίνης D1 προς το προκαθορίζουν εάν ενεργοποιηθούν από τα μακροφάγα. Τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης ΜΜΡ7, CD44 και του c-myc γονίδια ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα Ν87 επωάζονται με CM μακροφάγων και των επιπέδων της κυκλίνης D1 αυξήθηκε ελαφρά (Εικόνα 6Α). Μετά προτρέποντας μειωμένη δραστηριότητα εισβολή από χτυπήσει κάτω β-κατενίνης, ΜΜΡ7, CD44 και η κυκλίνη D1, αλλά όχι c-myc έδειξε πρωτεΐνη κάτω ρύθμιση (Σχήμα 6Β). Για να επιβεβαιωθεί η σχέση μεταξύ ικανότητας εισβολής και ΜΜΡ7 και CD44, ελέγξαμε την ικανότητα ενός αντισώματος να μπλοκάρει εξουδετέρωσης ΜΜΡ7 και CD44 δραστηριότητα. ικανότητα Εισβολή σημαντικά σε κίνδυνο από προκατεργασία με 2.5 μg /ml αντι-ΜΜΡ7 και με 10 μg /ml αντι-CD44 (Σχήμα 6C), αντίστοιχα, υποδεικνύοντας την εμπλοκή και των δύο γονιδίων σε μακροφάγα ενεργοποιημένα κύτταρο GC εισβολή. Βρήκαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης CD44 και κυκλίνης D1 γονίδια αυξήθηκαν στις άλλες κυτταρικές γραμμές GC (AGS και ΜΚΝ45) επωάζονται με CM μακροφάγων, αλλά ΜΜΡ7 και c-myc δεν ήταν σημαντική αλλαγή (S2 σχήμα).

( Α) Επίδραση των CM μακροφάγων σε mRNA και πρωτεΐνης έκφραση της β-κατενίνης γονιδίων κατάντη. κύτταρα Ν87 καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία CM μακροφάγων. Για RNA και το επίπεδο πρωτεΐνης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 6 ώρες και 24 θεραπεία ώρα, αντιστοίχως. κύτταρα (Β) Ν87, με ή χωρίς knock-down του β-κατενίνης χρησιμοποιώντας shRNA-2 συν-επεξεργασία παρουσία ή απουσία CM μακροφάγων. κύτταρα Ν87 συλλέχθηκαν μετά από θεραπεία 24 ώρες και αναλύθηκαν με κηλίδα western. (C) Επίδραση της ΜΜΡ7 εξουδετερώνεται αντισωμάτων στα κύτταρα GC εισβολή. κύτταρα Ν87 παρουσία CM μακροφάγων για 24 ώρες προ-θεραπεία με διάφορες δόσεις ΜΜΡ7 εξουδετερώθηκε αντισώματος (0, 0.625, 1.25 και 2.5 μγρ /ml) για 1 ώρα ισοτύπου IgG χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος το κλείδωμα. (D) Επίδραση των CD44 εξουδετερώνεται αντισώματος στην κυτταρική GC εισβολή. κύτταρα Ν87 παρουσία CM μακροφάγων για 24 ώρες είχαν προ-θεραπεία με διάφορες δόσεις CD44 αντίσωμα εξουδετερώνεται (0, 1.25, 2.5, 5 και 10 μg /ml) για 1 ώρα. Ισοτύπου IgG χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φραγμού. Όλα τα δεδομένα που αντιπροσωπεύουν ο αριθμητικός μέσος όρος ± SEM. *

σ

& lt? 0.05.

Η

Άλλοι έχουν αναφέρει μια πιθανή διασταύρωση της οδού ΜΑΡΚ με το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης. [12, 13] Ως εκ τούτου, πραγματοποιήθηκε μια μελέτη χρονικής πορείας και διαπίστωσε ότι μόνο το φωσφο-AKT και η έκφραση φωσφο-ΕΚΚ ήταν απορυθμίζεται όταν έλαβαν θεραπεία με CM μακροφάγων (S3A σχήμα). Για να επιβεβαιωθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ της ΑΚΤ /ERK μονοπάτι και β-κατενίνης, εμείς προεπεξεργασμένα κυττάρων είτε με τον αναστολέα της ERK (U0126) ή τον αναστολέα ΑΚΤ (LY294002). Μείωση του β-κατενίνης μετατόπιση εντός του πυρήνα βρέθηκε μόνο σε κύτταρα κατεργασμένα με τον αναστολέα της ΑΚΤ αλλά όχι αναστολέα ΕΚΚ, υποδεικνύοντας μακροφάγων avtivated Wnt /β-κατενίνης οδού σηματοδότησης θα μπορούσε να ρυθμίζεται από ΑΚΤ (S3b Εικ). Σε κύτταρα GC, το αποτέλεσμα ΑΚΤ φαίνεται να είναι κυρίαρχη στο μακροφάγα ενεργοποιούνται Wnt /β-κατενίνης σηματοδοτικό μονοπάτι. Προηγούμενες μελέτες πρότειναν επίσης ότι ο ΤΝΡ-α που παράγεται από μακροφάγα είναι ένας κύριος μεσολαβητής για τη φλεγμονή και μπορεί να προωθήσει δραστικότητα β-κατενίνης σε κύτταρα όγκου. Βρήκαμε ότι η χρήση εξουδετέρωσης αντίσωμα έναντι του TNF-α στην ενεργοποίηση καταστέλλουν β-κατενίνης Ν87 κάτω από την έκθεση σε CM μακροφάγων (S4 σχήμα).

Συζήτηση

Το μικροπεριβάλλον του όγκου είναι κρίσιμης σημασίας στην τον προσδιορισμό της λειτουργίας των λευκοκυττάρων και φαινότυπο. Αντικρουόμενα δεδομένα έχουν δείξει αντιογκογένεσης ή protumorigenic τις λειτουργίες της μακροφάγα κυρίως, όμως τα στοιχεία μας δείχνουν τα μακροφάγα παίζουν protumorigenic ρόλο σε ασθενείς με GC. Στην πλειονότητα των όγκων, ΤΑΜ παράγουν μυριάδες παράγοντες που προωθούν την ανάπτυξη του όγκου και την αγγειογένεση. [14, 15] Ο βαθμός διήθηση μακροφάγων στο καρκινικό κύτταρο φωλιά είναι επίσης ένας σημαντικός παράγοντας πρόβλεψης της επιβίωσης σε ασθενείς GC. [16-18] IHC ευρήματα αυτής της μελέτης δείχνουν σαφώς ότι η πυκνότητα των μακροφάγων στον ιστό GC συσχετίζεται με τον βαθμό της κλινικής στάδιο (ειδικά στον όγκο [T] στάδιο) και την επιβίωση σε ασθενείς. Οι τρέχουσες μελέτες υποδηλώνουν επίσης ότι τα μακροφάγα μπορεί να παίζουν επιβλαβή ρόλο σε προχωρημένο GC. Το εύρημα αυτό είναι σε αρμονία με μελέτες που υποδηλώνουν ότι το ανοσοποιητικό μικροπεριβάλλον μπορεί να είναι protumoral και όχι κατά των όγκων, παρά τις κάποιες αντικρουόμενες δεδομένων. [19, 20]

Η πυρηνική συσσώρευση β-κατενίνης έχει αναφερθεί σε περίπου το ένα τρίτο γαστρικών αδενοκαρκινώματα, και τα δύο εντερικών και διάχυτες τύπων. [18] β-κατενίνη είναι μια πρωτεΐνη 92 kDa η οποία λειτουργεί άμεσα σε κύτταρο-προς-κύτταρο προσκόλληση. [21] οι μεταλλάξεις του β-κατενίνης και παρεκκλίνουσα έκφραση της πρωτεΐνης του έχουν εμπλακεί σε εισβολή όγκου και μετάσταση. [22, 23] σε ευρήματά μας IHC, β-κατενίνης βρισκόταν στον πυρήνα στο μεταναστευτικό μέτωπο των κυττάρων του όγκου, αλλά όχι στην πιο κεντρική περιοχή των πρωτοπαθών όγκων, όπου εντοπίζεται στη μεμβράνη του πλάσματος . Οι παρατηρήσεις αυτές μπορεί επίσης να βρεθεί σε ορθοκολικό δειγμάτων όγκου [24]. Wnt ενεργοποίηση /β-κατενίνης σε καρκινικά κύτταρα που βρίσκονται στο μεταναστευτικό μέτωπο έχει υποτεθεί ως ένα σημαντικό βήμα στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου [25].

Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε επίσης β-κατενίνη που βρίσκεται στον πυρήνα των κυττάρων του όγκου με μακροφάγα που βρίσκονται γειτονικά, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή σχέση μεταξύ μακροφάγων και την πυρηνική μετατόπιση του β-κατενίνης σε κύτταρα όγκου. β-κατενίνης στην επεμβατική μπροστά από GCs εξηγείται εν μέρει από τις αλληλεπιδράσεις μέσα στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Επιβεβαιώσαμε

in vitro

που μακροφάγα να αυξήσουν την ικανότητα εισβολής των κυττάρων GC. Χρησιμοποιώντας ανοσοφθορισμού συνεστιακή μικροσκοπία, προσδιορίσαμε εντοπισμό και συσσώρευση του β-κατενίνης στον πυρήνα σε αγωγή μακροφάγα. Έτσι, υποψιαζόμαστε ότι οι κυτοκίνες που εκκρίνονται από τα μακροφάγα επάγουν β-κατενίνης πυρηνική μετατόπιση στα κύτταρα GC, αυξάνοντας έτσι την ικανότητα εισβολή τους. Η επεμβατική μέτωπο των επιθηλιακών όγκων αντιπροσωπεύει ένα μικροπεριβάλλον στο οποίο μακροφάγα αλληλεπιδρούν με παρεγχυματικά κύτταρα με την παραγωγή εξωκυττάριας μήτρας και με την έκκριση κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων που προάγουν τοπικά πολλαπλασιασμό των κυττάρων και εισβολή. [26, 27] Ωστόσο, στη μελέτη μας, αυξημένη β-κατενίνης έκφραση

in vitro

δεν μετέβαλε τον πολλαπλασιασμό, υποδεικνύοντας ότι από μόνη της, δεν είναι επαρκής για να αυξήσει κακοήθεια όγκων. Η διαπίστωση αυτή αποδεικνύεται επίσης ότι προηγουμένως β-κατενίνης προωθεί μόνο θέσεις προσκόλλησης για να σχηματίσουν εστιακά και διεγείρει κατεύθυνσης μετανάστευση και εισβολή του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα αλλά όχι εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των γαστρικών και κύτταρα καρκίνου προστάτη. [28-30] Παρ ‘όλα αυτά, το κύτταρο στρωματικό παρακρινή ρύθμιση της Wnt σηματοδότησης σε επιθηλιακά κύτταρα είναι πιθανό συντονίζεται από ένα πιο σύνθετο δίκτυο για την προώθηση και αναστέλλοντας την έκκριση παραγόντων. Οι κατάντη επιπτώσεις των διαφορετικών επιπέδων του σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης (και ιδίως εκείνες που επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ΕΜΤ και τοπική εισβολή) αποτελούν από ακόμα ελάχιστα κατανοητή. β-κατενίνης μετατοπίζεται στον πυρήνα όπου δεσμεύεται με παράγοντες μεταγραφής του παράγοντα ενισχυτή παράγοντα κυττάρων Τ /λεμφοκυττάρων (TCF /LEF) οικογένεια και εκκινεί μεταγραφή των γονιδίων στόχων όπως

κυκλίνη D1

,

C-

myc και

ΜΜΡ-7

[31, 32] που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό, την εισβολή όγκου και η μετάσταση. [33, 34] τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι οι οδοί σηματοδότησης μέσω των οποίων μακροφάγα διεγείρουν β-κατενίνης επάγουν επίσης η έκφραση των γονιδίων στόχων. Σε συμφωνία με προηγούμενες εργασίες μας, [5] ΜΜΡ-7 και CD44 ήταν δύο συστοιχίες PCR προσδιορίζονται μετά συγκαλλιέργεια με μακροφάγα ως διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια που σχετίζονται με τη μετάσταση των κυττάρων του GC. Η αποδόμηση της εξωκυττάριας μήτρας που προκαλούνται από μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) είναι μια κρίσιμη μηχανισμός κατά την εισβολή και μετάσταση όγκων. Τέτοια αποικοδόμηση είναι απαραίτητο να δημιουργηθεί ένα μικροπεριβάλλον που υποστηρίζει την ανάπτυξη των πρωτογενών όγκων και μετάσταση. Το σύμπλοκο β-κατενίνης /TCF συνέχεια ενεργοποιεί ένα μεγάλο αριθμό των ογκογονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των VEGF, c-myc, c-jun, fra-1 και της γαστρίνης που μπορούν επίσης να συμμετέχουν σε ενεργοποιημένα μακροφάγα β-κατενίνης καθοδικά συμβάντα. [35]

Μια ποικιλία οδών πιθανό διαμορφώνουν την Wnt /β-κατενίνης μονοπάτι και ρύθμιση της σηματοδότησης β-κατενίνης μπορεί να είναι περίπλοκη παρομοίως. Πρόσφατες μελέτες βρήκαν ότι CM μακροφάγων ενεργοποιεί το μονοπάτι ERK και Wnt ενεργοποιεί ERK σε ενδοθηλιακά κύτταρα. [36, 37] Εδώ, βρήκαμε ότι τα μακροφάγα διεγείρουν φωσφορυλίωση τόσο της ERK και ΑΚΤ σε κύτταρα GC. Δείξαμε ότι η θεραπεία με αναστολέα της ΑΚΤ αλλά όχι αναστολέα της ERK μειώνει β-κατενίνης μετατόπισης. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Akt παίζει ρόλους σε ενεργοποιημένα μακροφάγα σηματοδότηση β-κατενίνης σε γαστρικό τύπους κυττάρων.

Συμπεράσματα

Συλλογικά, τα κλινικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι διήθηση μακροφάγων συσχετίζεται με αυξημένη βαθμού και χειρότερη πρόγνωση για ασθενείς GC που υποβλήθηκαν σε ριζική εκτομή. Τα μακροφάγα μπορεί να επάγει διεισδυτικότητα GC με την ενεργοποίηση της οδού β-κατενίνης. Κατά συνέπεια, η καταστολή των μακροφάγων διείσδυση και την καταστολή της ενεργοποίησης του μονοπατιού β-κατενίνης αντιπροσωπεύουν πιθανές στρατηγικές για τη θεραπεία της GC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Σχ. . Επίδραση της CM μακροφάγων επί μονοπάτι β-κατενίνης

β-κατενίνης συσσωρεύεται στον πυρήνα μετά από θεραπεία με CM μακροφάγων για 30 λεπτά σε AGS και ΜΚΝ45 κύτταρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0134122.s001

(TIFF)

S2 Εικ. Επίδραση των CM μακροφάγων σε πρωτεΐνη έκφραση της β-κατενίνης γονιδίων κατάντη των κυττάρων AGS και ΜΚΝ45

doi:. 10.1371 /journal.pone.0134122.s002

(TIFF)

S3 Εικ. (Α) μακροφάγων CM επαγόμενη ΑΚΤ και την ενεργοποίηση ERK σε κύτταρα Ν87. κύτταρα (Β) Ν87 υποβλήθηκαν σε προ-θεραπεία με 10 μΜ των αναστολέων β-κατενίνης:. LY294002 ή U0126 για 1 ώρα, στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν παρουσία του CM μακροφάγων για 1 επιπλέον ώρα

ΑΚΤ, ERK και β-κατενίνης έκφραση πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν από κηλίδα Western

doi:. 10.1371 /journal.pone.0134122.s003

(TIFF)

S4 Εικ. . Εξουδετερωτικό αντίσωμα έναντι ΤΝΡ-α

κύτταρα Ν87 παρουσία CM μακροφάγων για 24 ώρες προ-αγωγή με ή χωρίς αναστολέα TNF-α για 1 ώρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0134122.s004

(TIFF)