Αφηρημένο

Ιστορικό

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η μεθυλίωση του DNA (DNAM) δείκτες στο περιφερικό αίμα μπορεί να κρατήσει την υπόσχεση ως διαγνωστικοί ή δεικτών έγκαιρης ανίχνευσης /κινδύνου για επιθηλιακών καρκίνων. Ωστόσο, μέχρι σήμερα καμία μελέτη δεν έχει αξιολογήσει τη διαγνωστική και προγνωστική δυναμικό αυτών των δεικτών σε μια μεγάλη ομάδα ελέγχου υπόθεσης και με βάση γονιδίωμα-ευρεία.

Κύρια Ευρήματα

Με την εκτέλεση του γονιδιώματος σε επίπεδο DNAM προφίλ του μια μεγάλη ομάδα ελέγχου περίπτωση καρκίνου των ωοθηκών, εμείς εδώ να αποδείξει ότι ενεργό καρκίνο των ωοθηκών έχει σημαντικό αντίκτυπο στο μοτίβο DNAM στο περιφερικό αίμα. Συγκεκριμένα, με μέτρηση των επιπέδων μεθυλίωσης πάνω από 27.000 CpGs στα κύτταρα του αίματος από 148 υγιή άτομα και 113 ίδιας ηλικίας προ-θεραπεία περιπτώσεων καρκίνου των ωοθηκών, έχουμε εξάγει μια υπογραφή DNAM που μπορεί να προβλέψει την παρουσία ενεργού καρκίνου των ωοθηκών σε τυφλές σετ δοκιμής με ένα AUC 0,8 (95% CI (0,74 – 0,87)). Μπορούμε να επικυρώνει περαιτέρω τα ευρήματά μας σε ένα άλλο ανεξάρτητο σύνολο των 122 περιπτώσεων μετά τη θεραπεία (AUC = 0,76 (0,72 – 0,81)). Επιπλέον, παρέχουν ενδείξεις για ένα σημαντικό αριθμό υποψήφιων κινδύνου ή δείκτες πρώιμης ανίχνευσης για τον καρκίνο των ωοθηκών. Επιπλέον, συγκρίνοντας την πρότυπο μεθυλίωσης με δεδομένα γονιδιακής έκφρασης από κύριους τύπους κυττάρων του αίματος, μπορούμε εδώ καταδεικνύουν ότι η ηλικία και τον καρκίνο προκαλούν κοινές αλλαγές στη σύνθεση του περιφερικού αίματος, με μυελοειδή λοξοδρόμηση που αυξάνει με την ηλικία και η οποία επιδεινώνεται περαιτέρω στο παρουσία του καρκίνου των ωοθηκών. Τέλος, δείχνουμε ότι οι περισσότεροι τον καρκίνο και συναφείς ηλικία μεταβλητότητα μεθυλίωση βρίσκεται σε CpGs που βρίσκονται εκτός των CpG νησίδων.

Σημασία

Τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν το δυναμικό της DNAM προφίλ στο περιφερικό αίμα ως εργαλείο για την ανίχνευση ή κινδύνου πρόβλεψης των επιθηλιακών καρκίνων, και εγγυάται περαιτέρω σε βάθος και ανώτερες σπουδές κάλυψη CpG σε περαιτέρω διαλεύκανση του ρόλου αυτού

Παράθεση:. Teschendorff AE, Menon U, Gentry-Maharaj Α, Ramus SJ, ΟθγΙΗβΓ Α.Ε. , Αποστολίδου S, et al. (2009) Μια Επιγενετική Υπογραφή στο περιφερικό αίμα Προβλέπει ενεργό καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 4 (12): e8274. doi: 10.1371 /journal.pone.0008274

Επιμέλεια: Rodolfo Aramayo, Texas A Δεύτερον, μπορούμε να προσδιορίσουμε δείκτες της μεθυλίωσης στο αίμα που μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτες έγκαιρης ανίχνευσης ή προδιάθεση για καρκίνο των ωοθηκών; Ταυτοποίηση των αξιόπιστων διαγνωστικών ή πρώιμων βιοδεικτών ανίχνευση προέρχονται από αίμα έχει μεγάλη κλινική και βιολογική σημασία, ειδικά για τον καρκίνο των ωοθηκών όπου η έγκαιρη διάγνωση είναι δύσκολη [18]. Τέλος, μετά τις πρόσφατες αναφορές ότι οι περισσότερες θέσεις μεταβλητού μεθυλίωση που βρίσκονται εκτός των CpG-νησιών [19], διερευνήσαμε τη γονιδιωματική μοτίβο των θέσεων μεταβλητής μεθυλίωσης σε σχέση με την πυκνότητα CpG.

Αποτελέσματα

Ηλικία και σχετίζονται με τον καρκίνο μεθυλίωσης του DNA Μοτίβα

Όλα τα 540 δείγματα περιφερικού αίματος υβριδοποιήθηκαν σε 27 k συστοιχίες beadchip Ανθρωπίνων μεθυλίωση Infinium [20] (Υλικά και Μέθοδοι, Πίνακας S1). Ένα αυστηρό έλεγχο της ποιότητας και της διαδικασίας κανονικοποίησης μεταξύ συστοιχία χρησιμοποιείται για την απομάκρυνση σύγχυση μεταβολή λόγω πειραματικών παραγόντων, με αποτέλεσμα ένα κανονικοποιημένο μήτρα δεδομένων των βαθμολογιών μεθυλίωσης (β-τιμές, 0 & lt? Β & lt? 1) απέναντι 383 δείγματα (148 υγιείς, 113 προ -Θεραπεία (pret) περιπτώσεις καρκίνου των ωοθηκών, 122 μετα-επεξεργασίας (post) περιπτώσεις καρκίνου των ωοθηκών) και 25.642 sites CpG (Υλικά και Μέθοδοι, το σχήμα S1). Singular αξία αποσύνθεση (SVD) των κανονικοποιημένων δεδομένων αποδεικνύεται τουλάχιστον 10 σημαντικές συνιστώσες της μεταβολής με τις μεγαλύτερες συνιστώσες που συνδέονται με την φαινοτυπική παράγοντες, κυρίως παρουσία καρκίνου και την ηλικία (Εικόνα S2, Υλικά και Μέθοδοι).

Ένα DNA η μεθυλίωση υπογραφή Συνεργαζόμενος με καρκίνο των ωοθηκών

Υιοθετήσαμε μια επιβλεπόμενη προσέγγιση για τη δημιουργία ενός καρκίνου συγκεκριμένη υπογραφή της μεθυλίωσης του DNA και να ρωτήσω αν μια τέτοια υπογραφή θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την πρόβλεψη της κατάστασης της νόσου των δειγμάτων τυφλή δοκιμή. Συγκεκριμένα, υποστήριξε ότι η παρουσία του όγκου μπορεί να έχει ένα αρκετά μεγάλο αντίκτυπο στην μοτίβα μεθυλίωσης του DNA ότι θα έπρεπε να είναι ανιχνεύσιμη από δείγματα περιφερικού αίματος σε ασθενείς πριν από τη υποβάλλονται σε θεραπεία.

Για να διασφαλιστεί ότι τα αποτελέσματα δεν ήταν προκατειλημμένη σε μια συγκεκριμένη επιλογή του σετ εκπαίδευσης /δοκιμή διαμέρισμα, πραγματοποιήσαμε συνολικά 100 τρεξίματα, κάθε τρέξιμο χρησιμοποιώντας ένα διαφορετικό σύνολο διαμέρισμα κατάρτισης /δοκιμή (Υλικά και Μέθοδοι). Για κάθε επιλογή του συνόλου εκπαίδευσης (90 ελέγχων και 70 δείγματα pret), χρησιμοποιήσαμε ένα πολυμεταβλητό μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης (MVLR), με το συγκεκριμένο προφίλ μεθυλίωσης CpG ως προγνωστικός και συμπεριλαμβανομένης της BSC (μετατροπή bi-θειώδες) αποδοτικότητα, η είσοδος του DNA και των παρτίδων επηρεάσει ως δυνητικά συγχυτικούς παράγοντες, για την παραγωγή ενός p-value της σύνδεσης με το καθεστώς ελέγχου ισχύει για κάθε μία από τις 25.642 περιοχές CpG (Υλικά και Μέθοδοι). Στη συνέχεια, CpG θέσεις κατατάχθηκαν σύμφωνα με p-τιμές τους και ένα συρρικνωμένο κέντρο βάρους ταξινομητή εκπαιδευτεί στην κορυφή 1000 sites CpG (FDR & lt? 0,05, Υλικά και Μέθοδοι). Παρατηρήσαμε ότι για τη μεγάλη πλειοψηφία των 100 τρεξίματα, η βέλτιστη (ή κοντά στο βέλτιστο) απόδοση ταξινομητή στην εσωτερική εγκάρσια επικυρώσεις ελήφθη με την επιλογή των 100 κορυφαία μνημεία CpG. Τέλος, σε κάθε επιχείρηση, η προκύπτουσα κορυφή 100 CpG ταξινομητή αξιολογήθηκε σε μια τυφλή σειρά δοκιμών που συνίσταται από 58 υγιείς μάρτυρες και 43 περιπτώσεις pret. απόδοση Ταξινομητής σχετικά με την εκπαίδευση και δοκιμή σύνολα αξιολογήθηκε μέσω των καμπυλών ROC και συνδέονται AUC (Εικόνα 1 Α-Β). Πάνω από τα 100 τρεξίματα, η μέση AUC και 95% CI στην εκπαίδευση και δοκιμασία σετ ήταν 0,82 (0,78-0,85) και 0,80 (0,74 – 0,87), αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι τα παράγωγα ταξινομητές διατήρησε ισχυρή προγνωστική δύναμη στα τυφλά σύνολα δοκιμών ( Εικόνα 1α-β).

α-β) απόδοση Ταξινόμηση ταξινομητές μεθυλίωσης του DNA σε α) σύνολα εκπαίδευσης και β) τυφλοί σύνολα δοκιμών. Κατάρτιση και δοκιμή σετ αποτελείται από δείγματα αίματος από τις περιπτώσεις προ-επεξεργασίας και υγιή άτομα (Υλικά και Μέθοδοι). Μέση καμπύλη ROC πάνω από 100 διαφορετικά σετ χωρίσματα κατάρτισης /δοκιμή με 95% CI φάκελο στα τυφλά σύνολα δοκιμών. Η μέση AUC και 95% CI πάνω από 100 δίνονται διαφορετικά διαμερίσματα. γ) απόδοση Κατάταξη σε σειρές δοκιμών που συνίσταται από υγιείς μάρτυρες και τα δείγματα μετά τη θεραπεία με ενδείξεις ενεργού νόσου. δ) Συσχέτιση μεταξύ της κατάταξης των κορυφαίων CpGs διακρίσεις περιπτώσεις προεπεξεργασίας από υγιή δείγματα αναφοράς σε μοντέλα παλινδρόμησης που περιλάμβαναν την ηλικία (χ-άξονας) και χωρίς την ηλικία (άξονας γ) ως συν-παράγοντα. Που απεικονίζονται είναι οι log10 (p-values) για τις 25.642 τοποθεσίες CpG, όπως αξιολογήθηκε από πολλαπλές λογιστικών παλινδρομήσεων της κατάστασης υπόθεση /έλεγχος κατά του προφίλ μεθυλίωσης CpG με την ηλικία ως συν-παράγοντα (άξονας x) και χωρίς την ηλικία ως συν- παράγοντας (γ-άξονας). Spearman συσχέτιση μεταξύ των δύο κατατάξεις δίνεται

Η

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε αν τα παράγωγα ταξινομητές θα μπορούσε να προβλέψει την κατάσταση του καρκίνου των δειγμάτων μετά τη θεραπεία με ενδείξεις ενεργού νόσου. (Καθορίζεται από τα επίπεδα CA125 στον ορό & gt? 30) κατά το χρόνο της ανάληψης δείγματος (47 δείγματα). Κατά μέσο όρο πάνω από 100 τρεξίματα, πήραμε μια AUC 0,76 (0,72 – 0,81, 95% CI) σε τυφλή σύνολα δοκιμών που συνίσταται από 58 υγιείς μάρτυρες και το (σταθερό) 47 δείγματα postreatment (Σχήμα 1γ). Σημαντική ισχύ σε διακρίσεις δειγμάτων μετά τη θεραπεία με ενεργό νόσο από εκείνους που δεν έχουν επίσης επιτευχθεί (AUC = 0.74,

P

& lt? 0.001). Συνεπώς, τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την ικανότητα των παράγωγων ταξινομητές να προβλέψουμε την παρουσία όγκων σε δείγματα μετά την επεξεργασία. Σε αντίθεση, οι ταξινομητές δεν προβλέψουμε την κατάσταση του καρκίνου των δειγμάτων μετά τη θεραπεία, χωρίς ενδείξεις ενεργού νόσου (70 δείγματα) σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες (AUC = 0,52 (0,48 – 0,55, 95% CI)).

Στη συνέχεια, ρωτήσαμε αν η απόδοση ταξινόμησης θα μπορούσε να επηρεάζεται από την ηλικία. Για να αντιμετωπιστεί αυτό, συγκρίναμε την κατάταξη των θέσεων CpG στην εποπτευόμενη ανάλυση MVLR με την αντίστοιχη κατάταξη σε ένα μοντέλο MVLR που περιλάμβαναν την ηλικία ως συν-παράγοντας. Αυτό έδειξε ότι το p-τιμές του συλλόγου ήταν σε μεγάλο βαθμό αμετάβλητη και ότι και οι δύο κατατάξεις είχαν υψηλή συσχέτιση (Spearman rank συσχετισμός = 0,998, Εικόνα 1δ), δείχνει ότι οι θέσεις CpG στις οποίες βασίστηκε κατάταξη μας ήταν προγνωστική της κατάστασης του καρκίνου, ανεξάρτητα από την ηλικία.

καρκίνος Diagnostic CpGs (CA-CpGs)

Αφού διαπιστώθηκε ότι ένας μεθυλίωσης του DNA υπογραφή από περιφερικό αίμα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να προβλεφθεί η παρουσία του καρκίνου των ωοθηκών, χρησιμοποιήσαμε την επόμενη όλες τις υγιείς μάρτυρες και προ- δείγματα θεραπεία για να αντλήσει ένα τελικό κατάλογο των εν λόγω «διαγνωστικό καρκίνου» CpGs (CA-CpGs).

Εντοπίσαμε ένα σύνολο 2714 CA-CpGs περνώντας ένα όριο FDR 0.05 (Σχήμα 2α, Πίνακας S2, S3 Εικόνα ). Παρατηρήσαμε μια λοξή προς υπομεθυλίωσης με 1513 (56%) CA-CpGs δείχνουν χαμηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης σε περιπτώσεις (Σχήμα 2α, διωνυμική δοκιμή

P

= 9 × 10

-10). Ακόμη πιο εντυπωσιακό, για τα 50 CpGs (47 μοναδικό γονίδιο loci), 41 (87%) ήσαν υπο-μεθυλιωμένα (διωνυμική δοκιμή

P

= 10

-8, Πίνακας S2). Από τους 2714 CA-CpGs, 1482 (55%) και 1232 (45%) βρίσκονταν εντός (iCpGs) και εκτός (niCpGs) νησίδες CpG [21], αντίστοιχα. Με δεδομένη την υπερεκπροσώπηση των iCpGs στη συστοιχία (76% iCpGs vs 24% niCpGs), ο αριθμός των niCpGs συνδέεται με τον καρκίνο ήταν πολύ υψηλότερο από εκείνο που αναμένεται από την τύχη (Σχήμα 2α, δοκιμασία Fisher

P

& lt? 2

e

-16). Η υπερεκπροσώπηση των niCpGs μεταξύ CA-CpGs ήταν επίσης εμφανής από την επιθεώρηση από την κορυφή του γονιδίου τόπους 47 CA-CpG με 32 (68%) εντοπίζεται στο niCpGs (δοκιμασία Fisher

P

= 6 × 10

-12 )

α) Κατανομή 2714 CA-CpGs (FDR & lt?. 0,05) από την άποψη της υπερ-και-υπομεθυλίωσης (διωνυμική P-τιμή της δοκιμής δίνονται), καθώς και σε σχέση με CpG εντοπισμού (ακριβής δοκιμασία του Fisher) . β) Επικάλυψη της ηλικίας CpGs με CA-CpGs (Fisher-test P-τιμή επικάλυψης δίνεται) και τη διανομή της κοινής ηλικίας 198 και CA-CpGs από την άποψη της υπερμεθυλιωμένων και μεθυλιωμένος πρότυπα και iCpGs /niCpGs (Διωνυμική και Fisher-test οι Ρ-τιμές που δίδονται, αντίστοιχα). Από τους 198 CpGs, 47 exbited υπερμεθυλίωση με την ηλικία και τον καρκίνο, 150 υπομεθυλίωση με την ηλικία και τον καρκίνο, 1 hyperM με την ηλικία και hypoM με καρκίνο και 0 έδειξε hypoM με την ηλικία και hypeM στον καρκίνο. γ) Γονιδιακή Ρύθμιση Εμπλουτισμός Ανάλυση για την κοινή ηλικία CA-CpGs, την ηλικία ειδικά CpGs (δηλαδή CpGs ηλικία μείον CA-CpGs) και CA-ειδικά CpGs (δηλαδή CA-CpGs μείον την ηλικία-CpGs) κατανεμημένες ανάλογα με υπερ /hypometylation. Οι Benjamini-Hochberg προσαρμοστεί P-τιμές που δίνονται. . Οι πιο σημαντικά εμπλουτισμένη βιολογική άποψη δοθεί

Η

Για να επικυρώσετε περαιτέρω τη διαγνωστική φύση των 2714 CpGs, αξιολογήσαμε επικάλυψη τους με τις 520 CpGs διακρίσεις δειγμάτων μετά τη θεραπεία με και χωρίς ενεργό καρκίνο των ωοθηκών (FDR & lt? 0.05, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό έδωσε την επικάλυψη των 355 CpGs (δοκιμασία Fisher

P

& lt? 2 × 10

-16), επιβεβαιώνοντας ότι ουσιαστικά το ίδιο καρκίνου διαγνωστική DNA υπογραφή μεθυλίωση θα μπορούσε να έχει προέλθει στη ρύθμιση μετά τη θεραπεία με τη χρήση επίπεδα CA125 ως δείκτες της παρουσίας όγκου.

βιολογική σημασία της DNAM υπογραφές

Για να διερευνήσει τις δυνατότητες λειτουργική σημασία του συνόλου CA-CpG ρωτήσαμε αν υπήρχε ειδικό εμπλουτισμό της βιολογικής τους όρους και τις οδούς, συμπεριλαμβανομένων μια μεγάλη βάση δεδομένων του λειτουργικού υπογραφών γονιδιακής έκφρασης [22]. Πρόσφατα, δείξαμε ότι η γήρανση έχει επίσης σημαντικές επιπτώσεις στην μοτίβο DNAM του περιφερικού αίματος και εντοπίστηκαν 589 CpGs σχετίζεται σημαντικά με την ηλικία (FDR & lt? 0.05) [16]. Έτσι, προκειμένου να τεμαχίσει τους ρόλους της ηλικίας και του καρκίνου πραγματοποιήσαμε Gene Set Ανάλυση εμπλουτισμού (GSEA) [22] για CpGs μοναδικά συνδέονται με την ηλικία και τον καρκίνο, καθώς και σχετικά με τα 198 CpGs (190 μοναδικό γονίδιο loci) μοιράζονται από την ηλικία και CA-CpG απαριθμεί (Σχήμα 2β, Πίνακας S2). Σημειώνουμε ότι αυτή η επικάλυψη ήταν εξαιρετικά σημαντική (Σχήμα 2β, δοκιμασία Fisher

P

& lt? 2 × 10

-16), γεγονός που υποδηλώνει ότι η ηλικία και όγκου παρουσία προκαλούν κοινές αλλαγές στο πρότυπο DNAM του περιφερικού αίματος. GSEA αποκάλυψε λειτουργικές ενώσεις (προσαρμοσμένο

P

& lt? 0,05) από τις τέσσερις κύριες κατηγορίες γονιδίων (Σχήμα 2γ, Πίνακας S3): (i)

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

-targets και αναπτυξιακών γονιδίων [23], [24] με υπερμεθυλιωμένων ηλικία CpGs, (ii) γονιδίων που εμπλέκονται στην αιμοποίηση και λεμφοειδή-μυελοειδή διαφοροποίηση με μεθυλιωμένος ηλικία και την ηλικία-CA CpGs, (iii) γονίδια που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων και φυσικών-φονιάδων (ΝΚ) κυτταροτοξικότητα με υπερμεθυλιωμένων ειδική για τον καρκίνο CpGs, και (iv) τα γονίδια που εμπλέκονται στην κυτταρική προσκόλληση και

HOXA9

ρυθμιστικών προγραμμάτων με μεθυλιωμένος καρκίνο συγκεκριμένες CpGs.

Για να κατανοήσουμε αυτές τις λειτουργικές ενώσεις υποθέσαμε ότι ορισμένα από αυτά μπορεί να αντανακλούν μεταβολές στην σύνθεση του τύπου των κυττάρων του αίματος, καθώς αυτό είναι γνωστό ότι ποικίλει με την ηλικία και τα δύο παρουσία όγκου [25] – [29]. Για να διερευνήσουν περαιτέρω το θέμα, ρωτήσαμε αν τα γονίδια που είναι γνωστό ότι εκφράζονται διαφορικά μεταξύ κύριοι τύποι κυττάρων αίματος [30] ήταν υπερεκπροσωπούνται στην ηλικία και τις λίστες CA-CpG. Αρκετές σημαντικές συσχετίσεις βρέθηκαν, η οποία ήταν εντονότερη για τον καρκίνο από ό, τι τις υπογραφές σχετιζόμενη με την ηλικία (Πίνακας 1). Συγκεκριμένα, μεταξύ των CpGs μεθυλιωμένος εις περιπτώσεων καρκίνου, υπήρχε εμπλουτισμός των γονιδίων που είναι γνωστό ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω σε κοκκιοκύτταρα (

P

= 2 × 10

-5, πίνακας 1), ενώ CpGs υπερμεθυλιωμένο στον καρκίνο ήταν εμπλουτισμένα για γονίδια που είναι γνωστό ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω σε Τ-λεμφοκυττάρων (CD4 +

P

= 0,002, CD8 +

P

= 0.01, Πίνακας 1, Πίνακας S4), σύμφωνα με τις εκθέσεις των υψηλότερη αναλογία κοκκιοκυττάρων /λεμφοκυττάρων στο αίμα των περιπτώσεων καρκίνου σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες [26], [29]. Για να δοκιμαστεί αυτή η περαιτέρω συγκρίναμε τα επίπεδα μεθυλίωσης αυτών CpGs χαρτογράφησης με γονίδια υπερεκφράζονται στα κοκκιοκύτταρα και lmphocytes μεταξύ υγιών μαρτύρων και των περιπτώσεων μετά την αγωγή με και χωρίς ενεργό νόσο (όπως προσδιορίζεται από τα επίπεδα CA125) (Σχήμα S4). Όπως ήταν αναμενόμενο, τα γονίδια υπερεκφράζονται σε κοκκιοκύτταρα ήταν σημαντικά μεθυλιωμένος εις περιπτώσεις μετά τη θεραπεία με θετικά επίπεδα CA125 σε σχέση με τους μάρτυρες, ενώ αυτό δεν ήταν τόσο για τις περιπτώσεις μετά τη θεραπεία χωρίς ενεργή ασθένεια (Σχήμα S4). Ομοίως, τα γονίδια υπερεκφράζονται σε lmphocytes ήταν σημαντικά υπερμεθυλίωση σε περιπτώσεις μετά τη θεραπεία με θετικά επίπεδα CA125 σε σχέση με τους μάρτυρες, ενώ δεν υπήρξε καμία διαφορά κατά τη σύγκριση μετα-treatmant περιπτώσεις χωρίς ενεργό νόσο με τους μάρτυρες (Εικόνα S4).

Ηλικία εξαρτώμενη DNAM Υπογραφή Προβλέπει όγκου Παρουσία

Η ισχυρή επικάλυψη μεταξύ της ηλικίας και του καρκίνου που σχετίζονται CpGs και τη λειτουργική εμπλουτισμό των γονιδίων που εμπλέκονται στην μυελοειδή-λεμφικών διαφοροποίηση ανέφερε σε μας ότι η ηλικία και ο καρκίνος προκαλεί τις ίδιες αλλαγές στη μορφή του DNAM από ανεξάρτητα προκαλεί τις ίδιες βασικές αλλαγές στη σύνθεση του τύπου των κυττάρων του αίματος. Ως εκ τούτου υποθέσαμε ότι η ηλικία-συγκεκριμένες αλλαγές DNAM μπορεί να επιδεινωθεί σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Για να δοκιμάσετε αυτό, πρέπει πρώτα να υπολογιστεί το μέσο επίπεδο μεθυλίωσης πάνω CpGs που υποβάλλονται σε συγκεκριμένες υπερ ή υπομεθυλίωσης με την ηλικία. Αυτά τα σχέδια έδειξαν τις αναμενόμενες συσχετίσεις με την ηλικία σε υγιείς ελέγχους και περιπτώσεων καρκίνου προεπεξεργασίας (σχήματα 3α, γ, ε, ζ & amp? Σχήμα S5). Ωστόσο, παρατηρήσαμε επίσης ότι οι μέσες τιμές της μεθυλίωσης ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των περιπτώσεων προεπεξεργασίας και τους ελέγχους, με το χαμηλότερο μέσο όρο μεθυλίωση σε περιπτώσεις έναντι των ελέγχων για την ηλικία μεθυλιωμένος niCpGs (Σχήμα 3β, δοκιμή Wilcox

P

= 1 × 10

-13) και iCpGs (Σχήμα 3στ,

P

= 1 × 10

-11), και αντίστοιχα υψηλότερα μέσα επίπεδα μεθυλίωσης σε περιπτώσεις σε σύγκριση με τους ελέγχους για niCpGs υπερμεθυλίωση με την ηλικία (Σχήμα 3δ,

P

= 3 × 10

-16). Είναι σημαντικό, οι οργανώσεις αυτές με την κατάσταση της νόσου ήταν ανεξάρτητα από την ηλικιακή ομάδα των μεθυλιωμένος niCpGs και iCpGs (σχήματα 3α, ε). Για τους υπερμεθυλιωμένων CpGs ηλικίας, παρατηρήσαμε ένα αντίστοιχο πρότυπο υπερμεθυλίωση στον καρκίνο σε όλες τις ηλικιακές ομάδες για niCpGs (Σχήμα 3γ), αλλά όχι τόσο για iCpGs (σχήματα 3g, h).

Μέση μοτίβα μεθυλίωσης του ηλικία συνδέονται CpGs επιλέγονται μέσω εποπτευόμενης ανάλυση. (Α-β) ηλικία μεθυλιωμένος niCpGs. (Γ-δ) ηλικία υπερμεθυλίωση niCpGs. (Ε-στ) την ηλικία μεθυλιωμένος iCpGs. (Ζ-η) ηλικίας υπερμεθυλίωση iCpGs. (A, c, e, g) Μέση μεθυλίωση (άξονας γ) των ελέγχων (πράσινο) και περιπτώσεις (μπλε) για καθεμία από τις έξι ηλικιακές ομάδες (χ-άξονας) (50-55,55-60,60-65 , 65-70,70-75, & gt? 75). (Β, δ, στ, η) Μέσος όρος μεθυλίωσης σε σχέση με την κατάσταση της νόσου (όλες τις ηλικίες σε συνδυασμό). Όλες οι Ρ-τιμές είναι από δύο ουρών δοκιμή αθροίσματος κατάταξης Wilcoxon. Σε όλους τους πίνακες, δίνουμε τον αριθμό των δειγμάτων σε κάθε ομάδα πάνω από τον αντίστοιχο boxplot. Περιπτώσεις είναι δείγματα προ-θεραπεία.

Η

Για την περαιτέρω αποδείξει ότι τα πρότυπα DNAM σχετίζονται με την ηλικία συσχετίστηκαν ανεξάρτητα με την παρουσία του όγκου, ρωτήσαμε αν οι CpGs συνδέονται ηλικίας που προέρχονται από τους 148 υγιείς μάρτυρες (293 CpGs με FDR & lt ? 0,3) [16] ήταν σε θέση να διακρίνουν τα δείγματα σύμφωνα με την κατάσταση της νόσου (Εικόνα 4α). Χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση πάνω από τα 293 CpGs διαχωρίζονται περιπτώσεις από τους ελέγχους (Σχήμα 4β, δοκιμασία Fisher

P

= 4 × 10

-13). Τα ίδια ηλικία CpGs ήταν επίσης σε θέση να διακρίνει τις περιπτώσεις με υποτροπιάζουσες ενεργή νόσο από εκείνους που δεν έχουν (όπως μετράται με επίπεδα CA125 στον ορό σε κλήρωση δείγμα) σε ένα ανεξάρτητο σύνολο των δειγμάτων αίματος από 122 περιπτώσεις μετά την θεραπεία (Σχήμα 4γ, δοκιμασία Fisher

P

= 3 × 10

-5). Για να εδραιώσει περαιτέρω τη σημασία αυτών των ευρημάτων, σε καμία 1000 τυχαίες επιλογές των 293 CpGs έκανε παρατηρούμε P-τιμές τόσο ακραία, όπως αυτά (Σχήμα 4δ).

α) Η πολυπαραγοντική γραμμική παλινδρόμηση της ηλικίας, σε 148 υγιείς αίμα δείγματα κατά CpG προφίλ μεθυλίωσης προσαρμογή για την αποδοτικότητα BSC, παρτίδας και η είσοδος του DNA αποτελέσματα, εντοπίστηκαν 293 CpGs σε q (FDR) & lt? 0,3. β) Ιεραρχική ομαδοποίηση των 148 υγιείς μάρτυρες και 113 προ-επεξεργασίας (pret) περιπτώσεις πάνω από τα 293 CpGs. Οι δύο κύριες ομάδες (CLUST) που προβλέπεται από τον αλγόριθμο χαρακτηρισμένα ως μπλε και πορτοκαλί. καθεστώς ελέγχου περίπτωση ενδείκνυται ως ενεργό νόσο (AD): υποθέσεως = μαύρο, ελέγχου = γκρι. γ) Ιεραρχική ομαδοποίηση των 117 περιπτώσεων μετά τη θεραπεία πάνω ίδιο 293 CpGs. Των περιπτώσεων μετά τη θεραπεία 117, 47 και 70 είχαν υποτροπιάζουσες (μαύρο) και όχι επαναλαμβανόμενο (γκρι) ενεργή νόσο (AD) σε κλήρωση του δείγματος, αντίστοιχα. Οι δύο κύριες ομάδες (CLUST) που προβλέπεται από τον αλγόριθμο χαρακτηρισμένα ως μπλε και πορτοκαλί. Στα θερμικούς χάρτες, CpG β-τιμές συγκεκριμένων μεθυλίωση τυποποιήθηκαν με μηδενική μέση τιμή και μονάδα διακύμανσης για λόγους σαφήνειας (μπλε: υψηλή σχετική μεθυλίωση, κίτρινο = χαμηλή σχετική μεθυλίωση). Στο πάνελ β) και γ) δίνουμε τον αριθμό των δειγμάτων με ενεργό νόσο σε κλήρωση δείγματος σε κάθε ομάδα, και να δώσει ακριβή P-τιμή δοκιμής με την αντίστοιχη του Fisher. δ) Σύγκριση των παρατηρούμενων P-τιμές με εκείνες που λαμβάνονται από το 1000 τυχαίες επιλογές των 293 CpGs. Ρ-τιμές υπολογίστηκαν από το ακριβές τεστ του Fisher για τις δύο συστάδες προκύπτει από την εφαρμογή ενός Gaussian μοντέλο μείγματος [43].

Η

Καρκίνος Προδιάθεση-CpGs

Είναι εύλογο ότι ένας μικρός αριθμός των 2714 CA-CpGs είναι καλόπιστες δείκτες καρκίνου-προδιάθεση. Υποθέσαμε ότι ορισμένοι από αυτούς τους δείκτες κινδύνου μπορεί να είναι ανιχνεύσιμη από τις 70 μετά την αγωγή δείγματα περιφερικού αίματος από ασθενείς που δεν έχουν υποτροπιάζουσα νόσο κατά το χρόνο της ανάληψης δείγματος αλλά που θα μπορούσαν τελικά να αναπτύξει υποτροπιάζουσα νόσο, εφόσον αυτά τα δείγματα θα μπορούσαν να μιμούνται την προ- στάδιο των κλινικών προδιάθεση. Για να καθοριστεί αυστηρά αν υφίσταται τέτοιος κίνδυνος CpG υπογραφή, εφαρμόσαμε ένα state-of-the-art Παρένθετη Μεταβλητή Ανάλυση (SVA) [31], [32] πλαίσιο, το οποίο κρυμμένα μοντέλα και δυνητικά συγχυτικούς παράγοντες για να αποκτήσουν μια πιο ακριβή εκτίμηση για το το FDR (Υλικά και Μέθοδοι). Χρησιμοποιώντας SVA πήραμε 84 CpGs περνώντας ένα όριο FDR 0,4, γεγονός που υποδηλώνει ότι κατά μέσο όρο περίπου 50 CpGs μπορούν να εισάγουν διακρίσεις μεταξύ των δειγμάτων μετά τη θεραπεία χωρίς ενεργό νόσο (επίπεδα ορού CA125 & lt? 30) και των υγιών μαρτύρων (Σχήμα S6a, Πίνακας S5). Δεδομένου ότι είναι πιθανό ότι ορισμένα από αυτά αντανακλούν τις αλλαγές μεθυλίωσης λόγω της θεραπείας και από ένα CpG κινδύνου θα πρέπει επίσης να είναι διαγνωστική, είμαστε αποσυσπειρωμένο την επίδραση της θεραπείας με την εύρεση της επικάλυψης μεταξύ των 84 CpGs και το 2714 CA-CpGs (ανεπηρέαστα από τη θεραπεία), η οποία έδωσε μια επικάλυψη 18 «καρκίνο προδιάθεση» CpGs κινδύνου (Fisher δοκιμή P = 0,003, σχήμα S6b, Πίνακας S5). Ενδιαφέροντος, αυτός ο κατάλογος περιλαμβάνεται

TSG101

, ένα γονίδιο με υποτιθέμενο ρόλους ογκοκατασταλτικό και ένα γονίδιο του καρκίνου του μαστού υποψήφιος προδιάθεση [33].

Συζήτηση

Εδώ έχουμε πραγματοποιήσει η πρώτη μεγάλης κλίμακας (πάνω από 300 δείγματα) γονιδιώματος-ευρεία μελέτη του προφίλ DNAM χρησιμοποιώντας ένα state-of-the art πλατφόρμα που μετρά την κατάσταση μεθυλίωσης πάνω από 27.000 CpGs. Έχουμε δείξει ότι ο καρκίνος των ωοθηκών έχει σημαντική επίδραση στον ρυθμό DNAM των κυττάρων περιφερικού αίματος. Ενώ η επιγενετική υπογραφή έχουμε παρουσιάσει εξακολουθεί να στερείται την υψηλή εξειδίκευση που απαιτούνται για άμεση διαγνωστική εφαρμογή, το γεγονός ότι η ενεργός ο καρκίνος των ωοθηκών θα μπορούσε να προβλεφθεί με μια σχετική υψηλή ακρίβεια (AUC = 0.8) από ένα προφίλ DNAM στο αίμα καταδεικνύει σαφώς τις μελλοντικές δυνατότητες του επιγενετικές προφίλ ως διαγνωστικό εργαλείο.

Επιπλέον, προσκόμισαν αποδεικτικά στοιχεία για την ύπαρξη των δεικτών DNAM που μπορούν να χρησιμεύσουν ως δείκτες έγκαιρης ανίχνευσης ή προδιάθεση για καρκίνο των ωοθηκών. Από τα 18 δείκτες κινδύνου υποψήφιος, 11 και 7 έδειξαν υπερ και υπομεθυλίωση στον καρκίνο, αντίστοιχα, με το

TSG101

και τον παράγοντα ματίσματος προ-mRNA

SFRS6

τόσο υποβάλλονται υπερμεθυλίωση στον καρκίνο. Περαιτέρω επιβεβαίωση ότι οι δείκτες που προσδιορίζονται εδώ μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτες έγκαιρης ανίχνευσης ή προδιάθεση για καρκίνο των ωοθηκών θα απαιτήσει μια μεγάλη προοπτική μελέτη, η οποία είναι επί του παρόντος σε εξέλιξη [34].

Τα παρατηρούμενα πρότυπα DNAM μπορούν να συνοψιστούν σε όρους δύο βιολογικά ξεχωριστές υπογραφές. Πρώτον, η παρατήρηση ότι μια υπογραφή DNAM για τη γήρανση, η οποία χαρακτηρίζεται από διαφορική μεθυλίωση των γονιδίων με αιμοποιητικών κυττάρων γενεαλογία και τις λειτουργίες του ανοσοποιητικού συστήματος επιδεινώνεται με την παρουσία του καρκίνου των ωοθηκών, υποδηλώνει ότι ένας επιθηλιακός όγκος και η γήρανση προκαλούν κοινές αλλαγές στην κυτταρική σύνθεση του περιφερικού αίμα. Η ερμηνεία αυτή υποστηρίζεται περαιτέρω από το γεγονός ότι τα ίδια βιολογική άποψη έντονα εμπλουτισμένο μεταξύ γονιδίων διαφορικά εκφραζόμενων μεταξύ κυτταρικών τύπων του αίματος [30] (Πίνακας S6), και ότι τα γονίδια συνήθως ρυθμίζεται αυξητικά στα κοκκιοκύτταρα και τα λεμφοκύτταρα έδειξε ένα πρότυπο απόκλιση μεθυλίωσης (Πίνακας 1, Σχήμα S4) συνεπές με αυξημένη κοκκιοκυττάρων στην αναλογία των λεμφοκυττάρων σε απόκριση σε γήρανση ή καρκίνο. Είναι σημαντικό το γεγονός ότι υπάρχουν ανεξάρτητα αποδεικτικά στοιχεία ότι τόσο η γήρανση και να οδηγήσει την παρουσία καρκίνου σε μυελοειδή-στράβωμα στο πρόγραμμα διαφοροποίησης μυελοειδή /λεμφικού, με αντίστοιχη αναλογία υψηλότερη κοκκιοκυττάρων /λεμφοκυττάρων [25] – [29], ένα σχέδιο συνάδει με την παρατήρηση μας ότι οι συγκεκριμένες κοκκιοκυττάρων και των Τ-λεμφοκυττάρων γονίδια εμπλουτίστηκαν μεταξύ CpGs υπο-και υπερμεθυλίωση στον καρκίνο, αντίστοιχα. Δεδομένου ότι το αποτέλεσμα αυτό προκύπτει από τα προφίλ DNAM, φαίνεται ότι η έκφραση ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων που χαρακτηρίζουν Το αίμα τύπους κυττάρων είναι υπό την άμεση επιγενετική ρύθμιση.

Ένα άλλο σχετικό ζήτημα είναι αν η διαγνωστική επιγενετική υπογραφή είναι ειδικά για ωοθηκών Καρκίνος. Αν διαφορετικούς καρκίνους προκαλούν παρόμοιες ανοσολογικές αποκρίσεις και ως εκ τούτου παρόμοιες αλλαγές στη σύνθεση του τύπου των κυττάρων του αίματος, θα μπορούσαμε να αναμένουμε ένα ποσοστό του εντοπίστηκαν διαγνωστικών υπογραφή να είναι μη-καρκίνου συγκεκριμένες. Ωστόσο, για να καθορίσει σαφώς ότι αυτή είναι η περίπτωση και ότι η ηλικία και ο καρκίνος δεν μεσολαβούν επιδράσεις ανοσο-συμβιβασμούς μέσω επιγενετική τροποποίηση συγκεκριμένων κυτταρικών τύπων, απαιτεί πρόσθετα στοιχεία που δεν παρέχονται από τη μελέτη μας. Ομοίως, αν τα μέρη των παρατηρούμενων υπογραφές του καρκίνου μπορεί να εμπλέκονται αιτιολογικά στην ασθένεια πρέπει να περιμένει περαιτέρω έρευνες.

Ένα δεύτερο DNAM υπογραφή χαρακτηρίστηκε από CpGs που υποβάλλονται σε υπερμεθυλίωση με την ηλικία και υψηλού εμπλουτισμού για αναπτυξιακών γονιδίων και

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

-targets. Δεδομένου ότι

ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑ

(

ΕΣΠΑ

) εμπλέκεται στην καταστολή των γονιδίων που απαιτούνται για τη διαφοροποίηση των εμβρυϊκών και των ενήλικων βλαστικών κυττάρων [24], την ηλικία που προκαλείται υπερμεθυλίωση

ΥΠΟΛΟΙΠΟ

-targets, αν επιβεβαιωθεί σε έναν πληθυσμό βλαστικών κυττάρων, μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα γενικό μηχανισμό για την σχετιζόμενη με την ηλικία απώλεια της λειτουργίας των βλαστικών κυττάρων και αυξημένη προδιάθεση για καρκίνο [5].

Τέλος, το εύρημα μας ότι τα περισσότερα της μεταβλητότητας μεθυλίωση συνδέεται με niCpGs υποστηρίζει περαιτέρω την άποψη ότι τα περισσότερα από τα φαινοτυπικά σχετική διακύμανση DNAM είναι να βρεθεί σε περιοχές εκτός των CpG νησίδων [19]. Επιβεβαιώνοντας αυτό περαιτέρω, η παρατηρούμενη συσχέτιση μεταξύ του γονιδίου έκφρασης διαφορετικών κυτταρικών τύπων του αίματος και το πρότυπο του DNA υπογλυκαιμίας και υπερμεθυλίωση ήταν πολύ ισχυρότερη για niCpGs από iCpGs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Συνοπτικά, αυτή η εργασία επιδεικνύει ότι DNAM προφίλ στο αίμα κατέχει σημαντική υπόσχεση ως μια μελλοντική διαγνωστική ή κινδύνου πρόβλεψη εργαλείο και εγγυάται περαιτέρω ανώτερες σπουδές CpG-κάλυψης ώστε να διαλευκανθεί πλήρως το ρόλο αυτό.

Υλικά και Μέθοδοι

Περιγραφή UKOPS Συλλογή δείγματος

Ένα σύνολο από 540 δείγματα ολικού αίματος λήφθηκαν από την καρκίνου των ωοθηκών Πληθυσμός μελέτης του Ηνωμένου Βασιλείου (UKOPS) για να συμπεριληφθούν σε αυτή τη μελέτη. Περιπτώσεις (n = 266) αποτελείτο από μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες διαγιγνώσκονται με πρωτοπαθή επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών. Οι μισές από τις περιπτώσεις (περιπτώσεις προεπεξεργασίας? N = 131) έδωσαν το αίμα τους κατά τη στιγμή της διάγνωσης τους πριν από τη θεραπεία και τα άλλα μισά (περιπτώσεις μετά τη θεραπεία? N = 135) έδωσαν το αίμα τους σε κάποιο στάδιο κατά τη διάρκεια της παρακολούθησή τους επισκέψεις μετά την πρωτοβάθμια επεξεργασία (2,4 ± 2,7 χρόνια μεταξύ διάγνωσης και δείγμα αίματος που ελήφθη). Έλεγχοι (n = 274) ήταν φαινομενικά υγιείς μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες που προσλαμβάνονται από το Ηνωμένο Βασίλειο Συνεργατική Δίκη των ωοθηκών προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου (UKCTOCS) [34], για τις οποίες υπάρχουν διαθέσιμα ετήσια δείγματα ορού. Πρόσληψη πραγματοποιήθηκε στις 8 συμμετέχοντα νοσοκομεία εντός του Ηνωμένου Βασιλείου. Οι γυναίκες με προηγούμενο ιστορικό των διμερών ωοθηκεκτομή ή /και του καρκίνου αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Όλες οι περιπτώσεις και υγιείς μάρτυρες ήταν οι μετεμμηνοπαυσιακές και ίδιας ηλικίας και λεπτομερή κλινικά χαρακτηριστικά δίνονται στον Πίνακα S1.

Επεξεργασία δείγματος

Τα δείγματα αίματος συλλέχθηκαν από τη νοσοκόμα της μελέτης στα περιφερειακά κέντρα σε σωλήνες ( 9 σωλήνες mL K3 EDTA Vacuette, που κατασκευάζεται από την Greiner Βίο One) και καταψύχθηκαν εντός 3 ωρών από τη συλλογή. Τα δείγματα φυλάχθηκαν στους -80 °

C

σε περιφερειακό κέντρο και απεστάλησαν στο κεντρικό εργαστήριο στο UCL σε τριμηνιαία βάση. Μόλις έλαβε στο κεντρικό εργαστήριο, τα δείγματα καταγράφονται και μεταφέρθηκαν σε -80 °

C

κατάψυξη μέχρι το DNA εκχυλίζεται. Οι συγκεντρώσεις ορού CA125 προσδιορίσθηκαν με ανοσοδοκιμασία ηλεκτροχημειοφωταύγειας σάντουιτς σε Elecsys 2010 (Roche Diagnostics, Burgess Hill, Ηνωμένο Βασίλειο) χρησιμοποιώντας δύο μονοκλωνικά αντισώματα (OC125 και M11? Fujirebio Diagnostics AB, Γκέτεμποργκ, Σουηδία), και τις αξίες & gt? 30 ελήφθησαν ως δείκτης της ενεργού νόσου [35]. Πάνω από το 95% των περιπτώσεων προ-θεραπεία είχαν CA125 & gt? 30, ενώ μεταξύ των περιπτώσεων μετά τη θεραπεία περίπου 40% είχε ενεργή υποτροπιάζουσα νόσο (ΟΑ125 & gt? 30).

DNA Εξόρυξη και όξινο θειώδες Τροποποίηση

Η DNA εκχυλίστηκε σε Tepnel, χρησιμοποιώντας μια μέθοδο που βασίζεται χλωροφόρμιο εκχύλιση και 800 ng (2 χ 400 για κάθε δείγμα). Μέση συγκέντρωση DNA ήταν 33,0 ± 17,4 ng /μL. DNA από κάθε δείγμα ήταν όξινο θειώδες τροποποιηθεί χρησιμοποιώντας το D5008 EZ μεθυλίωσης του DNA Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Illumina Δοκιμασία Infinium

ανάλυση μεθυλίωσης διεξήχθη χρησιμοποιώντας η Illumina Infinium Ανθρωπίνων Methylation27 BeadChip. Εν συντομία, όξινου θειώδους μετατραπεί DNA ενισχύθηκε, κατακερματισμένη και οι υβριδικές στις συστοιχίες BeadChip (κάθε τσιπ μπορεί να φιλοξενήσει 12 δείγματα, όπως ορίζεται από Sentrix θέσεων Α-Ε).