Αφηρημένο

Fanconi αναιμία (FA) ασθενείς είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα με συμπαγείς όγκους σε πολλαπλές ανατομικές περιοχές συμπεριλαμβανομένης της κεφαλής και περιοχή του λαιμού. Ένα υποσύνολο της κεφαλής και του τραχήλου καρκίνους (HNCs) συνδέεται με HPVs «υψηλού κινδύνου», ιδιαίτερα HPV16. Ωστόσο, ο συσχετισμός μεταξύ του HPV ογκογονίδια και καρκίνων σε ασθενείς FA είναι ακόμα ασαφής. Έχουμε ήδη μάθει ότι η έλλειψη ΦΑ σε ποντίκια προδιαθέτει HPV16 Ε7 διαγονιδιακά ποντίκια για να HNCs. Για την αντιμετώπιση ογκογόνο δυναμικό HPV16 Ε6 στο πλαίσιο ανεπάρκειας ΦΑ στην HNCs, χρησιμοποιήσαμε HPV16 Ε6-διαγονιδιακά ποντίκια (

K14E6

) και HPV16 Ε6 /Ε7-bi-διαγονιδιακά ποντίκια (

K14E6E7

) στο γενετικό υπόβαθρο επαρκή ή ανεπαρκή για μία από τις

Fanc

γονίδια,

fancD2

και να παρακολουθείται η ευαισθησία τους στην HNCs.

K14E6

ποντίκια απέτυχαν να αναπτύξουν όγκους. Ωστόσο, Ε6 και

fancD2

-deficiency επιτάχυνση Ε7 με γνώμονα την ανάπτυξη του όγκου σε

K14E6E7

ποντίκια. Η αυξημένη συχνότητα εμφάνισης όγκου ήταν περισσότερο συσχετισμένη με Ε7 με γνώμονα την βλάβη του DNA από τον πολλαπλασιασμό. Βρήκαμε επίσης ότι η ανεπάρκεια των πρωτεϊνών τσέπη, pRb, ρ107 και ρ130 που καθιερωμένη στόχους της Ε7, θα μπορούσε να ανακεφαλαιώσω επαγωγή Ε7 της βλάβης του DNA. Τα ευρήματά μας υποστηρίζουν την υπόθεση ότι Ε7 προκαλεί HPV που σχετίζεται με την προώθηση HNCs βλάβη του DNA μέσω της αδρανοποίησης των pocket πρωτεϊνών, γεγονός που εξηγεί γιατί η ανεπάρκεια στο DNA επιδιόρθωση βλάβης θα αυξήσει την ευαισθησία σε Ε7 με γνώμονα καρκίνου. Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν περαιτέρω την απρόσμενη ανακάλυψη ότι η ανεπάρκεια FA δεν προδιαθέτει Ε6 διαγονιδιακά ποντίκια για να HNCs, υποδεικνύοντας μια ειδικότητα στη συνέργεια μεταξύ FA ανεπάρκεια και HPV ογκογονιδίων στην πρόκληση HNCs

Παράθεση:. Πάρκο JW, Shin ΜΚ, Pitot HC, Lambert PF (2013) υψηλή συχνότητα της HPV-Associated Κεφαλής και Τραχήλου καρκίνοι στο FA Ελλιπή ποντίκια συνδέεται με την επαγωγή Ε7 του DNA Ζημιές μέσω αδρανοποίηση του Pocket πρωτεϊνών. PLoS ONE 8 (9): e75056. doi: 10.1371 /journal.pone.0075056

Επιμέλεια: Ιωσήφ S Pagano, Το Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας στο Chapel Hill, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Ιουλ 2013? Αποδεκτές: 6 Αυγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Σεπτέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Πάρκο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η πηγή της χρηματοδότησης για το έργο αυτό ήταν Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) (CA098428, CA022443). ΝΙΗ είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

Fanconi αναιμία (FA), το οποίο είναι ένα σπάνιο ετερογενής και υπολειπόμενη γενετική ασθένεια, που εμφανίζεται αναπτυξιακές ανωμαλίες και ανωμαλίες στα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα όπως ανεπάρκεια του μυελού των οστών και οξεία μυελοειδή λευχαιμία, τα μεγάλα φαινοτύπους εμφανίζεται στην πρώιμη παιδική ηλικία των ασθενών . Μέχρι σήμερα, 15 κυτταρικών γονιδίων (

Fanc

γονιδίων) έχουν προσδιοριστεί για τις οποίες ομόζυγο μεταλλάξεις που σχετίζονται με την ασθένεια FA.

Fanc

τα γονιδιακά προϊόντα (Fanc) συνθέτοντας ένα οδού επιδιόρθωσης DNA που ονομάζεται FA μονοπάτι με αρκετές άλλες κυτταρικές πρωτεΐνες για να βοηθήσει την επισκευή του κατεστραμμένου DNA, ειδικά DNA διασταυρώσεις μεταξύ των κλάδων (ICLs) βλάβη. Οκτώ από πρωτεΐνες Fanc (FancA, B, C, E, F, G, L, και Μ) αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και να σχηματίσουν ένα σύμπλοκο πρωτεΐνης που ονομάζεται τον πυρήνα συγκρότημα FA. FANCL στο συγκρότημα, το οποίο έχει ένα

Ε3

ουβικιτίνης δραστηριότητα λιγάσης θέσει μονο-ουβικιτίνης για FancD2 /Ι σε απόκριση της βλάβης του DNA [1]. Επιπλέον, στασιμότητα πιρούνια αντιγραφή του DNA στη φάση S ενεργοποιεί το μονοπάτι FA [2]. Το μονο-ουβικουιτινωμένης FancD2 /I εντοπίζονται στις περιοχές των βλαβών του DNA, όπου αλληλεπιδρούν με άλλες πρωτεΐνες που είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του κατεστραμμένου DNA, όπως το BRCA1, FancD1 /BRCA2, FancN /PALB2 και Rad51 οδηγούν σε επιδιόρθωση του DNA [3, 4]. Η διακοπή αυτής της οδού FA οδηγεί σε αυξημένη ευαισθησία σε DNA σταυροδεσμών, χρωμοσωμική αστάθεια, αυθόρμητη ανταλλαγή αδελφών χρωματίδων και διαταραχές του κυτταρικού κύκλου [5,6]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η μονο-ουβικουιτινωμένης FancD2 προσλαμβάνει κρίσιμη ενεργά μόρια, όπως η νουκλεάση FAN1 (ή SLX4) μέσω τομείς ουβικιτίνης δεσμευτικό τους [7,8]. Ετσι, μονο-ουβικουϊτινίωση του FancD2 είναι κρίσιμη όχι μόνο για χρωματίνη εντοπισμό της, αλλά και ενεργεί ως ένα ικρίωμα για ειδικούς παράγοντες επιδιόρθωσης του DNA. Το μονοπάτι FA δρα μαζί με την ομόλογο του συστήματος επισκευή ανασυνδυασμού (HR) για τη διατήρηση της γονιδιωματικής αστάθειας [9]. Εξάντληση των FancD2 αναστέλλει απάντηση ΥΕ, υποδεικνύοντας ότι ΥΕ ενεργεί κατάντη του FancD2 [10]. Αυξημένη γενωμική αστάθεια πιστεύεται ότι συμβάλλει στην αυξημένη ευαισθησία των ασθενών FA με τον καρκίνο. Αιμοποιητικών μεταμόσχευση βλαστικών κυττάρων (HSCT) θα μπορούσε να είναι μια λύση για να βοηθήσει τα ελαττώματα σε αιμοποιητικά κύτταρα. Ακόμα και μετά από επιτυχή μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, πλακωδών κυττάρων καρκινώματα (κλώνοι ενός κυττάρου) στο κεφάλι και το λαιμό περιοχές γίνει ένα υψηλό κίνδυνο για τους ασθενείς [11-15].

Ένα υποσύνολο της κεφαλής και του τραχήλου (HNCs) (~ 25%) , κυρίως μεταξύ των όγκων από το στοματοφάρυγγα στο γενικό πληθυσμό είναι θετική για την ανθρώπινη θηλωματοϊών υψηλού κινδύνου (HPVs), ιδίως HPV τύπου 16 (HPV16) που κωδικοποιεί το τρία ογκογονίδιο, Ε5, Ε6, Ε7 και [16,17]. Ειδικότερα οι ασθενείς FA από τη Βόρεια Αμερική ένα υψηλό ποσοστό (84%) της HNC προκύπτουν σε διάφορες θέσεις στην περιοχή του κεφαλιού και του λαιμού (δηλαδή δεν περιορίζεται στο στοματοφάρυγγα) βρέθηκαν να είναι θετικά για HPVs υψηλού κινδύνου [18]. Συνεπής με ένα ρόλο του HPV σε αυτούς τους καρκίνους, μεταλλάξεις σε ρ53, ένα ογκοκατασταλτικό που αδρανοποιείται με HPV16 Ε6, δεν βρέθηκαν σε HNCs από αυτούς τους ασθενείς. Ωστόσο, σε ασθενείς από χώρες της Ευρώπης, HNCs ήταν HPV DNA αρνητικές και πάνω από το 50% των όγκων αυτών είχαν μεταλλάξεις p53 [18,19]. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα αντικρουόμενα κλινικά δεδομένα, παραμένει ασαφές εάν οι HPV να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην HNCs που προκύπτουν σε ασθενείς με ΡΑ. Αρκετές μελέτες επισημαίνουν τη συμβολή της ανεπάρκειας της FA σε HPV σχετίζεται με τη νόσο σε μοριακό επίπεδο. Στην καλλιέργεια ιστού, η έκφραση HPV16 Ε7 έχει αποδειχθεί ότι διεγείρει τη μεταγραφή του

fancD2

[20] και να ενεργοποιήσετε το μονοπάτι FA [21]. Σε μια άλλη μελέτη που κάνει χρήση της οργανοτυπικές καλλιέργειες ανθρώπινων κερατινοκυττάρων για να ανακεφαλαιώσω τον κύκλο ζωής του HPV, HPV16 και HPV18 που προκαλείται υπερπλασία του επιθηλίου αυξήθηκε στο

fancA

ελλιπή ως κύτταρα ή στα κύτταρα χτυπηθεί κάτω στην έκφραση του? λαμβάνοντας υπόψη ότι η αποκατάσταση της

fancA

έκφραση εξασθενημένο αυτό το αποτέλεσμα [22]. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι υπάρχει μια αλληλεπίδραση μεταξύ του HPV και του μονοπατιού FA.

Το εργαστήριο μας αναπτύξει ένα ζωικό μοντέλο για τον HPV-σχετίζεται HNCs χρησιμοποιώντας HPV16 ογκογονίδιο διαγονιδιακά ποντίκια όταν θεραπεύτηκαν με ένα χημικό καρκινογόνο, 4NQO, η οποία επάγει προσαγωγές DNA παρόμοιες με αυτές που προκαλούνται από τον καπνό που συνδέεται καρκινογόνα συνεργεί με ογκογονίδια HPV16 για να προκληθεί HNC [23]. Οι καρκίνοι που προκύπτουν στο ζωικό μοντέλο ιστοπαθολογικές το μερίδιό μας και μοριακές ιδιότητες με HPV-θετικά HNCs στον άνθρωπο. Η περιοχή στην οποία προκύπτουν οι όγκοι είναι λιγότερο περιοριστική από ό, τι στον άνθρωπο, πιθανώς αντανακλαστική του προτύπου έκφρασης του HPV διαγονιδίου σε όλη τη στοματική /ανώτερο γαστρεντερικό επιθήλιο του ποντικιού. Μεταξύ Ε6 και Ε7, HPV16 Ε7 έχει μεγαλύτερες πιθανότητες να προκαλέσει ΕΘΕΓ σε ζωικά μοντέλα [23,24] με Ε6 που συμβάλλουν στην αύξηση της συχνότητας σε συνδυασμό με Ε7 [25]. Η συμβολή του HPV16 Ε5 να ΕΘΕΓ σε αυτό το μοντέλο ποντίκι δεν έχει αξιολογηθεί πλήρως, αλλά φαίνεται να είναι πολύ μικρότερη από εκείνη του Ε7 (Στρατή και Lambert, αδημοσίευτα αποτελέσματα).

Εμείς προηγουμένως αξιολογηθεί η επίδραση της FA οδού για η συχνότητα εμφάνισης της HNCs σε ποντίκια που εκφράζουν μόνο το ογκογονίδιο HPV16 Ε7. Ανεπάρκεια στην οδό FA ιδιαίτερα αυξημένη HPV16 Ε7-οδηγείται συχνότητα εμφάνισης όγκου [26]. Ωστόσο, σε HPV-θετικών ανθρώπινων καρκίνων, Ε7 πάντοτε βρέθηκε να συν-εκφράζεται μαζί με Ε6. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε μελέτες που περιγράφονται στο παρόν για τη διεύθυνση επιρροές FA μονοπάτι στο κεφάλι και το λαιμό καρκινογένεση στο πλαίσιο των ποντικών που εκφράζουν Ε6 μόνο του ή μαζί με Ε7. Συγκεκριμένα, δημιουργείται

K14E6

και

K14E6E7

διαγονιδιακά ποντίκια στο

fancD2

-Επαρκή και ελλιπή ως υπόβαθρα. Παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση στη συχνότητα εμφάνισης όγκου και τη σοβαρότητα της νεοπλασματικής νόσου στο

K14E6E7

/

FancD2

– /-

ποντίκια σε σύγκριση με το

K14E6E7

/

FancD2

+ /+

ποντίκια? Ωστόσο,

fancD2

-deficiency δεν αυξάνουν ούτε ένδειξη για καρκινογένεση στα

K14E6

ποντίκια που εκφράζουν Ε6 και μόνο. Τόσο HPV16 Ε6 και Ε7 προκάλεσε αύξηση της συχνότητας των κυττάρων που υποστηρίζουν τη σύνθεση του DNA και αυτό επαυξημένης στην FA-ανεπαρκή φόντο. Πράγματι ανεπάρκεια FA μόνο οδήγησε σε αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Αλλά αυτή η επαγωγή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων δεν συσχετίζονται με την επίδραση της οδού FA για ογκογένεση. Από την άλλη πλευρά, η συχνότητα στα επιθήλια της γλώσσας και του οισοφάγου του γ-Η2ΑΧ πυρηνικών εστίες θετικά κύτταρα, ένας δείκτης για την ανταπόκριση βλάβης του DNA, δεν συσχετίζεται με εμφάνιση όγκου. Αυτός ο δείκτης προκλήθηκε στους ιστούς που εξέφραζαν την ογκογονιδίου Ε7? εκτιμώντας ότι, Ε6 δεν επάγουν την έκφραση αυτού του δείκτη της ανταπόκρισης βλάβη του DNA. Επιπλέον, δύο βιοδείκτες, MCM7 και ρ16, που χρησιμοποιούνται για τη διάκριση HPV-θετικών HNCs από HPV-αρνητικό HNCs βρέθηκαν να είναι ιδιαίτερα πάνω ρυθμισμένα σε ποσοστό

K14E6E7

ποντικούς ανεξαρτήτως του

fancD2

κατάστασης του γονιδίου , αναφέροντας ότι θα μπορούσαν να είναι χρήσιμες για τον καθορισμό του καθεστώτος του HPV των HNCs που προκύπτουν σε ασθενείς με ΡΑ. Τέλος, παρατηρήσαμε ότι η ανεπάρκεια στην έκφραση των πρωτεϊνών τσέπη, pRb, ρ107 και ρ130, οι οποίες είναι εγκατεστημένες οι στόχοι της Ε7, θα μπορούσε να ανακεφαλαιώσω επαγωγή Ε7 των απαντήσεων βλάβης του DNA στο κεφάλι και το λαιμό επιθήλια. τρέχουσα μελέτη μας υποστηρίζει την υπόθεση ότι Ε7 προκαλεί HNC προωθώντας βλάβη του DNA μέσω της αδρανοποίησης των pocket πρωτεΐνες. Αυτά τα δεδομένα μπορεί να εξηγήσει γιατί η ανεπάρκεια στην οδό FA αυξάνει την ευαισθησία σε Ε7 με γνώμονα τον καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

Ποντίκια

K14E6

διαγονιδιακά

ποντίκια

[27]

και K14E7

διαγονιδιακά ποντίκια [28] σχετικά με την FVB γενετικό υπόβαθρο, διασταυρώθηκαν με

fancD2

νοκ-άουτ (

fancD2

– /-

) ποντίκια [29], σχετικά με την 129S4 γενετικό υπόβαθρο, για να δημιουργήσει F

1 ποντίκια,

K14E6 /FancD2

+/-

και

K14E7 /FancD2

+/-

(FVB /129S4 μικτή φόντο). Όλα τα πειραματικά ποντίκια (

NTG /FancD2

+ /+

,

NTG /FancD2

– /-,

K14E6 /FancD2

+ /+

,

K14E6 /FancD2

– /-

,

K14E6E7 /FancD2

+ /+

, και

K14E6E7 /FancD2

– /- ποντίκια

) ήταν άνδρες που παράγονται δια διασταυρώσεως F

1 ποντίκια.

K14Cre /Rb

f /f

,

Rb στ

/f /

ρ130

– /-

, και

K14Cre /Rb

f /f /ρ130

– /-

δημιουργήθηκαν για το ίδιο

FVB /129 /C57

μικτό γενετικό υπόστρωμα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30].

Rb στ

/f /

ρ 107

– /-

και

K14CreER /Rb

f /f /ρ107

– /-

δημιουργήθηκαν την ίδια

CD1 /129 /C57

μικτό γενετικό υπόβαθρο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Όλοι οι ποντικοί γονότυπος με PCR. Ποντικοί εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς με 0,3 κ.εκ. βρωμοδεοξυουριδίνης (BrdUrd? 12.5 mg /mL) 1 ώρα πριν την ευθανασία για τη μέτρηση του ρυθμού της σύνθεσης του DNA. Γλώσσες και οισοφάγοι συλλέχθηκαν και επεξεργάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Τα ποντίκια στεγάστηκαν στο Σύλλογο για την αξιολόγηση του Εργαστηρίου Animal Care-εγκεκριμένη μονάδα McArdle Εργαστήριο φροντίδα των ζώων. Όλες οι διαδικασίες που διενεργούνται σύμφωνα με το πρωτόκολλο των ζώων μας έχουν εγκριθεί από το Πανεπιστήμιο του Ουισκόνσιν Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήσης.

4-νιτροκινολίνη-1-οξείδιο (4NQO) που προκαλείται από το κεφάλι και μελέτη καρκινογένεσης λαιμό και ιστολογική ανάλυση

Η θεραπεία και οι κατευθυντήριες γραμμές για ιστολογική ανάλυση των όγκων έχουν περιγραφεί προηγουμένως [26]. Εν συντομία, ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με 4-νιτροκινολινο-1-οξείδιο (4NQO? 10 μg /ml) στο πόσιμο νερό τους για 8 εβδομάδες και κατόπιν διατηρήθηκε εκτός θεραπείας για επιπλέον 16 εβδομάδες. Στο τέλος σημείο ή όταν τα ποντίκια έγιναν ετοιμοθάνατα, αυτά υποβλήθηκαν σε ευθανασία, εμφανείς όγκους στο γλώσσα και τον οισοφάγο βαθμολογήθηκαν, και οι ιστοί συλλέχθηκαν για ιστοπαθολογική ανάλυση.

ανοσοφθορισμού

ανοσοφθορισμός πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν περιελάμβαναν αντι-ρ16 (1:50 σε 5% άπαχο γάλα /5% ορό αλόγου? M156, Santa Cruz Biotech.), Αντι-MCM7 (1: 200 σε 5% ορό αλόγου? NeoMarkers), αντι-κυτοκερατίνης 14 συζευγμένο με FITC (CK14? 1: 100 σε 5% ορό αλόγου? CBL 197f, Millipore), αντι-βρωμοδεοξυουριδίνης (BrdUrd? 1:50 σε 5% ορό αλόγου? Calbiochem), και αντι-γ-Η2ΑΧ (1: 100 σε 5 ορό% αλόγου? Millipore)

Η ποσοτικοποίηση των BrdUrd θετικών πυρήνων και γ-H2AX εστίες θετικά κύτταρα

τουλάχιστον τρία ποντίκια της κάθε γονότυπο,

NTG /FancD2

+ /+

,

NTG /FancD2

– /-

,

K14E6 /FancD2

+ /+

,

K14E6 /FancD2

– /-

,

K14E6E7 /FancD2

+ /+

, και

K14E6E7 /FancD2

– /- ποντίκια

, επιλέχθηκαν και ~ 8 έως 10 καρέ (400χ) των κυττάρων εντός του υπερβασικά (Cytokeratin 14 αρνητικά) και τα βασικά (Cytokeratin 14 θετικά) στρώματα της γλώσσας και του οισοφάγου επιθήλια ποσοτικοποιήθηκαν για κάθε ποντικό.

Στατιστική ανάλυση

μονόπλευρη exact test Barnard χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία των διαφορών σε εμφανείς συχνότητα εμφάνισης όγκου μεταξύ κάθε ομάδα ποντικών. Δύο όψεων δοκιμή Wilcoxon rank sum χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία των διαφορών σε σοβαρότητα εμφανούς βλάβης στο ζώο γλώσσας και του οισοφάγου. Για τον προσδιορισμό της σημαντικότητας για BrdUrd θετικών πυρήνων και γ-H2AX πυρηνική εστίες θετικά κύτταρα ανάμεσα σε κάθε ομάδα ποντικιών, χρησιμοποιήθηκε ένα δύο όψεων τεστ rank-sum Wilcoxon.

Αποτελέσματα

Η διακοπή της FA μονοπάτι αυξάνει σημαντικά τη συχνότητα εμφάνισης του HPV-ογκογονιδίου συνδέονται όγκων σε Ε6 /Ε7 δι-διαγενή ποντίκια, αλλά όχι σε Ε6 διαγονιδιακά ποντίκια

Για να εξεταστεί ο ρόλος των Ε6 και ανεπάρκειας της οδού FA στο κεφάλι και το λαιμό καρκινογένεση , HPV16 Ε6 διαγονιδιακά (

K14E6

) και HPV16 Ε7 διαγονιδιακά (

K14E7

) ποντίκια διασταυρώθηκαν με

fancD2

-null ποντίκια για να δημιουργήσει τέσσερις διαφορετικούς γονότυπους?

K14E6

/

FancD2

+ /+

,

K14E6

/

FancD2

– /-

,

K14E6E7

/

FancD2

+ /+

, και

K14E6E7

/

FancD2

– /-

ποντίκια. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με 4NQO, ένα υδατοδιαλυτό χημικό καρκινογόνο που δρα ως συν-καρκινογόνο στην επαγωγή HNCs σε HPV16 μας διαγονιδιακά ποντίκια [23], για 8 εβδομάδες και κατόπιν διατηρήθηκε για επιπλέον 16 εβδομάδες. Στο 24 εβδομάδες τελικό σημείο, γλώσσες και οισοφάγοι συλλέχθηκαν, βαθμολογήθηκαν για προφανείς όγκους, και οι ιστοί σταθεροποιήθηκαν, εγκλεισμένα σε παραφίνη, τεμαχίστηκαν και υποβλήθηκαν σε ιστοπαθολογική ανάλυση για την αξιολόγηση της χειρότερης στάδιο της νεοπλασματικής νόσου.

Στις

fancD2

-Επαρκή φόντο, μόνο δύο από 26

K14E6 /FancD2

+ /+

ποντίκια (8%) ανέπτυξαν εμφανείς όγκους κεφαλής και τραχήλου, η οποία δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από αυτή που παρατηρήθηκε σε μη διαγονιδιακά (NTG) ποντικούς (Πίνακας 1). Αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενη μελέτη μας [25]. Για το

fancD2

ελλιπή ως φόντο, δύο από τους 22

K14E6 /FancD2

– /- ποντίκια

(9%) ανέπτυξαν εμφανείς όγκους (Πίνακας 1) , η οποία δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από αυτή που παρατηρήθηκε στο

fancD2

-Επαρκή φόντο (

K14E6 /FancD2

+ /+

εναντίον

K14E6 /FancD2

– /-

,

P

= 0,52). Έτσι,

fancD2

ανεπάρκεια δεν οδηγεί σε αυξημένη ευαισθησία των Ε6 διαγονιδιακά ποντίκια με όγκους κεφαλής και τραχήλου.

μέγεθος γονότυπου

Η Ομάδα, ν

ζώων ιστούς με εμφανή όγκο, n (%)

Η Γλώσσα & amp? Esophagus

Tongue

Esophagus

*

NTG/FancD2

+

/

+

240 (0) 0 (0) 0 (0)

*

NTG /FancD2

– /-

260 (0) 0 (0) 0 (0)

*

K14E7 /FancD2

+

/

+

204 (20) 2 (10) 3 (15)

*

K14E7 /FancD2

– /-

2111 (52) 5 (24) 6 (29)

K14E6 /FancD2

+

/

+

262 (8 ) 0 (0) 2 (8)

K14E6 /FancD2

– /-

222 (9) 0 (0) 2 (9)

K14E6E7 /FancD2

+

/

+

146 (43) 4

α (29) 4

α (29 )

K14E6E7 /FancD2

– /-

1411 (79) 9

b (64) 7

b (50) Πίνακας 1. Σύγκριση των 4NQO που προκαλείται από τις εμφανείς . συχνότητα εμφάνισης όγκων στη μητρική του ποντικιού και του οισοφάγου ιστούς

ΣΗΜΕΙΩΣΗ:

K14E6E7 /FancD2

+ /

+ ποντίκια δείχνουν μια σημαντική αύξηση της συχνότητας εμφάνισης όγκου σε σύγκριση με

K14E6 /FancD2

+ /

+ ποντίκια (

P

= 0,01). Η διαφορά στη συχνότητα εμφάνισης όγκων μεταξύ

K14E6 /FancD2

+ /+

και

K14E6 /FancD2

– /-

ομάδες δείχνει καμία στατιστική σημασία (

P

= 0,52). Ωστόσο, η διαφορά στη συχνότητα των όγκων μεταξύ

K14E6E7 /FancD2

+ /+

και

K14E6E7 /FancD2

– /-

ομάδων είναι στατιστικά σημαντική (

P

= 0,03). Όλες οι στατιστικές συγκρίσεις έγιναν χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ μια μονόπλευρη Μπάρναρντ.

δύο του

K14E6E7 /FancD2

+ /+

ποντίκια είχαν όγκους στο τόσο της γλώσσας και του οισοφάγου.

β Πέντε από το

K14E6E7 /FancD2

– /-.

Ποντίκια είχαν όγκους στο τόσο της γλώσσας και του οισοφάγου

* περιστατικά Έκδηλη όγκου του

NTG /FancD2

+

/

NTG /FancD2

– /-

K14E7 /FancD2

+ /+

και

K14E7 /FancD2

– /-

ποντίκια είναι από την προηγούμενη μελέτη μας [26] CSV Λήψη CSV

Είμαστε δίπλα εξέτασαν την επίδραση του FA-ανεπάρκειας στο κεφάλι και το λαιμό ογκογένεση σε ποντίκια που εκφράζουν τόσο Ε6 και Ε7. Από την

fancD2

-Επαρκή φόντο,

K14E6E7 /FancD2

+ /+

ποντίκια ανέπτυξαν έναν αυξημένο αριθμό εμφανείς κεφαλής και του τραχήλου όγκους σε σύγκριση με το

K14E7 /FancD2

+ /+

ποντικούς (Πίνακας 1), σε συνέπεια με προηγούμενες μελέτες μας αποδεικνύουν την ικανότητα του Ε6 για την αύξηση της αποτελεσματικότητας της Ε7 με γνώμονα το κεφάλι και το λαιμό ογκογένεση [25]. Για το

fancD2

ελλιπή ως φόντο, παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση στη συχνότητα εμφάνισης όγκων σε εμφανή

K14E6E7

ποντίκια, από 43% σε 79% (

K14E6E7 /FancD2

+ /+

εναντίον

K14E6E7 /FancD2

– /-

,

P

= 0.03 στον πίνακα 1). Το μέγεθος της αύξησης της συχνότητας των όγκων εμφανείς στο

fancD2

ελλιπή ως φόντο φαίνεται με το Ε6 /Ε7 δι-διαγενή ποντίκια που δεν ήταν μεγαλύτερη από αυτή που παρατηρείται με Ε7 μόνο διαγονιδιακά ποντίκια (Πίνακας 1). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η οδός FA επηρεάζει την ογκογόνο δυναμικό των Ε7 αλλά δεν Ε6.

Ανεπάρκεια σε FA μονοπάτι οδήγησε σε πιο επιθετική νεοπλασματική HPV νόσου που σχετίζεται

Πραγματοποιήσαμε λεπτομερής ιστοπαθολογική ανάλυση του ιστού συλλέχθηκαν από αυτούς τους ποντικούς για την εκτίμηση του βαθμού της νεοπλασματικής νόσου σε αυτές ομάδες ποντικών. Οι ιστοί με εμφανείς όγκους συλλέχθηκαν, σταθερό, εγκλεισμένα σε παραφίνη και τομές υποβλήθηκαν σε ιστοπαθολογία. Συγκεκριμένα, κάθε δέκατο τμήμα 5μm της γλώσσας και του οισοφάγου χρωματίστηκε με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) και αναλύεται για να προσδιοριστεί το χειρότερο στάδιο της νεοπλασματικής νόσου σε κάθε ζώο (Πίνακας 2). HPV16 ογκογονίδιο-διαγονιδιακά ποντίκια αναπτύσσουν μια προοδευτική ασθένεια, που κυμαίνονται από φυσιολογικό επιθήλιο και καλοήθεις θηλώματος σε διηθητικό καρκίνο (δηλαδή, καρκίνωμα) [24,26]. Με βάση το επίπεδο της διαφοροποίησης (κερατινοποίησης) εντός των καρκινώματα, καρκίνους ήταν υπο-ταξινομούνται σε κατηγορίες Ι, II, και III. Στο γλώσσας, παρατηρήσαμε μόνο τέσσερις καλοήθη θηλώματα στο

K14E6E7

/

FancD2

+ /+

ποντίκια, ενώ στο

K14E6E7

/

FancD2

– /- ποντίκια

παρατηρήσαμε τρεις καλοήθεις θηλώματα, τέσσερις βαθμού καρκινώματα Ι, και δύο καρκινώματα βαθμού II. Αυτή η αύξηση στην σοβαρότητα της νόσου ήταν στατιστικώς σημαντική (

P

= 0.02 στον Πίνακα 2). Ενώ FA-ανεπάρκεια οδήγησε επίσης σε αύξηση της σοβαρότητας της νόσου στο οισοφάγοι ποντικών με όγκους, η αύξηση αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (

P

= 0.25 στον Πίνακα 2).

Tissue

γονότυπου

# ποντικών, n

νόσος βαθμό εμφανή βλάβη, n (%)

Απλή αναζήτηση Όχι νόσο

θηλωμάτων

βαθμός Καρκίνωμα

Απλή αναζήτηση

Η Ι

ΙΙ

III

Tongue

K14E6 /FancD2

+ /+

2626 (100) —-

K14E6 /FancD2

– /-

2222 (100) —-

K14E6E7 /FancD2

+ /+

1410 (71) 4 (29) —

K14E6E7 /FancD2

– /-

145 (36) 3 (21) 4 (29) 2 (14) -Esophagus

K14E6 /FancD2

+ /+

2624 (92) 2 (8) —

K14E6 /FancD2

– /-

2220 (91) 2 (9) —

K14E6E7 /FancD2

+ /+

1410 (71) 3 (21) -1 (7) –

K14E6E7 /FancD2

– /-

147 (50) 5 (36) -2 (14) -Πίνακας 2. Η ιστοπαθολογική ανάλυση των . δείγματα με εμφανείς βλάβες στο ζώο γλώσσας και του οισοφάγου ιστούς

ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ο συνολικός βαθμός της νόσου σε

K14E6E7 /FancD2

– /- ποντίκια

ομάδων είναι στατιστικά πιο σοβαρή από ό, τι το σε

K14E6E7 /FancD2

+ /+

ομάδες ποντικών στον ιστό ζώο γλώσσα (

P

= 0,02), αλλά όχι στον ιστό οισοφάγου ζώο (

P

= 0,25). Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός διπλής όψης δοκιμή rank-sum Wilcoxon. CSV Λήψη CSV

Δύο βιοδείκτες, MCM7 και p16, είναι ιδιαίτερα εκφράζεται σε όγκους σε ποντίκια K14E6E7 ανεξάρτητα από fancD2 κατάστασης του γονιδίου

Στο γενικό πληθυσμό, HPV-θετικές HNCs ανταποκρίνονται περισσότερο στην ακτινοβολία-θεραπείας από HPV -αρνητικοί HNCs [32]. Ωστόσο, αυτό το πρότυπο της θεραπείας φροντίδας για ασθενείς με HNCs δεν ισχύει για τους ασθενείς FA λόγω των σοβαρών παρενεργειών της θεραπείας σε αυτούς τους ασθενείς [33]. Αναγνώριση του HPV-κατάστασης στην HNCs από ασθενείς FA θα βοηθήσει τους κλινικούς ιατρούς αναζητήσουν ασφαλέστερες και καλύτερες λύσεις για τη θεραπεία αυτών των κακοηθειών. Αρκετές προηγούμενες μελέτες συμπεριλαμβανομένων δικό μας έχουν δείξει δύο μοριακές βιοδείκτες, MCM7 και ρ16, είναι χρήσιμα για τη διάκριση HPV-θετικά από HPV-αρνητικό HNCs τόσο σε ποντικούς [23,26] και στον άνθρωπο [34,35]. Θέλαμε να παρακολουθεί αν HPV16 Ε6 και Ε7 διπλή έκφραση για την ελλειμματική φόντο οδού FA αυξάνει επίσης τα επίπεδα MCM7 και της πρωτεΐνης p16 στους όγκους από

K14E6E7

/

FancD2

– /-

ποντίκια. τμήματα ιστών από τους όγκους που προκύπτουν στο

K14E6E7

/

FancD2

+ /+

και

K14E6E7

/

FancD2

– /- ποντίκια

υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημεία για αντι-MCM7 και -p16 ειδικά αντισώματα. Δεν νεοπλασματικές αλλοιώσεις παρατηρήθηκαν σε

NTG /FancD2

+ /+

και

NTG /FancD2

– /- ποντίκια

. Όπως έχει ήδη αναφερθεί [23], Ε6 δεν αυξηθούν τα επίπεδα έκφρασης αυτών των δεικτών και

fancD2

-deficiency δεν μετέβαλε τη διαπίστωση αυτή (Εικόνα 1). Οι δύο βιοδείκτες ήταν εντόνως εκφρασμένο στους πυρήνες όλων των καλοήθων και κακοήθων όγκων σε

K14E6E7

ποντικούς ανεξαρτήτως του

fancD2

κατάσταση έκφρασης (Σχήμα 1). Επιπλέον,

fancD2

knockout δεν άλλαξε το πρότυπο έκφρασης αυτών των βιοδεικτών στην κανονική επιθήλια της γλώσσας και του οισοφάγου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα ευρήματα αυτά μας οδηγούν να δείχνουν ότι αυτές οι δύο βιοδείκτες θα είναι πολύτιμη για τη διάγνωση της HPV-κατάστασης σε καρκίνους από ασθενείς FA.

Ορατή είναι αντιπροσωπευτικά εικόνες ανοσοϊστοχημεία από τα τμήματα βάφονται με αντι-MCM7 (καφέ πυρήνες) και αντι-p16 (καφέ πυρήνες) αντισώματα και με αιματοξυλίνη (μπλε πυρήνες). μπαρ κλίμακα, 50 μm.

Η

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων που προκαλείται από ογκογονίδια HPV16 αυξάνεται στο fancD2 ανεπάρκεια φόντο

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων πρέπει να είναι αυστηρά ρυθμιζόμενη να διατηρήσει την ομοιόσταση των ιστών και συμβάλλει απορρύθμιση της για νεοπλασματικές ασθένειες. Στην προηγούμενη μελέτη μας, μάθαμε ότι HPV16 Ε7 και

fancD2

-deficiency προσθετικά και ανεξάρτητα αύξησε την συχνότητα των κυττάρων στο βασικό επιθήλια της γλώσσας και του οισοφάγου που υποβάλλονται σε σύνθεση του DNA [26]. Ένα

in vitro

μελέτη έδειξε ότι η ανεπάρκεια FA οδήγησε στην υπερπλασία στο πλαίσιο της οργανοτυπικές καλλιέργειες σχεδία των ανθρώπινων κερατινοκυττάρων αθανατοποιημένων από το συνδυασμό των Ε6 και Ε7 ογκογονίδια [22]. Για να εκτιμηθεί εάν

in vivo

FA ανεπάρκεια είχαν οποιαδήποτε επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με την παρουσία του Ε6 μόνα ή Ε6 και Ε7 μαζί, τα ποντίκια από την ανωτέρω καρκίνο κεφαλής και λαιμού μελέτη εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς με BrdUrd (12.5 mg /ml), ένα συνθετικό ανάλογο της θυμιδίνης, 1 ώρα πριν από την θυσία και BrdUrd-ειδικό ανοσοφθορισμό διεξήχθη για τον εντοπισμό κυττάρων που υποστηρίζουν τη σύνθεση του DNA στα επιθήλια επένδυση της γλώσσας και του οισοφάγου των ποντικών (Σχήμα 2Α). Η συχνότητα των BrdUrd-θετικών κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε να παρέχει μια πολλαπλασιαστική δείκτη για κάθε ιστό (Εικόνα 2Β).

Α, και να στείλει το νεοσυντεθέν DNA στα επιθηλιακά στρώματα της γλώσσας και του οισοφάγου ιστούς, τα ποντίκια ενδοπεριτοναϊκά ένεση με BrdUrd πριν από τη θυσία και οι ιστοί τους χρωματίστηκαν για αντι-BrdUrd (κόκκινο) και αντι-κυτοκερατίνης 14 πρωτεΐνη (CK14) (πράσινο) αντισώματα. DAPI (μπλε) χρησιμοποιείται για την πυρηνική αντιχρωματισμός. μπαρ κλίμακα, 20μm. Β, τουλάχιστον τρία ποντίκια από κάθε γονότυπο,

NTG /FancD2

+ /+

,

NTG /FancD2

– /-

,

K14E6 /FancD2

+ /+

,

K14E6 /FancD2

– /-

,

K14E6E7 /FancD2

+ /+

, και

K14E6E7 /FancD2

– /- ποντίκια

, επιλέχθηκαν και ~ 8 10 καρέ των κυττάρων στα επιθηλιακά στρώματα της γλώσσας και του οισοφάγου επιθήλια ποσοτικοποιήθηκαν για κάθε ποντικό. Η ποσότητα του BrdUrd-θετικών πυρήνων επί του αριθμού των συνολικών κυττάρων παραστάθηκε γραφικά σε κάθε περίπτωση (στήλες)? μπαρ, SD. Ο αστερίσκος (*) σημαίνει ότι η ανεπάρκεια του

fancD2

γονίδιο προκάλεσε σημαντική αύξηση στη σύνθεση του DNA μεταξύ των γονότυπων (

P

& lt? 0,05). Όλες οι στατιστικές συγκρίσεις έγιναν με τη χρήση δύο όψεων τεστ rank-sum Wilcoxon.

Η

Από το

fancD2

-Επαρκή φόντο, Ε6 μόνο του ή μαζί με Ε7 αύξησε σημαντικά τον αριθμό των BrdUrd Θετικοί κύτταρα στο επιθήλιο της γλώσσας ή του οισοφάγου (

NTG /FancD2

+ /+

εναντίον

K14E6 /FancD2

+ /+

ή

K14E6E7 /FancD2

+ /+

,

P

& lt? 0.05 στο σχήμα 2Β). Ο συνδυασμός των Ε6 και Ε7 οδήγησε σε σημαντικά αυξημένο αριθμό BrdUrd-θετικών επιθηλιακά κύτταρα στο

fancD2

-Επαρκή φόντο απ ‘ότι Ε6 μόνο (

P

& lt? 0.05 στο Σχήμα 2Β). Είναι σημαντικό ότι η συχνότητα των κυττάρων που υποστηρίζουν τη σύνθεση του DNA ήταν σημαντικά αυξημένη στα επιθηλιακά κύτταρα του οισοφάγου γλώσσας ή όλων των ποντικών που είχαν ανεπάρκεια για

fancD2

, ανεξάρτητα από την κατάσταση HPV16 ογκογονίδιο (

NTG /FancD2

+ /+

εναντίον

NTG /FancD2

– /-

,

K14E6

/

FancD2

+ /+

εναντίον

K14E6

/

FancD2

– /-

, και

K14E6E7

/

FancD2

+ /+

εναντίον

K14E6E7

/

FancD2

– /-

? όλα

P

& lt? 0.05 στο σχήμα 2Β). Έχουμε βελτιωθεί περαιτέρω ανάλυσή μας της επίδρασης των ογκογονιδίων HPV16 και ανεπάρκεια FA για την επαγωγή της σύνθεσης του DNA σε δύο διαφορετικές υπο-διαμερίσματα του επιθηλίων: το βασικό διαμέρισμα, το οποίο είναι κυτοκερατίνης 14 (CK14) θετική, και το διαμέρισμα υπερβασικά, η οποία είναι CK14 αρνητικό (Σχήμα 2Α). Το παραπάνω αναφέρεται επίδραση και των δύο παραγόντων (ογκογονίδια HPV16 και FA-κατάσταση) ήταν πιο ομοιόμορφα παρατηρήθηκε στο βασικό διαμέρισμα τόσο της γλώσσας και του οισοφάγου (Εικόνα S1). Συνοπτικά, ανεπάρκεια σε

fancD2

οδήγησε στην επαγωγή της σύνθεσης κυτταρικού DNA στην γλώσσα και τον οισοφάγο επιθήλια ανεξάρτητα από HPV16 ογκογονιδίου κατάστασης. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι FancD2 παίζει ένα ρόλο για τη ρύθμιση [6,36,37] κυττάρων S φάσης του κύκλου. Ωστόσο, το γεγονός ότι FA-ανεπάρκεια δεν προκάλεσε αυξημένη ευαισθησία για το κεφάλι και ογκογένεση λαιμό στα διαγονιδιακά ποντίκια Ε6 αλλά προκάλεσε μια αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε αυτά τα ίδια ποντίκια δείχνει ότι η επαγωγή του επιθηλιακή υπερπλασία δεν εξηγεί πώς η ανεπάρκεια FA οδηγεί ογκογένεση .

Το μονοπάτι FA καταστείλει συγκεκριμένα Ε7 με γνώμονα την βλάβη του DNA

Τόσο HPV16 Ε6 και Ε7 ογκογονίδια έχουν υποστηριχθεί για να προκαλέσει βλάβη στο DNA βασίζεται κομήτη αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε κύτταρα σε καλλιέργεια ιστού [38,39 ]. Δεδομένου ότι η οδός FA εμπλέκεται στην επιδιόρθωση των κατεστραμμένων DNA, θα ήταν να είναι αυτονόητο ότι το επίπεδο της βλάβης του DNA που προκαλούνται από Ε6 και Ε7 θα αυξηθεί σε ανεπαρκή φόντο FA. Η παρουσία της βλάβης του DNA σε κύτταρα μπορούν να σημειωθούν έμμεσα με την παρακολούθηση της παρουσίας των πυρηνικών εστιών θετικά για ιστόνης 2AX φωσφορυλιωθεί στη σερίνη-139 (γ-Η2ΑΧ) [40,41]. Είχαμε προηγουμένως δείξει ότι σε

K14E7

ποντίκια, Ε7 οδήγησε σε ισχυρή αύξηση της συχνότητας των πυρηνικών εστιών-θετικών κυττάρων γ-Η2ΑΧ στα επιθήλια της γλώσσας και του οισοφάγου, και η συχνότητα αυξήθηκε περαιτέρω σχετικά με την

fancD2

ελλιπή ως φόντο [26]. Στην παρούσα μελέτη, θα θέλαμε να καθορίσει το ρόλο του HPV16 Ε6 σχετικά με την απάντηση βλάβη του DNA στα

fancD2

-Επαρκή και ελλιπή ως υπόβαθρα. Για το σκοπό αυτό, χρώση ανοσοφθορισμού ειδικό για γ-Η2ΑΧ διεξήχθη επί τμημάτων της γλώσσας και του οισοφάγου από

NTG

,

K14E6

, και

K14E6E7

ποντίκια στο

fancD2-

επαρκή ή

fancD2

ελλιπή ως υπόβαθρο (Εικόνα 3Α).

Α. Για την αξιολόγηση επάγεται DNA απόκριση ζημιά από HPV16 Ε6 και Ε7 στην ανεπάρκεια του

fancD2

γονίδιο, ιστοί από κάθε ομάδα υπέστησαν χρώση για αντι-γ-Η2ΑΧ (κόκκινο) και αντι-κυτοκερατίνης 14 πρωτεΐνη (CK14) (πράσινο ) αντισώματα. DAPI χρησιμοποιείται για ένα πυρηνικό αντιχρωματισμός. μπαρ κλίμακα, 20μm. γ-Η2ΑΧ είναι εστίες θετικά κύτταρα επισημαίνονται με πράσινα βέλη στις εικόνες. Β Τουλάχιστον τρία ποντίκια της κάθε γονότυπο,

NTG /FancD2

+ /+

, NTG /FancD2

– /-

,

K14E6 /FancD2

+ /+

,

K14E6 /FancD2

– /-

,

K14E6E7 /FancD2

+ /+

, και

K14E6E7 /FancD2

– /- ποντίκια

, επιλέχθηκαν και ~ 8 10 καρέ των κυττάρων στα επιθηλιακά στρώματα της γλώσσας και του οισοφάγου ποσοτικοποιήθηκαν για κάθε ποντικό. Η ποσότητα των κυττάρων με γ-Η2ΑΧ θετικών κυττάρων εστίες επί του αριθμού των συνολικών κυττάρων παραστάθηκε γραφικά σε κάθε περίπτωση (στήλες)? μπαρ, SD. Ο αστερίσκος (*) σημαίνει ότι οι διαφορές στον αριθμό των κυττάρων με γ-H2AX εστίες μεταξύ των ομάδων ήταν στατιστικά σύγκριση (

P

& lt? 0,05). Όλες οι στατιστικές συγκρίσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας δύο όψεων δοκιμή rank-sum Wilcoxon. Σημείωση: Οι χρόνοι έκθεσης που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα ίδια για όλα τα δείγματα που αναλύθηκαν. Μερικά κύτταρα σε ιστούς του

K14E6E7 /FancD2

+ /+

και

K14E6E7 /FancD2

– /- ποντίκια είχαν

πολύ φωτεινό γ-H2AX-ειδική πυρηνική χρώση στο έκθεσης που χρησιμοποιήθηκε. Μικρότερες έκθεση επιβεβαίωσε ότι αυτά τα κύτταρα που διατηρούνται στικτή πυρηνική χρώση αντανακλαστικό της βλάβης του DNA εστιών απόκριση.

Η

στο επιθήλιο της γλώσσας και του οισοφάγου ιστού, Ε6 διαγονιδιακά ποντίκια έδειξαν πολύ λίγοι γ-Η2ΑΧ θετικών κυττάρων εστίες, παρόμοια με εκείνη που παρατηρήθηκε στο

NTG

ποντίκια. μπαρ, SD. μπαρ, SD.