Αφηρημένο

Η φωσφορυλιωμένη είναι βιοδείκτες της παθοφυσιολογίας του καρκίνου και την αντίσταση στη θεραπεία, αλλά επειδή φωσφατάση αναλυτών είναι συχνά ασταθή, ανεπαρκώς ελεγχόμενη κλινική εργαστηριακή πρακτική θα μπορούσε να εμποδίζουν την μετάφραση των αποτελεσμάτων της έρευνας σε αυτόν τον τομέα από τον πάγκο στο κομοδίνο. Ως εκ τούτου, σε σύγκριση πολλαπλών βιοδεικτών και φωσφοπρωτεΐνη ανοσοϊστοχημεία (IHC) οδηγεί σε 23 κλινικά δείγματα ορθοκολικού καρκινώματος μετά είτε μία νέα, ταχεία πρωτόκολλο στερέωση του ιστού ή ένα πρότυπο πρωτόκολλο στερέωση του ιστού που απασχολούνται από κλινικά εργαστήρια, και διερευνήσαμε επίσης την επίδραση ενός καθορισμένου μετεγχειρητικού «κρύο» περίοδος ισχαιμίας σε αυτά τα αποτελέσματα IHC. Βρήκαμε ότι μία ώρα διάστημα ψυχρής ισχαιμίας, που επιτρέπεται από τις κατευθυντήριες γραμμές ASCO /CAP για ορισμένες δοκιμασίες καρκίνο βιοδείκτη, είναι ιδιαίτερα επιβλαβής σε ορισμένους αναλύτες φωσφοπρωτεΐνη, ειδικά ο υποδοχέας φωσφορυλιώνεται επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (pEGFR), αλλά μικρότερη ισχαιμική χρονικά διαστήματα (λιγότερο από 17 λεπτά) διευκολύνεται η διατήρηση της φωσφοπρωτείνες. Δεύτερον, βρήκαμε ότι η ταχεία 4 ωρών, δύο θερμοκρασία, μονιμοποίηση φορμαλίνης απέδωσε ανώτερη χρώση σε αρκετές περιπτώσεις με επιλεγμένες δείκτες (pEGFR, ρΒΑϋ, ρΑΚΤ) σε σύγκριση με ένα πρότυπο πρωτόκολλο στερέωση όλη τη νύκτα σε θερμοκρασία δωματίου, παρά τη λήψη λιγότερο χρόνο. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι οι μελλοντικές έρευνες και κλινικές επιχειρήσεις κοινής ωφελείας των φωσφοπρωτεΐνη IHC για την αξιολόγηση της παθοφυσιολογίας ορθοκολικό καρκίνωμα εξαρτώνται απόλυτα κατόπιν προσοχή στην προαναλυτικές παράγοντες και αυστηρά ελεγχόμενη πρωτόκολλα καθήλωσης ιστών

Παράθεση:. Theiss AP, Chafin D, Bauer DR, Grogan TM, Baird GS (2014) Ανοσοϊστοχημεία καρκίνου του παχέος εντέρου βιοδεικτών φωσφορυλίωση Απαιτεί Ελεγχόμενη ιστών Καθήλωση. PLoS ONE 9 (11): e113608. doi: 10.1371 /journal.pone.0113608

Επιμέλεια: Ιωάννης Ματθαίος Koomen, Moffitt Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 του Ιούνη 2014? Αποδεκτές: 28 Οκτώβρη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 19 Νοεμ, 2014

Copyright: © 2014 Theiss et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από μια ερευνητική επιχορήγηση για GSB από Ventana Medical Systems, Inc. Δεν υπάρχει κανένας αριθμός επιχορήγησης που συνδέονται με την έρευνα αυτή σύμβαση χορήγηση. Αυτή η μελέτη ήταν μια συνεργατική προσπάθεια μεταξύ του ιδρύματος και της Ventana GSB του, και ως εκ τούτου οι εργαζόμενοι Ventana ενεπλάκησαν σε όλα τα στάδια της έρευνας (σχεδιασμός της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων, την ανάλυση, την απόφαση να δημοσιεύσει, και την προετοιμασία του χειρογράφου). Το υπόλοιπο μέρος αυτού του έργου χρηματοδοτήθηκε από την εσωτερική Πανεπιστήμιο κεφαλαίων Ουάσιγκτον

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Geoffrey Baird έχει διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και τους συγγραφείς αυτού του χειρογράφου έχουν τα ακόλουθα ανταγωνιστικά συμφέροντα: Οι αναφέρεται συγγραφείς είναι υπάλληλοι της Ventana Medical Systems, Inc. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση οποιουδήποτε συγγραφέα σε κάθε PLoS ONE πολιτικής.

Εισαγωγή

σε στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου, έχει υπάρξει πρόσφατη προσοχή που δίνεται στη σημασία της αναγνώρισης της μέλη ενεργοποίηση των κυττάρων μορίων σηματοδότησης στην πρόβλεψη των αποκρίσεων σε θεραπεία. Μια τέτοια περίπτωση είναι ο EGFR μεσολάβηση επανενεργοποίηση της ΜΑΡΚ σηματοδότησης, η οποία συμβάλλει στην έλλειψη ευαισθησίας του BRAF-μεταλλαγμένο ορθοκολικού καρκινώματος σε αναστολή της RAF με Vemurafenib [1]. Είναι σημαντικό ότι αυτή η pEGFR επανενεργοποίηση εκδήλωση υπόκεινται σε διαφοροποίηση από αναστολείς EGFR, και το συνδυασμένο πολυθεραπεία αναστολείς BRAF και EGFR ξεπεραστεί αυτή η αντίσταση, με ευεργετική απάντηση

in vitro

και σε ζωικά μοντέλα

in vivo

.

Η επέκταση αυτών πριν από εργαστηριακά ευρήματα στην κλινική, και την ικανότητά μας να επηρεάσει εναλλακτικές θεραπείες, εξαρτάται εξ ολοκλήρου από την ικανότητά μας να διατηρήσουμε με ακρίβεια και να ανιχνεύουν τις καταστάσεις ενεργοποίησης αυτών. Στην προσπάθεια να προσδιοριστεί η βέλτιστη συντήρηση (στερέωση του ιστού) προϋποθέσεις για τη στήριξη στοχευμένη θεραπεία, η λογοτεχνία μας οδήγησε να αμφισβητήσει κατά πόσον ή όχι συνήθη πρακτική στο ανατομικό εργαστήριο παθολογίας είναι επαρκής για την αντιμετώπιση όλων των πιθανών παγίδες που θα μπορούσαν να επηρεάσουν βιοδείκτη κατάσταση /ενεργοποίησης διατήρηση. Για παράδειγμα, στο δικό μας κλινική εργαστηριακή εμπειρία, δείγματα ιστού μπορεί να παραμείνει σε θερμοκρασία δωματίου πριν από την εμβάπτιση σε στερεωτικό για μεγάλες χρονικές περιόδους, και του πραγματικού χρόνου που δαπανάται σε σταθεροποιητικό, και η θερμοκρασία του εν λόγω στερεωτικό, μερικές φορές κακώς ελεγχόμενη. Τρέχουσες επαγγελματικές κατευθυντήριες γραμμές των ΗΠΑ για το θέμα αυτό [2] – [4] αντιμετωπίσει μόνο ένας περιορισμένος αριθμός των κλινικών τύπων δείγματος και κατάντη των βιοδεικτών αναλύσεις, ή εξακολουθούν να είναι αρκετά ευρύ ορισμό αυτό που θεωρείται αποδεκτό από την άποψη του χρόνου στερέωσης (2-πλάσια διακύμανση στο μέγιστο χρόνο στερέωσης, 16-32 ώρες, συνιστάται στις κατευθυντήριες γραμμές CLSI, καθώς και μια σειρά 12-πλάσια της διάρκειας στερέωσης, 6-72 ώρες, θεωρείται αποδεκτή στις κατευθυντήριες γραμμές δείκτης του καρκίνου του μαστού ASCO /CAP). Μια προ-στερέωση «ψυχρή ισχαιμία» χρόνο μέχρι μία ώρα, επίσης, θεωρείται αποδεκτή σε μία από αυτές τις κατευθυντήριες γραμμές [3], η οποία είναι εντός του εύρους των όσων έχουμε παρατηρήσει κλινικά στα δικά μας ιδρύματα. Προηγούμενες μελέτες ανοσοϊστοχημείας καρκίνος βιοδείκτη έχουν βρει πράγματι ~ 1 ώρα φορές ισχαιμία αποδεκτή, αν και αυτές οι μελέτες έχουν επικεντρωθεί κυρίως σε καθιερωμένες βιοδείκτες όπως Οιστρογονικών Υποδοχέων και HER2 [5], [6]. Ωστόσο, από τις κατευθυντήριες γραμμές που υπάρχουν, κανένας φιλοδοξούν να αντιμετωπίσουν τη διατήρηση των καταστάσεων ενεργοποίησης των βιοδεικτών, όπως τα κράτη φωσφορυλίωση, σε όλα. Αυτό είναι ιδιαίτερα προβληματική, επειδή οι καταστάσεις φωσφορυλίωσης ήταν γνωστή για κάποιο χρονικό διάστημα να είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στην προαναλυτικές συνθήκες [7] -. [9], συμπεριλαμβανομένων ζεστό ισχαιμικό φορές [10] (η οποία δεν διερευνώνται εδώ)

Για το σκοπό αυτό, αναπτύξαμε ένα νέο, ταχύ δύο θερμοκρασία στρατηγική μονιμοποίηση φορμαλίνης που βρήκαμε διατηρεί τα βασικά χαρακτηριστικά του ιστού όπως η μορφολογία, καθώς επίσης και η έκφραση της πρωτεΐνης όπως εκτιμήθηκε με ανοσοϊστοχημεία [11]. Σε αυτή την εργασία, βρήκαμε σημαντικές διατήρηση ρΑΚΤ σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού Calu3, όπως αξιολογήθηκε με IHC, χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο στερέωση δύο θερμοκρασιών, και βρήκαμε ότι αυτή η χρώση ήταν σχεδόν εξ ‘ολοκλήρου χαθεί με τη χρήση τυποποιημένων στερέωση θερμοκρασία δωματίου. Προχωρώντας προς τα εμπρός από τη μελέτη αυτή, επεκτείναμε τη μελέτη μας σε δείγματα ορθοκολικού καρκινώματος, αναλύοντας για πρόσθετες phosphoepitopes. Σε αυτήν την τρέχουσα περιεκτική μελέτη, ρωτήσαμε αν ή όχι η τεχνολογία δύο θερμοκρασίας επιπλέον βοήθεια για τη διατήρηση της κατάστασης ενεργοποίησης των βιοδεικτών που σχετίζονται με ορθοκολικό θεραπεία του καρκίνου, καθώς και κατά πόσον ή όχι τον έλεγχο των προ-στερέωση κρύο ισχαιμική διαστήματα ήταν σημαντικό για αυτούς τους βιοδείκτες. Χρησιμοποιώντας 23 ορθοκολικό καρκίνωμα χειρουργική δείγματα που συλλέγονται με καθορισμένα κρύο ισχαιμική διαστήματα και πρωτόκολλα καθήλωσης με φορμαλίνη, μελετήσαμε την κατάσταση φωσφορυλίωσης των πολυάριθμων στόχων μονοπατιού κινάσης ΡΙ3, καθώς και τη μετάλλαξη BRAF V600E και άλλους δείκτες χρησιμοποίηση ανοσοϊστοχημείας [12], [13]. Αναφέρουμε εδώ τόσο τη σημασία του κρύου ισχαιμικό χρόνο ως μεταβλητή στην ανάλυση φωσφοπρωτεΐνη, καθώς και το συνολικό αντίκτυπο της ταχείας δύο θερμοκρασίας πρωτόκολλο καθήλωση φορμόλης μας.

Υλικά και Μέθοδοι

Δείγμα δείγματα ανθρώπινου καρκινώματος του παχέος εντέρου συλλογή και Καθήλωση

ελήφθησαν από Indivumed GmbH (Αμβούργο, Γερμανία) ως μπλοκ παραφίνης-ενσωματωμένα. Τα δείγματα συλλέχθηκαν σε Indivumed γιατί Ventana δεν είναι μια ιατρική μονάδα και ως εκ τούτου δεν έχει καμία πρόσβαση σε χειρουργική δείγματα, και επίσης επειδή Indivumed ήταν γνωστό για να είναι σε θέση να παρέχει δείγματα ιστού με μια τεκμηριωμένη μικρή (λιγότερο από 17 λεπτά) μετά την εκτομή ισχαιμική διάστημα. Indivumed επιστήμονες που εκτελούνται συλλογές ιστού κάτω από την έγκριση από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας τους, και έλαβε τη γραπτή συγκατάθεση των ασθενών που συμμετέχουν.

Για όλα τα πειράματα, τα πρωτόκολλα καθήλωσης διενεργήθηκαν από επιστήμονες Indivumed, και αποτελούνταν από εμβάπτιση σε ουδέτερη 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη (10% κορεσμένο υδατικό διάλυμα φορμαλδεΰδης από την Fisher Scientific, Houston, ΤΧ, ρυθμισμένο σε ρΗ 6.8 με 7.2 με 100 mM φωσφορικό ρυθμιστικό) για διάφορους χρόνους σε θερμοκρασίες που κυμαίνονται από 4-45 ° C. Η θερμοκρασία δωματίου κυμαινόταν από 20-25 ° C. Δείγματα ιστού συλλέχθηκαν από κλινικές περιπτώσεις χωρίστηκαν σε τρίτα και σε κάθε σταθερό διαφορετικά. Ένα κομμάτι τυλίχθηκε σε φυσιολογικό ορό εμποτισμένο γάζα και διατηρήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα ( «1 ώρα ψυχρή ισχαιμία») πριν 24 καθήλωσης ώρες σε RT. Αυτό έγινε για να ελεγχθεί η επίδραση του μακρύτερου κατευθυντήρια επιβεβλημένος διάστημα ψυχρή ισχαιμία μίας ώρας. Τα υπόλοιπα δύο κομμάτια ήταν να ελεγχθεί η επίδραση της μικρότερης (λιγότερο από 17 λεπτά) κρύο διάστημα ισχαιμίας. Ένα κομμάτι τοποθετήθηκε απ ‘ευθείας εντός θερμοκρασία δωματίου με φορμαλίνη για 24 ώρες ( «24 hr»). Ένα τρίτο κομμάτι τοποθετήθηκε απευθείας σε 4 ° C φορμαλίνης για 2 ώρες που ακολουθείται από 2 ώρες σε 45 ° C φορμαλίνη ( «2 + 2») [11]. Το τελευταίο ήταν να ελέγξετε αν η διαδικασία θα μπορούσε να επιταχυνθεί με την αύξηση της αποδοτικότητας της εργασίας στο νοσοκομείο. Καθήλωση διεξήχθη σε 100-500 mL καλύπτονται ποτήρια ζέσεως σε ψυγείο για θεραπεία 4 ° C, ή σε ένα πρότυπο χημικό απαγωγό για υψηλότερες θερμοκρασίες. Κρύο φορές ισχαιμία για το «24» και τα δείγματα «2 + 2» κατά μέσο όρο 10 +/- 3 λεπτά (εύρος 6-17 λεπτά). Οι μεταγενέστεροι επεξεργασία των ιστών εκτελέστηκε όπως περιγράφεται [11], με όλα τα βήματα επεξεργαστή διαλύτη διατηρείται στους 45 ° C υπό πίεση περιβάλλοντος, και το στάδιο παραφίνη κρατήθηκε στους 60 ° C υπό κενό. Όλα τα δείγματα εγκλείστηκαν σε παραφίνη και κόβονται σε γυάλινα πλακίδια ως τμήματα 4-micron για IHC ή histomorphology.

Automated Ανοσοϊστοχημεία

δοκιμασίες Ανοσοϊστοχημεία διεξήχθησαν σε ένα όργανο αυτοματοποιημένη χρώση VENTANA Discovery XT σύμφωνα με την τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα σλάϊντς-παραφινοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας διάλυμα EZprep (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, ΑΖ) για 30 λεπτά στους 75 ° C. Επιτόπου ανάκτηση επετεύχθη στην αυτοματοποιημένη βαφεύς με διάλυμα CC1 (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, ΑΖ) για 64 λεπτά στους 95 ° C. Αντισώματα που λαμβάνονται από την Cell Technologies Σηματοδότηση ή Epitomics πρώτα τιτλοδοτήθηκαν σε μία περιοχή συγκεντρώσεων για να παρέχει τη βέλτιστη αναλογία ειδικής χρώσης για χρώση υποβάθρου. Μόλις ορίστηκαν τίτλοι, τα αντισώματα μεταφέρθηκαν με αραιωτικό στο χρήστη fillable διανεμητές για χρήση στην αυτοματοποιημένη βαφεύς. Διαφάνειες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας την προβολή Opti

κιτ ανίχνευσης DAB (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ). Εν συντομία, τα βήματα που περιλαμβάνονται αναστολέας για 8 λεπτά, συνδετήρας για 8 λεπτά, πολυμερές για 12 λεπτά, DAB /υπεροξειδίου για 8 λεπτά και χαλκό για 4 λεπτά. Τα πλακίδια στη συνέχεια με αιματοξυλίνη II για 8 λεπτά (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, ΑΖ). Τα αντισώματα, οι κλώνοι, και οι τίτλοι που απαριθμούνται στον Πίνακα 1. Οι τίτλοι αντισωμάτων προσδιορίσθηκαν για κάθε αντίσωμα με τη χρήση θετικών και αρνητικών ιστούς ελέγχου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Η

Ανοσοϊστοχημεία Ανάλυση

ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις ήταν Ο δύο ανεξάρτητους παθολόγους, κάθε τυφλωθεί με τη μεθοδολογία στερέωσης για κάθε διαφάνεια, χρησιμοποιώντας ένα η-βαθμολογία για semiquantitation της χρώσης αναλογία και της έντασης [14]. Στις περιπτώσεις και με τα δύο

in situ

και επεμβατική νεοπλασίες, μόνο η επεμβατική όγκου μακριά από τα περιθώρια του δείγματος ιστού γκολ. Υψηλή ένταση χρώσης που ήταν σαφώς υποβιβαστεί στην απόλυτη περιθώρια του ιστού (δηλαδή αυτό που κοινώς αναφέρεται στην κλινική ανοσοϊστοχημεία ως «φαινόμενο άκρου» [15]) αγνοήθηκε. Παρτιτούρες αποκάλυψη του θεραπευτικού σκέλους από τρίτους, καθώς και όλα τα αποτελέσματα H από κάθε παθολόγος χαράχθηκαν ένας ενάντια στον άλλο για κάθε δείκτη. Βαθμολογίες που εμφανίστηκε υποκειμενικά αντιφατικά, δηλαδή εκείνους που παρεκκλίνουν ουσιαστικά από τη γραμμή της ταυτότητας όπως αξιολογήθηκε με οπτική επιθεώρηση, εξετάστηκαν από κοινού σε ένα πολυ-με επικεφαλής μικροσκόπιο και συναίνεση βαθμολογίας δημιουργήθηκε.

Στατιστική Ανάλυση

Όλες ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το στατιστικό πακέτο R. Για κάθε περίπτωση, ήταν κατά μέσο όρο οι βαθμολογίες H από τις δύο σχολιαστές. Στατιστικές διαφορές μεταξύ των ομάδων στερέωσης (24 ώρες έναντι 2 + 2, 24 ώρες vs ψυχρή ισχαιμία) χρησιμοποιώντας δύο όψεων ζεύγη Wilcoxon Signed Rank τεστ. Επειδή πολλές συνθήκες αξιολογήθηκαν ταυτόχρονα, ρ-τιμές για αυτές τις συγκρίσεις μετατράπηκαν σε ψευδείς τιμές Q ανακάλυψη ρυθμού διορθωμένη [16], [17]. Boxplots στο Σχήμα 1 παρήχθησαν με τη ggplot2 πακέτο. Μαύρες μπάρες αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές και κουτιά εκτείνονται από το 25

ου σε 75

ου εκατοστημόρια. Μουστάκια επεκταθεί σε 1,5 × την απόσταση ενδοτεταρτημοριακού.

βαθμολογίες H χρώσης έντασης για όλους τους μελετήθηκαν βιοδείκτες, από την κατάσταση επεξεργασίας. «2 + 2″ είναι η ταχεία κατάσταση καθήλωσης, «24 ώρες». Είναι το πρότυπο 24-ωρη κατάσταση θερμοκρασία δωματίου χωρίς προ-στερέωση ψυχρής ισχαιμίας, και «ισχαιμία» σημαίνει ένα 1-ώρα ψυχρή ισχαιμική περίοδο πριν από 24 ώρες room σταθεροποίηση της θερμοκρασίας. Οι διάμεσοι αντιπροσωπεύονται από οριζόντιες γραμμές, τα κουτιά σε αγροτεμάχια αντιστοιχούν στις 25

ου και 75 εκατοστημόριο κάθε διανομής, τα μουστάκια εκτείνονται στην πιο ακραία τιμή που είναι μέσα σε 1,5 φορές την απόσταση μεταξύ του πρώτου και τρίτου τεταρτημορίου, και τα στοιχεία πέρα ​​από τα μουστάκια εμφανίζονται ως κουκκίδες.

η

αποτελέσματα

H-βαθμολογίες για όλους τους δείκτες αναπαριστώνται γραφικά στο Boxplots Σχήμα 1, και τα αποτελέσματα των δοκιμών σύγκρισης φαίνονται στον πίνακα 2 .

η

Πολύ λίγες περιπτώσεις έδειξαν καμία αξιόλογη χρώση για τρεις από τους δείκτες (BRAF V600E, pMEK1 /2, και ρΑΚΤ), αλλά δύο περιπτώσεις ήταν αναμφισβήτητα θετική για τη μετάλλαξη BRAF V600E, ένα εύρημα επιβεβαιώνεται από μοριακή ανάλυση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνολικά, το πρωτόκολλο 2 + 2 έδωσε την ίδια ή μεγαλύτερη σήμα IHC από τη θεραπεία 24 ώρες, με αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα χρώσης φαίνεται στο Σχήμα 2. Ενώ αρκετές περίπτωση ειδικές διαφορές επισημαίνονται στην Εικόνα 2, δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές που παρατηρήθηκαν σε πολλαπλά ζεύγη συγκρίσεις μεταξύ των 24 περιπτώσεις (Πίνακας 2). Ο Πίνακας 2 δείχνει ότι δύο δείκτες φαίνεται να έχουν ελαφρώς αυξημένη χρώση στη θεραπεία 24 ώρες (EGFR και pERK), αλλά και πάλι, αυτές οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές, ούτε οι παθολόγους σκοράροντας τα δείγματα βρει καμία περίπτωση αποκλίνοντος χρώση μεταξύ 2 + 2 και 24 όρους ώρα θα οδηγήσει σε μια αλλαγή στη παθοφυσιολογική ερμηνεία αυτών των δύο δεικτών.

Εκπρόσωπος αποτελέσματα από την IHC ανάλυση δύο δειγμάτων παχέος καρκίνωμα υποβάλλονται είτε στην ταχεία κατάσταση στερέωσης ( «2 + 2») ή το πρότυπο 24 -hour κατάσταση θερμοκρασία δωματίου χωρίς προ-στερέωση ψυχρή ισχαιμία ( «24 ώρες»). pERK, pMTOR, pMEK1 /2 και pPRAS40 εμφανίζονται για μία περίπτωση και ρΒΑϋ και ρΑΚΤ φαίνονται από μια δεύτερη περίπτωση. Δύο διαφορετικές περιπτώσεις που παρουσιάζονται εδώ επειδή δεν είναι όλες τις περιπτώσεις έδειξαν χρώση για όλους τους δείκτες. Όλες οι μικρογραφίες λαμβάνονται σε 200 × με ισοδύναμες εκθέσεις.

Η

Το σήμα IHC επηρεάστηκε πολύ περισσότερο δυσμενώς από την μεγαλύτερη της 1 ώρας περίοδο ψυχρής ισχαιμίας πριν την καθήλωση σε σύγκριση με τις μικρότερες ισχαιμικό πρωτόκολλα διάστημα, με η μόνη εξαίρεση του EGFR. Οι τάσεις αυτές ήταν ιδιαίτερα στατιστικά σημαντικές για pEGFR και pMSK1, και η μείωση του pERK χρώση προσέγγισε στατιστική σημαντικότητα. Σε δύο περιπτώσεις, στις ειδικές, που φαίνεται στα Σχήματα 3 και 4, τα καρκινώματα που φέρουν τη μετάλλαξη BRAF V600E βρέθηκαν να είναι σαφώς θετικά για pEGFR στις δύο μικρότερες ισχαιμικών διάστημα συνθήκες, αλλά χρώση ήταν σχεδόν εξ ολοκλήρου απούσα όταν το δείγμα εκτέθηκε στην πλέον 1 ώρα ψυχρή κατάσταση ισχαιμίας.

Εκπρόσωπος εικόνες ενός παχέος περίπτωση καρκινώματος βάφονται με αντισώματα για να BRAF V600E, pEGFR, EGFR, και pMSK1, δείχνει σημαντική απώλεια της χρώσης pEGFR στην κατάσταση της ισχαιμίας. Όλες οι μικρογραφίες λαμβάνονται σε 200 × με ισοδύναμες εκθέσεις.

Η

Εκπρόσωπος της δεύτερης υπόθεσης παχέος καρκίνωμα χρωματίζονται με αντισώματα για να BRAF V600E, pEGFR, PTEN και pMSK1, δείχνει σημαντική απώλεια της χρώσης pEGFR στην ισχαιμία κατάσταση. Όλες οι μικρογραφίες λαμβάνονται σε 200 × με ισοδύναμες εκθέσεις.

Η

Συζήτηση

Τα ευρήματα αυτής της μελέτης δείχνουν σαφώς ότι ένα σημαντικό μετεγχειρητικό, προ-στερέωση κρύο ισχαιμικό χρονικό διάστημα (μια ώρα ) συγχέει την προσπάθεια για τον εντοπισμό των φωσφορυλίωσης του βασικού στοιχείου της οδού PI3 κινάσης σε φορμόλη-σταθερό ιστό. Το εύρημα αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενες εκθέσεις που δείχνουν τη σημαντική προαναλυτικές ευαισθησία των δοκιμασιών φωσφοπρωτεΐνη [7], [18]. Αν προσεκτικό χειρισμό δείγμα χρησιμοποιείται για να ελαχιστοποιηθεί το κρύο ισχαιμική διάστημα (λιγότερο από 17 λεπτά), ωστόσο, και οι δύο 24-ώρες στερέωση με φορμαλίνη θερμοκρασία δωματίου και ταχεία πρωτόκολλο στερέωση δύο θερμοκρασιών μας διατηρούν σήματα φωσφορυλίωσης κατά μέσο όρο για ουσιαστικά όλους τους δείκτες διερευνηθεί. Γιατί μερικοί δείκτες επηρεάστηκαν περισσότερο από την ψυχρή ισχαιμία είναι σαφές για μας? η ισορροπία μεταξύ απρόσκοπτη κινάσης και της δραστηριότητας φωσφατάσης κατά τη διάρκεια του ψυχρού ισχαιμικό διαστήματα δεν είναι πιθανό να παίζουν έξω με τον ίδιο τρόπο για κάθε στόχο φωσφορυλίωση, όμως, έτσι τον εντοπισμό των στόχων αυτών με υπερβολικές ευαισθησίες στο κρύο ισχαιμίας μέσω μελετών όπως αυτή θα είναι ζωτικής σημασίας, όπως στον τομέα της φωσφοπρωτεΐνη προκαταβολές ανοσοϊστοχημεία.

Όταν προκαθορισμού χρόνο ψυχρής ισχαιμίας εκτείνεται προς την μία ώρα θεωρείται ένα αποδεκτό χρονικό διάστημα στις τρέχουσες κατευθυντήριες γραμμές ASCO /ΚΓΠ για τον έλεγχο ER [3], βρήκαμε ότι το σήμα από επιλεγμένα φωσφοπρωτείνες μειώνεται σημαντικά. Συγκεκριμένα, σε δύο δείγματα βρέθηκαν να φιλοξενούν τη μετάλλαξη BRAF V600E (σχήματα 3 και 4), η 1-ώρα κρύο ισχαιμικό χρονικό διάστημα φαίνεται να επισκιάζει την έκφραση pEGFR, ένα σφάλμα που θα μπορούσε να οδηγήσει στην αποτυχία να εντοπίσει αυτούς τους ασθενείς ως υποψήφιοι για πρόσθετες θεραπεία [12], [13], [19]. Στις δύο αυτές περιπτώσεις, η ταχεία πρωτόκολλο στερέωσης δύο-θερμοκρασίας απέδωσε εμφανώς πιο χρώση pEGFR από το πρωτόκολλο στερέωσης 24 ωρών, υποδεικνύοντας ότι η ταχεία πρωτόκολλο θα μπορούσε να είναι μια πιο εύρωστη μεθοδολογία για την αξιολόγηση αυτού του κλινικά σημαντική κατάσταση ενεργοποίησης βιοδείκτη. Μια παρόμοια τάση παρατηρείται σε ορισμένες επιπλέον δείκτες (π.χ.. ΡΒΑϋ, ρΑΚΤ) στις επιλεγμένες περιπτώσεις φαίνεται στο Σχήμα 2. Η διαπίστωση αυτή αναδεικνύει με σαφήνεια τις πιθανές επιπτώσεις της προαναλυτικές χειρισμό δείγματος στην εποχή της εξατομικευμένης ιατρικής, δεδομένου ότι η διατήρηση των κρατών ενεργοποίησης βιοδείκτη φαίνεται να είναι σχετικά σταθερή, κατά μέσο όρο, μεταξύ των πρωτοκόλλων καθήλωσης για ορισμένους βιοδείκτες, αλλά διαφέρει σημαντικά για ειδικές περιπτώσεις.

Αρκετές μελέτες έχουν προσδιορίσει τώρα ότι ΜΑΡΚ μονοπάτι επανενεργοποίηση αποτελεί ένα μηχανισμό αντίστασης θεραπείας σε BRAF V600E μεταλλαγμένα ορθοκολικό καρκίνωμα που αντιμετωπίζονται με Vemurafenib [1], [20], [21].

In vitro

και μοντέλα ξενομοσχεύματος δείχνουν ότι ανθεκτικά αυτή η κατάσταση θα μπορούσε να ξεπεραστεί με τη διπλή θεραπεία που περιλαμβάνει αναστολείς του EGFR που απευθύνονται σε pEGFR, αλλά η προσέγγιση αυτή στηρίζεται στην ικανότητα του τεχνικού για να εντοπίσει pEGFR υπερέκφραση του δείγματος κλινική ιστού. Ενώ η υπάρχουσα βιβλιογραφία δείχνει ότι η διπλή θεραπεία κατέχει πολύ πιθανό όφελος για τους ασθενείς με αυτές τις συγκεκριμένες φαινοτύπους όγκου, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι όλο αυτό το πιθανό όφελος είναι σε κίνδυνο εάν μια ανεξέλεγκτη διαδικασία διατήρησης των ιστών και τη σταθεροποίηση απασχολείται. Οι δύο ασθενείς των οποίων τα καρκινώματα harbored μεταλλάξεις BRAF V600E, για παράδειγμα, δεν θα αναγνωρίζονται ως υποψήφιες για EGFR-κατευθυνόμενη θεραπεία είχαν δείγματα τους έχουν συλλεχθεί με το μακρύτερο ώρες ψυχρο ισχαιμική διάστημα που δεν είναι μόνο που παρατηρήθηκαν σε κλινικές περιοχές παθολογία, αλλά είναι επίσης θεωρείται αποδεκτή σε μια τρέχουσα κατευθυντήρια γραμμή ανάλυση του καρκίνου του βιοδείκτη. Πέρα από αυτές τις κλινικές εκτιμήσεις, αξίζει επίσης υπόψη τις ακραίες δαπάνες που συνδέονται με νέες στοχευμένες θεραπείες, έτσι ώστε misidentifying ασθενείς ως υποψήφιοι για θεραπείες θα μπορούσε να είναι όχι μόνο προσωπικά επιβλαβή, αλλά και οικονομικά σπάταλη.

Εκτός από την BRAFV600E /pEGFR παράδειγμα , είναι επίσης αξιοσημείωτο ότι pERK έκφραση μειώνεται μετά από 1 ώρα ψυχρή ισχαιμία (βλέπε πίνακα 2). Από pERK έχει χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας, αυτό το αποτέλεσμα, εάν υπάρχει σε μια κλινική δοκιμασία, θα μπορούσε δυνητικά να βλάψει την παρακολούθηση της θεραπείας. Επίσης, σε επιλεγμένες περιπτώσεις (Σχήμα 2), φαινόμενη έκφραση ρΒΑϋ μπορεί να μειωθεί κατά προκαθορισμού ισχαιμία, διαψεύδοντας την ικανότητά μας να εκτιμηθεί η έκφραση ενός παράγοντα που είναι γνωστό ότι είναι σχετικές με την παθογένεση του καρκίνου του παχέος εντέρου [19].

Μια πιθανή αδυναμία αυτής της μελέτης είναι ότι σχετικά λίγα δείγματα μελετήθηκαν. Ενώ όλα τα δείγματα αναλύθηκαν για όλους τους δείκτες, το υψηλό κόστος και η δυσκολία απόκτησης δειγμάτων με επακριβώς καθορισμένες προαναλυτικές θεραπείες από εμπορικές μας πωλητή απέκλειε την μελέτη των περισσότερων δειγμάτων. Σαφώς, πρόσθετες μεγαλύτερες μελέτες θα ήταν χρήσιμο να επιβεβαιώσουν αυτά τα ευρήματα. Οι εργασίες σχετικά με τα μοντέλα ξένου μοσχεύματος μπορεί επίσης να αναμένεται να είναι επωφελής σε αυτόν τον τομέα, και ήταν πράγματι τόσο στην προηγούμενη εργασία μας για το θέμα αυτό [11], λόγω της εξαιρετικής έλεγχο προαναλυτικές συνθήκες που είναι δυνατό σε αυτά τα συστήματα. Ωστόσο, επιλέξαμε να εργαστούμε σε κλινικά δείγματα εδώ λόγω της αυξημένης ενδιαφέρον τους για τα τρέχοντα προβλήματα στη μεταφραστική έρευνα για τον καρκίνο. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι τα 10 λεπτά κατά μέσο όρο φορές ψυχρή ισχαιμία των δειγμάτων που συλλέγονται στο πλαίσιο του παρόντος πρωτοκόλλου της έρευνας δεν είναι συνήθως παρατηρείται σε τρέχουσες ανατομικές πρακτικές παθολογία, ούτε μπορεί, όπως γρήγορους χρόνους ψυχρής ισχαιμίας είναι εφικτό με τις τρέχουσες διαδικασίες στη θέση τους σε κλινικά εργαστήρια. Ενώ μπορεί να είναι μια πρόκληση για να ενσωματώσει τα ευρήματά μας σε τυπική κλινική ροές εργασίας, διότι πολλές από τις σημερινές ιατρικές εγκαταστάσεις δεν είναι σε θέση να μειώσει σημαντικά τη διάρκεια της ισχαιμίας, πιστεύουμε ότι τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η τυποποίηση και βελτιστοποίηση των προαναλυτικές συνθήκες είναι τουλάχιστον ένας αξιόλογος στόχος.

Μια άλλη πιθανή αδυναμία είναι ότι τα αποτελέσματα του σήματος φωσφοπρωτεΐνη σε όλη συνθήκες θεραπείας δεν συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας κλινικά επικυρωθεί όρια βαθμολογίας, μόνο και μόνο επειδή δεν υπάρχουν τέτοια όρια για τους δείκτες διερευνώνται εδώ. Αυτό που παρατηρήθηκε με ημι-ποσοτική προσέγγιση μας, όμως, ήταν ότι τα σήματα συχνά μειώνεται δραματικά σε δείγματα με ισχαιμική διάστημα μακριά προκαθορισμού, και ότι στις δύο συγκεκριμένες περιπτώσεις που συζητήσαμε, η μεγάλη προκαθορισμού ισχαιμικό χρονικό διάστημα εμφανίστηκε για να αφαιρέσει όλες τις σχετικές σήμα από μια κρίσιμη βιοδείκτη. Σε αυτές τις περιπτώσεις, οι ελεγχόμενες πρωτόκολλα καθήλωσης ερευνήσαμε διατηρούνται τα σήματα που θα μπορούσαν πιθανώς να ερμηνευθεί, στην ιατρική κρίση των δύο εν ενεργεία παθολόγους, όπως παθοφυσιολογική σχέση με δυνητική θεραπεία.

Τέλος, ενώ έχουμε ερμηνεύεται απώλειες φωσφοπρωτεΐνη IHC σήματα και ενδείξεις επιβλαβή προαναλυτικές αποτελέσματα, θα μπορούσε να είναι η περίπτωση που αυξάνει σε χρώση ήταν οι αληθινοί αντικείμενα και ότι μειώθηκε χρώση ήταν πιο κοντά στην πραγματική κατάσταση

in situ

. Ωστόσο, άλλοι έχουν δείξει ότι πολυάριθμα phosphomarkers, συμπεριλαμβανομένων ρΑΚΤ, ελαττώνονται σαφώς στο πλαίσιο των αλλαγμένων συνθηκών καθήλωσης ή ψυχρή ισχαιμία [22], [23], έτσι ώστε η ερμηνεία μας δεν είναι χωρίς προηγούμενο. Ενώ αυτή η ερώτηση δεν μπορεί ποτέ να επιλυθεί χωρίς μέλλον

in vivo

μελέτες, τι είναι απολύτως σαφές από αυτό το έργο είναι ότι οι αλλαγές στα εμφανή κράτη ενεργοποίηση πολλών σχετικών βιοδεικτών του καρκίνου φαίνεται να είναι ευαίσθητα σε κοινή προαναλυτικές μεταβλητές. Από αυτές τις μεταβλητές, η ισχαιμική διάστημα είναι ίσως ένα από τα πιο σημαντικά, και ως εκ τούτου πιστεύουμε ότι η περαιτέρω έρευνα και κλινικές μελέτες πρέπει να περιλαμβάνουν ελέγχους που αφορούν αυτόν τον παράγοντα.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1. δεδομένων

Raw H-score για όλες τις υποθέσεις που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0113608.s001

(XLSX)