Αφηρημένο

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η τρίτη κυριότερη αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τον δυτικό κόσμο.

In vitro

και

in vivo

πειράματα έδειξαν ότι τα ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (κ-3 PUFA) μπορεί να εξασθενίσει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου, και να αυξήσει την αποτελεσματικότητα των διαφόρων αντικαρκινικά φάρμακα. Ωστόσο, οι μελέτες αυτές να αντιμετωπιστούν οι επιπτώσεις της η-3 PUFAs για το μεγαλύτερο μέρος των κυττάρων του όγκου και όχι επί των αδιαφοροποίητων καρκίνο του παχέος εντέρου βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (CSLCs) που είναι υπεύθυνα για τον σχηματισμό και τη συντήρηση του όγκου. CSLCs έχουν επίσης συνδεθεί με την απόκτηση αντίσταση χημειοθεραπεία και σε υποτροπή του όγκου. έχουν CSLCs του παχέος εντέρου έχουν ανοσοφαινότυπου χρησιμοποιώντας διάφορα αντισώματα έναντι κυτταρικών δεικτών, συμπεριλαμβανομένων CD133, CD44, EpCAM, και ALDH. Αντι-CD133 έχει χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση ενός πληθυσμού κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, που διατηρεί τα βλαστικά κύτταρα ιδιότητες (CSLCs) και από τις δύο καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές και πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες. Δείξαμε ότι ο n-3 PUFA, εικοσαπεντανοϊκό οξύ (EPA), ενσωματώθηκε ενεργά στα λιπίδια μεμβράνης COLO 320 κύτταρα DM. 25 μΜ EPA μείωσε τον αριθμό των κυττάρων του συνολικού πληθυσμού των καρκινικών κυττάρων, αλλά όχι των CSLCs CD133 (+). Επίσης, παρατηρήσαμε ότι το ΕΡΑ επαγόμενη μειορύθμιση της έκφρασης CD133 και ανιούσα ρύθμιση των δεικτών διαφοροποίησης του παχέως επιθήλιο, Cytokeratin 20 (ΟΚ20) και Βλεννίνη 2 (MUC2). Τέλος, αποδείξαμε ότι EPA αύξησε την ευαισθησία της COLO 320 κύτταρα DM (συνολικού πληθυσμού) και στις δύο πρότυπο-of-care χημειοθεραπείες (5-φθοριοουρακίλη και οξαλιπλατίνη), ενώ EPA αύξησε την ευαισθησία του CSLCs CD133 (+) μόνο σε 5- φθοριοουρακίλη

Παράθεση:. De Carlo F, Witte TR, Hardman ΕΜΕΙΣ, Claudio PP (2013) Ωμέγα-3 εικοσιπεντανοϊκό οξύ Μειώσεις CD133 τον καρκίνο του παχέος εντέρου Έκφραση Stem-όπως κυττάρων Marker Ενώ αυξανόμενη ευαισθησία στη χημειοθεραπεία. PLoS ONE 8 (7): e69760. doi: 10.1371 /journal.pone.0069760

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 14 του Φεβρουαρίου του 2013? Αποδεκτές: 12 Ιουνίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 του Ιούλη του 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς εκφράζουν την ευγνωμοσύνη αναγνωρίζουν την Μάρσαλ Πανεπιστημίου Βιοχημείας και Μικροβιολογίας & amp? Χειρουργική Τμήματα για την υποστήριξή τους. Οι παρούσες μελέτες υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση του Ιδρύματος Bean, και εν μέρει από τις επιχορηγήσεις NIH CA131395, CA140024, και WV-INBRE 5P20RR016477 (στη ΔΕΗ) και εν μέρει από ΝΙΗ χορηγήσει R01CA114018 και DOD επιχορήγηση W81XWH-10-1-0697 ( να WEH). Το περιεχόμενο είναι αποκλειστική ευθύνη των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραίτητα τις επίσημες απόψεις του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου ή το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η τρίτη κυριότερη αιτία θανάτου από καρκίνο στον δυτικό κόσμο και κάθε χρόνο είναι υπεύθυνος για μισό εκατομμύριο θανάτους παγκοσμίως [1], [2]. Παρά τη λήψη χειρουργική εκτομή και χημειοθεραπεία, σχεδόν το 50% των ασθενών αναπτύσσουν αντοχή, υποτροπή όγκου, ή μεταστατικό ασθενειών [2], [3]. Πρόσφατες ανακαλύψεις έχουν δείξει ότι αυτό μπορεί να οφείλεται, τουλάχιστον εν μέρει, με την ύπαρξη καρκίνου βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν [4] και αυτό υπογραμμίζει την ανάγκη για βελτιωμένες θεραπείες που μπορούν να τους στοχεύσουν.

Ένα αυξανόμενο σώμα της απόδειξη προσδίδει υποστήριξη στην ιδέα ότι ο καρκίνος του ανθρώπου μπορεί να θεωρηθεί ένα βλαστοκύτταρο ασθένεια. Το μοντέλο καρκίνου βλαστικών κυττάρων προτείνει ότι μόνο ένα κλάσμα των κυττάρων εντός ενός όγκου κατέχουν καρκίνο έναρξη δυναμικού και ότι αυτά τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (CSLCs) είναι σε θέση να ξεκινήσει και να διατηρήσει την ανάπτυξη του όγκου [5], [6]. Ricci-Vitiani [4] και O’Brian [7] ήταν η πρώτη που παρέχει ανεξάρτητες αποδείξεις για την ύπαρξη της CSLCs του παχέος εντέρου. Μπορούν απομονωθεί ένας πληθυσμός CD133 (+) κυττάρων εντός του όγκου που ήταν ικανά να αναπτυχθούν ως μη διαφοροποιημένων κόλου-σφαίρες σε ένα ελεύθερο από ορό μέσων, τα οποία θα μπορούσαν να διαφοροποιηθούν σε πληθυσμό ετερογενών κυττάρων του όγκου. Απέδειξαν ότι μόνο η CD133 (+) υποπληθυσμός ήταν ογκογόνο σε μια σειριακή δοκιμασία ξενομοσχεύματος σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς NOD /SCID. Πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι CD133 μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό CSLCs σε καθιερωμένες κυτταρικές σειρές. CD133 (+) κύτταρα που απομονώνονται από κυτταρικές γραμμές καρκίνου έχουν βρεθεί να είναι πιο ογκογόνα από το CD133 (-) κυτταρικό κλάσμα τόσο

in vitro

και

in vivo

[8]. Επιπροσθέτως, τα κύτταρα CD133 (+), που αναπτύσσονται σε σφαίρες, διατηρούν την έκφραση αυτού του δείκτη, ακόμη και σε μακροχρόνια καλλιέργεια σφαίρα [9]. Πρόσφατα στοιχεία από κλινικές μελέτες έδειξαν ότι η έκφραση CD133 σχετίστηκε αρνητικά με την πρόγνωση των ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του παχέος εντέρου [10], [11].

Επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει αυξημένη συχνότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου σε πληθυσμούς που καταναλώνουν μια δυτική διατροφή, πλούσια σε κόκκινο κρέας, ζωικά λίπη, και χαμηλή σε δημητριακά. Αυτή η επίπτωση είναι μειωμένη σε ασθενείς που καταναλώνουν μεγαλύτερες ποσότητες φρούτων, λαχανικών, ίνες, και, το πιο σημαντικό, η-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFA) θαλάσσιας προέλευσης [12], [13]. Η μητρική n-3 PUFA α-λινολενικό οξύ (ALA) βρίσκεται σε φυτικό έλαιο, ενώ οι μεταβολίτες του εικοσαπεντανοϊκό οξύ (ΕΡΑ) και decosahexaenoic οξύ (DHA) που λαμβάνεται κυρίως από τα λιπαρά ψάρια ψυχρών υδάτων. έχουν πολύ στοιχεία έχουν δημοσιευθεί σχετικά με την ικανότητα των ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα για να μειωθεί ο πολλαπλασιασμός, να ασκήσει μια προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα, και να αναστέλλουν την αγγειογένεση σε διάφορες

in vitro

μοντέλα καρκίνου του παχέος εντέρου [14] – [17] . Ωμέγα-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα έχουν επίσης αποδειχθεί ότι αυξάνουν την ευαισθησία σε χημειοθεραπεία αρκετών καλλιεργειών καρκινικών κυττάρων που προέρχονται από ανθρώπινο

in vitro

όπως του μαστού [18], του εγκεφάλου και του πνεύμονα [19], λεμφοκυτταρικής [20], και του κόλου [15]. Κατά παρόμοιο τρόπο, η-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα ευαισθητοποιημένα

in vivo

μοντέλα καρκίνου του μαστού [21], το σάρκωμα [22], και λευχαιμία [23] για να αντικαρκινική θεραπεία. Ωστόσο, όλες αυτές οι μελέτες εξέτασε τις επιδράσεις των θεραπειών PUFAs για το μεγαλύτερο μέρος των κυττάρων του όγκου, όχι στις CSLCs.

Η αντικαρκινική δραστικότητα του Ν-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα όχι μόνο έχει συνδεθεί με τα αποτελέσματά τους στον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση αλλά επίσης επί της διαφοροποίησης σε διάφορα μοντέλα κυττάρων. Μια σύνδεση μεταξύ ω-3 PUFA και την προώθηση της κυτταρικής διαφοροποίησης έχει ήδη περιγραφεί σε φυσιολογικά και κακοήθη κύτταρα [24] – [28]. έχουν Ωμέγα-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα έχουν δειχθεί ότι διαφοροποιούνται μυελοειδή προγονικά κύτταρα στο μυελό των οστών των ποντικών χωρίς να αλλοιώνει τον αριθμό των λευκών αιμοσφαιρίων σε κυκλοφορία [24]. Με παρόμοιο τρόπο, έχει δείξει ότι η μακροχρόνια θεραπείες του ΕΡΑ και DHA, το οποίο δεν αλλάζει την μορφολογία ή τις μέσες αριθμοί κυττάρων στο τμήμα κρύπτη του φυσιολογικού βλεννογόνου του κόλου σε αρουραίους, μείωσε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την ενίσχυση της διαφοροποίησης και απόπτωσης [29].

Επιπλέον, η θεραπεία των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του μαστού με ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα σαν αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξης τους, η οποία ήταν ανάλογη προς τη διαφοροποίηση του μαστικού αδένα [27], και ένα προ-διαφοροποιητική δράση παρατηρήθηκε επίσης σε DHA αντιμετωπίζονται ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος

in vitro

[26].

ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να διερευνηθεί εάν

in vitro

συγκεντρώσεις EPA ίση με τα επίπεδα στο πλάσμα μπορεί να επιτευχθεί στο ανθρώπινο σώμα μετά από τη συμπλήρωση της διατροφής με 2,4 g n-3 /ημέρα [30], ήταν σε θέση να επηρεάσει το καθεστώς της διαφοροποίησης και της χημειοευαισθησία του συνολικού πληθυσμού του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων και συγκεκριμένα των CLSCs CD133 (+).

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος COLO 320 DM (CCL-220, C Δούκα) λήφθηκε από την Αμερική Type Culture Collection (Rockville, ΜΑ). κύτταρα ΟοΙο320ϋΜ καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 2 mM Ε-γλουταμίνη, πενικιλίνη 100 U /mL στρεπτομυκίνη και 100 μg /mL (HyClone, Νότια Logan, UT). Τα κύτταρα υποκαλλιεργήθηκαν με πυκνότητα 1 × 10

5 /ml δύο φορές την εβδομάδα σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C, 5% CO

2.

χημικές ουσίες και φάρμακα

εικοσιπεντανοϊκό οξύ, ΕΡΑ (ωμέγα-3 πολυακόρεστων λιπαρών οξέων, 20:05) αγοράστηκε από την Cayman Chemicals (Αηη Arbor, ΜΙ) και στεατικό οξύ (SA, κορεσμένο λιπαρό οξύ, 18:00) από την Sigma-Aldrich (St. Louis , ΜΟ). 100 λύσεις mM απόθεμα της ΕΡΑ και SA σε απόλυτη αιθανόλη έγιναν και αραιώνονται σε τελική συγκέντρωση με μέσο καλλιέργειας.

Η οξαλιπλατίνη και 5-φθοριοουρακίλη αγοράστηκαν από τον Αλέξη Biochemicals (Farmingdale, NY). 12,6 mM αποθεματικών διαλυμάτων της οξαλιπλατίνη και 384,3 mM 5-φθοροουρακίλη σε DMSO έγιναν και αραιώθηκαν σε τελική συγκέντρωση με μέσο καλλιέργειας.

Τα κύτταρα μάρτυρες υποβλήθηκαν σε αγωγή με την ίδια ποσότητα του οχήματος, αιθανόλη ή DMSO (CTRL VH). Οι τελικές συγκεντρώσεις του οχήματος δεν ξεπέρασε ποτέ το 0,1% v /v.

αέρια χρωματογραφία

COLO 320 DM απλώθηκαν σε τριβλία petri 100 mm (1 × 10

6 κύτταρα) και αντιμετωπίζονται μετά από 4 ώρα με μάρτυρα φορέα ή ένα εύρος συγκεντρώσεων του ΕΡΑ και SA (6,25 υΜ, 12,5 μΜ, 25 μΜ). Οι συνθέσεις λιπαρών οξέων των COLO 320 DM αξιολογήθηκαν με τη χρήση αέριας χρωματογραφίας. CTRL VH και επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 96 ώρες, πλένονται σε PBS1X για την απομάκρυνση των λιπιδίων επιφάνεια, κατόπιν ομογενοποιούνται σε απεσταγμένο νερό με 0,1% ΒΗΤ (3,5-δι

τ

-βουτυλο-4-υδροξυ-τολουόλιο ) σε μεθανόλη για να αποφευχθεί η οξείδωση των λιπαρών οξέων. Τα λιπίδια εκχυλίστηκαν με χλωροφόρμιο /μεθανόλη, και στη συνέχεια transmethylated. Μεθυλιωμένος λιπίδια διαχωρίστηκαν και ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αέριο χρωματογραφία, όπως προγενέστερα είχαν δημοσιευθεί [31]. Λιπαρά πρότυπα οξέος μεθυλο (Nu-Chek-Prep, Elysian, ΜΝ) χρησιμοποιήθηκαν για την κορυφή ταυτοποίηση.

Οι επιμέρους μεθυλεστέρες λιπαρών οξέων EPA, DPA (decosapentaenoic οξύ), DHA και, SA αναφέρθηκαν ως το ποσοστό του αθροίσματος του συνόλου των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων (περιοχή κάτω από την καμπύλη).

δοκιμασία μεταβολική δραστηριότητα (ΜΤΤ δοκιμασία) χρονική πορεία

COLO 320 κύτταρα DM απλώθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (3000 κύτταρα /φρεάτιο). Μετά από 4 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα εύρος συγκεντρώσεων του ΕΡΑ και SA (6,25 υΜ, 12,5 μΜ, 25 μΜ) ή ελέγχου του οχήματος (CTRL VH) για 0-4 ημέρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύονται καθημερινά για μεταβολική δραστηριότητα με δοκιμασία ΜΤΤ. Εν συντομία, 10 μΐ από 5 mg /ml ΜΤΤ (3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο) (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες επωάστηκαν για 2 ώρες σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C, 5% CO

2. Μετά από αυτή τη φορά μέσα απομακρύνθηκαν, το άλας φορμαζάνης που σχηματίζεται διαλυτοποιήθηκε με DMSO και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm με έναν αναγνώστη μικρο-πλακών.

πλήθος των κυττάρων και ενεργοποιούμενη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS)

COLO 320 DM απλώθηκαν σε πλάκα 24-φρεατίων (2,5 × 10

4 /φρεάτιο) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία μετά από 4 ώρες με ένα εύρος συγκεντρώσεων του ΕΡΑ ή SA (6,25 υΜ, 12,5 μΜ, 25 μΜ) για 96 ώρες. Βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν με χρήση κυανού τρυπάνης μέθοδο αποκλεισμού. Ακολούθως τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ψυχρό ρυθμιστικό FACS (PBS1X, 2 mM EDTA, 0.1% BSA) και κλάσματα των κυττάρων, 2 × 10

5 κύτταρα /50 μΙ, σημάνθηκαν με την κατάλληλη συγκέντρωση του μονοκλωνικού αντισώματος έναντι CD133 /2 ( 293C3), phycoerytrin συζευγμένο (Miltenyi Biotech, Μπέργκις Γκλάντμπαχ, Γερμανία). Ένα αντίσωμα ισοτύπου χρησιμοποιήθηκε ως αντίσωμα ελέγχου για το φόντο κανονικοποίηση. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με Cytometer Accuri-C6 Flow (BD Accuri Κυτταρόμετρα, Ann Arbor, MI). Μετά το ποσοστό θετικότητας να CD133 προσδιορίστηκε ο αριθμός των CD133 (+) και CD133 (-). Αρνητικά κύτταρα εντός του συνολικού πληθυσμού υπολογίστηκε

Real Time PCR

COLO 320 γερμανικών μάρκων ήταν επιστρώθηκαν σε 100 mm πιάτα Petri (1 × 10

6 κύτταρα) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα, ΕΡΑ, ή SA (25 μΜ). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 48 και 96 ώρες και το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από τα δείγματα χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Το RNA διαλυτοποιείται σε ddH2O και συγκέντρωση νουκλεϊνικού οξέος μετρήθηκε με Nano Drop 2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, ΜΑ). RNA (1 ug) υποβλήθηκε σε αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης χρησιμοποιώντας ένα υψηλής χωρητικότητας σετ μεταγραφής cDNA (Applied Biosystems, Foster City, CA) και Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με RT2 SYBR Green /ROX qPCR Master Mix χρησιμοποιώντας ένα ΑΒΙ PRISM 7000 Σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας (Applied Biosystems, Foster City, CA). Σχετική αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-ΔΔCt, που περιγράφεται από Livak και Schmittgen [32]. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο καθαριότητας

β

ακτίνης-F

:. GGT TCC GCT GCC CTG ΑΓΓ?

β

ακτίνης-R

: GTC CAC GTC ACA CTT CAT Γ

Ειδικά ζεύγη εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν τα γονίδια ενδιαφέροντος:

CD133-F

: TTG GCT CAG ACT GGT ΑΑΑ TCC C?

CD133-R

: ΑΤΑ GGA ΑΓΓ ACT CGT TGC ΤΟΟ Τ?

ΟΚ20-F

: ACC TCC CAG GCC TTG AGA Τ?

ΟΚ20-R

: ΤΟΟ CTA ACT GGC TGC TGT AA?

MUC2-F

: GGG ACT ΟΤΟ AGT GCT TCT GC?

MUC2-R

: AGT GGA TGC CGT TGA ΤΟΟ Τ

Δυτική Blotting

COLO 320 DM απλώθηκαν σε τριβλία petri 100 mm (1 × 10

6 κύτταρα) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα, ΕΡΑ ή SA (25 μΜ) για 48 και 96 ώρες. Σύνολο πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από κύτταρα μετά από λύση σε ρυθμιστικό κρύο δείγμα (150 mM NaCl, 50 mM Tris /HCl, ρΗ 8, 0,5 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1% Triton Χ-100). δωδεκυλοθειικό νάτριο-πολυακρυλαμίδιο ηλεκτροφόρησης γέλης (SDS-PAGE) διεξήχθη σύμφωνα με την μέθοδο Laemmli [33]. Ίσες ποσότητες ολικών πρωτεϊνών από κάθε δείγμα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση συνέχεια μεταφέρθηκε σε 0,45 um μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Μετά τον αποκλεισμό στο 5% χωρίς λιπαρά γάλα σε TBS-T, οι μεμβράνες επωάστηκαν με τα ακόλουθα αντισώματα: Αντι-CD133 /1 (AC133 Miltenyi Biotech, Μπέργκις Γκλάντμπαχ, Γερμανία), Anti-Cytokeratin 20 (EPR1622Y Abcam, Cambridge, MA ). Αντι-β ακτίνης (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Μετά την επώαση με τα δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας, τα ανοσοσυμπλέγματα κατέστησαν ορατά με ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Οι εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση του συστήματος απεικόνισης /FX Luminary (Fotodyne, Hartland, WI). Πυκνότητας πραγματοποιήθηκε με Image ι 1.45 του λογισμικού (Επεξεργασία και Ανάλυση Εικόνας σε Java) (imagej.nih.gov/ij/download/).

Dot Blotting

Dot blot πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Εν συντομία, COLO 320 DM καλλιεργήθηκαν, σε επεξεργασία με όχημα, ΕΡΑ ή SA (25 μΜ) για 48 και 96 ώρες και οι πρωτεΐνες εκχυλίσθηκαν όπως περιγράφεται στην ενότητα κηλίδα western ανάλυση. Ίσες ποσότητες ολικών πρωτεϊνών από κάθε δείγμα κηλίδα επί μεμβράνης 0,45 um νιτροκυτταρίνη. Μια δοκιμασίες ανταγωνισμού πεπτιδίου διεξήχθη για να επαληθεύσει την ειδικότητα του MUC-2 αντίσωμα (Pierce, ThermoScientifics, Waltham, ΜΑ). 300 μg του πεπτιδίου επί παραγγελία (CPDFDPPRQENETWW, πεπτίδιο 2.0, Chantilly, VA) με μια ταυτόσημη αλληλουχία με εκείνη που χρησιμοποιείται για να δημιουργηθεί το αντίσωμα MUC-2 επωάστηκε για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με 1 μg MUC-2 αντίσωμα. Μετά τον αποκλεισμό εντός 5% χωρίς λιπαρά γάλα σε ΤΒδ-Τ, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντι-MUC-2 και αντι-β ακτίνης (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) ως συγκριτικό. Μετά την επώαση με τα δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας, τα ανοσοσυμπλέγματα οπτικοποιήθηκαν και απεικονίζεται όπως περιγράφεται στην ενότητα κηλίδα western ανάλυση.

Απομόνωση καρκινικά βλαστικά κυτταρικού πληθυσμού

CSCLs απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα CD133 Microbead σετ (Miltenyi Biotech, Μπέργκις Γκλάντμπαχ, Γερμανία). COLO 320 DM πληθυσμός συνολικού κυτταρικού σημάνθηκε με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα CD133 /2 (293C3) συζευγμένο με μικρο-σφαιρίδια και το CD133 (+) κύτταρα μαγνητικά ταξινομημένο. Ένα κλάσμα των κυττάρων που εκλούεται από τη στήλη σημάνθηκε με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα κατά του CD133 /1, phycoerytrin συζευγμένο (AC133, Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Γερμανία) και μια ανάλυση FACS διεξήχθη για να αξιολογηθεί το ποσοστό καθαρότητας του CD133 (+) κυττάρων.

παρεμπόδιση της ανάπτυξης

δοκιμασία

COLO 320 κύτταρα DM απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (3000 κύτταρα /φρεάτιο). Μετά από 4 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 24 ώρες με ένα εύρος συγκεντρώσεων της οξαλιπλατίνης (0.005-0.1 mM) ή 5-φθοριοουρακίλη (0.05-2 mM) για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση που προκαλεί 25% και 50% της αναστολής της ανάπτυξης. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν για μεταβολική δραστηριότητα τους με μία δοκιμασία ΜΤΤ.

χημειοευαισθησία δοκιμασία

COLO 320 DM (3 χ 10

3) κύτταρα /εκβαθύνσεις, συνολικού πληθυσμού ή CD133 (+) , τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά από 4 ώρες, πλήρες μέσο συμπληρωμένο με όχημα, ΕΡΑ, ή SA προστέθηκε για να επιτευχθεί μια τελική συγκέντρωση 25 μΜ ΕΧΟ. Μετά από 48 ώρες το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο συμπληρωμένο με μια σειρά από οξαλιπλατίνη (0.005-0.1 mM) ή 5-φθοριοουρακίλη (0.05-2 mM) συγκεντρώσεις. Μετά από 24 ώρες κατεργασίας ένας προσδιορισμός ΜΤΤ διεξήχθη για να καθορίσει το ανασταλτική συγκέντρωση που οδηγούν σε μείωση της βιωσιμότητας του 25% (IC25) και 50% (IC50).

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον τρεις φορές και παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Prism © λογισμικού (Graphpad, Inc., La Jolla, CA). Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) με πολλαπλές συγκρίσεις Tukey post-test χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των πειραματικών ομάδων:.

σ

τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

εικοσιπεντανοϊκό οξύ ενσωματώνεται και μεταβολίζεται από COLO 320 κύτταρα DM

Για να αξιολογήσουμε την ενσωμάτωση των λιπαρών οξέων από COLO 320 κύτταρα DM αναλύσαμε τη σύνθεση λιπαρών οξέων με αέρια χρωματογραφία μετά την αγωγή με EtOH (CTRL VH) ή με ένα εύρος συγκεντρώσεων (6,25 μΜ, 12,5 μΜ, 25 μΜ) του ΠΑΛΟ n-3, ΕΡΑ, ή κορεσμένα ΕΧΟ SA. Μετά από 96 ώρες τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα ολικά λιπίδια εκχυλίστηκαν. Πρώτα διαπιστώσαμε ότι Α.Ε. είναι 30 φορές πιο εκπροσωπούνται στο όχημα ελέγχου συνολικών λιπιδίων της κυτταρικής μεμβράνης από την EPA, DPA και DHA. Παρατηρήσαμε (εικόνα 1Α) μια σημαντική δόση αποκρίνεται αύξηση του ΕΡΑ στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με αυτό το λιπαρό οξύ. Επιπλέον, το κλάσμα που αντιστοιχεί στο DPA, η οποία είναι μια ΕΡΑ μεταβολίτης, αυξήθηκε επίσης μετά τη θεραπεία ΕΡΑ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι COLO 320 κύτταρα DM ενσωματωθεί και αποτελεσματικά μεταβολίζεται EPA. Με παρόμοιο τρόπο παρατηρήσαμε μια εξαρτώμενη από τη δόση αύξηση του περιεχομένου SA στο σύνολο των λιπιδίων από COLO 320 DM κατεργασία με στεατικό οξύ (σχήμα 1Β).

Τα ολικά λιπίδια εκχυλίστηκαν από COLO 320 κύτταρα DM σε αγωγή για 96 ώρες με όχημα ελέγχου (CTRL VH) ή ένα εύρος συγκεντρώσεων (α) ΕΡΑ ή (Β) Α.Ε., (6.25-12.5-25 μΜ). αέρια χρωματογραφία διεξήχθη για να μελετηθεί η ενσωμάτωση λιπαρών οξέων και των μεταβολιτών τους από COLO 320 κύτταρα DM. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως σχετικό ποσοστό σε σχέση με το CTRL VH. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD τριών τουλάχιστον πειραμάτων.

Μαύρες γραμμές

: ένωση που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία ανιχνεύονται με GC?

Light Grey μπαρ

: DPA (

εικοσαπεντανοϊκό οξύ

, C22: 5, n-3)?

Dark Grey μπαρ: DHA (δοκοσαεξανοϊκό οξύ, C22: 6, ω-3)

. (SA: C18 στεατικό οξύ: 0).

Η

25 θεραπεία μΜ εικοσιπεντανοϊκό οξύ μείωσε τον αριθμό των κυττάρων του COLO 320 κύτταρα DM χωρίς να επηρεάζει τον πληθυσμό CSLCs

Αρκετές γραμμές των αποδεικτικών στοιχείων έχουν δείξει η ύπαρξη ενός μικρού πληθυσμού από καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με τα οποία μπορούν να αρχίσουν και να διατηρήσουν όγκους. Η χρήση ειδικών δεικτών, συμπεριλαμβανομένων των CD133 για CSLCs κόλον, επέτρεψε στους ερευνητές να επισημαίνουν αυτά τα κύτταρα και να διακρίνουν μεταξύ του πληθυσμού CSLCs και το μεγαλύτερο μέρος του όγκου [4], [7]. Ωμέγα-3 λιπαρά οξέα έχουν ήδη αναφερθεί για να μειωθεί το μεγαλύτερο μέρος των καρκινικών κυττάρων [14] – [17]., Αλλά η επίδραση επί CSLCs δεν έχει προσδιοριστεί

Εικόνα 2Α και στον Πίνακα 1 δείχνουν ότι μια θεραπεία πορεία του χρόνου (0-96 ώρες) με 25 μΜ EPA μείωσε σημαντικά τον αριθμό των COLO 320 DM (συνολικός πληθυσμός), όπως μετράται με ΜΤΤ δοκιμασία σε σχέση με τον έλεγχο οχήματος (ρ & lt? 0,01 σε 72 ώρες? και ρ & lt? 0.001 σε 96 ώρες). Θεραπείες με 25 μΜ SA μειωθεί σε μικρότερο βαθμό ο αριθμός των κυττάρων των κυττάρων COLO 320 DM (Σχήμα 2Β και Πίνακας 1).

COLO 320 κύτταρα DM υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 0-96 ώρες με έλεγχο του οχήματος (CTRL VH ) ή 6.25-12.5-25 μΜ του (Α) EPA και (Β) SA. ΜΤΤ δοκιμασία της ΕΡΑ και SA κατεργασμένων κυττάρων έναντι του ελέγχου του οχήματος (CTRL VH) επεξεργασμένα κύτταρα.

τιμές ρ

υπολογίστηκαν με μονόδρομη δοκιμή ANOVA με πολλαπλές συγκρίσεις post-test ενός Tukey για τις διάφορες θεραπείες μέσα σε κάθε χρονικό σημείο. * P ≤ 0,05? ** P≤0.01? *** P≤0.001? n = 5. COLO 320 κύτταρα DM υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή για 96 ώρες με τον έλεγχο του οχήματος (CTRL VH) ή ένα εύρος συγκεντρώσεων των λιπαρών οξέων (6.25-12.5-25 μΜ), (Γ) ΕΡΑ και (D) SA. Τα βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν και επισημασμένο με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-CD133 να προσδιοριστεί το ποσοστό του CD133 (+) κύτταρα σε υπό αγωγή ομάδες. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν CD133 (+) και CD133 (-) αριθμών κυττάρων του ± SD τριών τουλάχιστον πειραμάτων.

σ τιμές

υπολογίστηκαν με t-test του Student για επεξεργασμένα δείγματα εναντίον CTRL VH (* p ≤ 0,05).

Η

Για να ορίσετε τα οποία κυτταρικού πληθυσμού (χύμα του όγκου ή CSLC) επηρεάστηκε, θα αντιμετωπίζονται πρώτα COLO 320 DM με ένα εύρος συγκεντρώσεων της ΕΡΑ ή SA (6,25 μΜ, 12,5 μΜ, 25 μΜ) για 96 ώρες. EPA επηρεάζονται με διαφορετικό τρόπο τα δύο κυτταρικών υποπληθυσμών (CD133 (+) και CD133 (-) κύτταρα). Ένα trypan blue καταμέτρηση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε αφού επισημασμένα δείγματα των επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων κυττάρων με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα κατά του CD133 /2 (επιτόπιο γλυκοζυλιωμένη 2). Μια ανάλυση ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων διαλογή διεξήχθη για να προσδιοριστεί το ποσοστό κυττάρων θετικών για CD133 και για τον υπολογισμό του αριθμού των κυττάρων CD133 (+) στο σύνολο του πληθυσμού για κάθε δείγμα αντιμετωπίζεται. Το Σχήμα 2C δείχνει ότι οι θεραπείες με EPA μειώθηκαν σημαντικά (ρ & lt? 0,05) τον αριθμό των CD133 (-) κύτταρα (χύμα του όγκου), στη φυσιολογική συγκέντρωση 25 μΜ. Είναι ενδιαφέρον ότι η CD133 (+) CSLCs πληθυσμός επηρεάστηκε μόνο ελάχιστα από την ίδια συγκέντρωση του ΕΡΑ (25 μΜ) που προκάλεσε μία μείωση στον αριθμό των κυττάρων του CD133 (-) υποπληθυσμό. Η θεραπεία με SA, η οποία είναι ένα κορεσμένο λιπαρό οξύ, δεν άλλαξε σημαντικά είτε CD133 (+) ή CD133 (-) τον αριθμό των κυττάρων (σχήμα 2D). Συμπερασματικά, δείξαμε ότι το 25 μΜ EPA μείωσε σημαντικά τον αριθμό των COLO 320 DM μεγαλύτερο μέρος των καρκινικών κυττάρων, αλλά αυτό SA δεν το έκανε.

εικοσιπεντανοϊκό οξύ προκάλεσε αύξηση του παχέος δείκτες διαφοροποίησης του επιθηλίου, Cytokeratin 20 και Βλεννίνης 2 , η έκφραση του mRNA ενώ μειώνουν CSLCs δείκτη, CD133

το ενδιάμεσο νήμα Cytokeratin 20 εκφράζεται σε επιθηλιακά κύτταρα του γαστρεντερικού σωλήνα. ΟΚ20 έχει δειχθεί ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω ή την έκφραση του είναι εντελώς χαθεί σε αριθμό δειγμάτων ορθοκολικού καρκινοπαθούς σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο [35] – [37]. Ομοίως, MUC2 είναι μικρότερη εκφράζονται σε ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα, ενώ η έκφραση της διατηρείται σε φυσιολογικό ιστό δίπλα στο κακοήθειας [38] – [40]

CD133 έχει αναφερθεί να σηματοδοτήσει ειδικά το μικρό αδιαφοροποίητο πληθυσμό καρκινικών έναρξη της έρευνας. κυττάρων σε καρκίνο του παχέος εντέρου [4], [7] και να συνδέεται με κακή πρόγνωση σε προχωρημένο καρκίνο του παχέος εντέρου [10], [11]. Για να καταλάβετε αν EPA αλλαγμένο γονίδιο έκφραση της ΟΚ20, MUC2, και CD133, θα αντιμετωπίζονται COLO 320 DM για 48 και 96 ώρες με 25 μΜ EPA, SA, ή τον έλεγχο του οχήματος. Παρατηρήσαμε ότι το ΕΡΑ προκάλεσε αύξηση στα σχετικά επίπεδα mRNA του ΟΚ20, βρέθηκαν τόσο εντεροκυττάρων και λαγηνοειδή κύτταρα (Σχήμα 3Α), και του δείκτη λαγηνοειδών κυττάρων MUC2 (σχήμα 3Β), σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν φορέα. Οι παρατηρούμενες επιδράσεις ήταν στατιστικώς σημαντική στις δύο 48 και 96 ώρες για ΟΚ20 και σε 96 ώρες για MUC2. Παρατηρήσαμε επίσης ότι το ΕΡΑ προκάλεσε μία μείωση στην έκφραση του δείκτη CD133 CSLCs στις 48 και 96 ώρες (Εικόνα 3C) (ρ & lt? 0,05 και 0,01). SA (Σχήμα 3Α, 3Β) μειώθηκε σημαντικά ΟΚ20 στις 48 ώρες της θεραπείας χωρίς να επηρεάζει την έκφραση MUC2. Παρατηρήσαμε επίσης ότι Α.Ε., από την άλλη πλευρά, η αυξημένη έκφραση RNA CD133 (σχήμα 3C) σε 96 ώρες μετά τη θεραπεία. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα ωμέγα-3 έχει μια επίδραση προ-διαφοροποίηση σε COLO 320 κύτταρα DM.

COLO 320 κύτταρα DM υποβλήθηκαν σε θεραπεία με έλεγχο οχήματος (CTRL VH) και 25 μΜ της ΕΡΑ ή SA για 48 και 96 ώρες . Ολικό RNA εκχυλίστηκε και Real-Time RT-PCR πραγματοποιήθηκε για να μελετηθεί η σχετική μεταβολή στη γονιδιακή έκφραση ειδικών δεικτών σε σύγκριση με β-ακτίνης. Η έκφραση των δεικτών διαφοροποίησης (Α) κυτοκερατίνη-20 (ΟΚ20), ένα εντεροκυττάρων και λαγηνοειδή κύτταρα δείκτη, (Β) Μουκίνη-2 (MUC2) ένας δείκτης λαγηνοειδή κύτταρα, και (Γ) του καρκίνου του παχέος εντέρου βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με τον προσωπικό CD133 ήταν μελετήθηκε μετά από θεραπείες με τον έλεγχο του οχήματος (CTRL VH), ΕΡΑ ή SA. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD τριών τουλάχιστον πειραμάτων.

σ τιμές

υπολογίστηκαν με t-test του Student για επεξεργασμένα δείγματα εναντίον CTRL VH (* p ≤ 0,05, ** p≤0.01).

Η

25 μΜ εικοσιπεντανοϊκό οξύ αυξάνει Cytokeratin 20 πρωτεϊνική σύνθεση ενώ μειώνεται CD133 σε κύτταρα COLO320 DM

για να προσδιορίσετε αν η αλλαγή στην έκφραση του mRNA σχετίζεται με τις επιπτώσεις στο ΟΚ20, Μουκίνη 2, και την πρωτεϊνική σύνθεση CD133, εξάγαμε τη συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη από την Κόλο 320 DM παρακάτω θεραπεία για 48 και 96 ώρες με όχημα, EPA και ΑΕ σε 25 μΜ. Όπως είχε προβλεφθεί από την ανάλυση Real Time PCR, η πρωτεΐνη CD133 μειώθηκε σημαντικά μετά από 96 ώρες επεξεργασίας ΕΡΑ (σχήμα 4Α και Β). Παρατηρήσαμε ότι στις 48 και 96 ώρες Cytokeratin 20 επίπεδα πρωτεΐνης ήταν σημαντικά υψηλότερα σε 25 κύτταρα κατεργασμένα μΜ EPA σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος ή στη θεραπεία SA (Σχήμα 4Α και C) όπως αποδεικνύεται με ανάλυση κηλίδος Western. Παρατηρήσαμε επίσης ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης Βλεννίνης 2 δεν άλλαξε στις 48 και 96 ώρες με ανάλυση στυπώματος κηλίδας σε 25 κύτταρα κατεργασμένα μΜ EPA σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος ή στη θεραπεία SA (Σχήμα 4Α και D). Για την επαλήθευση της ειδικότητας της MUC-2 αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση στυπώματος κηλίδας, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία πεπτιδικού ανταγωνισμού και έχουν δείξει ότι 300 φορές περίσσεια του πεπτιδίου ανταγωνίστηκε αποτελεσματικά την δέσμευση του αντισώματος με το MUC-2 που υπάρχει στο προϊόν λύσης κυττάρου .

(Α) Σύνολο λύμα ελήφθησαν από COLO 320 κύτταρα DM αντιμετωπίζονται με τον έλεγχο του οχήματος (CTRL VH), 25 μΜ ΕΡΑ ή SA για 48 και 96 ώρες. κηλίδα Western διεξήχθη για να μελετηθεί η έκφραση του κυτοκερατίνης-20 (ΟΚ20) και CD133 μετά τη θεραπεία με τα λιπαρά οξέα. Dot blot πραγματοποιήθηκε για να μελετηθεί η έκφραση του Βλεννίνη 2 (MUC2) μετά από αγωγή με τα λιπαρά οξέα. Ένα πεπτίδιο πανομοιότυπο με αυτό που χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργηθεί το αντίσωμα MUC-2 χρησιμοποιήθηκε σε μία δοκιμασία πεπτιδικού ανταγωνισμού για να προσδιοριστεί η ειδικότητα του αντισώματος MUC2. Οι αλλαγές στο (Β) CD133, (Γ) ΟΚ20, και η έκφραση πρωτεΐνης (Δ) MUC2 σε σχέση με το β-ακτίνης είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD τριών τουλάχιστον πειραμάτων.

σ τιμές

υπολογίστηκαν με t-test του Student για επεξεργασμένα δείγματα εναντίον CTRL VH (* p ≤ 0,05, ** p≤0.01).

Η

Εν κατακλείδι, παρατηρήσαμε ότι EPA αύξησε την πρωτεΐνη έκφρασης του δείκτη διαφοροποίησης ΟΚ20, και μείωσε την έκφραση του δείκτη βλαστική ικανότητα CD133 σε COLO 320 κύτταρα DM.

προ-θεραπεία με 25 μΜ εικοσιπεντανοϊκό οξύ αυξάνει την ευαισθησία των COLO συνολικού 320 DM πληθυσμού και CSLCs σε 5-φθοριοουρακίλη

Η ικανότητα των ωμέγα-3 λιπαρών οξέων για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας των αντικαρκινικών φαρμάκων, τόσο

in vitro

και

in vivo

σχετικά μεγαλύτερο μέρος των όγκων κύτταρα έχει αναφερθεί στο παρελθόν [15], [18], [19], [22], [23], [31]. Ωστόσο, εξακολουθούν να λαθραία είναι τα χημειο-ευαισθητοποίηση των επιπτώσεων της EPA για το μεγαλύτερο μέρος του όγκου σε σχέση με τις επιπτώσεις στον πληθυσμό CSLCs ακόλουθο πρότυπο-of-care αντικαρκινικών θεραπειών.

Στην εργασία αυτή διερευνάται αν προ-θεραπεία με ΕΡΑ αυξήσεις η απόκριση χημειοθεραπεία του προτύπου-of-care αντικαρκινικά φάρμακα τόσο μεγαλύτερο μέρος των καρκινικών κυττάρων και CSLCs πληθυσμός καλλιεργήθηκε από COLO 320 κύτταρα DM.

Βρήκαμε ότι 2,5 υΜ ή 10 μΜ οξαλιπλατίνη είχε ως αποτέλεσμα σε ένα κύτταρο βιωσιμότητα των 75,88 ± 3,23% (IC

25) ή 53 ± 1,18% (IC

50) ελέγχου (σχήμα 5Α). Βρήκαμε ότι το 100 υΜ και 1.5 mM 5-φθοροουρακίλη μειώθηκε COLO 320 DM βιωσιμότητα κυττάρου σε 74,48 ± 4,85% (IC

25) και 52,90 ± 1,09% (IC

50) του ελέγχου (Σχήμα 5Β).

(Α) COLO 320 κύτταρα DM υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μια σειρά από οξαλιπλατίνη (0.005-0.1 mM) ή 5-φθοριοουρακίλη (0.05-2 mM) συγκεντρώσεις για να προσδιοριστεί η ανασταλτική συγκέντρωση 25% (IC25) και 50% ( IC50). (Β) Τα κύτταρα από COLO 320 DM συνολικού πληθυσμού προ-επεξεργασία για 48 ώρες με 25 μΜ ΕΡΑ ή SA. Στη συνέχεια τα κύτταρα εκτέθηκαν για 24 ώρες με οξαλιπλατίνη (

IC25, 2,5

υΜ? IC50, 10

μΜ

) και 5 φθοροουρακίλη (

IC25, 100

μΜ? IC50, 1.5

mM

). (Γ) CD133 (+) κύτταρα μαγνητικά διαλέγεται από το σύνολο του πληθυσμού των COLO 320 DM και προ-θεραπεία για 48 ώρες με 25 μΜ ΕΡΑ ή SA και στη συνέχεια εκτέθηκαν για 24 ώρες για να IC25 και IC50 του οξαλιπλατίνη και 5-φθοροουρακίλη. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD τριών τουλάχιστον πειραμάτων.

σ τιμές

υπολογίστηκαν με t-test του Student για επεξεργασμένα δείγματα εναντίον CTRL VH (* p ≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001).

Η

για να προσδιορίσετε αν το n-3 PUFA ήταν σε θέση να αυξήσει την ευαισθησία του συνολικού πληθυσμού της COLO 320 DM κυττάρων στη χημειοθεραπεία, έχουμε επιχρυσωμένο και προ-επεξεργασία των κυττάρων όπως και πριν με 25 μΜ της ΕΡΑ ή SA λιπαρών οξέων. Μετά από 48 ώρες αφαιρέσαμε τα μέσα ενημέρωσης και κατεργασία των κυττάρων για 24 ώρες με την προηγουμένως ορισθείσα IC25 και IC50 συγκεντρώσεις για οξαλιπλατίνη και 5-φθοριοουρακίλη (Σχήμα 5 Α και Β). Βρήκαμε ότι το ΕΡΑ, αλλά δεν SA (σχήμα 5C, ανοιχτό γκρι ράβδοι), βελτίωσε σημαντικά την αποτελεσματικότητα των δύο χημειοθεραπευτικά φάρμακα (σχήμα 5C, μαύρες μπάρες), σε σχέση με το όχημα ελέγχου.

Για να καθορίσει εάν η ίδια μεταχείριση με 25 μΜ της EPA λιπαρά οξέα που επηρεάζονται παρόμοια απάντηση CLSCs στη χημειοθεραπεία, ελέγξαμε το χημειοευαισθησία μαγνητικά ταξινομημένο COLO 320 κύτταρα DM CD133 (+) για να οξαλιπλατίνη και 5-φθοριοουρακίλη. CD133 (+) CSLCs υποβλήθηκαν προ-αγωγή με 25 υΜ EPA για 48 ώρες, η οποία ακολουθείται από μια κατεργασία για 24 ώρες με οξαλιπλατίνη ή 5-φθοροουρακίλη. Όπως καταδεικνύεται προηγουμένως από άλλους [41], παρατηρήσαμε ότι CD133 (+) CSLCs ήταν πιο ανθεκτικά στις αντινεοπλασματικά φάρμακα που ελέγχθηκαν (Σχήμα 5D, σκούρο γκρι ράβδοι) σε σύγκριση με το συνολικό πληθυσμό (σχήμα 5C, σκούρο γκρι ράβδοι). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι η προ-θεραπεία με ΕΡΑ (μαύρη γραμμή), αλλά δεν SA (ανοιχτό γκρι μπάρα) αύξησε σημαντικά την ευαισθησία του CD133 (+) CSLCs με 5-φθοριοουρακίλη, αλλά να μην οξαλιπλατίνη (σχήμα 5D).

Συλλογικά τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ότι το ΕΡΑ ενισχύει την αποτελεσματικότητα της 5-φθοροουρακίλη, η οποία είναι μία από τις πρώτες γραμμής πρότυπο-of-care αντινεοπλασματικών παραγόντων, κατά του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Συζήτηση

υπάρχει