Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου με τη διαφοροποίηση σε ινοβλάστες καρκίνωμα που σχετίζονται με (CAFS) και συνθέτουν το μικροπεριβάλλον του όγκου. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για τη μετάβαση των MSCs να CAFS δεν είναι καλά κατανοητοί. Εξωσώματα ρυθμίζουν κυτταρικές δραστηριότητες με τη μεσολάβηση της επικοινωνίας κυττάρου-κυττάρου. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ως στόχο να διερευνήσει κατά πόσον ο καρκίνος εξωσώματα κυττάρων που προέρχονται συμμετείχαν στη ρύθμιση της διαφοροποίησης των ανθρώπινων MSCs ομφάλιο λώρο που προέρχονται από (hucMSCs) για να CAFS.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

πρώτα έδειξαν ότι γαστρικού καρκίνου εξωσώματα που προέρχεται από κύτταρα που προκαλείται από την έκφραση των δεικτών CAF σε hucMSCs. Στη συνέχεια έδειξε ότι γαστρικού καρκίνου εξωσώματα που προέρχεται από κύτταρα διέγειραν την φωσφορυλίωση των Smad-2 σε hucMSCs. Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι ο TGF-β αναστολέα της κινάσης του υποδοχέα 1 εξασθενημένο φωσφορυλίωση Smad-2 και την έκφραση δείκτη CAF στο hucMSCs μετά από έκθεση σε γαστρικό καρκίνο εξωσώματα που προέρχεται από κύτταρα.

Συμπέρασμα /Σημασία

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η γαστρική καρκινικά κύτταρα προκάλεσαν την διαφοροποίηση των hucMSCs να CAFS με μεταφορά εξωσώματα μεσολάβηση ΤΟΡ-β και ΤΟΡ-β /ενεργοποίησης οδού Smad, οι οποίες μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα νέο μηχανισμό για MSCs να CAFS μετάβαση στον καρκίνο

Citation.: Gu J, Qian Η, Shen L, Ζανγκ Χ, Zhu W, Huang L, et al. (2012) Ο γαστρικός καρκίνος Εξωσώματα Trigger Διαφοροποίηση του ομφάλιου λώρου μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα για Καρκίνωμα-Associated ινοβλάστες μέσω TGF-β /Smad Pathway. PLoS ONE 7 (12): e52465. doi: 10.1371 /journal.pone.0052465

Επιμέλεια: Ρατζίβ Samant, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Ιούνη 2012? Αποδεκτές: 13 Νοεμβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 20 του Δεκεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Gu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το μεγάλο σχέδιο Ερευνών του Εθνικού Ιδρύματος Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant αρ. 91129718), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant αρ. 81071421, 31140063), Επιστημονικής και Τεχνολογικής Υποστηρικτικό Πρόγραμμα επαρχίας Jiangsu (Grant όχι. BE2010703 ), 333 Έργο της επαρχίας Jiangsu (Grant αρ. 2009055) και την Ομάδα Sci-Tech καινοτομία και τα ταλέντα του Πανεπιστημίου Jiangsu (Grant όχι. 2008-018-02). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα καρκινικά κύτταρα αρχίζουν να διαμορφώνουν μικροπεριβάλλον τους σε πρώιμο στάδιο της εξέλιξης κακοήθους [1]. Εκτεταμένες αναφορές έχουν καταδείξει τις εκτεταμένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ μικροπεριβάλλον του όγκου και καρκινικών κυττάρων, τα οποία είναι κρίσιμα για την ογκογένεση και την εξέλιξη του όγκου [2], [3]. Στο μικροπεριβάλλον του όγκου θα μπορούσε να προκαλέσει αναστρέψιμες μεταβολές στον φαινότυπο των καρκινικών κυττάρων και να διευκολυνθεί η μεταστατική εξάπλωση του [4], και οι μεταβολές του όγκου ακόμη και μικροπεριβάλλοντος επηρεάζουν δραματικά την αποτελεσματικότητα της θεραπείας του καρκίνου. Στο μικροπεριβάλλον του όγκου αποτελείται από διάφορους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ινοβλαστών καρκίνωμα που συνδέεται (CAFS), διεισδύοντας ανοσοκύτταρα, του αίματος και του λεμφικού αγγειακών δικτύων, και μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) [4], [5].

CAFS αποτελούν καθοριστικούς παράγοντες στην κακοήθη εξέλιξη της ανάπτυξης του καρκίνου, αγγείωση, και μετάσταση. CAFS που εκφράζουν ινοβλαστών πρωτεΐνη ενεργοποίησης (FAP) και α-λείου μυός ακτίνη (α-SMA) θα μπορούσε να δημιουργήσει μια θέση για τα καρκινικά κύτταρα και να προωθήσει την κινητικότητα τους [6], [7]. Πράγματι, CAFS υποβάλλονται σε μια διαδικασία διαφοροποίησης που προκαλείται από τα καρκινικά κύτταρα και να αναπτύξει επεμβατικές και μεταναστευτικών ικανότητες [8], [9].

Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα είναι πολυδύναμα κύτταρα που μπορούν να απομονωθούν από μία μεγάλη ποικιλία ιστών, συμπεριλαμβανομένων των οστών μυελού, λιπώδη ιστό, αρθρικό υμένα, σκελετικό μυ, ήπαρ, αίμα του ομφάλιου λώρου, πλακούντα, και του ομφάλιου λώρου [10] – [13]. MSCs μπορεί να επαχθούν για να διαφοροποιηθούν προς οστεοκύτταρα, λιποκύτταρα, χονδροκύτταρα και μυοκύτταρα λόγω της αναγεννητικής ικανότητας τους και πολυδύναμα ικανότητα [14]. MSCs σπίτι για να επιβιώσουν και στις θέσεις της φλεγμονής και της ζημίας, καθώς και οι όγκοι, συμβάλλοντας στον σχηματισμό του σχετιζόμενου με τον όγκο στρώματος [15]. Μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι MSCs μπορεί να διαφοροποιούνται σε μυοϊνοβλάστες, ινοβλάστες καρκίνωμα που συνδέεται, ινοκύτταρα ή περικύτταρα υπό τις συνθήκες μικροπεριβάλλον του όγκου [6], [16], [17]. Σε προηγούμενες μελέτες μας, αποδείξαμε ότι MSCs μυελού των οστών και τα παράγωγα τους εξωσώματα θα μπορούσε να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου [18], [19]. Ωστόσο, ο μηχανισμός που είναι υπεύθυνος για αυτό το αποτέλεσμα παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος.

Τα κύτταρα όγκου αλληλεπιδρούν με μικροπεριβάλλον του όγκου μέσω αλληλεπίδρασης κυττάρου-κυττάρου και παρακρινή μηχανισμούς όπως παράγει μια ποικιλία από παράγοντες ανάπτυξης, χημειοκίνες, και ένζυμα αποδόμησης μήτρας που ενισχύουν ο πολλαπλασιασμός και η εισβολή του όγκου [20]. Εκτός από τους γνωστούς μηχανισμούς, ένα νέο μηχανισμό καρκινικά κύτταρα μπορεί να απελευθερώσει ενεργά εξωσώματα αναδύεται. Εξωσώματα έχουν μια συγκεκριμένη σύνθεση αντανακλώντας την καταγωγή τους και μπορούν να μεταφέρουν όχι μόνο τα συστατικά της μεμβράνης, αλλά και νουκλεϊκών οξέων μεταξύ διαφορετικών κυττάρων [21], [22], υπογραμμίζοντας το ρόλο τους στην ενδοκυτταρική επικοινωνία [23]. Συσσωρευμένα στοιχεία έχουν δείξει τη συμβολή των εξωσωμάτων σε ένα κυτταρικό τρόπο επικοινωνίας, που οδηγεί σε μεσοκυττάρια μεταφορά των μορίων [24]. Αν και ο ρυθμιστικός ρόλος του εξωσωμάτων στο ανοσοποιητικό σύστημα και την εφαρμογή τους ως εμβόλιο στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου υπόσχεται [25] – [28]., Το αποτέλεσμα μετά από αλληλεπίδραση μεταξύ εξωσώματα καρκίνου και στρωματικά κύτταρα δεν είναι καλά κατανοητός

Κακοήθη κύτταρα επανέρχονται MSCs να CAFS που συμβάλλουν στην προώθηση της εξέλιξης του όγκου έχει ενθαρρύνει την έρευνα για τις πιθανές μηχανισμοί μετάβασης της. Μελέτες έχουν δείξει ότι τουλάχιστον το 20% του CAFS προέρχονται από το μυελό των οστών και προέρχονται από μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα σε μοντέλα ποντικών του σε fl ammation επαγόμενη γαστρικό καρκίνο [16]. Υποθέσαμε ότι τα καρκινικά κύτταρα γνωστοποιούνται με MSCs μέσω της απελευθέρωσης εξωσωμάτων και τη μεταφορά των πρωτεϊνών, επομένως επάγει τη διαφοροποίηση των MSCs να CAFS. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι MSCs αποκτήσει ένα φαινότυπο CAF μετά από έκθεση σε καρκίνο που προέρχεται εξωσώματα και τη διαφοροποίηση των MSCs να CAFS συνδέθηκε με την ενεργοποίηση του ΤΟΡ-β /οδό σηματοδότησης Smad.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Ανθρώπινα MSCs ομφάλιου λώρου ελήφθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12], [29]. Φρέσκα ομφάλιο λώρο συλλέχθηκαν από ενημερωθεί, συναινούντων μητέρες και επεξεργασία μέσα σε 6 ώρες. Τα κορδόνια ξεπλύθηκαν δύο φορές με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) σε πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη και κατόπιν απομακρύνθηκαν σκάφη κορδόνι. Τα πλυμένα κορδόνια κόπηκαν σε κομμάτια των 1-3 mm

2 μεγέθους και επιπλέει σε DMEM που περιείχε 10% FBS (Invitrogen, USA), 1% πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη. Τα κομμάτια του μυελού στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγρό αέρα με 5% CO

2 και το μέσο αλλάχθηκε κάθε 3 ημέρες μετά την αρχική επένδυση. Όταν αναπτυχθεί καλά αποικίες που μοιάζουν με ινοβλάστες κύτταρα έφθασαν 80% συρροή, οι καλλιέργειες θρυψινοποιήθηκαν και περάστηκαν σε νέες φιάλες για περαιτέρω επέκταση. Τα χαρακτηριστικά των απομονωμένων hucMSCs συμπεριλαμβανομένων μορφολογική εμφάνιση, αντιγόνα επιφανείας, το δυναμικό διαφοροποίησης και έκφρασης γονιδίου ερευνήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Όλα τα πρωτόκολλα πείραμα που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Jiangsu. Επελέγησαν οι hucMSCs από πέρασμα 2 για τα πειράματα. Ανθρώπινο γαστρικό καρκινικά κύτταρα (SGC7901 και HGC27) αγοράστηκαν από την Τράπεζα Κυττάρων, επιτροπή Συλλογή Τύπος Πολιτισμού (Κινεζική Ακαδημία Επιστημών). Γαστρική επιθηλιακά κύτταρα (GES-1) αγοράστηκαν από Cwbiotech Company και διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS.

εξωσωμάτων Απομόνωση και Καθαρισμός

SGC7901, HGC27 και το γαστρικό επιθηλιακά κύτταρα (GES-1 ) που προέρχεται εξωσώματα απομονώθηκαν και καθαρίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30], [31]. Εν συντομία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% εξωσωμάτων-εξαντλημένο ορό εμβρύου μόσχου. Εμβρύου εξωσώματα βοοειδών αφαιρέθηκαν από τη διάρκεια της νύχτας υπερφυγοκέντρηση σε 100.000 g για 16 h με ρότορα τύπου 90 Ti σταθερής Άγγελος (Optima L-90K, Beckman Coulter). Τα υπερκείμενα από συρρέουσες καλλιέργειες (3-5 ημέρες) φυγοκεντρήθηκαν στα 2000 g για 20 λεπτά για να απομακρυνθούν τα κύτταρα και υπολείμματα. Και το διαυγασθέν υπερκείμενο συμπυκνώθηκε με υπερδιήθηση μέσω μιας 100-kDa MWCO μεμβράνη κοίλης ίνας (Millipore) στα 1000 g για 30 λεπτά. Το συμπυκνωμένο υπερκείμενο φορτώθηκε σε σωλήνες φυγοκέντρησης (Beckman) και υποστρώθηκαν με 30% σακχαρόζη /D

2O πυκνότητα μαξιλάρι (5 ml) που σχηματίζει μια ορατή μεσόφαση και υπερφυγοκεντρήθηκε στα 100.000 g και στους 4 ° C για 1 ώρα σε ένα SW-32Ti swinging-κουβά ρότορα (Optima L-90K, Beckman Coulter). Στη συνέχεια, τόσο οι εξωσώματα μαξιλάρια πυκνότητας σακχαρόζης (κλάσμα 3) που συλλέγονται από τους σωλήνες υπερφυγοκέντρησης πυθμένας και οι nonbanded κλάσματα (κλάσμα 6 και 7) τα οποία περιέχουν nonmembrane σύμπλοκα πρωτεΐνης συλλέγονται για χρήση ως έλεγχος εξωσώματα (Ε-έλεγχος) συνενώθηκαν και πλύθηκαν τρεις φορές μέσω μιας 100-kDa μινιατούρα φυσίγγιο κοίλων ινών (Millipore) στα 1000 g για 30 λεπτά, όπως περιγράφεται παραπάνω. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας BCA (Pierce). Τα εξωσώματα αποστειρώθηκαν μέσω φίλτρου 0,22 μm κάψουλα (Millipore) και αποθηκεύτηκε στους -70 ° C μέχρι τη χρήση [30].

Ηλεκτρονική Μικροσκοπία

Μια σταγόνα εξωσωμάτων (περίπου 20 μΙ) που ελήφθη μετά απόκλιση υπερφυγοκέντριση διοχετεύθηκαν πάνω Formvar επικαλυμμένα με άνθρακα πλέγματα και αφέθηκε να παραμείνει για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την απομάκρυνση της περίσσειας υγρού με ένα κομμάτι του φίλτρου, το δείγμα χρωματίστηκε με 2% (w /v) φωσφοβολφραμικό οξύ (ρΗ 6,8) επί 5 λεπτά και ξηραίνεται στον αέρα κάτω από έναν ηλεκτρικό λαμπτήρα πυρακτώσεως, και αναλύονται με ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (FEI Tecnai 12, Philips).

εξωσώματα Σήμανση και εσωτερίκευση

SGC7901 κύτταρα που προέρχονται εξωσώματα και τα εξωσώματα έλεγχος επισημάνθηκαν με CM-Dil (κόκκινο) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Invitrogen). Τα εξωσώματα από κύτταρα GES-1 χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος του κυττάρου. Το σημασμένο εναιώρημα Εξώσωμα διηθείται με μία μεμβράνη 100 kDa MWCO κοίλης ίνας (Millipore) και το διερχόμενο χρησιμοποιήθηκε ως μη δεσμευμένο ελέγχου χρωστική. HucMSCs (1 × 10

4 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων που περιέχουν ελάσματα και επωάζονται στους 37 ° C με επισημασμένα εξωσώματα (800 μg /mL) για 4 ώρες πριν από τη συγκομιδή.

χρώση ανοσοφθορισμού

HucMSCs μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά. Τα επισημασμένα κύτταρα παρασκευάστηκαν για μικροσκοπία φθορισμού με ανά-κινητοποίηση για 3 λεπτά με 0.1% Triton-Χ100, αποκλείστηκαν με 5% BSA και επωάστηκαν με μονοκλωνικά αντι-β-ακτίνης αντίσωμα όλη τη νύκτα, που ακολουθείται από επώαση με Cy2-επισημασμένο αντι-κουνελιού IgG δευτερογενούς αντισώματος στους 37 ° C για 45 λεπτά (Jackson ImmunoResearch). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI. Ομοεστιακή εικόνες διαδοχικά αποκτήθηκαν με TCS σύστημα SP5 ΙΙ (Leica) [32].

CAF Διαφοροποίηση

HucMSCs σπάρθηκαν σε 6-φρεατίων (5 × 10

3 /καλά) . Δώδεκα ώρες μετά την σπορά, hucMSCs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με εξωσώματα (800 μg /mL) για να προκαλέσει την διαφοροποίηση CAF με την παρουσία ή απουσία του ΤΟΡ-β υποδοχέα 1 αναστολέα κινάσης SD208 (Sigma) ή ανασυνδυασμένος ανθρώπινος ΤΟΡ-β (5 ng /ml? Sigma). Το μέσο αλλάχθηκε κάθε 3 ημέρες για 14 ημέρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέγονται και παρασκευάζονται για κηλίδωση Western και ποσοτική ανάλυση PCR.

Western Blotting

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν με ρυθμιστικό ΚΙΡΑ (10 mM Tris, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 0,1% SDS, 1 mM NaF, 1 mM Na

3νο

4, 1 mM PMSF, 1 mg /mL απροτινίνη, 1 mg /mL λευπεπτίνη). Κλάσματα που περιέχουν ίσες ποσότητες πρωτεΐνης κλασματοποιήθηκαν και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεθανόλη προ-ενεργοποιημένου μεμβράνες PVDF (Millipore, USA). Μετά από διαδοχική επώαση με το πρωτεύον και δευτερεύον αντίσωμα, το σήμα οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα HRP (Millipore, USA) και αναλύθηκαν με MD Image Quant Λογισμικού. Πηγές και παράγοντες αραίωσης του πρωτογενή αντισώματα ήταν: πολυκλωνικά κουνελιού αντι-CD9 (1:1000? Bioworld), αντι-CD81 (1:1000? Epitomics), αντι-ΤΟΡ-β (1:1000? Bioworld), αντι-FAP ( 1:1000, Abcam), μονοκλωνικό ποντικού αντι-α-SMA (1:1000? Santa Cruz), αντι-VEGF (1:1000? Santa Cruz) και αντι-βιμεντίνης (1:2000? Santa Cruz), αντι-Ν -cadherin (1:1,000? Bioworld), αντι-Ε-καδερίνης (1:500? SAB) και μονοκλωνικά ποντικού αντι-GAPDH. (1:5000? Kangcheng)

Ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA εκχυλίστηκε με το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) και το cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ αντίστροφης μεταγραφής (Toyobo, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εκκινητές που παράγεται από την Invitrogen Company (Σαγκάη, Κίνα). Real-time RT-PCR διεξήχθη για να ανιχνευθεί η αλλαγή του FAP, α-SMA, Ν-cadherin και γονιδιακή έκφραση της IL-6 (Rotor-Gene 6000, Αυστραλία). Για να αντισταθμίσει τις διακυμάνσεις του RNA εισόδου και την αποτελεσματικότητα της αντίστροφης μεταγραφής, ένα ενδογενές γονίδιο «καθαριότητας» (β-ακτίνη) ήταν επίσης ποσοτικούς να ομαλοποιήσει τα αποτελέσματα. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν και όλες οι αντιδράσεις επαναλήφθηκαν 3 φορές ανεξάρτητα για να εξασφαλιστεί η αναπαραγωγιμότητα.

Μετανάστευση Δοκιμασία

HucMSCs (8 × 10

4 σε 200 μL) αιωρήθηκε σε ορό -δωρεάν μέσου φορτώθηκαν εντός του άνω διαμερίσματος και 500 μL μέσου χωρίς ορό (SFM) που περιέχει 800 εξωσώματα μg /mL υπό την παρουσία ή απουσία του ΤΟΡ-β υποδοχέα 1 κινάση αναστολέα SD208 (2 μΜ) προστέθηκε στο κάτω μέρος του φρεατίων (Corning). Μετά από καλλιέργεια στους 37 ° C για 6 ώρες, τα κύτταρα άνω η μεμβράνη σκουπίστηκαν με βύσμα βάμβακα. Τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει διαμέσου της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο και τουλάχιστον 10 πεδία των κυττάρων προσδιορίστηκαν για κάθε ομάδα.

ΤΟΡ-β Η εξουδετέρωση

HucMSCs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με εξωσώματα όγκου (800 μg /mL) για να προκαλέσει την CAF διαφοροποίηση με την παρουσία ή απουσία του αντισώματος ΤΟΡ-β (R &? D). Πριν από τα πειράματα, αντι-ΤΟΡ-β αντίσωμα (20 μg /mL) επωάστηκε με εξωσώματα στους 37 ° C για 2 ώρες.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SD. λογισμικό SPSS χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων. Τα μέσα διαφορετικές ομάδες θεραπείας συγκρίθηκαν με αμφίδρομη δοκιμή ANOVA ή t-test του Student. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Εξωσώματα Χαρακτηρισμός και εσωτερίκευση

Εμείς απομονωθεί και ταυτοποιηθεί τα εξωσώματα με βάση το μοναδικό μέγεθος και την πυκνότητά τους.. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α-α, τα εξωσώματα είχε χαρακτηριστική πιατάκι-όπως το σχήμα περιορίζεται από μία διπλή στιβάδα λιπιδίου με διάμετρο κυμαίνονταν από 40 έως 100 nm. Επιβεβαιώσαμε την άφθονη έκφραση των δεικτών exosomal CD9 και CD81 σε απομονωμένες εξωσώματα μας με κηλίδωση Western (Σχ. 1Α-Β). Μετά προηγούμενες μελέτες μας, ανθρώπινο ομφάλιο λώρο που προέρχονται MSCs παρασκευάστηκαν και χαρακτηρίστηκαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να διερευνηθεί η εσωτερίκευση εξωσωμάτων από hucMSCs, θα επισημαίνονται τα εξωσώματα με CM-Dil. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 Β, τα κύτταρα που προέρχονται SGC7901 εξωσώματα είχαν εσωτερικευθεί και συσσωρεύεται στο hucMSCs μετά από επώαση για 4 ώρες ενώ ελέγχου εξωσώματα έδειξαν ελάχιστη επίδραση. Σε σύγκριση με την ομάδα SGC7901, λιγότερο GES 1 που προέρχονται από εξωσώματα ελήφθησαν από hucMSCs.

Α. Η μορφολογία εξωσωμάτων και έκφραση exosomal δείκτη. (Α) μορφολογικής ανάλυσης του γαστρικού καρκίνου που προέρχεται εξωσώματα. Κλίμακα bar = 100 nm. (Β) CD9 και έκφραση CD81 σε εξωσώματα. Β Εξωσώματα είχαν δεσμεύεται από τη hucMSCs. Τα εξωσώματα σημασμένο με CM-Dil (κόκκινο) στους 37 ° C για 1 ώρα προστέθηκαν σε hucMSCs και επωάστηκαν για 4 ώρες. Τα λύματα από μια φιλτραρισμένη εναιώρημα CM-Dil-επισημασμένο εξωσώματα (έλεγχος) και το CM-Dil-επισημασμένο αποσύρονται κλάσμα εξωσώματα (e-exos) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για κυτόπλασμα (CY2-ακτίνη, πράσινο) και οι πυρήνες (ϋΑΡΙ, μπλε). μπαρ κλίμακας = 20 μm.

Η

όγκων που προέρχονται από Εξωσώματα Προώθηση hucMSCs Διαφοροποίηση προς CAFS

Υποθέσαμε ότι εξωσώματα που προέρχονται από όγκους μπορεί να επάγει την διαφοροποίηση των hucMSCs να CAFS

in vitro

. CAFS ορίστηκαν ως η αυξημένη έκφραση του FAP και πρωτεϊνών α-SMA. HucMSCs μονοστοιβάδας καλλιεργήθηκε σε μέσο που περιείχε 800 μg /mL εξωσώματα SGC7901 και GES-1 εξωσώματα. αναλύσεις Ποσοτική RT-PCR έδειξε ότι SGC7901 εξωσώματα αλλά όχι GES-1-εξωσώματα προώθησε την έκφραση των δεικτών CAF σε MSCs σε 36 ώρες (Εικ. 2Α) και 14 d (Σχ. 2Β) μετά την επαγωγή, αντίστοιχα. Σε σύγκριση με την ομάδα άνευ αγωγής, όγκου εξωσώματα θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα αυξήσεις στην FAP, α-SMA, Ν-cadherin, και τα επίπεδα της πρωτεΐνης βιμεντίνης (Σχ. 2C). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι hucMSCs υποβάλλονται CAF διαφοροποίηση στην αντιμετώπιση των όγκων Εξωσώματα έκθεσης.

A.Quantitative αναλύσεις της έκφρασης α-SMA mRNA FAP, IL-6 και hucMSCs. HucMSCs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις SGC7901 εξωσωμάτων ή GES-1 εξωσώματα για 36 ώρες. B. Η ποσοτική ανάλυση της έκφρασης FAP, IL-6 και Ν-καντερίνης hucMSCs. HucMSCs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις SGC7901 εξωσωμάτων ή GES-1 εξωσώματα για 14 ημέρες. Γ κηλίδωση Western αναλύσεις της έκφρασης πρωτεΐνης FAP, α-SMA, Ν-καδερίνη και βιμεντίνης σε hucMSCs κατεργάζεται με SGC7901 εξωσώματα (800 μg /ml) για διαφορετικούς χρόνους. (Α-δ) Ανάλυση Πυκνότητα κηλίδωση Western μπάντες. * P & lt? 0.05 και # P & lt? 0,01, σε σύγκριση με τη σχετική ομάδα ελέγχου (n = 3)

Η

όγκων που προέρχονται από Εξωσώματα Προώθηση hucMSCs Μετανάστευση

Για να αναλυθεί το κατά πόσον το μεταναστευτικό ικανότητα. του hucMSCs επηρεάστηκε από εξωσώματα όγκου, hucMSCs καλλιεργήθηκαν στο transwell και διεγείρονται για να μεταναστεύσουν από εξωσώματα όγκου. Όπως φαίνεται στα σχήματα 3Α και 3Β, στις 6 ώρες μετά την επώαση, εξωσώματα όγκου προώθησε την μετανάστευση των hucMSCs πιο αποτελεσματικά από το κανονικό προέρχονται κύτταρο εξωσώματα. Δείξαμε επίσης ότι η αυξημένη μετανάστευση των hucMSCs με εξωσωμάτων όγκου παρεμποδίστηκε με ταυτόχρονη αγωγή με αναστολέα ΤΟΡ-β R1, SD208. Επιπλέον, εξετάσαμε την επίδραση της SGC7901 εξωσωμάτων για τη μετανάστευση των hucMSCs χρησιμοποιώντας δοκιμασία μηδέν. Τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνη με εκείνη του Transwell δοκιμασία μετανάστευσης, που δείχνει μια μειωμένη απόσταση κενό στην όγκων εξωσωμάτων αγωγή ομάδα (Εικ. S1). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι εξωσώματα όγκου μπορεί να προωθήσει τη μετανάστευση hucMSCs

in vitro

.

Α. HucMSCs υπέστησαν αγωγή με γαστρικό καρκινικό κύτταρο ή κανονική γαστρικού επιθηλίου που προέρχονται κύτταρο εξωσώματα (800 μg /mL) παρουσία ή απουσία SD208 (2 μΜ) για 6 ώρες. δοκιμασία μετανάστευσης Transwell πραγματοποιήθηκε για να αναλυθεί η μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων. B. Ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν ανωτέρω αξιολογήθηκε. Αυτά τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. * P & lt? 0.05 και # P & lt? 0.01, n = 3. Κλίμακα bar = 50 μm

Η

όγκων που προέρχονται από Εξωσώματα Ενεργοποίηση Smad2 /3 και p38 σε hucMSCs

TGF-β. έχει αποδειχθεί ότι είναι παρόντες στην επιφάνεια των εξωσωμάτων [33] και κρίσιμη για CAF διαφοροποίηση. Στη συνέχεια διερευνήθηκε κατά πόσον οδού TGF-β ήταν υπεύθυνος για την πρόκληση της μετάβασης MSCs να CAFS από εξωσώματα όγκου. Δείξαμε πρώτα την παρουσία του ΤΟΡ-β σε εξωσώματα όγκου (Σχ. 4Α). Σε σύγκριση με εξωσώματα όγκου, φυσιολογικό προερχόμενο κύτταρο εξωσώματα έδειξαν χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης ΤΟΡ-β. Για να εκτιμηθεί κατά πόσον η διαφοροποίηση των hucMSCs να CAFS σχετίζεται με την ενεργοποίηση του ΤΟΡ-β μονοπατιού, εξετάσαμε την κατάσταση των φωσφορυλιωμένη Smad 2/3 μετά όγκου Εξωσώματα θεραπεία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Smad 2/3 φωσφορυλίωση αυξήθηκε κατά εξωσώματα όγκου στα 15 λεπτά μετά την αγωγή και έφθασε το υψηλότερο επίπεδο σε 60 λεπτά μετά την αγωγή, ενώ δεν επηρεάστηκαν τα συνολικά Smad 2/3 επίπεδα πρωτεΐνης. Προσδιορίσαμε επίσης το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης ρ38 και διαπίστωσε ότι η φωσφορυλίωση ρ38 αυξήθηκε επίσης με εξωσώματα όγκου (Σχ. 4Β). Σε αντίθεση, GES-1 που προέρχεται εξωσώματα δεν θα μπορούσε να ενεργοποιήσει Smad2 /3 και ρ38 (Εικ. 4C). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι εξωσώματα όγκου ενεργοποιούν συγκεκριμένα Smad2 /3 και p38 σε hucMSCs.

Α. Κηλίδωση Western αναλύσεις του ΤΟΡ-β έκφραση σε γαστρικό καρκινικό κύτταρο (SGC7901) και παράγωγα εξωσώματα φυσιολογικό γαστρικό επιθηλιακών κυττάρων (GES-1). B. HucMSCs υποβλήθηκαν σε αγωγή με παράγωγα SGC7901 εξωσώματα (800 μg /mL) για διαφορετικούς χρόνους όπως υποδεικνύεται. Τα επίπεδα του p-Smad2 /3, τ-Smad2 /3, π-τ-p38and ρ38 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. ΤΟΡ-β χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. Γ HucMSCs υποβλήθηκαν σε αγωγή με GES-1 που προέρχεται εξωσώματα (800 μg /mL) για διαφορετικούς χρόνους όπως υποδεικνύεται. Τα επίπεδα του p-Smad2 /3, τ-Smad2 /3, π-ρ38 και ί-ρ38 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western.

Η

ΤΟΡ-β Pathway Αναστολή Blocks Tumor Εξωσώματα επαγόμενη Smad2 /3 και p38 ενεργοποίησης

για να αποδείξει αν η ενεργοποίηση των Smad2 /3 και ρ38 είναι ειδικό για σηματοδότηση TGF-β ενεργοποιείται από εξωσώματα όγκου, έχουμε μπλοκάρει TGF-β μονοπατιού με TGF-β R1inhibitor σηματοδότησης και ανιχνεύθηκαν τα επίπεδα των φωσφορυλιωμένων Smad2 /3 και p38. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, η αυξημένη φωσφορυλίωση της Smad2 /3 και p38 εξής όγκου εξωσώματα αγωγή αντιστράφηκε με αναστολέα ΤΟΡ-β R1, SD208, με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Για να καταδειχθεί περαιτέρω ΤΟΡ-β από εξωσώματα όγκου που ενεργοποιεί hucMSCs, εμείς εξουδετερώθηκε ΤΟΡ-β σε εξωσώματα όγκου χρησιμοποιώντας ένα αντι-ΤΟΡ-β αντίσωμα. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα από αναστολέα ΤΟΡ-β R1, η αυξημένη φωσφορυλίωση της Smad2 /3 και ρ38 σε hucMSCs επίσης αντιστρέφεται με ΤΟΡ-β αντίσωμα (Σχ. 5Β). Συνοπτικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ο TGF-β από εξωσώματα όγκου αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα ΤΟΡ-β επί hucMSCs, που οδηγεί στην διαδοχική ενεργοποίηση Smad2 /3 και ρ38 σε hucMSCs.

A. HucMSCs υποβλήθηκαν σε αγωγή με παράγωγα SGC7901 εξωσώματα (800 μg /mL) παρουσία ή απουσία SD208 (2 μΜ) για 1 ώρα. Τα επίπεδα του φωσφορυλιώθηκαν Smad2 και ρ38 εξετάστηκαν με κηλίδωση Western. B. Γαστρικό καρκινικών κυττάρων (SGC7901) προέρχεται εξωσώματα προ-επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-ΤΟΡ-β (20 μg /mL) για 2 ώρες, και στη συνέχεια προστέθηκε σε hucMSCs. Έξι ώρες αργότερα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα επίπεδα των φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών Smad2 και ρ38 εξετάστηκαν με κηλίδωση Western.

Η

ΤΟΡ-β Pathway Αναστολή Αντιστρέφει Tumor Εξωσώματα επαγόμενη hucMSCs Διαφοροποίηση προς CAFS

για να καταδειχθεί αλληλεπίδραση /ΤΟΡ-β R1 ΤΟΡ-β είναι υπεύθυνος για την διαφοροποίηση των hucMSCs να CAFS επάγεται από εξωσώματα όγκου, έχουμε μπλοκάρει ΤΟΡ-β σηματοδότηση με SD208 και το αντίσωμα εξουδετέρωσης του ΤΟΡ-β που ακολουθείται από όγκο εξωσώματα θεραπεία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α-ένα, η αγωγή με SD208 (2 μΜ) για 14 ημέρες αντέστρεψε έντονα τον όγκο εξωσώματα επαγόμενη έκφραση των δεικτών CAF συμπεριλαμβανομένων FAP, α-SMA, Ν-καδερίνης και βιμεντίνης σε hucMSCs. Επιβεβαιώσαμε επίσης αυτό το αποτέλεσμα, χρησιμοποιώντας εξωσώματα από HGC-27 γαστρικά καρκινικά κύτταρα (Σχ. 6Α-Β). Επιπλέον, η θεραπεία με αντι-ΤΟΡ-β αντίσωμα οδήγησε στις παρόμοιες δράσεις με εκείνο που παρατηρήθηκε σε αναστολέας ΤΟΡ-β R1 (Εικ. 6Β). Συνοπτικά, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι εξωσώματα όγκου μεσολαβούν την διαφοροποίηση των hucMSCs να CAFS μέσω της ενεργοποίησης του ΤΟΡ-β /οδό σηματοδότησης Smad.

A. HucMSCs υπέστησαν αγωγή με γαστρικό καρκίνο κυττάρων που προέρχονται εξωσώματα με την παρουσία ή απουσία του SD208 (2 μΜ) για 2 εβδομάδες. Η έκφραση του FAP, α-SMA, βιμεντίνη και πρωτεΐνες Ν-καδερίνης προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. (Α) SGC7901? (Β) HGC27. B. HucMSCs υπέστησαν αγωγή με γαστρικό καρκινικό κύτταρο (SGC7901) προέρχεται εξωσώματα παρουσία ή απουσία του αντισώματος ΤΟΡ-β (20 μg /mL) για 2 εβδομάδες. IgG Κουνελιού χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Η έκφραση των πρωτεϊνών FAP και α-SMA προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε εντοπίσει ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο τα καρκινικά κύτταρα επάγει τη διαφοροποίηση των MSCs να CAFS. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι: (1) γαστρικού καρκίνου κυτταρική προέρχονται εξωσώματα εσωτερικεύεται από hucMSCs? (2) γαστρικό καρκίνο των κυττάρων που προέρχονται εξωσώματα προκαλέσει hucMSCs διαφοροποίηση σε CAFS και (3) TGF-β /Smad οδός διαμεσολαβεί τη μετάβαση των hucMSCs να CAFS. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι ο TGF-β σε εξωσώματα όγκου μπορεί να αλληλεπιδρούν με το ΤΟΡ-β R1 επί hucMSCs, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των Smad πορείας hucMSCs και την επακόλουθη διαφοροποίηση των hucMSCs να CAFS.

Αν και έχει αναφερθεί ότι εξωσώματα όγκου μπορεί να βελτιώσει την μεταστατική δραστηριότητα των κυττάρων του όγκου [34], ο ρόλος των εξωσωμάτων όγκου σε MSCs δεν έχει αποκαλυφθεί ακόμη. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να ρυθμίζει την κινητικότητα των MSC, υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα του όγκου θα μπορούσε να προσλάβει MSCs από το μυελό των οστών ή άλλους ιστούς στο μικροπεριβάλλον του όγκου μέσω εξωσωμάτων μεσολάβηση μηχανισμό.

Η έκθεση σε εξωσώματα όγκου αυξάνει την έκφραση του δείκτες CAF σε MSC, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα εξωσώματα όγκου προκαλεί το διακόπτη του φαινοτύπου από MSCs να CAFS. Αν και αυτό το χαρτί ήταν στο πλαίσιο της προετοιμασίας, Cho et al. ανέφεραν ότι εξωσώματα από καρκίνο του μαστού και των ωοθηκών κύτταρα θα μπορούσαν να επάγουν την λιπώδη ιστό που προέρχεται MSCs να αποκτήσουν φυσιολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά του μυοϊνοβλαστών όγκου στήριξης [35], [36]. Η δουλειά μας είναι συνεπής με τα ευρήματά τους και την περαιτέρω αποδεικνύει ότι αυτή η διαδικασία είναι Smad-εξαρτώμενη.

Στην παρούσα μελέτη, παρουσιάζουμε τα στοιχεία που αποδεικνύουν ότι εξωσώματα όγκου προσφέρουν μια αποτελεσματική πλατφόρμα για τη μεταφορά των συγκεκριμένων μηνυμάτων προς MSCs, την προώθηση MSC-CAF μετάβασης. Αρκετές προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ο ΤΟΡ-β εκφράζεται από τον καρκίνο εξωσώματα που προέρχεται από κύτταρα και αυτή η μορφή του ΤΟΡ-β είναι βιολογικά ενεργή στην οδήγηση Smad-εξαρτώμενη σηματοδότηση [33], [37]. ΤΟΡ-β είναι ένας βασικός ρυθμιστής της ανανέωσης των βλαστικών κυττάρων και διαφοροποίηση [38]. Επαληθεύσαμε την παρουσία του ΤΟΡ-β σε γαστρικό προέρχονται εξωσώματα καρκινικών κυττάρων και επιβεβαίωσε την αλληλεπίδραση TGF-β /ΤΟΡ-β R1 μεσολάβηση της ενεργοποίησης Smad2 /3 και διαφοροποίηση CAF σε hucMSCs.

Έχει αποδειχθεί ότι MSCs θα μπορούσε να προωθήσει μετάστασης του καρκίνου [4], [39]. Έχουμε επίσης αναφερθεί ότι τα ανθρώπινα MSC παράγωγες ρυθμισμένο μέσο και εξωσώματα ενισχύουν (VEGF) έκφραση αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα σε κύτταρα όγκου και την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου

in vivo

[18], [19]. Αν τα εξωσώματα από MSCs θα μπορούσε να παίξει ένα ρόλο στη μετάσταση του καρκίνου δεν έχει αντιμετωπιστεί. Έχουμε παρατηρήσει ότι MSCs εξωσώματα προώθηση της μετάβασης των επιθηλιακών-to-μεσέγχυμα (EMT) σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα, αλλά οι υποκείμενοι μηχανισμοί πρέπει ακόμη να διερευνηθεί σε μελλοντικές μελέτες.

Εν κατακλείδι, έχουμε αποδείξει σε αυτή τη μελέτη ότι η γαστρική καρκινικό κύτταρο που προέρχεται εξωσώματα έχουν την ικανότητα να επάγει την διαφοροποίηση των MSCs να CAFS και την ενεργοποίηση του ΤΟΡ-β /Smad μονοπάτι από εξωσώματα όγκου συμβάλλει στη μετάβαση των MSCs να CAFS. Τα ευρήματά μας παρέχουν έναν νέο μηχανισμό με τον οποίο τα καρκινικά κύτταρα επάγουν MSCs να διαφοροποιούνται σε στρωματικά κύτταρα του όγκου και να συμμετέχουν στη διαμόρφωση του μικροπεριβάλλον του όγκου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

γαστρικού καρκίνου των κυττάρων που προέρχονται εξωσώματα προώθηση hucMSCs μετανάστευσης. HucMSCs υπέστησαν αγωγή με γαστρικό καρκινικό κύτταρο (SGC7901) προέρχεται εξωσώματα (800 μg /mL). συστοιχία Scratch πραγματοποιήθηκε για να αναλυθεί η ικανότητα μετανάστευσης των κυττάρων. (Α-γ) Μη επεξεργασμένα hucMSCs? (Δ-στ) SGC7901-εξωσώματα αντιμετωπίζονται hucMSCs. μπαρ κλίμακας = 50 μm

doi:. 10.1371 /journal.pone.0052465.s001

(ΔΕΘ)