Αφηρημένο

Ιστορικό

Αχλωρυδρία που προκαλείται από π.χ. ατροφική γαστρίτιδα επιτρέπει την βακτηριακή υπερανάπτυξη, η οποία επάγει χρόνια φλεγμονή και βλάβη στα κύτταρα του βλεννογόνου των μολυσμένων ατόμων οδήγησης γαστρικό κακοήθειες και ο καρκίνος.

Enterococcus faecalis

(

Ε. Faecalis

) μπορεί να αποικίσει achlohydric στομάχια και γι ‘αυτό ήθελε να μελετήσει την επίδραση των

Ε. faecalis

μόλυνσης στην φλεγμονώδη απόκριση, αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) σχηματισμός, μιτοχονδριακή αναπνοή, και μιτοχονδριακή γενετική σταθερότητα σε γαστρικού βλεννογόνου κύτταρα.

Μέθοδοι

Για να διαχωριστούν τα μεταβολές που προκαλούνται από βακτήρια από εκείνες των φλεγμονωδών κυττάρων καθιερώσαμε μια

in vitro E. faecalis

σύστημα μοντέλο μόλυνσης χρησιμοποιώντας την κυτταρική γραμμή γαστρικού καρκινώματος ΜΚΝ74. Σύνολο ROS και υπεροξειδίου μετρήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού. Κυτταρική κατανάλωση οξυγόνου χαρακτηρίστηκε μη επεμβατικά με τη χρήση XF24 μικροπλάκες αναπνευσιομετρίας. έκφραση του γονιδίου εξετάστηκε από μικροσυστοιχιών, και τα μονοπάτια απάντηση εντοπίστηκαν από το γονίδιο Set Analysis (GSA). Επιλεγμένα μεταγραφές γονίδιο ελέγχεται από ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (qRT-PCR). Μιτοχονδριακές μεταλλάξεις προσδιορίστηκαν με αλληλούχιση.

Αποτελέσματα

Η μόλυνση των κυττάρων ΜΚΝ74 με

Ε. faecalis

που προκαλείται από την παραγωγή ενδοκυτταρικής ROS μέσω ενός μονοπατιού ανεξάρτητου από οξειδωτική φωσφορυλίωση (oxphos). Επιπλέον,

Ε. faecalis

λοίμωξη που προκαλείται από μιτοχονδριακό DNA αστάθεια. Μετά τη μόλυνση, τα γονίδια που κωδικοποιούν για φλεγμονώδεις πρωτεΐνες απόκριση ήταν μεταγραφικά πάνω ρυθμισμένα ενώ γονίδια ελέγχου κυτταρικού κύκλου επιδιόρθωση βλάβης ΟΝΑ και ρυθμισμένα προς τα κάτω. Η ανάπτυξη των κυττάρων επιβραδύνεται όταν μολύνονται με βιώσιμο

Ε. faecalis

και απάντησε με δοσοεξαρτώμενο τρόπο να

Ε. faecalis

λύμα.

Συμπεράσματα

Η μόλυνση από

Ε. faecalis

προκάλεσε μια oxphos-ανεξάρτητο απάντηση ενδοκυτταρική ROS και καταστραφεί το μιτοχονδριακό γονιδίωμα σε καλλιέργεια γαστρικών κυττάρων. Τέλος, τα βακτήρια που προκαλείται από μια NF-κΒ φλεγμονώδη απόκριση, καθώς και μειωμένη ανταπόκριση βλάβες του DNA και την έκφραση του γονιδίου έλεγχο του κυτταρικού κύκλου.

Απομαγνητοφώνηση προφίλ

Array Express αριθμό ένταξης E-Μπειραμ-3496.

Παράθεση: Strickertsson τρύπημα, Desler C, Martin-Bertelsen T, Machado AMD, Wadström Τ, Winther O, et al. (2013)

Enterococcus faecalis

μόλυνση προκαλεί φλεγμονή, Η ενδοκυτταρική Oxphos-Ανεξάρτητη ROS Παραγωγής και βλάβη στο DNA σε ανθρώπινα κύτταρα γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 8 (4): e63147. doi: 10.1371 /journal.pone.0063147

Επιμέλεια: Shree Ram Singh, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Αυγούστου 2012? Αποδεκτές: 2 του Απρίλη 2013? Δημοσιεύθηκε: 30 Απριλίου 2013

Copyright: © 2013 Strickertsson et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. AMDM είναι υποστηρίζεται από μια υποτροφία από την πορτογαλική Επιστήμης, Τεχνολογίας του Ιδρύματος. LFH υποστηρίζεται από τη Δανική MRC. Τρυπήματα υποστηρίζεται από τη Δανική Εταιρεία Καρκίνου, και το Πανεπιστήμιο της Κοπεγχάγης SUND. ΤΜΒ και OW υποστηρίζονται από μια επιχορήγηση από το Ίδρυμα Novo Nordisk στο Κέντρο Βιοπληροφορικής. CD και LJR υποστηρίζονται από NORDEA-Fonden. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στομάχου είναι μεταξύ των δέκα πιο κοινές μορφές καρκίνου, και με συνολικό ετήσιο ποσοστό θανάτων περίπου 700.000, είναι η δεύτερη πιο κοινή αιτία της θνησιμότητας που σχετίζονται με τον καρκίνο [1]. Ο εντερικός τύπος γαστρικός καρκίνος αναπτύσσεται μέσω μιας σειράς παθολογικών εκδηλώσεων αρχίζοντας με χρόνια φλεγμονή, ατροφική γαστρίτιδα, εντερική μεταπλασία, και, τέλος, ο καρκίνος [2].

Η χρόνια φλεγμονή και τον καρκίνο έχει συνδεθεί σε αρκετές μελέτες ασθενών και του γενετικά τροποποιημένα ποντίκια, και πιστεύεται ότι εμπλέκονται στην παθογένεση του 25% περίπου όλων των περιπτώσεων καρκίνου παγκοσμίως [2] – [4]. Χαρακτηριστικά της φλεγμονής σχετίζονται με τον καρκίνο περιλαμβάνουν την παρουσία χημειοκινών και κυτοκινών σε ιστούς όγκου, που έχουν τη δυνατότητα να διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση των κακοηθών κυττάρων [5], [6]. Η χρόνια φλεγμονή ευνοεί επίσης μια υπερπαραγωγή του DNA βλάπτουν αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), των οποίων η παραγωγή μπορεί να είναι συναφείς με την οξειδωτική φωσφορυλίωση (oxphos) αντιδράσεις στα μιτοχόνδρια (oxphos-εξαρτώμενο) ή παράγονται από έξω από τα μιτοχόνδρια συνηθέστερα από nicotinamid φωσφορικό δινουκλεοτίδιο αδενίνης ( NADPH) οξειδάσες (oxphos-ανεξάρτητο) (για επισκόπηση βλέπε [7] – [9]). Η χρόνια παραγωγή της βλάβης ROS αιτία DNA, επιτρέποντας την συσσώρευση μεταλλάξεων που με τη σειρά μπορούν να ενεργοποιήσουν ογκογονίδια ή /και απενεργοποιούν ογκοκατασταλτικά γονίδια αυξάνοντας έτσι τον κίνδυνο ανάπτυξης του καρκίνου [3].

Ο πιο κοινός παράγοντας κινδύνου για την ανάπτυξη καρκίνο του στομάχου είναι η χρόνια βακτηριακή λοίμωξη του στομάχου με το

Helicobacter pylori

(

η. pylori

) [10]. Η χρόνια λοίμωξη του στομάχου από το

H. pylori

επηρεάζουν το γαστρικό pH ισορροπία και μπορεί να προκαλέσει αχλωρυδρίας ή hyperchlorhydria [11]. Αν και αυτό το βακτήριο έχει ταξινομηθεί ως τάξη ένα καρκινογόνο, δεν συνδέεται πάντα με αυξημένο κίνδυνο γαστρικού ανάπτυξη καρκίνου. Για παράδειγμα,

H. pylori

οροθετικούς ασθενείς με δωδεκαδακτυλικό έλκος και τα υψηλά επίπεδα γαστρικού οξέος έχουν μειωμένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του στομάχου σε σύγκριση με εκείνες από το γενικό πληθυσμό [11] – [13]. Αντίθετα, οι ασθενείς με ατροφική γαστρίτιδα και μειωμένη έκκριση γαστρικού οξέος έχουν αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης γαστρικού καρκίνου [11], [13], [14]. Ο αυξημένος κίνδυνος καρκίνου σε achlorhydric άτομα μπορεί να οφείλεται σε βακτηριακή υπερανάπτυξη άλλων βακτηρίων στα γαστρικά αυλό [15]. Σε αμφότερες τις achlorhydric ανθρώπους και ζωικά μοντέλα βακτηριακή υπερανάπτυξη αιτία χρόνιας γαστρίτιδας που εξελίσσεται σε εντερική μετάπλαση και γαστρικό καρκίνο τελικά [16] – [18]. Μεταξύ των βακτηρίων που βρίσκονται στο στομάχι του achlorhydric ποντικών ήταν

Enterococci

είδη, τα οποία είναι gram-θετικούς κόκκους σε θέση να επιβιώσουν σε περιβάλλοντα με ρΗ τόσο χαμηλά όσο 4.5 [19], [20].

Enterococcus faecalis

(

E. Faecalis

) είναι ένα μέλος της ανθρώπινης μικροχλωρίδας συμβιωτικό και ένα από τα πιο κοινά βακτήρια στο γαστρεντερικό σωλήνα [19]. Παρά το γεγονός αυτό,

E. faecalis

μπορεί να δράσει ως ένα ανθρώπινο παθογόνο [21], και έχει βρεθεί σε σημαντικά αυξημένους αριθμούς στη στοματική καρκινικές βλάβες και σε ανθρώπινους καρκίνους του παχέος εντέρου [22], [23]. Σε σχέση με αυτό το

Ε. faecalis

είναι ικανή να παράγει Ν-νιτροζαμίνες και επάγει γενετικής αστάθειας σε επιθηλιακά κύτταρα του κόλου μέσω οξειδωτική βλάβη του DNA [24], [25].

Γαστρίτιδα σχετίζεται με ενδοδιήθηση ανοσοκυττάρων σε ο ιστού, η οποία καθιστά δύσκολη την τεμαχίσει τη δράση των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος από εκείνη των κυττάρων του βλεννογόνου επένδυσης

in vivo

. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται ένα

in vitro

μοντέλο καλλιέργειας ιστών που μας επέτρεψε να εξετάσει πώς απομονωμένα βλεννογόνου κύτταρα ανταποκρίνονται σε βακτήρια και τους μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους εντερικών βακτηρίων, όπως

Ε. faecalis

να προκαλέσει βλάβη στο γαστρικό επιθηλιακά κύτταρα. Χρησιμοποιώντας αυτό το μοντέλο που εξέτασε την επίπτωση της

Ε. faecalis

μόλυνση του γαστρικού αδενοκαρκινώματος καλλιέργειες κυττάρων για την παραγωγή ROS, κυτταρική αναπνοή, την ανάπτυξη, βλάβες στο DNA /επισκευής και φλεγμονώδεις αντιδράσεις.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture,

Ε. faecalis

, και Προϋποθέσεις Ανάπτυξης

Ανθρώπινο ΜΚΝ74 καλλιέργειες αδενοκαρκίνωμα στομάχου κυττάρων από την ιαπωνική συλλογή της τράπεζας κυττάρων Έρευνας Bioresources (JCRB # JCRB0255) διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), όπως συμπληρώθηκε με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Invitrogen), 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και 100 U /ml πενικιλίνη (Invitrogen) στους 37 ° C, και

2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO. Μολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με

Ε. faecalis

στέλεχος (ATCC 29212). Τα βακτήρια αναπτύχθηκαν σε τρυβλία άγαρ αίματος 5% στους 37 ° C. Η οπτική πυκνότητα (OD) των βακτηρίων που καλλιεργούνται σε RPMI 1640 μετρήθηκε στα 550 nm σε UV-1601 φασματοφωτόμετρο (Shimadzu, Kyoto, Japan) (Σχήμα S1).

Ε. faecalis

λύμα παρασκευάστηκε με κατάψυξη /απόψυξη το βακτηριακό εναιώρημα τρεις φορές, ενώ κατεργασία με υπερήχους το εναιώρημα μεταξύ κάθε κύκλου.

Μόλυνση γαστρικά κύτταρα για RNA και DNA απομόνωση

Για 24 ώρες λοιμώξεις , 80% συρρέοντα κύτταρα ΜΚΝ74 πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν σε αντιβιοτικό μέσο ελεύθερο. Τη διάρκεια της νύχτας που καλλιεργούνται αποικίες

Ε. faecalis

προστέθηκαν στην κυτταρική καλλιέργεια ΜΚΝ74 σε πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 50 βακτήρια ανά κύτταρο. 5 μολύνσεις ημέρες διεξήχθησαν με κατεργασία 65% συρρέοντα κύτταρα ΜΚΝ74 με

E. faecalis

σε ΜΟΙ 10 ή με μία συγκέντρωση πρωτεΐνης υλικού λύσεως των 40 μg /μl. Κάθε 24 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και φρέσκο ​​μέσο και προστέθηκαν βακτήρια ή λύμα. Κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ομοίως με την απουσία των βακτηρίων ή βακτηριακής λύσης.

In vitro

μελέτες πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή για να δοκιμαστεί η βλαπτική επίδραση του

E. faecalis

για γαστρικά κύτταρα αδενοκαρκινώματος. Αυτά τα κύτταρα διαφέρουν από τα φυσιολογικά γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα εκτελώντας διάφορες χρωμοσωμικές ανωμαλίες, αλλά προσφέρουν το πλεονέκτημα ότι είναι ένα αναπαραγώγιμο σύστημα μοντέλο που με πολλούς τρόπους αναπαράγει τα γεγονότα που συμβαίνουν στο στομάχι. Συγκρίνοντας μολυσμένα κύτταρα σε μη μολυσμένα κύτταρα δίνει μια αξιόπιστη εικόνα της ζημίας και μεταβολές στην έκφραση γονιδίου που προκαλείται από τη μόλυνση.

RNA και DNA απομόνωση

Μετά τη μόλυνση, RNA και DNA εκχυλίστηκαν με την προσθήκη του Αντιδραστηρίου ΤπζοΙ (Invitrogen) σε κάθε φιάλη καλλιέργειας. RNA απομονώθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το περιέχει DNA ενδιάμεση φάση καταβυθίστηκε με την προσθήκη αιθανόλης 100%. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στους 4 ° C, 3500 g για 6 λεπτά. Το υπερκείμενο φαινόλη-αιθανόλη απομακρύνθηκε και το υπόλοιπο εκχύλιση του DNA έγινε με τη χρήση ενός κιτ ιστού NucleoSpin (Macherey-Nagel, Düren, Germany). Οι συγκεντρώσεις RNA και DNA μετρήθηκαν σε NanoDrop ND-1000 φασματοφωτόμετρο. αριθμοί ακεραιότητα του RNA μετρήθηκαν σε 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Καλιφόρνια) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Μέτρηση των ROS και υπεροξειδική

Δύο ημέρες πριν από τη μόλυνση 8 × 10

4 ΜΚΝ74 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας Lab-Tek

TM θαλάμη Coverglas (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts). κύτταρα ΜΚΝ74 βάφτηκαν για δύο ώρες πριν από τη μόλυνση με 2-plex μείγμα ανίχνευσης. χρώση ROS και δισμουτάση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το ROS /RNS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. κύτταρα ΜΚΝ74 μολύνθηκαν σε ΜΟΙ 50 για 30 λεπτά και αναλύθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο Zeiss συνεστιακού LSM 510 χρησιμοποιώντας το λογισμικό LSM 510 (Zeiss, Oberkochen, Germany). Μη μολυσμένα χρώση ΜΚΝ74 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι.

Εντοπισμός

E. faecalis

κατά τη διάρκεια της λοίμωξης

8 × 10

4 ΜΚΝ74 κύτταρα /και σπάρθηκαν σε ένα 8-θάλαμο γυάλινο πυθμένα ολίσθησης (Thermo Fisher Scientific) 24 ώρες πριν από τη βαφή. Προκειμένου να προσδιορίσει τον εντοπισμό των

Ε. faecalis

μετά τη μόλυνση εμείς χωριστά βάφονται την μεμβράνη πλάσματος με CellMask

TM Deep Red λεκές μεμβράνη πλάσματος (C10046, Invitrogen) και το τοίχωμα του βακτηριακού κυττάρου χρησιμοποιώντας BacLight

TM Πράσινη βακτηριακή κηλίδα (Β-35000, Molecular Probes, Invitrogen) σύμφωνα με τις δύο πρωτόκολλα, αντίστοιχα. Τα κύτταρα και τα βακτήρια πλύθηκαν 3 φορές σε PBS πριν από τη μόλυνση. Τα κύτταρα μολύνθηκαν σε ΜΟΙ 100 για 4 ώρες και αναλύθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο Zeiss συνεστιακού ΑΠΕ 510 χρησιμοποιώντας το λογισμικό LSM 510 (Zeiss). Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές και 8 Επιμελητήρια εξετάστηκαν κάθε φορά.

XF24 μικροπλάκας με βάση αναπνευσιομετρίας

αναπνευσιομετρία των κυττάρων ΜΚΝ74 πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα XF24 Εξωκυττάρια Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, Βόρεια Billerica, ΜΑ ). Τα μισά από τα επιμεταλλωμένα ΜΚΝ74 κύτταρα μολύνθηκαν με

E. faecalis

σε ΜΟΙ 50 για 4, 8 ή 24 ώρες, ενώ το άλλο μισό παρέμεινε μη μολυσμένα. Μετά την επώαση, τα βακτήρια απομακρύνθηκαν με τη χρήση 4% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (5 U /ml) και 4% cefotaxim (100 μg /ml) (ACS Dobfar Generics S.A., Λουξεμβούργο, Βέλγιο). Τα κύτταρα επωάστηκαν σε CO

2 δωρεάν επωαστήρα στους 37 ° C για 1 ώρα για να επιτραπεί θερμοκρασία και το ρΗ εξισορρόπησης. Η μικροπλάκα με κύτταρα στη συνέχεια φορτώθηκε στον XF24 και ο ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου του κάθε φρεάτιο μετρήθηκε σε μία περίοδο 100 λεπτών. Τα φάρμακα ολιγομυκίνη (0,5 μΜ), FCCP (0,3 μΜ) και αντιμυκίνη Α (2.0 μΜ) με τη σειρά τους σε κάθε εκβάθυνση. Περισσότερες λεπτομέρειες είναι διαθέσιμες σε S1 File.

μιτοχονδριακού DNA Αστάθεια

Η συχνότητα των μεταλλάξεων στην περιοχή D-βρόχο του μιτοχονδριακού DNA, προσδιορίστηκαν με ενίσχυση PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές C6-CA5 (Πίνακας S1 ). Τα ενισχυμένα θραύσματα κλωνοποιήθηκαν εντός του φορέα pCR2.1 (Invitrogen) και ένθετα από 328 αποικίες ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τους εκκινητές VectorD βρόχου (Πίνακας S1). Τα ενισχυμένα θραύσματα καθαρίστηκαν και αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας τον ΑΒΙ Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit και ΑΒΙ Prism 3730 ϋΝΑ Sequencer (Perkin-Elmer, Waltham, Massachusetts). Για τον προσδιορισμό μεταλλάξεων, οι ακολουθίες χρησιμοποιήθηκαν ως ερωτήματα κατά την αλληλουχία αναφοράς του Cambridge που λαμβάνεται από MitoMap (https://www.mitomap.org. Προσεγγισμένος Φεβρουάριο 9. 2012).

μικροσυστοιχιών και GSA

RNA με έναν αριθμό ακεραιότητα RNA από 8 ή παραπάνω από τρεις ελέγχου και τρία δείγματα μόλυνση (με βιώσιμο

E. faecalis

ή με

E. faecalis

λύματος 40 μg /μl) γιά 24 ώρες και 5 πειράματα ημέρα υποβλήθηκαν στην μικροσυστοιχιών Κέντρο RH στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Κοπεγχάγης. RNA ενισχύθηκε και επισημαίνονται με τη χρήση του «κιτ 3 IVT Express (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 250 ng ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε ως είσοδο. Τα επισημασμένα δείγματα υβριδίστηκαν με GeneChip Genome U133 συν 2 συστοιχίες (Affymetrix). Οι συστοιχίες πλύθηκαν και χρωματίστηκαν με phycoerytrin συζευγμένη στρεπταβιδίνη χρησιμοποιώντας Affymetrix ρευστονικής Station® 450, καθώς και οι συστοιχίες σαρώθηκαν σε ένα σαρωτή Affymetrix GeneArray® 2500 για να δημιουργήσει φθορίζουσες εικόνες, όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο Affymetrix GeneChip®. 24 πρώτες αρχεία ένταση κυττάρων (CEL-αρχεία) παρήχθησαν στην GeneChip® Command Console® Λογισμικού (AGCC) (Affymetrix). Οι πρώτες CEL αρχεία έγιναν διαθέσιμες στο κοινό σε ArrayExpress με αριθμό ένταξης E-Μπειραμ-3496. Προεπεξεργασία των μικροσυστοιχιών για το σύνολο του γονιδίου ανάλυση (GSA) έγινε με R /Bioconductor [26], [27]. προσαρμογή φόντο, ποσοστημόριο εξομάλυνση και η τελική περιληπτική παρουσίαση για να εξετάσει που εντάσεις έκφρασης έγινε με τον αλγόριθμο GCRMA [28], για κάθε πειραματική συνθήκη, ξεχωριστά (S2 File).

Ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής

cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix για qPCR (Invitrogen). Η γονιδιακή έκφραση αναλύθηκε με qRT-PCR χρησιμοποιώντας SYBR Greener Q-PCR SuperMix για ΑΒΙ PRISM (Invitrogen). Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν με χρήση του λογισμικού Primer-Blast από το NCBI [29]. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν σε ένα ΑΒΙ PRISM 7900HT Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (SDS) από την Applied Biosystems. Δεδομένα κανονικοποιήθηκε προς GAPDH έκφραση mRNA.

δοκιμασία ανάπτυξης

8.000 κύτταρα κατανεμήθηκαν σε κάθε φρεάτιο έξι 24-φρεατίων και επωάστηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 για δύο ημέρες πριν από τη θεραπεία. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε τετραπλούν ως εξής? 4 φρέατα μη μολυσμένα κύτταρα ελέγχου, 4 πηγάδια σε επεξεργασία με 400 μg /μl

E. faecalis

λύμα, 4 πηγάδια σε επεξεργασία με 40 μg /μΙ λύμα, 4 φρεάτια σε επεξεργασία με 4 μg /μl λύμα και 4 φρέατα κατεργάζεται με βιώσιμο

E. faecalis

σε ΜΟΙ 10. Μία πλάκα κυττάρων σταθεροποιείται κάθε μέρα. Η σταθεροποίηση έγινε με πλύση με PBS και στερέωσης με 1 ml 10% φορμαλίνη για 10 λεπτά. Σταθεροποιείται κύτταρα χρωματίστηκαν με 1 ml 0.1% κρυσταλλικό ιώδες (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri), και οι πλάκες ανακινήθηκαν για 30 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν, ξηράνθηκαν, και κρυσταλλικό ιώδες εκχυλίσθηκε με 500 μΙ 10% οξικού οξέος. Απορρόφηση μετρήθηκε στα 620 nm σε ένα PowerWave XS (BioTek Instruments, Winooski, Vermont).

Στατιστική Ανάλυση

Ενιαία ανάλυση ταξινόμηση της διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή διαφορές στη μέγιστη αναπνευστική ικανότητα , ΑΤΡ κύκλου εργασιών και oxphos-ανεξάρτητο κατανάλωση οξυγόνου. ANOVA είχε επιπλέον χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο των διαφορών στην ανάπτυξη των κυττάρων κατά τη διάρκεια διαφορετικές θεραπείες με

Ε. faecalis

. Όταν η ANOVA έδειξε σημαντικές διαφορές μεταξύ των θεραπειών, Tukeys ειλικρίνεια σημαντική μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο των διαφορών μεταξύ των ποσοστών κατανάλωση οξυγόνου ή του αριθμού των κυττάρων. συχνότητες μετάλλαξης mtDNA αξιολογήθηκαν από chi-square και ακριβή δοκιμασία του Fisher. αποτελέσματα ROS εκφράστηκαν ως μέσες τιμές τουλάχιστον είκοσι ανεξάρτητες μετρήσεις και αναλύθηκαν με unpaired δύο ουρών

t-τεστ

. Αποτελέσματα qRT-PCR εκφράστηκαν ως μέσες τιμές τουλάχιστον τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων μετρήθηκαν σε τρεις τεχνικές επαναλήψεις, και αναλύθηκαν με unpaired δύο ουρών

t-τεστ

. Οι διαφορές μεταξύ των συνόλων δεδομένων θεωρήθηκαν σημαντικές σε ρ τιμές ≤0.05. Οι μπάρες σφάλματος = ± SEM, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Ταυτοποίηση των οργανωμένων μονοπατιών έγινε με μια μέθοδο GSA, GAGE ​​[30], ενισχυμένη με την αξιοποίηση των διαθέσιμων πληροφοριών επαγωγής-καταστολή (για εκτενείς λεπτομέρειες και οι υπολογισμοί δείτε S2 αρχείου). Μονοπάτια εκπροσωπήθηκαν από τους καταλόγους των γονιδίων (γονίδιο σετ) κατεβάσει από το Μοριακής υπογραφές Database (MSigDB) 3.0 [31]. C2 συλλογή των οργανωμένων συνόλων γονιδίων (κανονικά μονοπάτια και τις υπογραφές γονιδιακή έκφραση των γενετικών και χημικών διαταραχές) χρησιμοποιώντας σύμβολα γονιδίου αναγνωριστικά. p-τιμές σετ Gene διορθώθηκαν για πολλαπλές δοκιμές από την εκτίμηση του ψευδή ρυθμό ανακάλυψης και το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο 1%.

Αποτελέσματα

Ε. faecalis

μόλυνση επάγει ενδοκυτταρική ROS και υπεροξειδίου παραγωγής

κ.λπ. και έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η achlorhydric γαστρίνης ΚΟ του ποντικιού είχαν βακτηριακή υπερανάπτυξη με

εντερόκοκκοι

που δεν είναι κανονικά μέρος των γαστρικών χλωρίδας [ ,,,0],20]. Αν και

Enterococci

γενικά πιστεύεται ότι είναι χαμηλής παθογένειας, υπέστη υπερανάπτυξη σε achlorhydric ποντίκια συνδέεται με μια φλεγμονώδη απόκριση και, τελικά, αυτοί οι ποντικοί αναπτύσσουν καρκίνο του στομάχου [20], [32]. Για να χαρακτηριστεί η παθολογική διεργασία εντός των γαστρικών κυττάρων εξετάσαμε πως τα βακτήρια που επηρεάζονται τα γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα. Χρησιμοποιώντας ανιχνευτές παρακολούθησης ενδοκυτταρική παραγωγή ROS, βρήκαμε ότι 30 λεπτά λοίμωξη διεγείρεται μια σημαντική αύξηση στην ενδοκυτταρική ROS σχηματισμό (Σχήμα 1Α). Με ανιχνευτές ειδικούς για την παραγωγή υπεροξειδίου δείξαμε ότι η ROS συνίστατο κυρίως υπεροξειδίου σε ΜΚΝ74 κύτταρα (Σχήμα 1Α). Η ένταση φθορισμού ποσοτικοποιήθηκε με χρήση του λογισμικού LSM 510 και μια στατιστικά σημαντική αύξηση στην ενδοκυτταρική ROS και υπεροξειδίου στα μολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με μη μολυσμένα κύτταρα ελέγχου παρατηρήθηκε (Σχήμα 1Β). Δεν βρήκαμε κανένα στοιχείο που πρότεινε εισβολή των κυττάρων από βακτήρια, έτσι καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η ενδοκυτταρική ROS παρήχθη από τα μολυσμένα κύτταρα και όχι από εσωτερικεύεται

Ε. faecalis

(Σχήμα 1 C-D).

ΜΚΝ74 κύτταρα μολυσμένα με

E. faecalis

για 30 λεπτά σε MOI50. (Α) Εκπρόσωπος φθορισμού μικροσκόπιο εικόνα των κυττάρων ΜΚΝ74 βάφονται με ROS ανίχνευση ανιχνευτές (πράσινο) και την ανίχνευση υπεροξειδίου ανιχνευτές (πορτοκαλί) Κλίμακα μπάρες = 50 μm. (Β) Ποσοτικοποίηση της έντασης φθορισμού χρησιμοποιώντας το λογισμικό LSM 510. παρατηρήθηκε στα μολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με μη μολυσμένα κύτταρα ελέγχου Μια στατιστικά σημαντική αυξημένη ενδοκυτταρική παραγωγή των ROS (ρ & lt?? 0,01) και υπεροξειδίου (0,02 ρ & lt). * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά. (C) φθορισμού εικόνα που δείχνει ΜΚΝ74 μεμβράνη πλάσματος (κόκκινο) και

Ε. faecalis

(πράσινο) μετά από 4 ώρες μόλυνσης. Συνοδευτικά εικόνες δείχνουν το επίπεδο YZ και XZ. Παρατηρήθηκε (D) Σπλιτ εικόνα του C. Δεν υπάρχουν ενδείξεις για βακτηριακή εισβολή των κυττάρων.

Η

Η μόλυνση μειώνεται δραστηριότητα των μιτοχονδρίων και αυξάνει oxphos-ανεξάρτητο κατανάλωση οξυγόνου

Η πηγή των ROS βρέθηκαν μετά από βακτηριακή μόλυνση θα μπορούσε είτε να παράγεται από εξωκυτταρικό βακτήρια [33] και /ή παράγονται από μέσα στα κύτταρα [34], [35]. Ενδοκυτταρική ROS μπορεί είτε να παραχθεί σε ένα oxphos-εξαρτώμενα ή ανεξάρτητο τρόπο. Για να εξετάσει και στη συνέχεια να χαρακτηρίζουν το δυνατόν ενδοκυτταρική παραγωγή ROS που σχετίζονται με

Ε. faecalis

λοίμωξη? μετρήσαμε πως η βακτηριακή μόλυνση που επηρεάζονται μιτοχονδριακή αναπνοή με τη μέτρηση ΑΤΡ του κύκλου εργασιών, αναπνευστική ικανότητα και oxphos ανεξάρτητη κατανάλωση οξυγόνου (Εικόνα 2). Για να εξασφαλισθεί ότι τα αποτελέσματα αντικατοπτρίζονται αναπνοή μόνο των κυττάρων ΜΚΝ74, όλα τα βακτήρια απομακρύνθηκαν πριν από τις μετρήσεις. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην ΑΤΡ κύκλο εργασιών των κυττάρων ελέγχου που καλλιεργούνται για 4-24 ώρες, ενώ ένα σημαντικό 2- και 4 φορές μείωση (ρ & lt? 0.001) του κύκλου εργασιών ΑΤΡ ήταν παρόντες μεταξύ των κυττάρων ελέγχου και τα μολυσμένα κύτταρα επωάζονται για 8 και 24 ώρες αντίστοιχα (Εικόνα 2Α). Μια αντίστοιχη συσχέτιση βρέθηκε στην αναπνευστική ικανότητα, όπου οι ικανότητες των μολυσμένων κυττάρων ήταν επίσης σημαντικά 2- και 4 φορές μειωμένη (ρ & lt? 0,01) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου μετά από 8 και 24 ώρες από την μόλυνση (Σχήμα 2Β). Η oxphos-ανεξάρτητο κατανάλωση οξυγόνου από τα κύτταρα ελέγχου ήταν αμετάβλητη για τα κύτταρα καλλιεργούνται για 4-24 ώρες. Σε αντίθεση ο oxphos ανεξάρτητη κατανάλωση οξυγόνου των κυττάρων που έχουν μολυνθεί με βακτηρίδια αυξήθηκε από -50% της συνολικής πρόσληψης οξυγόνου μετά από 4 ώρες από τη μόλυνση για να γίνει η κύρια Ανάκτησεις οξυγόνο (ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 2C). Αυτό υποδηλώνει ότι

Ε. faecalis

αλληλεπιδρούν με τα επιθηλιακά κύτταρα προκαλεί σχηματισμό ROS και την κατανάλωση οξυγόνου από άλλα συστήματα ενδοκυττάριο ένζυμο από οξειδωτική φωσφορυλίωση. Έκφραση των NOX1-5 και Duox1-2 εξετάστηκε στο γαστρικό κυτταρική γραμμή? Ωστόσο, η έκφραση δεν επηρεάζεται από τη μόλυνση (Πίνακας S2).

ΜΚΝ74 κύτταρα επωάστηκαν με ή χωρίς

E. faecalis

για 4, 8 ή 24 ώρες. Τα βακτήρια αφαιρέθηκαν και ο ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου μετρήθηκε σε μία XF24 Εξωκυτταρική Flux Analyzer. (Α) ΑΤΡ κύκλου εργασιών, (Β) της αναπνευστικής ικανότητας και oxphos-ανεξάρτητο κατανάλωση οξυγόνου (C) προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στο κείμενο. ▪ = κύτταρα ελέγχου, ο =

Ε. faecalis

μολυσμένα κύτταρα. (N = 3-6, γραμμές σφάλματος δείχνουν Τ.Α. ** και *** υποδηλώνει σημαντική διαφορά p & lt? 0,01 και p & lt? 0.001 αντίστοιχα)

Η

Ε.. faecalis

λοίμωξη που προκαλείται αστάθεια μιτοχονδριακό DNA

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η μόλυνση με παθογόνους

H. pylori

στελέχη επάγονται μεταλλάξεις στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα σε καλλιέργεια ανθρώπινων κυττάρων [36]. Δεδομένου ότι η μόλυνση με το

Ε. faecalis

αυξάνουν ενδοκυτταρική ROS εξετάσαμε αν προκαλείται επίσης γενωμική αστάθεια mtDNA. Η συνολική συχνότητα της περιοχής μιτοχονδριακής D-loop μεταλλακτικά γεγονότα ήταν σημαντικά υψηλότερη σε καλλιέργειες κυττάρων ΜΚΝ74 μολυνθεί με

E. faecalis

(45,5%) από ό, τι σε μη μολυσμένες καλλιέργειες κυττάρων ελέγχου (23,0%? ρ & lt? 0,01) (Σχήμα 3). Επιπλέον, τα μολυσμένα κύτταρα έδειξαν έναν μεγαλύτερο αριθμό μεταπτώσεων (36,4%) από ό, τι τα κύτταρα ελέγχου (21,8%? Ρ & lt? 0,05). Διαγραφές (0% έλεγχος /3,9% μολυσμένων), ενθέσεις (έλεγχος 1,1% /2,6% μολυσμένων) και μεταστροφές (0% έλεγχος /2,6% μολυσμένων), η τελευταία τυπικά θεωρηθεί ως συνέπεια του ROS, ανιχνεύθηκαν συχνότερα σε μολυσμένα κύτταρα. Έτσι μόλυνση με

Ε. faecalis

επάγει μεταλλάξεις στα γαστρικά κύτταρα (Σχήμα 3).

Μεταλλάξεις ανιχνεύονται στην περιοχή D-loop mtDNA μετά τη μόλυνση. κύτταρα ΜΚΝ74 μολύνθηκαν με

Ε. faecalis

σε ΜΟΙ 10 για 5 ημέρες. Μολυσμένες καλλιέργειες κυττάρων ΜΚΝ74 είχαν σημαντικά υψηλότερο αριθμό των συνολικών μεταλλάξεων και μεταλλάξεων μετάβαση από μη μολυσμένες κυτταρικές καλλιέργειες ελέγχου. * Υποδηλώνει σημαντικά διαφορετικό από μη επεξεργασμένα κύτταρα p & lt?. 0.05

Η

Η μόλυνση που προκαλείται μία NFκB κυριάρχησε φλεγμονώδη απόκριση και μια απάντηση ROS

Για να αποκτήσουν περαιτέρω βιολογική διορατικότητα στις κυτταρικές αποκρίσεις σε γαστρικά κύτταρα να

Ε. faecalis

λοίμωξη πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση μικροσυστοιχιών εξετάζει τις παγκόσμιες αλλαγές στην έκφραση γονιδίων σε κύτταρα μολυσμένα με βιώσιμο

Ε. faecalis

ή θεραπεία με

Ε. faecalis

λύμα. Αντί να εστιάζει στην έκφραση των απλών γονιδίων χρησιμοποιήσαμε GSA [30] για τον εντοπισμό οδών και των διαδικασιών που ενεργοποιείται ή αναστέλλεται από την μόλυνση. Εστιάζοντας σε σύνολα γονιδίων αντί των μεμονωμένων γονιδίων αυξάνει την ευρωστία, την ευαισθησία και βιολογική σημασία ακόμη και για μέτρια ρυθμίζονται σύνολα γονιδίων. Αυτό επιτυγχάνεται με την ενίσχυση του λόγου σήματος προς θόρυβο, καθιστώντας δυνατή την ερμηνεία μέτριες μεταβολές σε μεμονωμένα γονίδια [37]. Το GSA δοκιμάστηκε 2403 γονίδιο σύνολα και οδήγησε σε 484 ρυθμίζονται οδούς είναι στατιστικά σημαντική για είτε ζωντανά μολύνσεις και /ή ερεθίσματα λύμα (Εικόνα S2). Εστιάζοντας σε αυτά τα μονοπάτια στατιστικά σημαντική για τις ζωντανές λοιμώξεις, μερικές από τις σειρές γονιδίων που κρίνονται για να χαρακτηρίσει τον καλύτερο τρόπο την τρέχουσα μελέτη ήταν το χέρι κατανεμήθηκε σε τρεις ομάδες (σχήματα 4, 5 και 6 Α Α). Εξετάζοντας φλεγμονή και ROS,

Ε. faecalis

μόλυνση προκάλεσε σημαντική αυξητική ρύθμιση αρκετών οδών που εμπλέκονται στην ανοσολογικές αποκρίσεις, συμπεριλαμβανομένης της συστάδες των υποδοχέων χημειοκινών και γονίδια χημειοκίνης σηματοδότησης, τα γονίδια που εμπλέκονται στην G-πρωτεΐνη πρόσδεμα υποδοχέα πρόσδεσης, και ΝΡκΒ ενεργοποίηση γονιδίων (Σχήμα 4, άνω έξι σύνολα γονιδίων). Επιπλέον, δύο σετ γονιδίων περιλαμβάνει γονίδια που ανταποκρίνονται στις προ-φλεγμονώδεις οξειδωμένα φωσφολιπίδια ήταν έντονα πάνω ρυθμισμένα. Τα οξειδωμένα φωσφολιπίδια παράγονται από ROS και λειτουργία σε μια προ-φλεγμονώδη τρόπο [38], [39] (Εικόνα 4, γονίδιο που επτά και οκτώ). Στήριξη της παρουσίας των ROS, ένα σύνολο γονίδιο 30 γονίδια που είναι γνωστό ότι εκφράζεται σε απόκριση προς ROS ενεργοποιήθηκε (Εικόνα 4, κάτω σετ γονιδίων). Είναι γνωστό ότι ROS είναι σημαντικά για λιποπολυσακχαρίτη (LPS) καθοδηγούμενου παραγωγή πολλών προ-φλεγμονωδών κυτοκινών [40] Ωστόσο, gram-θετικά βακτηρίδια όπως

E. faecalis

δεν εκφράζουν LPS. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε πως η έκφραση των μεμονωμένων γονιδίων που κωδικοποιούν προ-φλεγμονωδών κυτοκινών και χημειοκινών πραγματοποιήθηκαν σε απόκριση σε ένα μη-διεγερμένα με LPS μόλυνση κατά τη διάρκεια 24 ωρών και 5 ημερών λοιμώξεις (Πίνακας 1). Πολυάριθμες γονίδια που εμπλέκονται στην φλεγμονώδη οδό ΝΡκΒ ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα κατά τη διάρκεια

E. faecalis

μόλυνση συμπεριλαμβανομένης της ιντερλευκίνης-1β (IL-1β), ιντερλευκίνη-1 υποδοχέα που συνδέεται κινάση 2 (IRAK2), VEGF, IL-8, IL-23α, IL-11, και Παράγοντα Νέκρωσης Ογκου-α (ΤΝΡ α) περισσότερα από τα οποία μπορεί να διαδοθεί περαιτέρω την απόκριση ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ [41] – [44]. Μεταξύ αυτών ήταν αρκετές κυτταροκίνες που είχαν διαπιστωθεί στο

H. pylori

μεσολάβηση λοιμώξεις, όπως η IL-8 και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), και τα δύο σχετίζονται με την αγγειογένεση και με προχωρημένο καρκίνο του στομάχου, η IL-1β η οποία είναι ένας ισχυρός αναστολέας της έκκρισης οξέος, καθώς επίσης και ΤΝΡ-α, α ρυθμιστής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης και της απόπτωσης [43] – [45]. Επιπλέον, η κυτοκίνη IL-23α το οποίο προωθεί συχνότητα εμφάνισης όγκου και την ανάπτυξη [46] και είναι ιδιαίτερα παράγεται σε

H. pylori

αποικίσει βλεννογόνο [47] ήταν ρυθμισμένη μαζί με, IL-11 το οποίο είναι ένα τοιχωματικών κυτοκίνη κύτταρο που εμποδίζει την έκκριση γαστρικού οξέος, προωθεί ατροφική γαστρίτιδα και γαστρικό ογκογένεση [48], [49]. Μεταξύ άλλων γονιδίων βρέθηκαν να εμφανίζουν υψηλή, και σημαντικά επίπεδα κατά εκφραστική μόλυνση ήταν IL-1α, IL-32, παράγοντα διαφοροποίησης αύξησης 15 (GDF15) και, χημειοκίνη (C-C μοτίβο) συνδέτη 22 (CCL22). Επιπλέον, ένα πάνω ρύθμιση της υπεροξειδικής δισμουτάσης 2 (SOD2), η οποία μετατρέπει το υπεροξείδιο σε υπεροξείδιο του υδρογόνου, παρατηρήθηκε. IL-8, ρυθμιστικό παράγοντα ιντερφερόνης 1 (IRF-1) και TNFa επικυρώθηκαν από qRT-PCR (Σχήμα 4 Β).

(α) ένα τμήμα του αποτελέσματος GSA. Από το τμήμα του γονιδίου συνόλων σημαντικά εμπλουτισμένο σε ΜΚΝ74 κύτταρα μολυσμένα για 24 ώρες, ένα υποσύνολο των γονιδίων συνόλων με το χέρι που επιλέγεται από την ένωση με φλεγμονώδη απόκριση και η απόκριση στη ROS. Οι αριθμοί στις παρενθέσεις δείχνουν σκληρά αποτελεσματική αριθμό γονιδίων στο σύνολο γονίδιο. Ο τίτλος του κάθε σετ γονιδίων αντιστοιχεί στον τίτλο δίνεται στην ιστοσελίδα MSigDB. Οι αριθμοί σε χρωματιστά κουτιά προσαρμόζονται p-τιμές (τιμές Q), μαύρο υποδεικνύουν στατιστική σημαντικότητα σε επίπεδο 1% Fdr. (Β) Χαρακτηρισμός με qRT-PCR μεταγράφων που κωδικοποιούν σημαντικά κυτοκινών και χημειοκινών μετά

E. faecalis

μόλυνση για 24 ώρες (MOI50) και 5 ημέρες (MOI10). * Υποδηλώνει σημαντικά διαφορετικό από μη επεξεργασμένα κύτταρα p & lt?. 0.05

Η

(Α) Ένα τμήμα του αποτελέσματος GSA μετά από 24 ώρες από τη μόλυνση. σετ Gene που σχετίζονται με την επισκευή βλάβης του DNA με το ίδιο εγκατάστασης ως το σχήμα 4 Α (Β) Χαρακτηρισμός των μεταγραφών που κωδικοποιούν για σημαντικά γονίδια που εμπλέκονται στην MMR μετά

E. faecalis

μόλυνση για 24 ώρες (MOI50) και 5 ημέρες (MOI10). * Υποδηλώνει σημαντικά διαφορετικό από μη επεξεργασμένα κύτταρα p & lt?. 0.05

Η

DNA αποκατάστασης των ζημιών έχουν απενεργοποιηθεί κατά τη διάρκεια

Ε. faecalis

μόλυνση

Η ανάλυση μονοπατιού έδειξε ότι η έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση της βλάβης του DNA ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω σε σύγκριση με καλλιέργειες μη μολυσμένο κύτταρο μετά από 24 ώρες από την μόλυνση (Σχήμα 5Α). qRT-PCR επιβεβαίωσε ότι η έκφραση των γονιδίων αρκετών επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων (MMR) έχουν ρυθμισμένα προς τα κάτω μετά από δύο ώρες και 24 5 ημέρες

E. faecalis

μόλυνση (Σχήμα 5, Β). Σε 24 ώρες τα μολυσμένα κύτταρα PMS1 και MSH6 ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται (4 φορές και 1,8 φορές αντίστοιχα? P & lt? 0.001). Ένα σημαντικό ρύθμιση προς τα κάτω του MSH2 (3 φορές), MSH3 (1,9 φορές), MSH6 (2 φορές), και PMS1 (3 φορές) (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 5, Β) παρατηρήθηκε σε κύτταρα 5 ημέρες μετά την μόλυνση. Οι εκφραστικές πολλαπλών μεταβολών των επιλεγμένων γονιδίων επιδιόρθωσης βλαβών του DNA μετά από λοίμωξη φαίνεται στον Πίνακα S3. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι

Ε. faecalis

μόλυνση ρυθμίζει προς τα κάτω μεγάλα μονοπάτια επιδιόρθωσης του DNA με αποτέλεσμα τη γενετική αστάθεια παρόμοια με λοιμώξεις με

H. pylori

[36], [50], [51].

Μόλυνση από

Ε. faecalis

αναστέλλει έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και την ανάπτυξη των κυττάρων ΜΚΝ74

Για να αξιολογήσει τις αλλαγές στην ανάπτυξη των κυττάρων που προκαλείται από

Ε. faecalis

λοίμωξη, διερευνήσαμε την επίδραση των βακτηρίων επί της έκφρασης των γονιδίων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και στην κυτταρική ανάπτυξη ΜΚΝ74. σετ Gene περιλαμβάνει έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και του σημείου ελέγχου γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω μετά από 24 ώρες από την μόλυνση με βιώσιμων βακτηρίων που υποδηλώνει μια σημαντική επιβράδυνση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά επίσης ένα αυξημένο κίνδυνο μεταλλάξεις σε νέα κύτταρα (Σχήμα 6 Α). Αντίθετα, αυτές οι οδοί πάνω ρυθμισμένα σε κύτταρα μολυσμένα με βακτηριακή λύμα που υποδηλώνει ότι αυτά τα κύτταρα ήταν ακόμη διαίρεση μετά από 24 ώρες (Σχήμα 6 Α). Εμείς επόμενη μετρούμενη τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων για 5 ημέρες και διαπίστωσαν ότι βιώσιμων βακτηρίων που προκαλείται πολλαπλασιασμός ΜΚΝ74 κύτταρο για να επιβραδύνει ή να σταματήσει τελείως (Σχήμα 6 Β).