Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι από τις πιο θανατηφόρες κακοήθειες με υψηλή μετάσταση και ποσοστό υποτροπής, η οποία είναι πιθανόν να οφείλεται στην ύπαρξη του καρκίνου του πνεύμονα βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ). ΚΕΠ σε πολλούς όγκους, συμπεριλαμβανομένων του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) έχουν ταυτοποιηθεί χρησιμοποιώντας προσκόλληση μοριακού CD44, είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό με άλλα δείκτη (ες). Τα microRNAs (miRNAs) ρυθμίζουν τόσο φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα και ΚΕΠ και απορύθμιση των miRNAs έχει ενοχοποιηθεί στην ογκογένεση. Πρόσφατα, miR-34a βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε κύτταρα NSCLC, αλλά οι βιολογικές λειτουργίες του miR-34a στη ρύθμιση κυτταρική συμπεριφορά NSCLC δεν έχουν μελετηθεί εκτενώς. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η επιμόλυνση των συνθετικών miR-34a, αλλά όχι στον αρνητικό μάρτυρα (NC) miRNA ολιγονουκλεοτίδια (oligos) σε τρεις κυτταρικές γραμμές NSCLC, δηλαδή, Α549, Η460, και Η1299, ανέστειλε το σχηματισμό τους holoclone, κλωνογονική επέκταση, και αναγέννηση του όγκου in vivo. Επιπλέον, το φορέα λεντοϊού μεσολάβηση υπερέκφραση του miR-34a σε καθαρισμένο CD44

hi Η460 κυττάρων επίσης ανέστειλε την ανάπτυξη όγκων. Σε αντίθεση, η έκφραση του antagomirs miR-34a (δηλαδή, ολιγονουκλεοτίδια) στην CD44

lo Η460 κύτταρα προωθούνται ανάπτυξη του όγκου. Η μελέτη μας δείχνει ότι miR-34a είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής των ογκογόνων ιδιοτήτων των κυττάρων NSCLC και CD44

hi πνεύμονα ΚΕΠ, και καθιερώνει μια ισχυρή λογική για την ανάπτυξη miR-34a ως νέο θεραπευτικό μέσο κατά της NSCLC.

Παράθεση: Shi Υ, Liu C, Liu Χ, Τανγκ ΓΔ, Wang J (2014) η microRNA miR-34a Αναστέλλει μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), την ανάπτυξη και το CD44

hi κύτταρα Stem-Like NSCLC. PLoS ONE 9 (3): e90022. doi: 10.1371 /journal.pone.0090022

Επιμέλεια: Gokul Μ Das, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29, Νοέμ του 2013? Αποδεκτές: 24η Ιανουαρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 4 του Μάρτη, 2014

Copyright: © 2014 Shi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Νο 81141096 και Grant Νο 81372512) και το Κλειδί Ταμείο έργου της Σαγκάης Επιστήμης και Τεχνολογίας σύνδεσης, Κίνα (Grant Νο 05119554) για να J. Wang, και ΝΙΗ (R01- CA155693), Υπουργείο άμυνας (PC120817), CPRIT (RP120380), και η MDACC Κέντρο για τον Καρκίνο Επιγενετική και RNA Κέντρο-Laura & amp? Κοινωφελές Ίδρυμα Ιωάννη Arnold χορηγεί στη ΓΔ. Ισχυρή γεύση. Γ Liu υποστηρίχθηκε, εν μέρει, από DOD μετα-διδακτορική υποτροφία (PC121553). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος βλαστικά κύτταρα (CSC), δηλαδή, τα καρκινικά κύτταρα με ορισμένες ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων, έχουν αναφερθεί σε πολλούς ανθρώπινους όγκους και πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για την έναρξη του όγκου, αντοχής στη θεραπεία, την εξέλιξη, η υποτροπή και μετάσταση [ ,,,0],1] – [3]. Τα microRNAs (miRNAs), μικρά RNAs μη κωδικεύουσα, ρυθμίζουν περίπου 20% -30% των γονιδίων στο ανθρώπινο γονιδίωμα, και έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης, της μετανάστευσης, και την απόπτωση μέσω αναστολής της μετάφρασης πρωτεΐνης ή /και την επαγωγή αποικοδόμησης messenger με σύνδεση προς τις συμπληρωματικές αλληλουχίες του 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR) σε mRNAs στόχο τους [4], [5]. miRNAs μπορούν να λειτουργήσουν τόσο ως ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια [6], [7], και έχουν αναδειχθεί ως σημαντικοί ρυθμιστές των ΚΕΠ, καθώς και.

Η microRNA-34α (miR-34a) λειτουργεί ως καταστολέας των όγκων [ ,,,0],8] και ρυθμίζεται μειωτικά σε ορισμένες ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού [9], του καρκίνου του προστάτη [10], οστεοσάρκωμα [11], και του καρκίνου του πνεύμονα [12], [13]. Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο θανατηφόρα κακοήθεια σε όλο τον κόσμο. Οι εργασίες κατά τα τελευταία αρκετά χρόνια δείχνει ότι και οι δύο μικρές-κυττάρων (SCLC) και μη-μικρών κυττάρων (NSCLC) καρκίνων του πνεύμονα περιέχουν ΚΕΠ [14], [15]. Όπως και στις περισσότερες άλλες όγκους, έχουν δυναμικό ΚΕΠ πνεύμονα έχουν εμπλουτιστεί και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας λειτουργικούς προσδιορισμούς [16] – [18], καθώς και δείκτες κυτταρικής επιφάνειας όπως CD133, CD34, CD90, και CD44 [3]. CD44 είναι μία γλυκοπρωτεΐνη δεσμευμένη σε μεμβράνη, που μεσολαβεί ένα σύμπλεγμα φάσμα λειτουργιών. Μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι ο CD44

+ κύτταρα είναι εμπλουτισμένα για χωρητικότητα όγκου-πολλαπλασιαστικό και ότι CD44 είναι ένας πιθανός δείκτης CSC σε NSCLC [19]. Liu

κ.ά.

έχουν δείξει ότι miR-34a μπορούν να αναστείλουν ΚΕΠ του προστάτη και τη μετάσταση με άμεση καταστολή CD44 [20]. Προσδιορισμός των CD44 ως άμεση και λειτουργικά σχετικό στόχο miR-34a αποκαλύπτει μια προηγουμένως παραγνωρισμένη σηματοδοτικό μονοπάτι [20].

Αν και υπάρχουν ενδείξεις ότι miR-34a είναι μειωμένη σε NSCLC, τις βιολογικές λειτουργίες αυτού του miRNA σε NSCLC παραμένουν γλισχρώς διερευνηθεί. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιώντας μια ποικιλία βιολογικών δοκιμασιών σε συνδυασμό με την εκτεταμένη πειράματα ξενομοσχεύματος όγκου, αναφέρουμε ότι miR-34a ρυθμίζει αρνητικά τα CSC που σχετίζονται με τις ιδιότητες, καθώς και την ικανότητα του όγκου έναρξη των τριών NSCLC κυττάρων.

Υλικά και μέθοδοι

Ζώα και ζωικά πειράματα

ανοσοποιητικού ανεπάρκεια NOD-SCID (μη-παχύσαρκους διαβητικούς σοβαρή συνδυασμένη ανοσολογική ανεπάρκεια) ποντίκια που παράγεται κυρίως από τη δική μας αποικίες αναπαραγωγής και διατηρούνται σε πρότυπες συνθήκες, σύμφωνα με το θεσμικές κατευθύνσεις. Όλες οι μελέτες που αφορούν τα ζώα σε αυτό το έργο έχει εγκριθεί από την M.D. Anderson Cancer Center IACUC (Θεσμικές φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση? ACUF # 08-05-08132). Η τρέχουσα έρευνα δεν περιλαμβάνει ανθρώπινα υποκείμενα (δηλαδή, ζουν άτομα ή αναγνωρίσιμες προσωπικές πληροφορίες). Όλες οι άλλες μελέτες που παρουσιάζονται εδώ ήταν ο ερευνητής-ξεκίνησε και δεν απαιτούν έγκριση από άλλους ρυθμιστικούς φορείς.

Cells και βασικές πειραματικές διαδικασίες

Οι τρεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC (Α549, Η460 και Η1299 ) ελήφθησαν από την ATCC. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο που συνιστάται από ATCC συμπληρωμένο με 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? Invitrogen-Life Technologies). Τα κύτταρα επωάστηκαν σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C τροφοδοτείται με 5% CO

2. Τα κύτταρα συνήθως διατηρούνται σε 75 cm

2 φιάλες καλλιέργειας ιστού (Corning Incorporated, USA) και συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας 0.05% θρυψίνη. Οι πιο βασικές πειραματικές διαδικασίες που έχουν περιγραφεί σε προηγούμενες δημοσιεύσεις μας [20], [21].

Η παροδική επιμόλυνση με συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια (oligos)

επιμολυσμένα χύμα κύτταρα ή το καθαρισμένο CD44

+ κύτταρα NSCLC με 33 nM του miR-34a ή μη στόχευση αρνητικός έλεγχος miRNA (miR-NC) ολίγο (Ambion, Austin, TX) με χρήση Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Εναλλακτικά, μπορούμε επιμολυσμένα τα καθαρισμένα CD44

– NSCLC κύτταρα με 33 nM αντι-miR-34a (αντι-34α) ή (αντι-NC) ολίγο-miR-NC αντι (Ambion). Εμείς γενικά συγκομίζονται τα επιμολυσμένα κύτταρα για in vitro ή in vivo μελέτες μετά από καλλιέργεια για 48 ώρες.

λεντοϊών μεσολάβηση υπερέκφραση του miR-34a

Ένας φορέας λεντοϊού που κωδικοποιεί προ-miR-34a (Lenti -34a) και ο φορέας ελέγχου (lenti-CTL) ελήφθησαν από Systems Biosciences (SBI) [20]. Lentivirus παρήχθη σε 293FT κύτταρα συσκευασίας και οι τίτλοι που καθορίζεται για GFP χρησιμοποιώντας κύτταρα ΗΤ1080. κύτταρα NSCLC μολύνθηκαν σε ΜΟΙ 25 παρουσία 8 μg /mL πολυβρένιο και συλλέχθηκαν 48-72 ώρες μετά τη μόλυνση.

Ποσοτική RT-PCR

επίπεδα Ώριμη miRNA και CD44 mRNA ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας TaqMan microRNA δοκιμασίες (Applied Biosystems) [20]. Εν συντομία, ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το mirVANA PARIS miRNA κιτ απομόνωσης (Ambion). Ποσοτικά στοιχεία έκφρασης των miRNAs ομαλοποιήθηκαν με εσωτερική miRNAs «καθαριότητας», δηλαδή, miR-24 και miR-103. Ποσοτικά στοιχεία έκφρασης mRNA ομαλοποιήθηκαν με εσωτερική «καθαριότητας» mRNA, δηλαδή, GAPDH. Διαφορές μεταξύ του θετικού και αρνητικού αντίστοιχο του πληθυσμού, δηλαδή, οι τιμές ddCt, για καθένα από τα miRNAs ή mRNAs μετατράπηκαν σε ποσοστό έκφρασης χρησιμοποιώντας τον τύπο 2

-ddCt [20].

Κλωνικές και κλωνογενείς δοκιμασίες

Για δοκιμασίες holoclone [22], μπορούμε επιστρώθηκαν κύτταρα NSCLC σε κλωνική πυκνότητα (δηλαδή, 50 κύτταρα /φρεάτιο) σε ένα 6-φρεατίων πιάτο, μετρήθηκαν ο αριθμός των holoclones αρκετές ημέρες αργότερα, και παρουσίασε το ποσοστό του κύτταρα που καθιέρωσε ένα holoclone ως αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης. Για κλωνογόνο προσδιορισμούς [20], πρώτον, αναμιγνύεται μεθυλοκυτταρίνη (MC) με ελεύθερο ορού μέσο συμπληρωμένο με 5 μg ml-1 ινσουλίνη, 20 ng ml-1 EGF και 10 ng ml-1 bFGF (Sigma). Στη συνέχεια επιστρώθηκαν κύτταρα γενικά σε 1000 κύτταρα /φρεάτιο σε μίγμα MC σε αναλογία 1:10 σε 24 φρεατίων εξαιρετικά χαμηλής προσκόλλησης (ULA) πλάκες και απαριθμήθηκαν οι αποικίες 2-3 εβδομάδες μετά την επίστρωση. Για όλα τα παραπάνω πειράματα, θα τρέχει ένα ελάχιστο φρεατίων εις τριπλούν για κάθε κατάσταση και επανέλαβε τα πειράματα, όποτε είναι εφικτό.

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS)

Η έκφραση των δεικτών CSC αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν ζωντανά στο διάλυμα χρώσης που περιέχει BSA και FITC-συζευγμένο μονοκλωνικό αντι-CD44 (κλώνος # G44-26? BD Bioscience) ή ΡΕ-συζευγμένο μονοκλωνικό αντι-CD133 (κλώνος # AC133? Miltenyi Biotech) στην συγκέντρωση που συνιστά ο κατασκευαστές. Αντίστοιχες ισότυπο ανοσοσφαιρίνες ποντικού χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι (BD Bioscience). Τουλάχιστον 10.000 κύτταρα αναλύθηκαν. Για ταξινόμηση των κυττάρων, επισήμανση των δεικτών επιφανείας κυττάρου διεξήχθη υπό συνθήκες αποστείρωσης και τα κύτταρα ταξινομούνται κατά BD FACSVantage διαλογέα κυττάρων (BD Bioscience). Το top 10% πιο λαμπρά χρωματισμένο, και το κάτω μέρος 10% πιο αμυδρά χρωματισμένα κύτταρα επιλέχθηκαν ως τα θετικά και τα αρνητικά τους πληθυσμούς, αντιστοίχως. Διαλογή καθαρότητα πάνω από 90% διασφαλίστηκε για περαιτέρω in vitro και in vivo πειράματα. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν από το λογισμικό FlowJo (έκδοση 7.6.1).

Aldefluor δοκιμασία

Η Δοκιμασία Aldefluor Kit (Aldagen, Inc. Durham, NC) χρησιμοποιήθηκε στο προφίλ της αφυδρογονάσης αλδεΰδης ( ΑΙ_ϋΗ) δραστηριότητα σε κύτταρα NSCLC [23]. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε ρυθμιστικό δοκιμασίας που περιέχει την Aldefluor ALDH υπόστρωμα πρωτεΐνη ΒΟϋΙΡΥ-αμινοακεταλδεΰδης (ΒΑΑΑ) για 40 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα που θα μπορούσαν να καταλύουν ΒΑΑΑ σε φθορίζον προϊόν ΒΟϋΙΡΥ-αμινοξικού του (ΒΑΑ) θεωρήθηκαν ΑΙ_ϋΗ

+. Διαλογή πύλες για FACS καταρτίστηκαν σε σχέση με την αρχική τιμή του φθορισμού των κυττάρων », η οποία προσδιορίσθηκε με την προσθήκη του ειδικού αναστολέα ΑΙ_ϋΗ diethylaminobenzaldehyde (ϋΕΑΒ) κατά τη διάρκεια της επώασης και ϋΕΑΒ επεξεργασμένα δείγματα χρησίμευσαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Μη-βιώσιμα κύτταρα εντοπίστηκαν από ιωδιούχου προπιδίου (PI) θετικότητα. Τα κύτταρα ταξινομούνται κατά BD FACSVantage ταξινομητή κυττάρων.

πειράματα μεταμόσχευση του όγκου

Τα κύτταρα εγχύθηκαν σε 60 μΐ μίγματος medium:Matrigel (1:01) υποδορίως (sc) σε ποντίκια NOD /SCID ( 6-8 εβδομάδων). Εμείς επιμολυσμένα χύμα Η460, Α549, ή Η1299 κυττάρων με miR-34a ή ολίγο miR-NC (33 nM). 48 ώρες αργότερα, τρεις διαφορετικές δόσεις κυττάρων σε 500.000, 50.000, ή 5.000 εμφυτεύθηκαν. Για Η460 κύτταρα, επιπλέον 2 εκατομμύρια κύτταρα το καθένα (n = 7) εμφυτεύθηκαν. Εκτός από την επιμόλυνση ολίγο, μολύναμε επίσης κάποια κύτταρα με lenti-34α ή lenti-CTL φορείς (ΜΟΙ 25) [20], και, 48 ώρες αργότερα, τρεις δόσεις των κυττάρων σε 500.000, 50.000, 5.000 εμφυτεύθηκαν. Τέλος, επιμολυσμένα καθαρισμένο CD44

lo Η460 κύτταρα με αντι-34 ή ολίγο αντι-NC (33 nM) και επίσης μολυνθεί καθαρίζεται CD44

hi Η460 κυττάρων με lenti-34α ή lenti-CTL φορείς (ΜΟΙ 25). 48 ώρες αργότερα, τα κύτταρα σε διαφορετικές δόσεις εμφυτεύθηκαν. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε σε εβδομαδιαία βάση και τα μεμονωμένα μεγέθη όγκων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ψηφιακό παχύμετρο και προσεγγίζονται σύμφωνα με τον τύπο V = 1 /2ab

2 (μια που είναι η μεγάλη διάμετρο και β βραχυπρόθεσμα διάμετρος του όγκου). Στο τέλος των πειραμάτων, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι όγκοι συλλέχθηκαν, μετρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν.

Στατιστική ανάλυση

Χρησιμοποιήσαμε unpaired two-tailed του Student

t-test για

συγκρίνουν τις διαφορές σε αριθμό κυττάρων, την αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης, τα βάρη των όγκων, και άλλων σχετικών παραμέτρων. Εμείς που απασχολούνται Chi-square τεστ για να συγκρίνουν επίπτωση και λανθάνουσα κατάσταση. Χρησιμοποιήσαμε ANOVA (F-test) να συγκρίνει τις διαφορές σε πολλαπλές ομάδες. Σε όλες αυτές τις αναλύσεις, η

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα και Συζήτηση

miR-34a αναστέλλει NSCLC σχηματισμό των κυττάρων holoclone και κλωνογονικού

ικανότητα.

miR-34a έχει δειχθεί ότι διαθέτει λειτουργίες όγκο κατασταλτικός [8], [20], [21], [24] – [33] και να είναι υπό-εκφράζεται σε μερικούς όγκους, καθώς και ορισμένες ογκογόνο υποπληθυσμούς [ ,,,0],10], όπως CD44

+ ΚΕΠ του προστάτη [20]. miR-34a είναι ένας άμεσος στόχος p53 [32] και υποστηρικτής του είναι σιγήσει σε ορισμένα καρκινικά κύτταρα [30]. Υπήρξε κάποια πειραματική απόδειξη ότι miR-34a ρυθμίζεται προς τα κάτω σε κύτταρα NSCLC [12], [13]. Για να διευκρινιστεί η πιθανή βιολογική συνέπεια της απώλειας της έκφρασης σε κύτταρα miR34a NSCLC, επιμολύναμε πρώτα τρία NSCLC κύτταρα, Α549 (ρ53 άγριου τύπου), Η460 (ρ53 άγριου τύπου), και Η1299 (ρ53 μεταλλαγμένη), με συνθετικά ώριμη ΜΙΚ 34α ή oligos miR-NC (33 ηΜ) [20] για 48 ώρες, και μετά καλλιεργήθηκαν τα κύτταρα εις τριπλούν σε κλωνική πυκνότητα (δηλαδή, 50 κύτταρα /φρεάτιο) σε πλάκες 6 φρεατίων. Στη συνέχεια αξιολογήθηκε το σχηματισμό holoclones, τα οποία έχουν δειχθεί ότι φιλοξενούν αυτο-ανανέωση ΚΕΠ που μπορεί μακροχρόνια διαδίδονται όγκους [22], 12 ημέρες (δ) μετά την επίστρωση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 (Α-Γ), miR-34a υπερέκφραση ανέστειλε σημαντικά εγκατάσταση holoclone σε τρία μοντέλα NSCLC. Της σημασίας, αν και miR-NC επιμολυσμένα κύτταρα NSCLC σχηματίζονται μεγάλα και πυκνά holoclones, οι miR-34a κύτταρα επιμολυσμένα NSCLC ιδρύθηκε πολύ μικρότερα ή /και χαλαρά paraclones (βλέπε Εικόνα 1Β για παραδείγματα). Ακολούθως, εκτελέσαμε πιο αυστηρές, ανεξάρτητη από προσκόλληση, κλωνογενείς δοκιμασίες σε μεθυλκυτταρίνη (MC), τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη μέτρηση της κυτταρικής αυτόνομη δραστηριότητα των δυνητικών ΚΕΠ [3]. Όπως και στην κλωνική προσδιορισμούς, miR-34a υπερέκφραση ανέστειλε σημαντικά την ικανότητα σχηματισμού σφαίρας χύμα Α549, Η460 και Η1299 κύτταρα (Σχήμα 1 D-E).

(Α-Ο) Κλωνικές δοκιμασίες. Κύτταρα μετεμβολιασμένα με miR-34a ή ολίγο miR-NC (33 ηΜ) απλώθηκαν εις τριπλούν σε 50 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 6 φρεατίων. Το πείραμα τερματίστηκε σε 12 d και τα πηγάδια ήταν Giemsa χρώση (Α). Φαίνεται στο Β είναι αντιπροσωπευτικές εικόνες. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται σε Α και Β ήταν αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) Η ποσοτική παρουσίαση των αποτελεσμάτων στο Α ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± S.D. (D-Ε) Δοκιμασίες κλωνογονικότητας σε MC. Συνολικά 1000 κύτταρα ανά πηγάδι στρώθηκαν για κλωνογονική δοκιμασία. Φωτογραφίες τραβήχτηκαν στο δ 15 μετά την επίστρωση και φαίνεται στο D είναι αντιπροσωπευτικά πεδία. (E) Ποσοτική παρουσίαση των αποτελεσμάτων στο Δ ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± Τ.Α.

Η

Τα παραπάνω πειραματικά αποτελέσματα παρέχουν ενδείξεις ότι η αποκατάσταση της έκφρασης miR-34a στα κύτταρα NSCLC αναστέλλει τόσο κλωνική και κλωνογονικού ιδιότητες. Καθώς τα 3 κύτταρα NSCLC έχουν διαφορετικά κατάσταση ρ53, τα αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι τα ανασταλτικά αποτελέσματα του miR-34a είναι ρ53-ανεξάρτητη. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα oligos miR-34a έδειξαν δραματικά αυξημένα επίπεδα miR-34a όπως αξιολογείται με qPCR ανάλυση του ώριμου miR-34a (Σχήμα 2Α). Είναι ενδιαφέρον, όμως, οι 3 τύποι κυττάρων NSCLC εμφανίζεται μια ευρεία διακύμανση των αυξημένων επιπέδων miR-34a, με Η1299 κύτταρα διατηρούν την υψηλότερη ποσότητα εξωγενούς miR-34a 48 ώρες μετά την επιμόλυνση (Σχήμα 2Α). Όπως συζητήθηκε νωρίτερα, miR-34a είναι μία άμεση μεταγραφική στόχος της ρ53 [32] και Η1299 κύτταρα έχουν μεταλλαγμένο ρ53. Μια πιθανότητα είναι ότι τα επίπεδα τόσο ρ53 και miR-34a σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα θα πρέπει να ελέγχονται πολύ στενά. Κατά συνέπεια, σε Α549 και Η460 κύτταρα που έχουν άγριου-τύπου ρ53, ακόμη και εξωγενώς εισήχθη p53 καθίσταται υποβαθμισμένη γρήγορα ενώ σε κύτταρα Η1299 ρ53-μεταλλαγμένο, τα επιμολυσμένα oligos ώριμη miR-34a επιβιώσει πολύ περισσότερο (Σχήμα 2Α).

(Α) κύτταρα NSCLC προσφάτως επιμολυσμένα με oligos miR-34a έδειξαν επίπεδα miR-34a αρκετές τάξεις μεγέθους υψηλότερες από εκείνες που επιμολύνθηκαν με miR-NC ολίγο. Τα αναφερόμενα κύτταρα NSCLC επιμολύνθηκαν με miR-34a ή miR-NC ολίγο, και 48 ώρες αργότερα, συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα όγκου (παρακάτω), ενώ ένας μικρός αριθμός κυττάρων τέθηκαν κατά μέρος και χρησιμοποιούνται σε μέτρηση qRT-PCR του ΜΙΚ επίπεδα 34α mRNA. Παρουσιάζονται οι μέσες επίπεδα miR-34a (σε λογαριθμική κλίμακα? Η = 2) σε miR-34a επιμολυσμένων κυττάρων σε σχέση με εκείνα των miR-NC επιμολυσμένα κύτταρα (πραγματικές μέσες τιμές που υποδεικνύονται στις μπάρες). (Β-Δ) miR-34a ολίγο επιμόλυνση ανάπτυξη του όγκου αναστέλλεται Α549. Που αναφέρονται είναι συχνότητα εμφάνισης όγκου (ανέπτυξαν όγκους /αριθμό των ενέσεων?%), Το χρόνο συγκομιδής (συμπεριλαμβανομένων πραγματική ένεση και τερματισμού ημερομηνίες), μέσο βάρος όγκου (σε γραμμάρια), καθώς και οι

P τιμές

για τα βάρη των όγκων. Ακαθάριστο εικόνες όγκου δεν είναι στην ίδια κλίμακα. (Ε-G) miR-34a επιμόλυνση ολιγο ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου Η460. (H-L) miR-34a ολίγο επιμόλυνση ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου Η1299.

Η

Απόδειξη ότι miR-34a υπερέκφραση αναστέλλει επίσης την ανάπτυξη των όγκων

Στη συνέχεια αξιολογήθηκαν τα πιθανά όγκου-ανασταλτικές επιδράσεις της miR-34a επί των τριών NSCLC τύπους κυττάρων in vivo (Σχήμα 2). Εμείς επιμολυσμένα 33 ηΜ miR-34a ή ολίγο miR-NC σε κύτταρα Α549 για 48 ώρες και στη συνέχεια εμφυτεύονται 50.000 (50 κ) κύτταρα υποδορίως (s.c) σε ανοσο-ανεπαρκή NOD /SCID ποντίκια. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β-D, miR 34a-επιμολυσμένα κύτταρα ανέπτυξαν όγκους που ήταν μόνο το ήμισυ περίπου τα μεγέθη των όγκων miR-NC και η πρώην μεγάλωσε επίσης πιο αργή. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η διαφορά στο βάρος όγκου δεν ήταν στατιστικά σημαντική λόγω των σχετικά μικρών μεγεθών δείγματος. Ομοίως, miR-34a κύτταρα που υπερεκφράζουν Η460 αναπτύχθηκε πολύ μικρότερα και πιο αργά αναπτυσσόμενη όγκους σε σύγκριση με το miR-NC επιμολυσμένα Η460 κύτταρα (Σχήμα 2Ε-G). κύτταρα Η460 μολυνθεί με ένα φορέα λεντοϊού miR-34a (δηλαδή, lenti-34α) αναγεννάται επίσης μικρότερα και πιο αργά αναπτυσσόμενους όγκους από τον φορέα ελέγχου μολυσμένα κύτταρα (Σχήμα S1A-C). Είναι σημαντικό, miR-34a υπερέκφραση σε κύτταρα Η460 μειωμένη συχνότητα εμφάνισης όγκου (75% το miR-NC έναντι 50% το miR-34a,

P

& lt? 0,01? Σχήμα 2Ε). Τέλος, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία όγκου περιοριστική αραίωσης με εμφύτευση 5 k, 50 k, ή 500 k του miR-NC ή miR-34a επιμολυσμένα Η1299 κύτταρα σε NOD ποντίκια /SCID και σε κάθε δόση κύτταρο παρατηρήσαμε μικρότερα και πιο αργή αναπτυσσόμενους όγκους που προέρχονται από το miR-34a κύτταρα που υπερεκφράζουν σε σύγκριση με τους όγκους από miR-NC επιμολυσμένα Η1299 κύτταρα (Σχήμα 2Η-L). Και πάλι, miR-34a υπερέκφραση μειωμένη συχνότητα εμφάνισης όγκου σε δύο δόσεις κυττάρων εμφυτεύονται (δηλαδή, 5 k και 500 k,

P

& lt? 0,01? Σχήμα 2Θ). Στην πραγματικότητα, miR-34a επιμολυσμένα Η1299 κύτταρα εμφάνισαν σημαντικά μικρότερη συχνότητα ογκογενή (ΔΕΘ) από αντίστοιχους ελέγχους miR-NC (

P

= 4.64E-179), όπως προσδιορίζεται με τη χρήση της λειτουργίας Limdil του πακέτου Statmod (https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html). Τα σχετικά ισχυρότερη όγκο ανασταλτικά αποτελέσματα του miR-34a επί Η1299 κυττάρων σε σχέση με συχνότητα εμφάνισης όγκου είναι πιθανόν να σχετίζονται με πολύ υψηλότερα επίπεδα των εξωγενών miR-34a σε επιμολυσμένα Η1299 κύτταρα (Σχήμα 2Α).

Όπως και στην περίπτωση των κυττάρων Α549, οι διαφορές στα βάρη όγκου σε miR-34a vs. miR-NC επιμολυσμένα Η460 και Η1299 κύτταρα δεν ήταν στατιστικά σημαντική, πιθανόν λόγω του σχετικά μικρού μεγέθους του δείγματος (Σχήμα 2Ε και 2i, αντίστοιχα), το οποίο είναι ένα πολύ κοινό φαινόμενο σε τέτοιες δοκιμασίες ξενομοσχεύματος όγκου. Μια άλλη πιθανή εξήγηση είναι ότι τα επιμολυσμένα ολίγο έγινε σταδιακά υποβαθμίζονται in vivo, όπως έχουμε κατ ‘επανάληψη παρατηρηθεί σε παρόμοια πειράματα όγκου χρησιμοποιώντας miR-34a [20] και αφήστε-7 [21] ολίγο. Προς στήριξη, οι υπολειμματικές όγκοι που προέρχονται από miR-34a επιμολυσμένα κύτταρα δεν έδειξαν αύξηση στην miR-34a (τα δεδομένα δεν φαίνονται), σε αντίθεση με προσφάτως επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2Α). Μία ενδιαφέρουσα παρατήρηση ήταν ότι οι ρ53-μεταλλαγμένων κυττάρων Η1299 διατηρούνται σημαντικά υψηλότερα επίπεδα των εξωγενών miR-34a (Σχήμα 2Α), το οποίο φαινόταν επίσης να εκδηλώνουν τα ισχυρότερα όγκο ανασταλτικά αποτελέσματα σε αυτή την κυτταρική σειρά (σύγκρινε Σχήμα 2I εναντίον σχήμα 2Β και 2Ε ).

miR-34a υπερέκφραση αναστέλλει CD44

hi Η460 αναγέννηση του όγκου, ενώ αντι-34α προωθεί την ανάπτυξη του όγκου στον καθαρισμό CD44

lo Η460 κύτταρα

υπήρξε ισχυρή πειραματική απόδειξη ότι miR-34a μπορεί να εκδηλωθεί με όγκο ανασταλτικά αποτελέσματα με τη στόχευση ΚΕΠ [10], [20], [21] και καλλιέργειες κυττάρων NSCLC έχουν δειχθεί ότι φιλοξενούν στέλεχος που μοιάζει με τα καρκινικά κύτταρα [3], [14] – [19]. Ως εκ τούτου, αναρωτιόμαστε αν οι βιολογικές επιπτώσεις των miR-34a στις 3 κύτταρα NSCLC (Σχήμα 1 και 2) μπορεί να σχετίζεται με τη δράση του σε βλαστικά-όπως τα καρκινικά κύτταρα. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, θα προσδιορίζεται για πρώτη φορά το ποσοστό των κυττάρων που είναι θετικά για Aldefluor, CD44 και CD133, αναλύσεις ή δείκτες που χρησιμοποιούνται συχνά για να εμπλουτίσουν ΚΕΠ του πνεύμονα. Παρατηρήσαμε περίπου 1-2% Aldefluor θετική Η460 και Η1299 κύτταρα, τα οποία σε μεγάλο βαθμό »αποκοπεί» στην παρουσία του αναστολέα ϋΕΑΒ ΑΙ_ϋΗ (Σχήμα 3). Για άγνωστους λόγους, διάφορα πειράματα επανάληψης έδειξαν ότι & gt? 90% των κυττάρων Α549 ήταν Aldefluor-θετικά και το ποσοστό αυτό δεν επηρεάστηκε από ϋΕΑΒ (Σχήμα 3). Σχεδόν το 100% των Α549, κύτταρα Η460 και Η1299 ήταν CD44-θετικά (μέσες τιμές είναι 97.2%, 99.3% και 99.2%, αντίστοιχα? Η = 3) (Σχήμα 3). Σε αντίθεση, δεν υπήρχε σχεδόν καμία έκφραση του CD133 σε αυτές τις τρεις NSCLC κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3C). Είναι ενδιαφέρον ότι αυτές οι δοκιμασίες μπορεί να εντοπίσει επικάλυψη των πληθυσμών των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με NSCLC όπως καθαρίζεται ΑΙ_ϋΗ

hi κύτταρα Η1299 παρουσίασαν υψηλότερα επίπεδα CD44 mRNA (Σχήμα S1D). Σε προκαταρκτικές μελέτες, που εμφυτεύονται 5 Κ ή 10 k καθαρίζεται ΑΙ_ϋΗ

hi και το αντίστοιχο ALDH

lo Η1299 κυττάρων σε NOD ποντίκια /SCID. Στα 5 k, ο ΑίϋΗ

hi και ALDH

κύτταρα lo αναπτυχθεί 4/5 (1.22 g, 0.32 g, 0.24 g, και 0.12 g) και 1/7 (0,99 g) όγκους, αντίστοιχα. Στα 10 k, ο ΑίϋΗ

hi και ALDH

κύτταρα lo αναπτυχθεί 3/8 (0.36 g, 0.2 g, 0.1 g) και 1/8 (0,03 g) όγκους, αντίστοιχα. Αυτά τα προκαταρκτικά αποτελέσματα δείχνουν ότι οι ΑΙ_ϋΗ

hi κύτταρα Η1299 διαθέτουν μεγαλύτερη χωρητικότητα όγκου-αναγέννηση, μια σημαντική CSC γνώρισμα.

(Top) Η δοκιμασία Aldefluor σε 3 κύτταρα NSCLC. ΫΕΑΒ-επεξεργασμένα δείγματα χρησίμευσαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Περίπου 1-2% Η460 και Η1299 κύτταρα Aldefluor θετικά, ενώ & gt? 90% των κυττάρων Α549 ήταν Aldefluor θετικά. (Μέση) Εκπρόσωπος κυτταρομετρία ροής προφίλ του CD44 (FITC) έκφραση σε 3 κύτταρα NSCLC. Σχεδόν το 100% των Α549, κύτταρα Η460 και Η1299 ήταν CD44-θετικά (μέσες τιμές είναι 97.2%, 99.3% και 99.2%, αντίστοιχα? Η = 3). (Κάτω) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του CD133 (ΡΕ) έκφραση σε 3NSCLC κύτταρα. Δεν υπήρχε σχεδόν καμία έκφραση του CD133 σε αυτές τις τρεις κυτταρικές σειρές NSCLC.

Η

Στα καρκινικά κύτταρα προστάτη PC3, σχεδόν 100% των κυττάρων είναι θετικά για CD44 [34]. Ωστόσο, υπάρχουν PC3 κύτταρα που εκφράζουν πολύ υψηλά επίπεδα κυτταρικής επιφάνειας CD44 (δηλαδή, CD44

hi) και εκείνων χαμηλά επίπεδα CD44 (δηλαδή, CD44

lo). Σπουδαιότητας, CD44

κύτταρα hi PC3 έδειξαν σημαντικά υψηλότερο κλωνική και κλωνογονικού δυναμικά από τα ισογονιδιακές CD44

κύτταρα lo PC3 [34]. Με βάση αυτήν την αναλογία, θα καθαρίζεται από CD44

hi (δηλαδή, top 10%) και CD44

lo (δηλαδή, κάτω του 10%) Η460 κύτταρα (Εικόνα 4Α). Όπως ήταν αναμενόμενο, το CD44

hi κύτταρα Η460 εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα CD44 mRNA από τα CD44

Η460 κύτταρα lo (

P

= 0,0009) (Εικόνα 4Β). Αξιοσημείωτα, λεντοϊού μεσολάβηση miR-34a υπερέκφραση του CD44

hi Η460 κύτταρα ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου (Σχήμα 4C, Ε και F). Πιο εντυπωσιακά, οι antagomirs αντι-miR-34a [20] προωθείται δραματικά το ρυθμό ανάπτυξης ανάπλαση του όγκου και του όγκου των CD44

lo Η460 κύτταρα σε τρεις δόσεις κυττάρων (100 k, 10 k, και 1 k) δοκιμάστηκε (Εικόνα 4D , G-J).

(Α-Β) επίπεδο έκφρασης CD44. (Α) Αντιπροσωπευτική διαγράμματα ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του CD44 (FITC) έκφραση σε κύτταρα Η460. (Β) επίπεδα CD44 mRNA σε καθαρισμένο CD44

hi και CD44

lo Η460 κύτταρα αξιολογούνται από qRT-PCR. (C, E, F) miR-34a υπερέκφραση σε καθαρισμένο CD44

hi Η460 κύτταρα από λεντοϊού μόλυνση αναγέννηση ανέστειλε όγκου. (C) Ενδείκνυται είναι συχνότητα εμφάνισης όγκου (όγκοι αναπτύσσονται /αριθμό των ενέσεων?%), Το χρόνο συγκομιδής (συμπεριλαμβανομένων πραγματική ένεση και τερματισμού ημερομηνίες), μέσο βάρος όγκου (σε γραμμάρια, F), και τα

P

τιμές για βάρη των όγκων. Ακαθάριστο εικόνες όγκου δεν είναι στην ίδια κλίμακα. (Ε) Η καμπύλη ανάπτυξης όγκου. (D, G-J) Αντι-miR-34a προώθησε την ανάπτυξη του όγκου του καθαρισμένου CD44

lo Η460 κύτταρα. (D) Ενδείκνυται είναι συχνότητα εμφάνισης όγκου (όγκοι αναπτύσσονται /αριθμό των ενέσεων?%), Το χρόνο συγκομιδής (συμπεριλαμβανομένων πραγματική ένεση και τερματισμού ημερομηνίες), μέσο βάρος όγκου (σε γραμμάρια, G), και οι

P

τιμές για βάρη των όγκων. Ακαθάριστο εικόνες όγκου δεν είναι στην ίδια κλίμακα. (H-J) Η καμπύλη ανάπτυξης του όγκου σε τρεις διαφορετικές δόσεις κυττάρων.

Η

Συνοπτικά, δείξαμε ότι miR-34a υπερέκφραση αναστέλλει τον σχηματισμό NSCLC κύτταρο holoclone και κλωνογονικού επέκταση in vitro και, το σημαντικότερο, όγκος αναγέννηση σε βιολογικό περιβάλλον. Αυτές οι ανασταλτικές επιδράσεις του miR-34a μπορεί να οφείλεται σε επιδράσεις της για τα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με NSCLC. Προς υποστήριξη αυτής της δυνατότητας, επιβάλλεται η έκφραση του miR-34a ειδικά στο CD44

hi Η460 κύτταρα αναστέλλεται σε μεγάλο βαθμό δραστηριότητας με όγκο αναγέννηση τους, ενώ οι ανταγωνιστές του miR-34a προωθείται δραματικά την αναγέννηση του όγκου σε CD44

lo Η460 κύτταρα. Αυτές οι παρατηρήσεις είναι συνεπείς με CD44 είναι ένας άμεσος και λειτουργικός στόχος του miR-34a σε προστάτη [20] και κάποιο άλλο καρκίνο [31] κύτταρα και προτείνουν ότι miR-34a ρυθμίζει αρνητικά την ικανότητα ογκογενή του NSCLC ΚΕΠ. Μελλοντικές εργασίες θα έχουν ως στόχο να διαφωτίσει τους θεμελιώδεις μηχανισμούς και τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των miR-34a και της έκφρασης CD44 σε κύτταρα NSCLC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

miR-34a αναστέλλει την ανάπτυξη των όγκων Η460 και ALDH

hi κύτταρα Η1299 εκφράζει υψηλότερα επίπεδα CD44 mRNA. (Α-Ο) λεντοϊών μεσολάβηση miR-34a υπερέκφραση σε Η460 κύτταρα ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου. (Α) Τα βάρη του όγκου του τελικού σημείου. (Β και Γ) καμπύλες ανάπτυξης όγκου σε δύο διαφορετικές δόσεις κυττάρων. (Δ) Τα επίπεδα CD44 mRNA σε καθαρίζεται ΑΙ_ϋΗ

hi και τις αντίστοιχες ALDH

lo Η1299 κύτταρα αξιολογούνται από qRT-PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090022.s001

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε T. Davis για βοήθεια σε όλα τα πειράματα όγκου και π Whitney για FACS. Ευχαριστούμε επίσης και άλλα μέλη του εργαστηρίου Τανγκ για χρήσιμες συζητήσεις και υποστήριξη.