Abstract

υποξία επαγώγιμοι Παράγοντα (HIF) οδού σηματοδότησης είναι σημαντική για τα καρκινικά κύτταρα με περιορισμένο οξυγόνο, όπως φαίνεται να εμπλέκονται στη διαδικασία του πολλαπλασιασμού και της αγγειογένεσης. Δεδομένου κεντρικό ρόλο στην βιολογία του καρκίνου, εύρωστο δοκιμασίες για παρακολούθηση αλλαγών στην έκφραση του HIF είναι απαραίτητες για την κατανόηση της ρύθμισης στον καρκίνο καθώς και την ανάπτυξη θεραπειών που στοχεύουν σηματοδότηση HIF. Εδώ αναφέρουμε μία νέα κατασκεύασμα ανταποκριτή που περιέχει HIF διαδοχικές επαναλήψεις των ελάχιστων θέσεων σύνδεσης HIF ανοδικά της ακολουθίας κωδικοποίησης EYFP. Δείχνουμε ότι το κατασκεύασμα ανταποκριτή έχει ένα εξαιρετικό λόγο σήματος προς υπόβαθρο και η δραστηριότητα ανταποκριτή εξαρτάται HIF και απευθείας συσχετίζεται με τα επίπεδα πρωτεΐνης HIF. Με τη χρησιμοποίηση αυτής της νέας κατασκεύασμα, προσδιορίσαμε τα επίπεδα δραστηριότητας HIF σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε διάφορους βαθμούς υποξία. Αυτή η ανάλυση αποκαλύπτει ένα εκπληκτικό κυτταρική σειρά καρκίνου ειδική παραλλαγή της δραστηριότητας HIF στο ίδιο επίπεδο υποξία. Δείχνουμε επίσης ότι σε δύο τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές, ΜΕ180 και HeLa, τα διαφορετικά επίπεδα δραστηριότητας HIF παρατηρείται συσχετίζονται με τα επίπεδα της hsp90, ένα συμπαράγοντα που προστατεύει HIF κατά VHL ανεξάρτητη αποικοδόμηση. Αυτή η νέα δομή HIF δημοσιογράφος χρησιμεύει ως ένα εργαλείο για να καθορίσει γρήγορα τα επίπεδα δραστηριότητας HIF και ως εκ τούτου, η θεραπευτική ικανότητα των δυνητικών καταστολείς HIF σε επιμέρους καρκίνους

Παράθεση:. Zhou W, Dosey TL, Biechele Τ, Σελήνη RT, Horwitz MS , Ruohola-Baker Η (2011) εκτίμηση του επιπέδου υποξία επαγώγιμοι Παράγοντα σε σειρές καρκίνου κύτταρο κατά Υποξικές Επαγωγή Χρησιμοποιώντας ένα Novel κατασκεύασμα αναφοράς. PLoS ONE 6 (11): e27460. doi: 10.1371 /journal.pone.0027460

Επιμέλεια: Gangjian Τσιν, το Πανεπιστήμιο Northwestern, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4η Μαΐου του 2011? Αποδεκτές: 17 Οκτώβρη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 23 Νοεμ του 2011

Copyright: © 2011 Zhou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από R01GM083867-01, R01GM097372-01, και 1P01GM081619 από το Εθνικό Ινστιτούτο Γενικών Ιατρικών Επιστημών και του Καρκίνου του μαστού Ερευνητικό Πρόγραμμα Πιλοτικό επιχορήγηση έργου HR-B. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η υποξία είναι καλά γνωστό ότι ρυθμίζει θεμελιωδώς πολλές πτυχές της κυτταρικής βιολογίας. Τα περισσότερα από τα αποτελέσματα της υποξίας περιλαμβάνουν την υποξία επαγώγιμου παράγοντα (HIF), μια εξαιρετικά διατηρημένη και κρίσιμος παράγοντας ετεροδιμερής μεταγραφής του οξυγόνου ρυθμίζεται αποτελείται από μια άλφα (α) και βήτα (β) υπομονάδα. Και οι δύο αυτές υπομονάδες ανήκουν στην ομάδα PER-ARNT-SIM (PAS) σε βασική έλικα-βρόχος-έλικα-(bHLH) οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων [1]. Δύο γονίδια που κωδικοποιούν υπομονάδες HIFα θηλαστικών (HIF1α, HIF2α) είναι καλά μελετηθεί: HIF1α εκφράζεται παντού ενώ HIF2α παρουσιάζουν πιο περιορισμένη κατανομή στους ιστούς [2]. Σε φυσιολογική οξυγόνωση, HIFα υποβάλλεται προλυλο υδροξυλίωση και δεσμεύεται σε ένα ουμπικουϊτίνης Ε3-λιγάση, ο νοη Hippel-Lindau (VHL) πρωτεΐνη, η οποία οδηγεί σε polyubiquitination και ταχεία αποδόμηση proteosomal του HIFα [3], [4]. Κάτω από υποξία, HIFα υδροξυλίωση αναστέλλεται, με αποτέλεσμα τη συσσώρευση των HIFα και το σχηματισμό των HIFα-HIFβ ετεροδιμερή. Τα ετεροδιμερή περαιτέρω σύμπλοκο με τα p300 συνενεργοποιητή, και δεσμεύονται στους υποκινητές των γονιδίων στόχων HIF να επάγει την έκφραση του γονιδίου [5]. Εκτός από την υποξία, πολλές άλλες οδοί μπορούν να επηρεάσουν HIF σταθεροποίηση [6], [7]. Συμπαράγοντες, όπως PACF P300 /CBP σχετιζόμενους παράγοντες [8] και hsp90 [9], [10], βοηθούν επίσης να διευκολύνει τη σταθεροποίηση HIF και ενίσχυση των δραστηριοτήτων HIF. Hsp90 έχει δειχθεί ότι προστατεύει έναντι HIFα VHL ανεξάρτητη αποικοδόμηση που μπορεί να παρουσιαστεί σε υποξία [11].

Η καλά μελετηθεί HIF γονιδίων στόχων περιλαμβάνουν εκείνα που εμπλέκονται στην απελευθέρωση οξυγόνου και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, όπως η αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (

VEGF

) [12], [13] και

p21

[14]. Επιπλέον, ο HIF διευκολύνει την προσαρμογή στην στέρηση οξυγόνου ρυθμίζοντας γονίδια που εμπλέκονται στην πρόσληψη και μεταβολισμό της γλυκόζης, όπως καρβονικής ανυδράσης (

CA9

) [15], η οποία διατηρεί την κυτταρική pH

i ομοιόσταση υπό υποξία. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι HIF και το γονίδιο-στόχο,

Oct4

, είναι υπεύθυνα για την επαγόμενη από υποξία φαινοτύπου καρκινικών κυττάρων στελέχους, που πιστεύεται ότι οδηγεί την εξέλιξη και την επιθετικότητα σε ορισμένους όγκους [16]. Δεδομένου κεντρικό ρόλο στην αγγειογένεση και την εξέλιξη του όγκου, ο HIF είναι μια θεραπευτικά ελκυστικός στόχος και κλείδωμα HIF, ειδικά όταν συνδυάζεται με συμβατικές θεραπείες, έδειξε ευεργετικά αποτελέσματα [17], [18].

Για να εξεταστεί HIFs ‘χρονική και χωρική έκφραση σε ιστούς, τα διάφορα συστήματα άμεσων και έμμεσων δημοσιογράφος που αναπτύχθηκε για να παρακολουθείτε την έκφραση της πρωτεΐνης HIF

in vivo

. Είτε πλήρους μήκους cDNA HIF, ή ένα θραύσμα σύμφωνα με τον κανονισμό οξυγόνο εξαρτώμενη έχει συνδεθεί με φθορίζουσα πρωτεΐνη [19], ή λουσιφεράση πυγολαμπίδας [20] για την κατασκευή πρωτεϊνών HIF-σύντηξης. Εναλλακτικά, δεδομένου ότι οι μελέτες πρωτεΐνη σύντηξης HIF δεν αποκαλύπτουν εάν συγκρότημα HIF είναι μεταγραφικά ενεργή, ρεπόρτερ υποκινητής βάση έχουν επίσης αναπτυχθεί. Τυπικά, 5-8 επαναλήψεις των στοιχείων απόκρισης υποξίας (HREs) (5′-GCCCTACGTGCTGTCTCACACAGC-3 ‘) από το 3′ περιοχή ενισχυτή του ανθρώπινου γονιδίου ερυθροποιητίνης, ή το HRE από VEGF (5’-CACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCT-3 ‘) συνδέονται σε συνδυασμό με ένα ελάχιστο προαγωγέα για να οδηγήσει την έκφραση ενός προς τα κάτω γονιδίου αναφοράς [21], [22]. Αξίζει να σημειωθεί ότι σε αυτά τα κατασκευάσματα, HRE περιέχει όχι μόνο το HIF-1α ή θέσεις δέσμευσης HIF2α συναίνεσης (5’-CGTG-3 ‘και 5′-TRCGTG-3’, αντίστοιχα), αλλά και

Ερο

ή

VEGF

ειδικές αλληλουχίες υποκινητή. Πρόσφατα

Oct4

έχει δείξει ότι προκαλείται από HIF υπό υποξία [16], ωστόσο,

Oct4

προαγωγέα περιέχει μόνο τρεις επαναλήψεις της CGTG, η πραγματική θέση πρόσδεσης HIF αλλά όχι οι αλληλουχίες HRE παρατηρήθηκαν είτε στο

ερυθροποιητίνης

ή

VEGF

υποκινητή.

για να μεγιστοποιηθεί η ειδικότητα και η ευαισθησία της κατασκευής δημοσιογράφος, μια στρατηγική με τη χρήση της πιο πρωτόγονες θέση δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής σε συνδυασμό σε ένα ρεπόρτερ έχει επιτυχώς χρησιμοποιηθεί προηγουμένως στην περίπτωση της ανάλυσης Wnt-μονοπάτι [23], [24]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μια παρόμοια στρατηγική για τη δημιουργία ενός υποκινητή βάση, μόνο που ενσωματώνουν την ελάχιστη HIF1α και HIF2α θέσεις σύνδεσης μαζί (CGTGTACGTG) σε συνδυασμό με τον υποκινητή. Θα δείξουμε ότι αυτή η νέα HIF δημοσιογράφος με HIF δεσμευτική επαναλήψεις (ΒΕΣ) έχει ένα καλό σήμα με το υπόβαθρο λόγο και το σήμα δυναμική στην αποξυγόνωση και επανοξυγόνωση. Μπορούμε επίσης να αποδείξει ότι το σήμα είναι HIF εξαρτώμενη όπως αποκαλύφθηκε από τις μελέτες HIF RNAi, και συσχετίζεται με το επίπεδο κυτταρικής HIF πρωτεΐνης σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Με τη χρησιμοποίηση νέων μας κατασκεύασμα, δείχνουμε ότι τα επίπεδα δραστικότητας HIF ποικίλλουν σημαντικά στις διάφορες κυτταρικές γραμμές καρκίνου καλλιεργήθηκαν στο ίδιο βαθμό υποξίας. Εμείς αποκαλύπτουν επίσης ότι σε δύο τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές, οι διαφορές στα επίπεδα δραστηριότητας HIF συσχετίζονται με το επίπεδο του συμπαράγοντα HIF, Hsp90, η οποία προστατεύει HIF κατά VHL-ανεξάρτητο υποβάθμιση.

Αποτελέσματα

κατασκευάσαμε ένα λεντοϊού πλασμίδιο, στο οποίο η έκφραση της ενισχυμένης πρωτεΐνης κίτρινου φθορισμού (EYFP) ήταν κάτω από τη ρύθμιση του δώδεκα διαδοχικές επαναλήψεις της ελάχιστης θέσεις HIF-δέσμευσης (CGTGTACGTG), που ακολουθείται από μια ελάχιστη ανθρώπινη κινάση θυμιδίνης (ΤΚ) προαγωγό (12U- ΒΕΣ). Επίσης, ένα 770 bps αλληλουχιών ιντρονίου β-σφαιρίνης ενσωματώθηκε μεταξύ του υποκινητή ΤΚ και EYFP για την καλύτερη μεταγραφή των EYFP (Σχήμα 1α, Εικόνα S1). Για να προσδιοριστεί η λειτουργία του κατασκευάσματος του

in vitro

, εμείς μετάγονται τον ιό σε κύτταρα HeLa και τους καλλιεργήθηκαν είτε σε νορμοξικά (20% O

2) ή υποξικά (2% O

2) κατάσταση. Μετά από 24 ώρες, παρατηρήθηκε ότι τα κύτταρα κάτω από υποξία εκφράζεται ομοιόμορφα EYFP (-70% του EYFP θετική), ενώ εκείνα του νορμοξία μόνο αποκτήθηκε φθορισμού με κατά πολύ μειωμένη ένταση (~ 6% του EYFP θετική, Σχήμα 1β και Εικόνα S2).

3, 6 ή 12 διαδοχικές μονάδες των επαναλήψεων δεσμευτική HIF (3U, 6U ή 12U-ΒΕΣ) και ΤΚ ελάχιστος προαγωγός μαζί ρυθμίζουν την έκφραση EYFP. β-γ) Βελτιστοποίηση του αριθμού των επαναλήψεων δέσμευσης HIF. β) κύτταρα 6U-ΒΕΣ HeLa ενεργοποιήσετε EYFP για το 2%, αλλά όχι σε 20% οξυγόνο. Ίση ποσότητα κυττάρων (5 × 10

4) τοποθετήθηκαν σε δύο δίσκους καλλιέργειας και μικροσκοπία και ανάλυση FACS πραγματοποιήθηκαν μετά από 2 ημέρες? γ) ο λόγος σήματος προς υπόβαθρο αναπαριστάται με ανάλυση FACS. κύτταρα HeLa υπέστησαν μεταγωγή με HIF-HBR σωματίδια ρεπόρτερ λεντοϊού για 24 ώρες και στη συνέχεια αναπτύσσονται υπό φυσιολογική οξυγόνωση (20% Ο2) ή υποξία (2% Ο2) για 48 ώρες πριν από την ανάλυση FACS. Αναλογίες είναι γεωμετρικές μέσες τιμές της έντασης EYFP στο 2% έως 20% οξυγόνο.

Η

Για την περαιτέρω βελτιστοποίηση του λόγου σήματος προς υπόβαθρο, μειώσαμε τον αριθμό των θέσεων HIF-δέσμευσης, δημιουργώντας έτσι HIF-δημοσιογράφους με 3 θέσεις πρόσδεσης παράλληλα (3U-ΒΕΣ) ή με 6 περιοχές (6U-ΒΕΣ) (Σχήμα 1α). Κατά την ανάλυση σε κύτταρα HeLa, παρατηρήσαμε ότι κατασκεύασμα 6U-HBR επιτευχθεί μια καλύτερη αναλογία σήματος προς υπόβαθρο από 3U-HBR και κατασκευάσματα 12U-HBr (33,4, 5,8 και 15,1, αντίστοιχα. Σχήμα 1Γ). Για να συγκριθεί η ειδικότητα και ευαισθησία σε άλλους δημοσιογράφους υποξία, λάβαμε συγκεκριμένα ένα από τα ευρέως χρησιμοποιούμενα HIF δημοσιογράφος 5HRE_hCMV_Luc [25]. Μετά παροδική επιμολυσμένα 5HRE_hCMV_luc ρεπόρτερ σε κύτταρα HeLa, παρατηρήσαμε 50-100 φορές μεγαλύτερη δραστικότητα λουσιφεράσης κάτω από 2% O

2 σε σύγκριση με κύτταρα που αναπτύσσονται σε 20% O

2, η οποία ήταν σύμφωνη με την αρχική διαπίστωση. Σε σύγκριση, HBR_eYFP ρεπόρτερ μας δείχνει περίπου 30-40 φορές αύξηση στο 2% O

2, μια αύξηση που πέφτει σε παρόμοια κλίμακα, όπως φαίνεται με 5HRE_hCMV_luc δημοσιογράφος. Με την ομοιότητα στην ένταση του σήματος, ωστόσο, οι δύο κατασκευές HIF ρεπόρτερ δεν είναι άμεσα συγκρίσιμα, δεδομένου ότι έχουν διακριτές αλληλουχίες σκελετού, διαφορετικά ελάχιστη υποκινητές και γονίδια αναφοράς, τα οποία θα μπορούσε να τους καταστήσει διακριτή συμπεριφορά και τη δυναμική υπό υποξία. Σε αυτή τη μελέτη, 6U-HBR χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω βελτιστοποίηση και χαρακτηρισμό.

επόμενο χαρακτηριζόμενη τη δυναμική του κατασκευάσματος κατά τη διαδικασία της αποοξυγόνωσης και επανοξυγόνωση. Όταν πέρασε από νορμοξία σε υποξία (2%), κύτταρα 6U-HBR-HeLa είχε ταχείας αντίδρασης (Σχήμα 2α)? Ωστόσο, όταν πέρασε από την υποξία πίσω στην φυσιολογική οξυγόνωση, η ένταση φθορισμού μειώνεται αργά (72 ώρες για να φθάσει το βασικό επίπεδο? Εικόνα 2b). Για ένα κατασκεύασμα με την καλύτερη ικανότητα να αντανακλά έγκαιρα τον κύκλο εργασιών του HIF, τροποποιήσαμε EYFP και δημιουργείται μια αποσταθεροποιημένη έκδοση συνδέοντας αποκαρβοξυλάση της ορνιθίνης ποντίκι 422 – 461 περιοχή, μια περιοχή υπεύθυνη για την ταχεία αποδόμηση της πρωτεΐνης [26], στο C-τελικό άκρο της EYFP, δημιουργώντας έτσι την κατασκευή των 6U-αποσταθεροποιηθεί-ΒΕΣ (6UD-ΒΕΣ). Παρατηρήσαμε ότι 6UD-HBR εμφάνισαν μειωμένη φθορισμού αλλά παρόμοια δυναμική, όπως φαίνεται με 6U-HBr (Σχήμα 2α). Όταν μεταφέρθηκε πίσω στη φυσιολογική οξυγόνωση, το σήμα φθορισμού των κυττάρων 6UD-ΒΕΣ έδειξαν δραματική μείωση φτάνοντας το χαμηλότερο επίπεδο σε 10 ώρες. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, 6U-ΒΕΣ είναι πιο ευαίσθητη στην ανίχνευση μεταβολών στη διαδικασία της deoxygenation ενώ 6UD-ΒΕΣ αντικατοπτρίζει καλύτερα τις αλλαγές στη διαδικασία της επανοξυγόνωση.

5 × 10

4 κύτταρα απλώθηκαν σε 35 πλάκες mm και στη συνέχεια καλλιεργούνται κάτω από είτε νορμοξία (20% O

2) ή υποξία (2% O

2). Σε διαφορετικά χρονικά σημεία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν για ανάλυση FACS. Η μέση και οι ράβδοι σφάλματος είναι από τρεις βιολογικούς επαναλήψεις.

Η

Για να επιβεβαιώσετε HIF-εξάρτηση του δημοσιογράφου, πραγματοποιήσαμε πειράματα RNAi στόχευση HIFs υπό υποξία. Όταν χτυπήσει κάτω τρεις HIFs (HIF1α, HIF1β και HIF2α), κύτταρα 6U-ΒΕΣ-HeLa υπό υποξία είχε μειωθεί σημαντικά φθορισμού, κοντά στο επίπεδο δει κάτω από φυσιολογική οξυγόνωση (Σχήμα 3α-f, περίπου ίσο αριθμό κυττάρων που παρατηρούνται σε ένα-δ) . Επιπλέον, δείξαμε ότι η υπερ-έκφραση του μη αποικοδομήσιμο HIF1α ή HIF2α μόνο ήταν αρκετή για να ενεργοποιήσει την έκφραση του κατασκευάσματος (Σχήμα 4α και 4β). Για να ελέγξετε αν το σήμα που προκαλείται από HIFα υπερέκφραση (Ο.Ε.) προκλήθηκε άμεσα από την κανονική δραστηριότητα των HIFα, εισαγάγαμε RNAi κατά την ουσιώδη συμπαράγοντα της HIFα, HIF1β, στα κύτταρα HIFα ΟΕ. Δείξαμε ότι όταν επιμολύνθηκαν με HIF1β RNAi, η ένταση που επάγεται από EYFP HIFα ΟΕ μειώθηκε σημαντικά (Σχήμα 4b-d). Αξίζει να σημειωθεί ότι στα πειράματα RNAi που εκτελούνται σε μια πλατφόρμα υψηλής απόδοσης, κύτταρα έδειξαν ισοδύναμη ένταση σε όλη φρεάτια στην ίδια ομάδα θεραπείας (Σχήμα 4b-d). Αυτά τα πειράματα καταδεικνύουν την εφαρμοσιμότητα και την ευαισθησία του κατασκευάσματος 6U-HBr σε μία πλατφόρμα υψηλής απόδοσης. Η ευαισθησία της κατασκευής τόσο HIF1α και HIF2α επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από τα αποτελέσματα, όταν χτυπήσει κάτω ατομική HIFα ή HIFs με διάφορους συνδυασμούς σε κύτταρα HeLa (Σχήμα S3). Συνολικά, δείχνουμε ότι ο ανταποκριτής είναι άμεσα αισθητήρια HIF σηματοδότηση στα κύτταρα.

6U-HBR κύτταρα HeLa επιμολυσμένα με τα siRNA κατά τριών HIFs (HIF1α, HIF1β και HIF2α) αποτελούν EYFP αρνητικά υπό υποξία, επέδειξαν τόσο μικροσκοπία (άνω πάνελ α-δ) και τα αποτελέσματα FACS (κατώτερο πάνελ e και f). Ίση ποσότητα κυττάρων (5 × 10

4) απλώθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας και μικροσκοπία και ανάλυση FACS πραγματοποιήθηκαν μετά από 2 ημέρες μετά την επιμόλυνση siRNA.

Η

α) κατασκευή 6U-ΒΕΣ στο Α549 είναι ενεργοποιούνται είτε με ndHIF1α ή ndHIF2α, αλλά όχι με άδειο κατασκεύασμα φορέα. b-d) HIF1β siRNA μόνη μειώνει σε μεγάλο βαθμό σήματα φθορισμού που προκαλείται από ndHIF1α /ndHF2α υπερέκφραση (ndHIFα ΟΕ) σε κύτταρα HeLa, υποδεικνύοντας ότι τα σήματα EYFP είναι αναστρέψιμες με χειρισμό των επιπέδων των παραγόντων HIF. Και οι δύο εικόνες μικροσκοπίας (β) και φθορίζοντα ποσοτικοποίησης (γ και δ) απεικονίζεται.

Η

εμβρυογένεσης και της ανάπτυξης των θηλαστικών, οι ιστοί αναπτύσσουν σε ένα μικροπεριβάλλον με διάφορα επίπεδα οξυγόνου. Έχει αποδειχθεί ότι η υποξία, αφενός, είναι απαραίτητη για τον σχηματισμό της καρδιάς [27], [28], [29] και το σχηματισμό των οστών endochondrial [30], [31], [32], [33]? Ωστόσο, από την άλλη πλευρά, εξασθενίζει λιπώδη ιστό ανάπτυξη [34], [35] και της διαφοροποίησης μυοϊνοβλάστη δέρμα [36]. Με δεδομένο τον κρίσιμο ρόλο του HIF σηματοδότησης σε υποξία, ένα θεμελιώδες ερώτημα είναι κατά πόσο τα κύτταρα να αποκτήσουν ιστό-συγκεκριμένες απαντήσεις σε περιβάλλον χαμηλού οξυγόνου τους με διαφορετικό τρόπο τη ρύθμιση της οδού HIF. Για να προσδιορίσετε το πώς τα κύτταρα από διαφορετικές προελεύσεις ιστού ανταποκριθεί σε υποξία όσον αφορά τα επίπεδα και τις δραστηριότητες του HIF, εξετάσαμε 5 καρκινώματα κυτταρικές σειρές 6U-ΒΕΣ, δηλαδή 786 + VHL από αδενοκαρκίνωμα των νεφρικών κυττάρων, Α549 από καρκίνωμα του πνεύμονα, ΜΕ180 από επιδερμοειδές καρκίνωμα στο τράχηλο της μήτρας , U251 από γλοίωμα, και HeLa από αδενοκαρκίνωμα του τραχήλου της μήτρας. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε διαφορετικά επίπεδα οξυγόνου (20%, 5%, 3%, 2%, 1% ή 0,3%) για 4 ημέρες, και ο μέσος φθορισμός 6U-HBR προσδιορίστηκε με ανάλυση FACS. Αυτά τα κύτταρα θα αναμενόταν να συμπεριφερθεί παρομοίως υπό υποξικές συνθήκες λόγω του γεγονότος ότι έχουν προσαρμοστεί στις συνθήκες καλλιέργειας? Ωστόσο, παρατηρήσαμε ότι ανταποκρίθηκαν ευδιάκριτα, υπό τον ίδιο βαθμό οξυγόνου. Για παράδειγμα, ΜΕ180 και HeLa και οι δύο είχαν μικρή ανταπόκριση στο 3% του οξυγόνου, ωστόσο, όταν το επίπεδο οξυγόνου ήταν κάτω από το 3%, ΜΕ180 παρουσίασαν δραματική αύξηση του σήματος, ενώ HeLa είχε σχετικά μικρή αύξηση (Σχήμα 5). Από την άλλη πλευρά, το σήμα του U251 αυξήθηκε αργά στους 5% και 3% του οξυγόνου, πιο δραματικά σε 2% και 1% του οξυγόνου, και ευδιάκριτα συνέχισαν να αυξάνονται ακόμη και σε 0,3% του οξυγόνου (Σχήμα 5).

Πέντε κυτταρικές σειρές καρκίνου μολυνθεί με 6U-HBR lentivirus καλλιεργήθηκαν υπό διάφορες βαθμό υποξίας, συμπεριλαμβανομένων 20%, 5%, 3%, 2%, 1% και 0,3% του O

2. εντάσεις EYFP τους προσδιορίστηκαν μετά από 4 ημέρες σε καλλιέργεια με ανάλυση FACS. Οι βαθμοί υποξία παρουσιάζεται ως αρχείο καταγραφής της σχετικής O

2 επίπεδο για την φυσιολογική οξυγόνωση (20% O

2).

Η

Επαληθεύσαμε επίσης ότι τα σήματα 6U-ΒΕΣ σε αυτές τις κυτταρικές σειρές συσχετίζονται με ενδοκυτταρικά επίπεδα πρωτεΐνης HIF. Δεδομένου ότι το 1% οξυγόνο περιβάλλον εμφάνισαν την μεγαλύτερη διαφορά σε 6U-HBR σήματα μεταξύ των κυττάρων ΜΕ180, U251 και HeLa, χρησιμοποιήσαμε αυτό το επίπεδο του οξυγόνου για να προσδιοριστεί HIF mRNA και πρωτεΐνης. Ενώ τα επίπεδα HIF1α mRNA ήταν παρόμοια μεταξύ αυτών των κυτταρικών σειρών, τα επίπεδα mRNA HIF2α ποικίλει (Σχήμα S4), το οποίο ήταν σύμφωνα με μια προηγούμενη μελέτη [2]. Για επίπεδο πρωτεΐνης, πρώτα έδειξαν ότι τέσσερις ώρες σε υποξία προκαλούμενη υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης HIF1α σε ΜΕ180, U251 και Α549 από ό, τι σε HeLa και 786-Ο + VHL (Εικόνα 6a-b). Δεδομένου ότι έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι σε παρατεταμένη υποξία, HIF1α πρωτεΐνη αποικοδομεί ενώ HIF2α επιδεικνύει ελάχιστη αλλαγή [37], υποθέσαμε ότι όχι μόνο τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης HIF αλλά επίσης και η δυναμική σταθεροποίηση των πρωτεϊνών είναι υπεύθυνες για διαφορετικές δραστηριότητες ρεπόρτερ 6U-HBR σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές. Ως εκ τούτου, αναλύθηκε τις διαφορές στην κινητική αποδόμησης των πρωτεϊνών HIFα σε όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πέντε σε 1% οξυγόνου. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε ότι HIF1α σε κύτταρα HeLa είναι λιγότερο σταθερό κατά την διάρκεια παρατεταμένης υποξίας από ό, τι σε οποιονδήποτε άλλο τύπο κυττάρων που αναλύθηκαν (Σχήμα 6c και δ). Κατά τη σύγκριση των επιπέδων HIF2α στο 1% υποξία έναντι normaxia, η διαφορά μεταξύ αυτών των πέντε κυτταρικές σειρές μειώνεται σε όρους συνολικών επιπέδων πρωτεΐνης και μοντέλων αποδόμησης (Σχήμα S5). Ωστόσο, ενώ δεν HIF1α πρωτεΐνη παρατηρήθηκε σε 786-O + VHL κύτταρα, HIF2α πρωτεΐνης προκλήθηκε σε υποξία σε αυτό κυτταρικές γραμμές, explaning την ανταπόκριση αυτής της κυτταρικής γραμμής στον ανταποκριτή 6U-HBR (Σχήμα S5? Σχήμα 5). Συνολικά, τα δεδομένα δείχνουν ότι τα υψηλότερα επίπεδα πιο σταθερή πρωτεϊνών HIFα παρατηρήθηκαν σε ΜΕ180, Α549 και U251 σε σύγκριση με HeLa και 786-O + VHL κύτταρα, υποστηρίζοντας τα συμπεράσματα αποκαλύφθηκαν από 6U-HBR ρεπόρτερ ότι αυτές οι πέντε κυτταρικές γραμμές εμφανίζουν διακριτές δραστηριότητες HIF στον ίδιο βαθμό υποξίας.

α) HIF1α σε ΜΕ180, U251, Α549, HeLa και 786-Ο + VHL κύτταρα κάτω του 1% O

2 για 4 ώρες. β) Ποσοτικοποίηση για HIF1α πρωτεΐνη που απεικονίζεται στο α). Η ποσοτικοποίηση έγινε στις σαρωμένες εικόνες ταινία προκύπτει από ξεχωριστές κηλίδες Western. γ) τα επίπεδα και δ HIF1α) τον ποσοτικό προσδιορισμό σε ΜΕ180, U251, Α549, HeLa και 786-Ο + VHL κύτταρα κάτω του 1% O

2 σε τρία χρονικά σημεία: 4 ώρες, 12 ώρες και 48 ώρες, σε σύγκριση με τα υπό επίπεδα 20% O

2 ως έλεγχοι.

η

Εμείς επιλέξαμε HeLa και ΜΕ180 για περαιτέρω μελέτη, δεδομένου ότι και οι δύο του τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές γραμμές που εμφανίζουν πολύ ξεχωριστή αποκρίσεις σε υποξία. Για να κατανοήσουμε τη ρύθμιση των HIFα σε αυτούς τους δύο τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές, αναλύσαμε τα δεδομένα μικροσυστοιχιών mRNA προηγουμένως διεξάγεται σε αυτές τις κυτταρικές σειρές σε% υποξία 2 [38]. Είναι ενδιαφέρον, ταυτοποιήσαμε mRNA hsp90 εκφράζονται διαφορικά μεταξύ HeLa και ΜΕ180. Εμείς επικυρωθεί πρώτα αυτό το εύρημα με πραγματικού χρόνου ανάλυση PCR και έδειξε ότι ΜΕ180 έχει υψηλότερα επίπεδα hsp90 τόσο σε φυσιολογική οξυγόνωση και υποξία (Σχήμα 7). Για να προσδιορίσετε αν υψηλότερα επίπεδα της hsp90 σε ΜΕ180 θα μπορούσε να είναι αιτιώδης για την υψηλότερη δραστηριότητα HIF, μειώσαμε σύνδεση με HIF1α σε ΜΕ180 hsp90 από επώαση των κυττάρων με 17-αλλυλαμινο-demethoxygeldamycin (17-ΑΑΟ) στο 2% συνθήκες υποξίας. 17-AAG αναστέλλει τη σύνδεση ΑΤΡ προς hsp90, εμποδίζοντας έτσι την αλληλεπίδραση της hsp90 και πρωτεΐνη-στόχο της [39]. Από την αλληλεπίδραση hsp90 με HIF1α έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει τη σταθερότητα HIF1 σε υποξία [11], 17-ΑΑΟ θα πρέπει να μειώσει εξαρτάται hsp90 δραστηριότητα HIF1. Κατά συνέπεια, 6U-HBR ΜΕ180 επωάστηκαν με 17-AAG έδειξε χαμηλότερα επίπεδα δραστικότητας ανταποκριτή 6U-HBR από αυτά που παρατηρήθηκαν στην ομάδα ελέγχου (Σχήμα 8α). Επιπλέον, η έκφραση του mRNA του γονιδίου-στόχου HIF1α CA9 μειώθηκε σημαντικά (Σχήμα 8b), υποδηλώνοντας ότι η δραστικότητα HIF μειώθηκε σε ΜΕ180 όταν hsp90 ήταν καθίσταται ανενεργός. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η διαφορά στα επίπεδα hsp90 είναι αιτιώδης για τη διαφορά στη δραστικότητα HIF παρατηρήθηκαν στις δύο τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές. Αποκλείσαμε το ενδεχόμενο της μείωσης των δραστηριοτήτων HIF που προκαλείται από τη γενική ρύθμιση της μεταγραφής στα κύτταρα, δείχνοντας σταθερή έκφραση της άλλης ενδογενούς γονιδίου καθαριότητας στους δύο τύπους κυττάρων (WYHAZ, Σχήμα 8γ).

Τα κύτταρα είτε επωάζεται κάτω από 1% υποξία ή 20% νορμοξία για 48 ώρες πριν από τον ποσοτικό προσδιορισμό του επιπέδου του mRNA hsp90 με πραγματικού χρόνου PCR. Οι ράβδοι σφάλματος που παρουσιάζονται ως σφάλμα δείγμα του μέσου όρου (SEM) από τρία ανεξάρτητα πειράματα βιολογικών.

Η

Τα αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων συνοψίζονται και τα μπάρες σφάλματος παρουσιάζεται ως σφάλμα δείγμα του μέσου όρου (SEM ). α) εντάσεις φθορισμού των HeLa σε DMSO, ΜΕ180 σε DMSO και ΜΕ180 σε 100 ηΜ 17-AAG σε 2% υποξία κανονικοποιούνται με αυτό στο 20% νορμοξία. β) Οι φορές μεταβολές των επιπέδων mRNA CA9 κανονικοποιημένη σε 20% νορμοξία σε αυτά τα κύτταρα δείχνουν ότι η διαφορά, σε όρους δραστηριότητας HIF, μειώνεται με την παρουσία 17-AAG. γ) Η σταθερή έκφραση ενός άλλου γονιδίου housekeeping, τυροσίνη 3-μονοοξυγενάση /τρυπτοφάνη 5-μονοοξυγενάση πρωτεΐνη ενεργοποίησης, πολυπεπτίδιο ζήτα (YWHAZ), καταδεικνύει τα γενικά κανονική μεταγραφική δραστηριοτήτων σε αυτά τα κύτταρα κατεργασμένα είτε με DMSO ή 17-ΑΑΟ.

Συζήτηση

Εδώ δημιουργούμε και να χαρακτηρίζουν μια νέα δομή HIF δημοσιογράφος, στην οποία η έκφραση EYFP ρυθμίζεται από διαδοχικές επαναλήψεις της ελάχιστης HIF1α και θέσεις πρόσδεσης HIF2α. Χρησιμοποιώντας κύτταρα που έχουν μολυνθεί με φακοϊό του κατασκευάσματος HIF-HBr, δείχνουμε ότι τα κύτταρα με 6 διαδοχικές επαναλήψεις ο υποκινητής στο κατασκεύασμα (6U-HBR) δίνουν καλύτερη αναλογία σήματος προς υπόβαθρο από εκείνα με 3 ή 12 επαναλήψεις. Επίσης, από την άποψη της κινητικής ρεπόρτερ, το κατασκεύασμα 6U-HBR επιτυγχάνει ένα ισχυρότερο σήμα στη διαδικασία της αποοξυγόνωσης, ενώ τα κύτταρα με κατασκεύασμα 6U-αποσταθεροποιηθεί-HBR απεικονίζει ακριβέστερα τη μείωση των επιπέδων HIF κατά τη διαδικασία της επανοξυγόνωση. Επιπλέον, μέσω μελετών siRNA εναντίον HIF1α, HIF2α και HIF1β καθώς και υπερ-έκφραση μελέτες ndHIF1α και ndHIF2α, έχουμε αποδείξει ότι η κατασκευή είναι ειδικά HIF και είναι σε θέση να ανταποκριθεί σε τόσο HIF1α και HIF2α. Χρησιμοποιώντας 5 διαφορετικές καρκινικές κυτταρικές γραμμές που έχουν μολυνθεί με κατασκεύασμα 6U-HBr, παρατηρούμε ότι οι διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου έχουν διακριτά σήματα EYFP υπό τις ίδιες επίπεδα οξυγόνου, τα οποία συσχετίζονται με το συνολικό ποσό των HIF1 α και πρωτεΐνες HIF2 α σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές.

χρησιμοποίησαν το ρεπόρτερ να διερευνήσει διαφορά στην υποξική απόκριση των κυτταρικών σειρών καρκίνου του τραχήλου HeLa και ΜΕ180. Παρατηρήσαμε ότι οι δύο αυτές κυτταρικές γραμμές καρκίνου έχουν διακριτά σήματα 6U-HBR που συσχετίζεται με την ποσότητα των πρωτεϊνών HIFα σε απόκριση προς το ίδιο επίπεδο υποξία. Ομοίως, οι διαφορετικές συμπεριφορές ανάμεσα HeLa και ΜΕ180 υπό υποξία παρατηρούνται επίσης στην έκφραση αγγειογόνο παράγοντα ανάπτυξης [40], [41] καθώς και στην πρωτεασώματος, αποακετυλάσης ιστόνης [42] και δράση Hsp90 [43]. Μεταξύ αυτών, Hsp90 έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Σύμφωνα με τα προηγούμενα ανάλυση [43], δείχνουμε ότι ΜΕ180 έχει υψηλότερα επίπεδα Hsp90 mRNA από HeLa τόσο υπό φυσιολογική οξυγόνωση και υποξία. Υψηλότερες βασικό επίπεδο HIF συμπαράγοντα Hsp90 σε ΜΕ180 θα μπορούσε να συμβάλει στην παρατηρούμενη υψηλότερη δραστικότητα HIF, αφού hsp90 δέσμευση σε HIF έχει αναφερθεί για την προστασία έναντι HIFα VHL ανεξάρτητη αποικοδόμηση [9], [11]. Τα χαμηλά επίπεδα οξυγόνου αδρανοποίηση εξαρτάται PHD /VHL αποδόμηση του HIF, με αποτέλεσμα να σταθεροποιηθεί και ενεργό παράγοντα μεταγραφής HIF. Ωστόσο, HIFα τελικά υποβαθμίζεται σε συνθήκες υποξίας. Αυτό VHL-ανεξάρτητο αποικοδόμηση του HIF1α έχει αποδειχθεί ότι είναι RACK1 εξαρτώμενη [11]. Hsp90 συναγωνίζεται την δέσμευση να HIF1α RACK1, προστατεύοντας έτσι HIF1α εναντίον υποξικών υποβάθμιση. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι τα κύτταρα ΜΕ180 έχουν υψηλότερα επίπεδα της hsp90 και πιο σταθερή πρωτεΐνες HIFα σύγκριση με HeLa (Εικόνα 6). Δείχνουμε περαιτέρω ότι η μείωση του hsp90 σε ΜΕ180 μειώνει την διαφορά του επιπέδου HIF και δραστικότητα συγκριτικά με HeLa. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα διαφορετικά επίπεδα Hsp90 θα μπορούσαν να αιτιώδης για τα διαφορετικά επίπεδα δραστηριότητας HIF που παρατηρήθηκαν στις δύο τραχήλου καρκινικές κυτταρικές γραμμές κάτω από το ίδιο επίπεδο υποξία. Θα είναι ενδιαφέρον να δοκιμαστεί στο μέλλον αν οξυγόνου /PDH /VHL ανεξάρτητο αποικοδόμηση HIFα είναι γενικά το βασικό ρυθμιστή των διαφορών δραστηριότητας HIF παρατηρήθηκε σε καρκινικές κυτταρικές σειρές κάτω από το ίδιο επίπεδο υποξία.

Είναι γνωστό ότι τα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας είναι συχνά μολυσμένα με ένα ογκογόνο τύπου ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV), και HeLa μετασχηματίζεται με HPV18 ενώ ΜΕ180 με HPV68. HPV διαφορετικών τύπων ποικίλουν στην έκφραση και ρύθμιση των δύο πρωτογενών ογκογονίδια HPV, Ε6 και Ε7 [44], που είναι αρκετή για να μεταβάλει το επίπεδο HIF-1α. HPV11 Ε6 και HPV31 Ε6 μπορεί να διεγείρει την έκφραση του HIF-1α ως συνέπεια της ουμπικουϊτίνης που εξαρτώνται αποικοδόμηση της ρ53 [45], ενώ HPV16 Ε7 μπορεί να αλληλεπιδράσει με ένα σύμπλοκο λιγάση ουμπικουϊτίνης cullin-2 που μεσολαβεί VHL εξαρτώμενη HIFα αποικοδόμηση [46]. Θα είναι ενδιαφέρον να αποκαλύψει στο μέλλον αν οι διαφορετικές απαντήσεις στην υποξία που παρατηρήθηκαν σε HeLa και ΜΕ180 που σχετίζονται με το είδος των ογκογόνων έχουν μολυνθεί με.

Στην παρούσα μελέτη αναφέρουμε ένα νέο κατασκεύασμα HIF δημοσιογράφος που περιέχουν συνδυασμό επαναλήψεις των ελάχιστων θέσεων δέσμευσης του HIF ανάντη της ακολουθίας κωδικοποίησης EYFP. Δείχνουμε ότι το σήμα του ανταποκριτή εξαρτάται HIF και συσχετίζεται με τα κυτταρικά επίπεδα πρωτεΐνης HIF σε διάφορες κυτταρικές σειρές. Με τη χρησιμοποίηση αυτής της νέας κατασκεύασμα, βρίσκουμε ένα εκπληκτικό παραλλαγή της δραστηριότητας HIF σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές κάτω από το ίδιο επίπεδο υποξία. Αυτή η νέα δομή HIF δημοσιογράφος μπορεί να χρησιμεύσει ως εργαλείο για να καθορίσει γρήγορα τα επίπεδα δραστηριότητας HIF και ως εκ τούτου θεραπευτική ικανότητα των δυνητικών καταστολείς HIF σε επιμέρους μορφές καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

επαγωγή

Cells, καλλιέργεια ιστών και την υποξία

HeLa και ΜΕ180 (τραχηλικό καρκίνωμα), Α549 (καρκίνωμα πνεύμονος), κύτταρα U251 (γλοιώματος) ήταν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD). κύτταρα 786-O επιμολυσμένα με VHL άγριου τύπου ελήφθησαν από τον Dr. William G. Kaelin Jr. (Dana Farber-Institute, Boston, ΜΑ). Τα καρκινικά κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με πενικιλίνη, στρεπτομυκίνη και 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, Invitrogen, Carlsbad, CA). Τα κύτταρα πέρασαν με θρυψίνη /EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA) όταν φτάσει το 80% συρροή.

Η υποξία επαγωγή

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε θερμοκοιτίδες multi-αερίου (Sanyo, San Diego, CA ). Αέριο άζωτο τροφοδοτήθηκε στους θαλάμους προκειμένου να προκληθεί μια ελεγχόμενη μειωμένο ποσοστό οξυγόνου. Για νορμοξία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε θερμοκοιτίδες που περιέχει 5% CO

2 και ατμοσφαιρική συγκέντρωση O

2, περίπου 20% έως 21% O

2. Καθ ‘όλη αυτή η εργασία «φυσιολογική οξυγόνωση» αναφερόταν ως 20% O2.

λεντοϊών κατασκευή πλασμιδίων

Εμείς παράγεται HIF κατασκευή αναφοράς με θέση πρόσδεσης HIF1α συναίνεση CGTG ακολούθησε HIF2α ιστοσελίδα TACGTG μαζί ως μία μονάδα της θέσης πρόσδεσης για τους παράγοντες HIFα και επανέλαβε τους παράλληλα 12 φορές (12U-ΒΕΣ), με 5 ζεύγη βάσεων των νουκλεοτιδίων των διαφόρων συνδυασμών απόσταση μεταξύ των. Επαγωγή CACAG στοιχείο, ένα στοιχείο DNA αναγκαίες για υποξική επαγωγή, ήταν ομοιόμορφα εισάγονται μέσα στις αλληλουχίες ολόκληρο τρεις φορές για να βοηθήσει στη διαδικασία επαγωγής. Οι τελικές αλληλουχίες HIF-δέσμευσης συντέθηκαν απευθείας από Integrated DNA Technologies, Inc, Coralville, Αϊόβα (Σχήμα S1). ΤΚ ελάχιστος προαγωγός ακολουθείται από 770 bps β-σφαιρίνης αλληλουχίες ιντρονίων και EYFP ενισχύθηκε από pBARL πλασμίδιο (ευγενική προσφορά του εργαστηρίου Δρ Randall Σελήνης, του Πανεπιστημίου της Ουάσινγκτον, Seattle, WA) και συνδέονται με την ακολουθία HIF-δεσμευτική με σύντηξη PCR. Οι ακολουθίες HIF-ΤΚ-EYFP περαιτέρω συνδέθηκαν σε ένα λεντοϊού πλασμίδιο pRRL-οΡΡΤ-Χ-PRE-SIN [47] (ευγενική προσφορά του εργαστηρίου Δρ William Osborne, University of Washington, Seattle, WA) μεταξύ των θέσεων Clal και Xhol. 6U-HBR και 3U-HBR κατασκευάστηκαν με τον ίδιο τρόπο, εκτός από τις αλληλουχίες HIF-δεσμευτική περιέχουν μόνο έξι δεσμευτικές επαναλήψεις (6U-HBR) ή τρεις επαναλήψεις (3U-HBR). Για τη δημιουργία 6U-ΒΕΣ-αποσταθεροποίησε έκδοση, οι ακολουθίες τομέα της ορνιθίνης ποντίκι αποκαρβοξυλάση 422-461 πρώτα ενισχύθηκαν από το πλασμίδιο Μ38 TOP-dGFP (ευγενική προσφορά του εργαστηρίου Δρ Randall Σελήνη) και στη συνέχεια να εισαχθεί σε 6U-ΒΕΣ κατασκευάσει μέσα ΜΜ site μετά το 3 ‘αλληλουχία EYFP.

παραγωγή Lentivirus και σταθερή μεταγωγή των κυτταρικών γραμμών

λεντοϊών πλασμίδια επιμολύνθηκαν σε κυτταρικές σειρές FT293 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) με διαμόλυνση φωσφορικού ασβεστίου για να παραχθεί φακοϊικό σωματίδια. Συγκεκριμένα, μεταφέροντας πλασμίδιο (12U-HBr, 6U-HBr, 3U-HBr, ή 6U-HBR-αποσταθεροποιηθεί κατασκεύασμα), πλασμιδίου πακεταρίσματος, VSVG πλασμίδιο και το πλασμίδιο REV διαμολύνθηκαν μαζί σε 23:15:8:11.5 αναλογία, και 25 μg μικτών πλασμίδια διαμολύνθηκαν ανά πλάκα 150 mm, με 1 mL 2Χ HBS και 0,1 mL 2,5 Μ CaCl

2. Μετά την επιμόλυνση, τα μέσα άλλαξαν μετά από 24 ώρες και ιικά υπερκείμενα συλλέχθηκαν και διηθείται μετά 72 ώρες. Για να αποκτήσετε συμπυκνωμένου ιού, τα ιικά υπερκείμενα περαιτέρω φυγοκεντρήθηκε στις 6100 rpm για 17 ώρες στους 4 ° C. Το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 1Χ TBS (50 mM Τπδ.ΗΟΙ, ρΗ 7.4 και 150 mM NaCl) και, στη συνέχεια, αποθηκεύεται σε -80 ° C πριν από τη χρήση. Για τη μεταγωγή κυτταρικές γραμμές με τον ιό, κατάλληλη ποσότητα ιού προστέθηκαν άμεσα στο μέσο με την παρουσία βρωμιούχου εξαδιμεθρίνης σε 4 ng /ml (Polybrene, Invitrogen Inc, Carlsbad, CA) και τα μέσα ενημέρωσης αλλάχθηκε μετά από 24 ώρες.

ενεργοποιούμενη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS) ανάλυση

τα κύτταρα που πρόκειται να αναλυθεί θρυψινοποιήθηκαν από τις πλάκες, φυγοκεντρήθηκε προς τα κάτω και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδης επί τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την ανάλυση. Πρότυπο ρυθμίσεις εφαρμόστηκαν σε διαλογή κυττάρων με κατάλληλες τάσεις κανάλι και τουλάχιστον 30.000 κύτταρα αναλύθηκαν για κάθε πείραμα. FITC κανάλι χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του φθορισμού EYFP. FlowJo (Tree Star, Inc. Ashland, OR) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση των δεδομένων και τις αξίες FITC ορίστηκαν ως ο γεωμετρικός μέσος της έντασης φθορισμού της EYFP πληθυσμό θετικό για υποξική δείγματα. Για δείγματα επωάστηκαν σε 20% O

2, οι εντάσεις ορίστηκαν ως ο γεωμετρικός μέσος της έντασης φθορισμού του EYFP του συνολικού πληθυσμού (EYFP αρνητικό).

Μη αποικοδομήσιμο HIF (ndHIF) υπερέκφραση

για να ληφθεί σταθερή έκφραση ιδιοσυστατικά HIFα πρωτεΐνης, ndHIF υπερεκφράζουν πλασμίδια (Addgene πλασμίδιο 19005 και 19006) χρησιμοποιήθηκαν, κατά την οποία δύο οι θέσεις Proline του HIF cDNA άλλαξαν σε αλανίνη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [48]. Ρετροϊών κατασκευασμένα από αυτά τα πλασμίδια μολύνθηκαν σε HeLa και κυτταρικές γραμμές σε Α549 παρουσία βρωμιούχου εξαδιμεθρίνης σε 4 ng /ml (Polybrene, Invitrogen Inc. Carlsbad, CA) και τα μέσα ενημέρωσης αλλάχθηκε μετά από 24 ώρες. Υπερέκφραση του HIF1α και HIF2α επιβεβαιώθηκε από τις δυτικές κηλίδες, όπως φαίνεται στο Σχήμα S6.

siRNA εναντίον δοκιμασία HIF

siRNAs εναντίον του παράγοντα HIF ήταν δώρο του Δρ Ζαν Zhang [38]. siRNAs ήταν παροδικές επιμολύνθηκαν σε κύτταρα στις 6 φρεατίων με Lipofectamine 2000 (Invitrogen Inc. Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες Lipofectamine 2000.