Αφηρημένο

πνεύμονα (LC) με διαφορετικούς υποτύπους του είναι γενικά γνωστή ως θεραπεία του καρκίνου ανθεκτική με την υψηλότερη ποσοστό νοσηρότητας σε όλο τον κόσμο. αντίσταση Θεραπεία ενός όγκου πιστεύεται ότι σχετίζεται με τον καρκίνο βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) εντός των όγκων. Υπήρξαν ενδείξεις ότι ο καρκίνος του πνεύμονα διαδίδεται και συντηρείται από έναν μικρό πληθυσμό των ΚΕΠ. Να μελετήσει αυτό το θέμα έχουμε δημιουργήσει μια ομάδα 15 πρωτοπαθούς καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών (PLCCLs) από 20 φρέσκα πρωτοπαθείς όγκους χρησιμοποιώντας ένα ισχυρό σύστημα καλλιέργειας χωρίς ορό. Εμείς στη συνέχεια επικεντρώθηκε στην αναγνώριση των ΚΕΠ πνεύμονα με τη μελέτη αυτών των κυτταρικών γραμμών που προέρχονται από 4 εκπρόσωπος υποτύπους καρκίνου του πνεύμονα όπως μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC), καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου (LCC), πλακώδες καρκίνωμα (SCC) και το αδενοκαρκίνωμα (AC). Εντοπίσαμε ένα μικρό πληθυσμό κυττάρων έντονα θετικά για CD44 (CD44

υψηλή) και ένα κύριο πληθυσμού που ήταν είτε ασθενώς θετικό ή αρνητικό για CD44 (CD44

χαμηλή /-). Συν-έκφραση των CD90 περαιτέρω περιόρισε το υποθετικό πληθυσμό βλαστικών κυττάρων σε PLCCLs από μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και LCC ως σφαιροειδή σχηματίζουν κύτταρα βρέθηκαν κυρίως εντός του CD44

highCD90

+ υπο-πληθυσμού. Επιπλέον, αυτά τα CD44

highCD90

+ κυττάρων αποκάλυψε μεσεγχυματικά μορφολογία, αυξημένη έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών

N-καδχερίνη

και

βιμεντίνης

, αυξημένα επίπεδα mRNA των σχετικών εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων γονίδια

Nanog

και

Oct4

και αυξημένη αντοχή σε ακτινοβολία σε σύγκριση με άλλες υπο-πληθυσμούς που μελετήθηκαν, γεγονός που υποδηλώνει την CD44

highCD90

+ πληθυσμού ένας καλός υποψήφιος για τα ΚΕΠ του πνεύμονα. Τόσο CD44

highCD90

+ και CD44

highCD90

– κυττάρων στο PLCCL προέρχεται από SCC σχηματίζονται σφαιροειδή, ενώ τα CD44

χαμηλή /- κύτταρα που στερούνται αυτή τη δυνατότητα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η CD44

highCD90

+ υπο-πληθυσμός μπορεί να αντιπροσωπεύει ΚΕΠ σε SCLC και LCC, ενώ στην SCC πνεύμονα υπότυπο του καρκίνου, CSC δυναμικών βρέθηκαν εντός του CD44

υψηλής υπο-πληθυσμού.

Παράθεση: Wang P, Q Gao, Suo Ζ, Munthe Ε, Solberg S, Ma L, et al. (2013) Ταυτοποίηση και Χαρακτηρισμός κύτταρα με τον καρκίνο ιδιότητες βλαστοκυττάρων σε ανθρώπινα πρωτογενή καρκίνο του πνεύμονα Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 8 (3): e57020. doi: 10.1371 /journal.pone.0057020

Συντάκτης: Dean G. Τανγκ, το Πανεπιστήμιο του Τέξας ΜΌ Anderson Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 Ιουνίου του 2012? Αποδεκτές: 21 Ιαν 2013? Δημοσιεύθηκε: 4, Μάρτη του 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το νορβηγικό Συμβούλιο έρευνας (SFI-CAST). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η (CSC) θεωρία »του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων» υπονοεί μια ιεραρχική οργάνωση εντός του όγκου στην οποία ΚΕΠ αντιπροσωπεύει την κορυφή της ιεραρχίας. Παρόμοια με φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων, ΚΕΠ έχουν την ικανότητα να υποστούν αυτο-ανανέωση, καθώς και ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση. Αυτά τα βασικά χαρακτηριστικά επιτρέπουν ΚΕΠ για την έναρξη και τη διατήρηση των όγκων. Εκτός από την κλασσική έννοια, δηλαδή CSC, διάφοροι όροι έχουν χρησιμοποιηθεί στην πρόσφατη επιστημονική βιβλιογραφία για να περιγράψει τα βασικά χαρακτηριστικά της ΚΕΠ όπως αυτο-ανανέωση και όγκου έναρξη /διατήρηση ιδιοκτησίας. Μεταξύ άλλων είναι τέτοιους όρους όπως καρκινικών κυττάρων κίνηση (TIC), ο καρκίνος κίνηση κυττάρων (CIC) και του όγκου πολλαπλασιαστικού κυττάρου (TPC). Στην έκθεση αυτή θα χρησιμοποιήσουμε τον όρο CSC να χαρακτηρίσει τα κύτταρα που ήταν σε θέση να ξεκινήσει και να διατηρήσει το σχηματισμό όγκων στα ζώα και μακροπρόθεσμα υγρή καλλιέργεια.

Οι τρέχουσες μελέτες στον τομέα της έρευνας για τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων έχουν παράσχει αυξανόμενα στοιχεία για την ύπαρξη και την ταυτοποίηση των ΚΕΠ με τη χρήση αρκετών ειδικών βιοδεικτών, όπως CD44, CD133 και CD90. Οι δείκτες γίνει ευρέως αποδεκτό για την απομόνωση των ΚΕΠ στο ανθρώπινο αιματολογικές κακοήθειες [1], [2], καθώς και σε στερεούς όγκους [3] – [11]. Περαιτέρω, ΚΕΠ έχουν βρεθεί να είναι πιο ανθεκτικά στην συμβατική χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία από τον κύριο πληθυσμό των πιο διαφοροποιημένα καρκινικά κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι η ΚΕΠ μπορεί να παραμείνει σε μια υπολειπόμενη όγκων μετά τη θεραπεία και να συμβάλλουν στην υποτροπή του καρκίνου και εξαπλώνεται. ΚΕΠ Ως εκ τούτου, οι νέες θεραπείες που στοχεύουν δυνητικά μπορεί να αποτρέψει την επανεμφάνιση του όγκου και παρατείνει την επιβίωση των ασθενών. Η επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) διαδραματίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη [12]. Προκαλεί επιθηλιακά κύτταρα να χάνουν επιθηλιακά συμπεριφορά τους, αλλάζοντας τη μορφολογία τους και κυτταρικές ιδιότητες για να μοιάζουν με μεσεγχυματικά κύτταρα [13]. EMT έχει προταθεί να συμβάλει στην επεμβατική και μεταστατική ανάπτυξη πολλών τύπων καρκίνου [14] – [17]. Πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι τα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με κύτταρα από επιθηλιακούς καρκίνους που έχουν μια μεσεγχυματικά φαινότυπο εκφράζουν δείκτες που σχετίζονται με EMT [15].

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο, και έχει κακή πρόγνωση με ποσοστά επιβίωσης 5 ετών περίπου 15%. Σύμφωνα με την ιστολογική ανομοιογένεια, οι πνεύμονες καρκινώματα κατηγοριοποιούνται σε τέσσερις μείζονες υπότυπους: μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (SCLC), πλακώδες καρκίνωμα (SCC), καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου (LCC) και το αδενοκαρκίνωμα (AC). Σε αυτή τη μελέτη, μετά την υπόθεση «Cancer Stem Cell», εστιάσαμε στην αναγνώριση και τον χαρακτηρισμό των ΚΕΠ στο προαναφερθέν υποτύπους καρκίνου του πνεύμονα.

Ο δείκτης κυτταρικής επιφάνειας CD133 έχει προηγουμένως ταυτοποιηθεί ως ένα αξιόπιστο δείκτη για ΚΕΠ σε ορισμένες από υποτύπους καρκίνου του πνεύμονα [18]. Ωστόσο, η αξιοπιστία αυτού του δείκτη ως δείκτης CSC για τον καρκίνο του πνεύμονα έχει πρόσφατα αμφισβητηθεί [19]. Ως εκ τούτου, εστιάσαμε στην άλλη δείκτη, δηλαδή CD44, η οποία έχει προταθεί για το χαρακτηρισμό CSCs σε μαστού, του προστάτη, κεφαλής και λαιμού, του παχέος εντέρου, του παγκρέατος και γαστρικών καρκίνων [3], [4], [9] – [11], [ ,,,0],20].

σε αυτή τη μελέτη, επωφεληθήκαμε από τα κύρια πνεύμονα καρκινικούς ιστούς που αφαιρούνται κατά την εκτομή και επικεντρώθηκε στην ίδρυση της PLCCLs από φρέσκα απομονωθεί όγκους. Υποθέσαμε ότι PLCCL μπορεί να παρέχει μια πιο αντιπροσωπευτική και κατάλληλη πηγή των καρκινικών κυττάρων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ταυτοποίηση των κυττάρων ή κυτταρικών πληθυσμών με ιδιότητες βλαστικών κυττάρων-παρόμοια. Δημιουργήσαμε πρώτα επιτυχώς ένα πάνελ των πρωτοπαθή καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές από πρόσφατα ληφθέντα δείγματα από τις μείζονες υπότυπους του καρκίνου του πνεύμονα. Βασίζονται σε λεπτομερείς φαινοτυπική και λειτουργική ανάλυση αντιπροσωπευτικών κυτταρικών σειρών από SCLC, LCC και SCC, παρέχουμε στοιχεία που δείχνουν ότι CD44

υψηλή πληθυσμιακή ενδέχεται να φέρουν ΚΕΠ σε αυτούς τους υποτύπους του καρκίνου. Επιπλέον, η συν-έκφραση του CD90 περαιτέρω περιόρισε τον πληθυσμό των ΚΕΠ σε SCLC και LCC. Η εικόνα για το AC, ωστόσο, παραμένει λιγότερο σαφής, και προς το παρόν δεν έχουμε καμία πειστική απόδειξη ότι είτε των δεικτών, δηλαδή CD44 και CD90, είναι χαρακτηριστική για ΚΕΠ σε αυτό το συγκεκριμένο υπότυπο του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Συλλογή των δειγμάτων όγκου και δημιουργία κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα πρωτοβάθμια

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Περιφερειακή Επιτροπή Ηθικής και του Διοικητικού Institutional Review του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου του Όσλο και εκτελείται σύμφωνα με τις οδηγίες του σύμβαση του Ελσίνκι. Κατά υπέγραψε συγκατάθεση, ανθρώπινο πνεύμονα καρκινικούς ιστούς ελήφθησαν από 20 ασθενείς με πρωτοπαθή καρκίνο του πνεύμονα (εύρος ηλικίας 55-81 ετών) που υποβάλλονται σε λοβεκτομή ή πνευμονεκτομή του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου του Όσλο από τον Ιούλιο του 2007 έως τον Οκτώβριο του 2009. Η ιστολογική διάγνωση προσδιορίστηκε με βάση μικροσκοπικά χαρακτηριστικά του κύτταρα καρκινώματος (Πίνακας 1).

η

Φρέσκο ​​λαμβάνεται ιστό του όγκου (εντός 1-2 ωρών μετά την χειρουργική αφαίρεση) πλύθηκε σε μέσο RPMI-1640 (Invitrogen, USA) που περιέχει πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (PS, πενικιλλίνη 100 U /ml και στρεπτομυκίνη 100 μg /ml? Lonza, Βέλγιο). τα αιμοφόρα αγγεία και του συνδετικού ιστού αφαιρέθηκαν προσεκτικά και το καρκινικό μέρος στη συνέχεια κόπηκε σε μικρά κομμάτια λιγότερο από 1 mm

3 χρησιμοποιώντας νυστέρι, που ακολουθείται από εκτεταμένη πλύση σε μέσο RPMI-1640 και φυγοκέντρηση στα 300 g για 5 λεπτά. Τέλος, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε RPMI-1640 που περιείχε κολλαγενάση II (Invitrogen, USA) σε συγκέντρωση 200 U /ml και χωνεύτηκε για 2-4 ώρες στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή. Η ενζυματική πέψη διεκόπη όταν περισσότερα από τα κύτταρα ήταν στην ενιαία εναιώρημα κυττάρων. Μετά την πλύση σε μέσο RPMI-1640 και 3x φυγοκέντρηση στα 300 g για 5 λεπτά, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε πρότυπο καλλιέργειας ιστού επικαλυμμένων φιαλών (Corning Life Sciences, USA) και καλλιεργήθηκαν εντός της οριοθετημένης κερατινοκύτταρα ορού Ελεύθερη Medium (DK-SFM) συμπληρωμένο με L -γλουταμίνη (Invitrogen, USA), EGF 20 ng /ml, βασικό FGF-10 ng /ml (PeproTech Inc., USA), 2% Β27 (Invitrogen, USA), PS και αμφοτερικίνη Β (0,25 μg /ml? Invitrogen, ΗΠΑ). Οι καλλιέργειες όλων PLCCLs διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2. Το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε κάθε 2-3 ημέρες. Τα κύτταρα περάστηκαν μετά απόσπαση με TrypLE ™ Express (Invitrogen, USA), όταν τα κύτταρα έφθασαν 80-90% συρροή. Όλες οι μελέτες πραγματοποιήθηκαν με τις αρχικές πέντε περάσματα των καθιερωμένων PLCCLs.

Απομόνωση νουκλεϊκών οξέων και η λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA δοκιμασία

Για να πραγματοποιήσετε μια γενετικό αποτύπωμα για κάθε νέο κυτταρικές σειρές, ανάλυση DNA λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων διεξήχθη στις αντιπροσωπευτικές PLCCLs (LC004, LC006, LC007 και LC021), καθώς και σε μια εκ νέου καθιερωμένη κυτταρική γραμμή από ξενομόσχευμα της LC021. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο Dulbecco (DPBS, Invitrogen) πλυμένα ιζήματα κυττάρων. Ολικό γονιδιωματικό DNA λήφθηκε με χρήση NucleoSpin κιτ Tissue (Macherey-Nagel, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ταυτότητα των προφίλ DNA προσδιορίστηκε με προφίλ STR χρησιμοποιώντας Powerplex 16 System (Promega, Madison, WI). Αυτό το πακέτο ενισχύει 15 STR τόπους και αμελογενίνης για τον προσδιορισμό του φύλου: Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, FGA, TPOX, D8S1179, VWA, αμελογενίνη, Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317 και D5S818. Τα προϊόντα της PCR ήταν μέγεθος προσδιορίζεται σε MegaBACE 1000 (Applied Biosystems, USA) χρησιμοποιώντας το λογισμικό Θραύσμα Profiler (GE Healthcare). Αυτά τα αποτυπώματα στη συνέχεια σε σύγκριση με τα προφίλ DNA σε μια βάση δεδομένων δακτυλικού αποτυπώματος κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα που είχε καθοριστεί προηγουμένως για την εξασφάλιση τη μοναδικότητά τους.

Ανοσοϊστοχημεία

Τα πρωτογενή καλλιεργημένα κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα είχαν ενσωματωθεί σε παραφίνη μπλοκ η ακόλουθη μέθοδος: τα κύτταρα από το υγρό καλλιέργειας αποκολλήθηκαν και πλύθηκαν με DPBS και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 300 g για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε προσεκτικά πριν προστέθηκαν και αναμίχθηκαν με περιστροφή του σωλήνα 3 σταγόνες πλάσματος και 2 σταγόνες της θρομβίνης. Ρυθμισμένη φορμαλίνη (4%) προστέθηκε μετά το μίγμα έπηξε. Το πηγμένο μάζα στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε χαρτί λινό πριν ενσωματωμένο σε παραφίνη μπλοκ με τυπική διαδικασία. Ορισμένες τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) για την αξιολόγηση κυτταρική μορφολογία, ενώ άλλα τμήματα χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημεία ανάλυση (IHC). Τέσσερις μικρόμετρο παχύ τμήματα αποκηρώθηκαν και ενυδατωμένο σε διαβαθμισμένη αιθανόλη. Για να ξεσκεπάσει τα επίτοπα, οι τομές στη συνέχεια σε μικροκύματα σε διαφορετικά ρυθμιστικά βελτιστοποιηθεί για διαφορετικά αντισώματα. Χαμηλό ρΗ 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ = 6.0) χρησιμοποιήθηκε για αντισώματα Ρ53, Ber-ΕΡ4 και CD44. Για την αναστολή της ενδογενούς υπεροξειδάσης, οι τομές επωάστηκαν με 3% υπεροξείδιο του υδρογόνου (DakoCytomation, USA) για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-ανθρώπινο Ρ53, CD44 και το Ber-EP4 πρωτογενή ποντικού (ϋΑΚΟ, 1:1000, 1:100 και 1:300 αραιώσεις, αντίστοιχα) και CD133 (Miltenyi Biotec, κλώνος AC133 1 αραίωση 1:40 /) αντισώματα για 30 λεπτά σε ΘΔ και ακολούθησε επώαση με αντίστοιχα δευτερογενή αντισώματα για 30 λεπτά σε RT και βάφτηκαν με 3,3′-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική (Dako EnVision ™ + Σύστημα υπεροξειδάσης (DAB) (K4007, DakoCytomation, USA)) πριν από την αντίθετη χρώση με αιματοξυλίνη, αφυδατωμένο και τοποθετημένα σε Diatex. Όλες οι τομές ξεπλένονται καλά με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Tween πλύσιμο (Dako Cytomation, USA) μετά από κάθε βήμα επώασης. Τμήματα από το μπλοκ παραφίνης που περιέχει ανθρώπινη σεμίνωμα και καρκίνου του μαστού δείγμα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι για αντισώματα Ρ53, Ber-ΕΡ4 και CD44, αντίστοιχα? Τμήματα από το μπλοκ παραφίνης που περιέχει κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου Caco-2 χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για CD133 αντίσωμα. αντισώματα ελέγχου ισοτύπου στην ίδια συγκέντρωση χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Όλοι οι έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν και η αντιδραστικότητα του αντισώματος επαληθεύτηκε πριν πειραματικές εφαρμογές των αντισωμάτων. Κάθε χρωματισμένο τμήμα επανεξετάστηκε ανεξάρτητα από δύο παθολόγους.

Τα πειράματα σε ζώα

Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από και διεξάγεται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές που καθορίζονται από το Διοικητικό Συμβούλιο Δεοντολογίας Έρευνας των ζώων στο Πανεπιστήμιο του Όσλο. Γυναίκα NOD /SCID ποντίκια (NODSC-Μ-F /M-M Ομόζυγος NOD /mrkBOMTac-Prkdcscid? Taconic, Δανία) αγοράστηκαν. Αφού κρατήθηκε σε καραντίνα μιας εβδομάδας για τις παρακολούθηση στο στείρο περιβάλλον της εγκατάστασης ζώων στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Όσλο, Rikshospitalet, 4-5 εβδομάδων NOD /SCID ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα πειράματα. Για να αξιολογηθεί η ογκογονικότητα των καθιερωμένων PLCCLs, 3 × 10

6 κύτταρα της κάθε κυτταρικής σειράς αιωρήθηκε σε DK-SFM εμβολιάσθηκαν υποδορίως στην δεξιά πλευρά του NOD /SCID ποντίκια (3 ποντίκια σε κάθε ομάδα) σε μία μέγιστη όγκο 100 μλ. Τα ποντίκια ελέγχθηκαν δύο φορές την εβδομάδα και ο όγκος μεγέθους μετρήθηκε με παχύμετρο. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν με αυχενική εξάρθρωση, όταν το μέγεθος του όγκου έφθασε μία διάμετρο 15 mm. Τα ξενομοσχεύματα στη συνέχεια απομακρύνθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για ιστολογική ανάλυση και την καθιέρωση των καλλιεργειών υγρού κυττάρου. Serial ξενο-μεταμοσχεύσεις διεξήχθησαν με την κυτταρική γραμμή LCC LC006 με εμφύτευση κομμάτια του πρωτογενούς υποδορίως ξενομοσχευμάτων σε δεύτερο παραλήπτη NOD ποντίκια /SCID. Ξενομοσχεύματα που προέρχονται από κάθε διέλευση αφαιρέθηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε 4% ρυθμισμένη φορμαλίνη για ιστολογική ανάλυση.

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και ενεργοποιούμενη με φθορισμό ταξινόμηση κυττάρων (FACS)

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε σε PLCCLs σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης. Τα κύτταρα πρώτα αποσπαστεί με TrypLE ™ Express και πλένεται με DPBS. Re-αιωρούμενα κύτταρα μετρήθηκαν και μεταφέρθηκαν σε 75 mm πολυστυρόλιο με στρογγυλό πυθμένα δοκιμαστικούς σωλήνες (BD Falcon, USA) σε συγκέντρωση κυττάρων 1 χ 10

6 κύτταρα /ml, και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με αντισώματα σε αραιώσεις που καθορίζεται από τις προηγούμενες τιτλοδότηση. ρυθμιστικό χρώσης Ανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη (DPBS + 0,1% αλβουμίνη ανθρώπινου ορού (Octapharma, Στοκχόλμη, Σουηδία)) και 5 μί 10 mg /ml γ-σφαιρίνη (Gammagard, Baxter, UK) προστέθηκε στα κύτταρα για να μπλοκάρουν το FcR και την ελαχιστοποίηση μη ειδική σύνδεση αντισωμάτων. Fluorochrome συζευγμένα μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) προστέθηκαν στους δοκιμαστικούς σωλήνες σε συγκεντρώσεις κορεσμού και τα κύτταρα επωάστηκαν για 20 λεπτά σε πάγο αποφυγή της έκθεσης φως. Μια εξέταση για δείκτες εκτελέστηκε με μια ομάδα mAbs (βλέπε λεπτομερή δεδομένα στον Πίνακα 2) σε τέσσερις PLCCLs εκπροσωπούν κάθε υπότυπο του καρκίνου του πνεύμονα. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ισότυπο mAbs (BD Pharmingen, USA) χρησίμευσαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Διαφορετικές πληθυσμοί κύτταρα ταξινομήθηκαν με βάση τις εκφράσεις του CD44 και μόνο, ή σε συνδυασμό με CD90 χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο διαλογέα FACSAria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). δεδομένα ροής αποκτήθηκαν στο FACSAria II ή LSR II κυτταρομετρητή (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό BD FACSDiva (Version 6.1.3). Η βιωσιμότητα των ταξινομημένων κυττάρων συνήθως ελέγχεται με χρήση Trypan blue (Invitrogen, USA) χρώση και συνήθως ήταν & gt? 70%

Η

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

FACS ταξινομημένο CD44

υψηλή. και CD44

χαμηλής /- κυττάρων σε πυκνότητα 150 ή 500 κύτταρα ανά φρεάτιο καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν σε 200 μΙ DK-SFM με συμπληρώματα σε πρότυπο επικαλυμμένες πλάκες 96 φρεατίων. Wells μέσο που περιέχει χρησιμοποιήθηκαν μόνο ως φόντο αρνητικός έλεγχος. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα για μία ημέρα, πριν χρησιμοποιηθούν στη δοκιμασία πολλαπλασιασμού. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε κατά τις επόμενες 8 ημέρες χρησιμοποιώντας CellTiter 96® Υδατικό One Λύση Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού kit (Promega, Madison, WI) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή. Η απορρόφηση στα 490 nm μετρήθηκε με ένα μετρητή πλακιδίων Wallac Victor2 (Perkin Elmer, Waltham, ΜΑ). Οι καμπύλες ανάπτυξης συντάχθηκαν σύμφωνα με τη μέση τιμή της απορρόφησης, που σχετίζονται με το φόντο.

2 διαστάσεων (2D) αποικία μοναδικό κύτταρο που αποτελούν και την ετερογένεια

δοκιμασία

CD44high και CD44

χαμηλή /- κύτταρα από την SCLC LC004 κυτταρική γραμμή και το LCC κυτταρική γραμμή LC006 ταξινομήθηκαν και σπάρθηκαν σε ένα μόνο κύτταρο ανά φρεάτιο σε τυποποιημένα επικαλυμμένες πλάκες 96 φρεατίων που περιέχουν 200 μΙ DK-SFM συμπληρωμένο με EGF 20 ng /ml, βασικό FGF 10 ng /ml, και 2% Β27. Ενιαία ελάσματα κυττάρων ελέγχθηκε με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Nikon, Γερμανία). Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO2 υγροποιημένο επωαστήρα. Μετά από 2 εβδομάδες, ο αριθμός των θετικών φρεάτων που περιέχουν αποικίες μετρήθηκε και αξιολογήθηκαν μορφολογικά χαρακτηριστικά των αποικιών. Για τη μελέτη αυτο-ανανέωση και τη διαφοροποίηση των μεμονωμένων κυττάρων, οι αποικίες διαφορετικών τύπων δηλ holoclones, meroclones και paraclones, υποβλήθηκαν σε σειριακά περάσματα επιλέγοντας και την εκ νέου σπορά τους πρώτα σε 24-φρεατίων, τότε πλάκες 6-φρεατίων (Corning Life Science , USA), και τελικά σε φιάλες (Corning Life Science, USA) όπου επεκτάθηκαν περαιτέρω. ανάπτυξη αποικίας στην αποικία μόνο κύτταρο 2D δοκιμασία που αποτελούν και τις μακροπρόθεσμες υγρές καλλιέργειες που προέρχονται από αυτές τις αποικίες παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Nikon, Γερμανία).

αποικία 2D σχηματισμό δοκιμασία της αποτελεσματικότητας

FACS ταξινομημένο CD44

υψηλή, CD44

χαμηλή /- και CD44

highCD90

+ και CD44

highCD90

– κυττάρων από τις κυτταρικές σειρές SCLC LC004 και LCC LC006 σπάρθηκαν εις τριπλούν σε μια πυκνότητα 200 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τυποποιημένα επικαλυμμένη πλάκα 6 φρεατίων (Corning Life Science, USA) που περιέχει 5 ml DK-SFM με συμπληρώματα ανά φρεάτιο. Τα ταξινομημένα κύτταρα διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια στους 37 ° C σε 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστή για περίπου 10 ημέρες. Όταν οι παραγόμενες αποικίες ήταν ορατές και περιείχαν & gt? 100 κύτταρα, το υπερκείμενο αναρροφήθηκε και τα φρεάτια ξεπλύθηκαν δύο φορές με DPBS, μονιμοποιήθηκαν σε 4% ρυθμισμένη φορμαλίνη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου που ακολουθείται από χρώση με κρυσταλλικό ιώδες για άλλα 15 λεπτά σε RT. Μετά το ξέπλυμα μακριά τη χρωστική ουσία, ο αριθμός των αποικιών μετρήθηκε και η αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικίας (CFE), δηλαδή ο αριθμός των αποικιών ανά επιχρυσωμένο κυττάρων, υπολογίστηκε και σύγκριση μεταξύ διαφορετικών υπο-πληθυσμών.

σφαιροειδές δοκιμασία σχηματισμού

FACS ταξινομημένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 100 κυττάρων ανά φρεάτιο σε εξαιρετικά χαμηλή προσκόλληση (ULA) πλάκα 96 φρεατίων (Corning Incorporated) που περιέχει 200 ​​μΙ DK-SFM με συμπληρώματα και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένο εκκολαπτήριο έως ότου τα κύτταρα άρχισαν σχηματίζουν σφαιροειδή. Το μέσο αλλάχθηκε κάθε 2 ημέρες με προσεκτική απομάκρυνση 50 μΐ από το ανώτερο στρώμα του μέσου και αντικατάσταση αυτού με ίσο όγκο φρέσκου μέσου. Τα φρεάτια επιθεωρήθηκαν κάθε 2 ημέρες χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Όταν τα σφαιρίδια ήταν αρκετά μεγάλη (οι περισσότερες από τις κυτταρικές σφαιροειδή ήταν & gt? 200 μm)., Που μετρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν (Nikon, Γερμανία)

εκχύλιση RNA και σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση

Ολικό RNA εκχυλίσθηκε από 10

5 FACS ταξινομημένα κύτταρα και ακολούθως μεταγράφηκε ανάστροφα με χρήση Taqman κυττάρων-to-CT kit (Applied Biosystems, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή. Real-time PCR χρησιμοποιώντας Taq-Man Gene σύστημα Expression Assay (Applied Biosystems, USA) επί 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη 2.3 Software SDS ( Applied Biosystems, USA). Κάθε δείγμα, συμπεριλαμβανομένων των ορούς ελέγχου χωρίς πρότυπο, διεξήχθη εις διπλούν. PCR αντίδραση χωρίς εκμαγείο χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Θερμικές συνθήκες κύκλων ήταν 50 ° C για 2 λεπτά και 95 ° C για 10 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους των 15s στους 95 ° C, που ακολουθείται από 1 λεπτό στους 60 ° C. Τα επίπεδα έκφρασης προσδιορίστηκαν για τα ακόλουθα γονίδια

Nanog

(δοκιμασία ID 8S02387400_gl),

Oct4

(δοκιμασία ID Hs03005111_g1),

Sox2

(δοκιμασία ID Hs01053049_sl),

Ε-καδχερίνη

(δοκιμασία ID Hs01023895_m1),

Ν-καδερίνη

(δοκιμασία ID Hs00169953_m1),

βιμεντίνης

(δοκιμασία ID Hs00958111_ml),

ομάδα υψηλής κινητικότητας AT-hook 2 (HMGA2)

(δοκιμασία ID HS00171569_ml) και

φωσφογλυκερικής κινάσης 1

(

PGK1

) (δοκιμασία ID Hs99999906_m1). Η έκφραση των γονιδίων-στόχων που σχετίζονται με την έκφραση του

PGK1

και κανονικοποιούνται με τα κύτταρα ελέγχου χωρίς διαλογή χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ddCT.

Ακτινοβολία ευαισθησία

δοκιμασία

FACS ταξινομημένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 500 κύτταρα ανά φρεάτιο εις διπλούν σε πρότυπο επικαλυμμένες πλάκες 96 φρεατίων (Corning Incorporated) που περιέχει 200 ​​μΙ DK-SFM με συμπληρώματα. Μετά από 24 ώρες τα συμβατικά επώαση, τα κύτταρα στις καλλιέργειες μονοστοιβάδας είχαν ακτινοβοληθεί σε RT με δόσεις 1Gy, 2Gy και 4Gy, αντίστοιχα χρησιμοποιώντας μια μονάδα ακτινών Χ δίοίηεηδ, που λειτουργεί στα 200 kV, 20 mA, με διήθηση χαλκού 0,5 mm (Siemens , Γερμανία). Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε κανονικές συνθήκες καλλιέργειας για 5 επιπλέον ημέρες με αλλαγή μέσου κάθε 2 ημέρες. Η επίδραση της ακτινοβολίας σε διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς ελέγχθηκε με Δοκιμασία το CellTiter 96® Υδατικό One Solution κυτταρικού πολλαπλασιασμού, όπως περιγράφεται παραπάνω. Η επίδραση της ακτινοβολίας επί του πολλαπλασιασμού δίδεται ως ο λόγος αναστολής και υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο:. Αναλογία αναστολή = ((μη ακτινοβολημένα ελέγχου καλά απορρόφηση – ακτινοβολημένα καλά απορρόφηση) /μη ακτινοβολημένα έλεγχος καλά απορρόφηση) χ 100%

Αποτελέσματα

1. κυτταρικές σειρές πρωτοπαθή καρκίνο του πνεύμονα

Για να παράσχει μια βάση για την παρούσα μελέτη, ένα μυθιστόρημα, ισχυρή μέθοδο για τον πολιτισμό του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων από φρέσκα εκτομή καρκίνου του πνεύμονα ιδρύθηκε (βλέπε υλικά και μέθοδοι). Δεκαπέντε πρωτογενείς κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα είχαν δημιουργήσει με επιτυχία από τις 20 ιστούς του καρκίνου του πνεύμονα αφαιρεθεί. Αυτές περιλάμβαναν 7 ACS, 6 ΕΕΑΚ 1 LCC και 1 SCLC (Πίνακας 1). Η επιτυχία ρυθμού της δημιουργίας πρωτογενών καλλιεργειών ήταν 75%. Η πλειονότητα των αποτυχιών συνέβη στο πρώτο μέρος της μελέτης, πριν είχε καθοριστεί βέλτιστες συγκεντρώσεις των παραγόντων ανάπτυξης. Η DK-SFM έκανε υποστηρίζουν την επιλεκτική ανάπτυξη των τυπικών επιθηλιακών κυττάρων, αναστέλλοντας σαφώς την ανάπτυξη του συνυπάρχουν ινοβλάστες. Αυτό ήταν σε αντίθεση με καλλιέργειες που περιείχαν ορό που χρησιμοποιείται στην αρχή, όπου συνέβη ταχεία υπερανάπτυξη από ινοβλάστες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μονόφυλλο κύτταρα με τυπικό επιθηλιακά μορφολογία ελήφθησαν σε πολύ υψηλή καθαρότητα σε κάθε μία από τις καθιερωμένες PLCCLs (Σχήμα 1). Οι πρωτογενείς κυτταρικές σειρές που διατηρούνται υπό αυτές τις συνθήκες περάστηκαν για πολλές γενιές με τη μεγαλύτερη διέλευση μέχρι στιγμής πάνω από 30 γενιές, χωρίς οποιοδήποτε σημάδι της παρακμής της ανάπτυξης.

Α. Η LC004 SCLC κυτταρική σειρά? κυτταρική γραμμή B. Η LCC LC006? C. Η AC κυτταρική σειρά LC007? Δ Η SCC κυτταρική σειρά LC021. Όλες οι αντιπροσωπευτικές εικόνες ήταν από πρωτογενή καλλιεργημένα καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές στο δεύτερο πέρασμα. Μικροφωτογραφία μεγέθυνσης, × 200.

Η

Για να εξασφαλιστεί ότι οι καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές ήταν μοναδικής προέλευσης και δεν έχουν μολυνθεί από προηγουμένως καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές [21], τα προφίλ DNA χρησιμοποιώντας ένα σύνολο πολύ πολυμορφικών δεικτών μικροδορυφορικού παρήχθησαν από ένα υποσύνολο των κυτταρικών σειρών που αντιπροσωπεύουν τις τέσσερις διαφορετικούς τύπους καρκίνου του πνεύμονα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι τέσσερις κυτταρικές σειρές ήταν μοναδικές και άσχετες μεταξύ τους (Πίνακας SL).

2. Φαινότυπο PLCCLs και γονικών καρκινικούς ιστούς να έχουν παρόμοια /είναι συγκρίσιμα για την έκφραση της Ρ53, Ber-EP4 και CD44

Είμαστε επικεντρώθηκε το έργο μας σε τέσσερις PLCCLs που αντιπροσωπεύουν τις τέσσερις πνεύμονα υποτύπων του καρκίνου: το SCLC κυτταρική σειρά LC004, το LCC κυτταρική σειρά LC006, η AC LC007 κυτταρική σειρά και η SCC LC021 κυτταρική σειρά. Από τα επιλεγμένα αντιπροσωπευτικά PLCCLs, παρασκευάσαμε μπλοκ παραφίνης, και τομές από αυτές τις κυτταρικές γραμμές χρωματίστηκαν με Η &? Ε. Μορφολογική αξιολόγηση των PLCCLs επιβεβαίωσε επιθηλιακής προέλευσης τους με τα σημάδια της κακοήθους εξαλλαγής. Επιπλέον, οι πρωτογενείς κυτταρικές σειρές που προέρχονται από καθένα από τα τέσσερα υποτύπους καρκίνου του πνεύμονα ήταν μορφολογικά ετερογενείς τόσο σε κυτταρικό επίπεδο και πυρηνικά (Σχήμα 2Α).

A. Η &? Ε χρώση των 4 αντιπροσωπευτικών πρωτογενείς κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα για διαφορετικούς υποτύπους καρκίνου του πνεύμονα: ο SCLC κυτταρική γραμμή LC004? η LC006 LCC κυτταρική γραμμή? η AC LC007 κυτταρική σειρά και η SCC LC021 κυτταρική σειρά. Τα κύτταρα που προέρχονται από τις τέσσερις υποτύπους του καρκίνου του πνεύμονα έδειξαν ετερογένεια στην κυτταρική και πυρηνική μορφολογία. Τα κύτταρα του κάθε πρωτογενούς κυτταρικής σειράς είχαν επιθηλιακά μορφολογία. Μικροφωτογραφία μεγέθυνσης, × 200. B. Ανάλυση η έκφραση της Ρ53, Ber-EP4 και CD44 στα 4 πρωτογενείς κυτταρικές σειρές και ιστούς όγκων αντίστοιχο αρχειακό των ασθενών τους. Όλες οι πρωτογενείς κυτταρικές σειρές που διερευνήθηκαν, παρουσίασαν διάχυτη θετική χρώση για Ρ53, εκτός από τον αρχικό ιστό SCC της κυτταρικής σειράς LC021. αντιγόνο επιθηλιακής μεμβράνης το Ber-EP4 ήταν ευρέως θετική σε όλες τις αρχικές τους ιστούς καρκίνου του πνεύμονα και διάχυτη θετική σε όλες τις πρωτογενείς κυτταρικές γραμμές. CD44 έδειξαν διάχυτη θετική χρώση με διαφορετική ένταση στα πρωτογενή κυτταρικές σειρές και καρκινικούς ιστούς αντίστοιχες αρχειακό ασθενών τους εκτός ασθενώς θετικές στον αρχικό ιστό όγκου του AC LC007 κυτταρική γραμμή. Τομές από παραφίνη μπλοκ που περιέχει ανθρώπινη σεμίνωμα και καρκίνου του μαστού δείγμα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι για αντισώματα Ρ53, Ber-ΕΡ4 και CD44, αντίστοιχα. Μικροφωτογραφία μεγέθυνσης, × 200.

Η

ογκοκατασταλτικών μεταλλάξεις P53 πρωτεΐνη είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου και είναι γενικά ρυθμίζεται προς τα πάνω [22]. Είμαστε δίπλα σε σύγκριση με τα επίπεδα έκφρασης της Ρ53 σε σειριακές τομές από ιστούς όγκων του αρχειακού ασθενών και τις νεοσυσταθείσες PLCCLs χρησιμοποιώντας IHC. Και οι τέσσερις PLCCLs έδειξαν διάχυτη θετική χρώση για την P53. Ο ίδιος τύπος χρώσης παρατηρήθηκε σε ιστό καρκίνου του αρχικού ασθενούς με την εξαίρεση της γονικής ιστού SCC, η οποία ήταν αρνητική για Ρ53 (σχήμα 2Β). Είναι ενδιαφέρον ότι η κυτταρική γραμμή που προέρχεται από την SCC (LC021) εξέφρασε Ρ53. Τα επίπεδα έκφρασης του Ber-EP4 και CD44 ερευνήθηκαν με τον ίδιο τρόπο. ιστοί όγκου του αρχειακού ασθενών και των αντίστοιχων PLCCLs τους έδειξαν σε γενικές γραμμές θετική χρώση για την παν-επιθηλιακά δείκτη Ber-EP4. Η διάχυτη θετική χρώση με διαφορετική ένταση σε ιστούς όγκων Το αρχειακό ασθενών και αντίστοιχες κυτταρικές σειρές τους παρατηρήθηκε με χρώση CD44, εκτός από τον ιστό πατρικού όγκου AC, η οποία ήταν ασθενώς θετική για το μεγαλύτερο μέρος του τμήματος που μελετήθηκαν (Σχήμα 2Β, πίνακας S2). Έκφραση CD133 στο πατρικό καρκινικούς ιστούς διερευνήθηκε επίσης με χρώση IHC. CD133 εμφανίζεται μια πιο μεταβλητό μοτίβο, με όλα τα γονικά όγκοι είναι αρνητική, εκτός από το SCLC (LC004), όπου παρατηρήθηκε έκφραση σε απομονωμένες περιοχές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Όλα PLCCLs προέλθουν από τις αντίστοιχες γονικές καρκινικούς ιστούς ήταν ομοιόμορφα αρνητικά για έκφραση CD133 με χρώση IHC.

Στο σύνολό τους οι συνοψίζονται πειράματα δείχνουν ότι οι PLCCLs στις αρχές περάσματα (μέχρι 5) είναι αντιπροσωπευτικές της γονικής ιστού όγκου σε και οι τέσσερις καρκίνο υποτύπους.

3. Οι πρωτογενείς καλλιέργειες καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα είναι τόσο ογκογόνο ως xenotransplants

Κακοήθη δυναμικό των PLCCLs ερευνήθηκε σε ένα πειραματικό ζωικό μοντέλο. Μια δοκιμασία ογκογένεση διεξήχθη επί 5 έως 6-εβδομάδων σε ηλικία θηλυκών NOD ποντίκια /SCID. Επτά από τις PLCCLs ελέγχθηκαν στις αρχές περάσματα και όλοι ήταν σε θέση να δημιουργήσει ξενομοσχεύματα εντός 3 εβδομάδων μετά την ένεση. Οι τέσσερις κυτταρικές σειρές μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα LC004-P4, LCC LC006-P2, SCC LC021-P2 και AC LC007-P3, επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτες, το πολλαπλασιαστικό υποδόρια χύμα όγκων σε 2/2, 3/3, 2/2 και 2/2 ζώα, αντίστοιχα. Επιπλέον, ήμασταν σε θέση να αποκατασταθεί PLCCLs

in vitro

από τα ξενομοσχεύματα ελήφθησαν από αυτά τα ζώα (Σχήμα S1). Επιπλέον, το DNA δακτυλικών αποτυπωμάτων ήταν χρήσιμο να παρακολουθείτε μεμονωμένες κυτταρικές σειρές από τα ξενομοσχεύματα του LC021 (Πίνακας S1 και το σχήμα S1).

Με βάση τα αποτελέσματα αυτά συμπεραίνουμε τα PLCCLs με την ιδιότητα της ογκογένεσης σε ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια μπορεί εύκολα και επαναλήψιμα να παραχθούν και από τις τέσσερις υποτύπους του καρκίνου του πνεύμονα και πολλαπλασιάστηκε σε

in vitro

υγρή καλλιέργεια.

Δευτερογενής ξενομεταμόσχευση διεξήχθη με εμφύτευση υποδορίως κομμάτια του ξενομοσχεύματος πρωτογενούς LCC (LC006) σε δεύτερο παραλήπτη . Πρωτοβάθμια παραλήπτη μεταμοσχεύονται με κύτταρα LC006 αποκάλυψε μετάσταση στους πνεύμονες εκτός από την υποδόρια όγκου. Ωστόσο, στις ακόλουθες σειριακές ξενο-μεταμοσχεύσεις, οι όγκοι σχηματίστηκαν μόνο υποδόρια. Όταν συγκρίθηκαν μορφολογικά χαρακτηριστικά της PLCCL και τους αύξοντες ξενομοσχεύματα και γονικών ιστούς, αυτοί εμφανίζονται μεγάλη ομοιότητα υποστηρίζοντας την παρατήρηση ότι PLCCLs και xenotransplants αντιπροσωπεύουν τον αρχικό όγκο.

4. Η έκφραση των δεικτών που σχετίζονται CSC κυτταρικής επιφανείας είναι δυναμική σε μακροχρόνια καλλιέργεια PLCCLs

Για τον εντοπισμό υποπληθυσμών των θεωρούμενων καρκίνου του πνεύμονα βλαστικών κυττάρων σε πρωτογενείς κυτταρικές σειρές καρκίνου, ερευνήσαμε την έκφραση ενός ευρέος πάνελ δεικτών προηγουμένως περιγράφεται ως εκφράζονται διαφορικά σε μία ποικιλία ανθρώπινων καρκινικών βλαστικών κυττάρων. Τα δεδομένα από έξι αντιπροσωπευτικά PLCCLs αναλύεται σε διάφορα περάσματα δίνονται στον Πίνακα S3. Το προφίλ έκφρασης αποκάλυψε ένα μεταβλητό μοτίβο με ορισμένα κοινά χαρακτηριστικά. Σε δύο κυτταρικές σειρές (SCLC LC004 και SCC LC021) δοκιμάστηκε επανειλημμένα ο φαινότυπος μετατοπιστεί κατά τη διάρκεια μακροχρόνιας

in vitro

πολιτισμό (Πίνακας S3). Μερικοί δείκτες (CD29, CD49b και CD49f) έχουν ομοιόμορφα εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε όλες τις διόδους και όλες οι κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν, ενώ άλλοι, όπως CD44, CD166 και CD142, έδειξε μια υψηλότερη έκφραση σε αργότερα σε σύγκριση με προηγούμενα περάσματα. Το αντίθετο παρατηρήθηκε για CD90 και CD326 έκφρασης, όπου η αναλογία των θετικών κυττάρων μειώθηκε με την αύξηση του αριθμού διόδου. Είναι ενδιαφέρον, διακριτή ανήλικος υποπληθυσμών που εκφράζουν CD117, CD184 και CD15 ήταν παρόντες σε κάθε ένα από τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. CD24 και CD326 έδειξε μεταβλητό επίπεδο έκφρασης σε διαφορετικές PLCCLs. Η έκφραση του CD133 ήταν χαμηλή, όπως δοκιμάστηκε με δύο διαφορετικά αντισώματα, και κυμαινόταν μεταξύ μηδέν έως 2,4% και επιβεβαιώνει τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από την IHC.

Έτσι, το επίπεδο έκφρασης και η συχνότητα των CD44 και /ή CD90 θετικών υπο -populations ήταν δυναμική, αποκαλύπτοντας διαφορική έκφραση των αντιγόνων σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Αυτές οι διακριτές μεταβολές που συνέβησαν κατά τη διάρκεια μακροχρόνιας καλλιέργειας υποδεικνύει είτε πιθανή επιλογή ορισμένων υπο-πληθυσμών σε μακροχρόνια καλλιέργεια ή απάντηση σε

in vitro

συνθήκες καλλιέργειας.

Συνολικά, τα αποτελέσματα μας (ΣΙ). ένα. σι. ντο. ένα. σι.