Αφηρημένο

Η απορρύθμιση της μη-υποδοχέα ETK τυροσινικής κινάσης /BMX έχει αναφερθεί σε διάφορα στερεά όγκων. Σε αυτή την έκθεση, αποδείξαμε ότι η έκφραση ETK αυξάνεται προοδευτικά κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Βρήκαμε ότι η ρύθμιση προς τα κάτω της ΕΤΚ σε καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης εξασθενημένα STAT3 και AKT δραστηριότητα, ενώ εξωγενείς υπερέκφραση του ETK είχε αντίθετα αποτελέσματα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η απορρύθμιση των ETK μπορεί να αποδώσει στην αυξημένη δραστικότητα της STAT3 και ΑΚΤ ανιχνεύονται συχνά στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Η επιβίωση, τη μετανάστευση και την εισβολή του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα σημαντικά μειωμένη όταν η έκφραση ETK χτυπήθηκε κάτω από ένα συγκεκριμένο shRNA. Επιπλέον, δείξαμε ότι ETK εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια σε καρκινικά κύτταρα κύστης μέσω της αλληλεπίδρασης με Bcl-XL και τη ρύθμιση της παραγωγής ROS και την ευαισθησία του φαρμάκου. Ως εκ τούτου, ETK μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της επιβίωσης, τη μετανάστευση και εισβολή με ρύθμιση πολλαπλές οδούς σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα κύστης. Ανάλυση ανοσοϊστοχημείας μικροσυστοιχίες ιστού που περιέχει 619 δείγματα ανθρώπινου ιστού της ουροδόχου κύστης δείχνει ότι ETK σημαντικά ρυθμίζεται αυξητικά κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και την εξέλιξη και το επίπεδο έκφρασης ETK προβλέπει το ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με κυστεκτομή. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ETK μπορεί ενδεχομένως να χρησιμεύσει ως ένα νέο στόχο για τη θεραπεία της καρκίνο της ουροδόχου κύστης, καθώς και ένα βιοδείκτη που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τον εντοπισμό ασθενών με υψηλότερο κίνδυνο θνησιμότητας, ο οποίος μπορεί να επωφεληθεί από θεραπευτικά στόχευση δραστηριότητα ETK.

Παράθεση: Guo S, Sun F, Guo Ζ, Λι W, Alfano Α, Chen H, et al. (2011) κινάσης τυροσίνης ETK /BMX ρυθμίζεται προς τα πάνω στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης και προβλέπει κακή πρόγνωση σε ασθενείς με Κυστεκτομή. PLoS ONE 6 (3): e17778. doi: 10.1371 /journal.pone.0017778

Επιμέλεια: Λιν Ζανγκ, University of Pennsylvania, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 Γενάρη του 2011? Αποδεκτές: 9 Φλεβάρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 7, Μαρτίου 2011

Copyright: © 2011 Guo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ΝΙΗ (CA106504) και DOD (W81XWH-08-1-0174) επιχορηγήσεις σε YQ, την Κίνα Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών (30.872.584) και του Ιδρύματος Επιστήμης Φυσικής Guangdong (8251008901000018) με SQ Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι μια από τις πιο συχνές μορφές καρκίνου στις Ηνωμένες Πολιτείες. Εκτιμάται ότι θα υπάρχουν 70.530 νέες περιπτώσεις και 14.680 θάνατοι από καρκίνο της ουροδόχου κύστης σε 2010 [1], [2], [3]. Πολλαπλά γενετικά και επιγενετικών παραγόντων πιστεύεται ότι συμβάλλει στον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Εκτός από τα καλά γνωστούς παράγοντες κινδύνου, όπως η γήρανση, το φύλο, την έκθεση στον καπνό του τσιγάρου και τα βιομηχανικά χημικά προϊόντα, διάφορες γενετικές αλλοιώσεις που παρέχουν συνθήματα για μετασχηματισμό κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή του καρκίνου της ουροδόχου κύστης έχουν ταυτοποιηθεί [4]. Αυτές περιλαμβάνουν μεταλλάξεις ή μεταβολές στην έκφραση του ρ53, pRb, E-cadherin, COX2, BLCA-4, CXCL1, ΜΜΡ-2/9 και EGFR [5]. Σωρευτική αύξηση σε αυτά τα γενετικά ελαττώματα παρέχει επίσης προγνωστική εκτίμηση για την έκβαση της νόσου. Ωστόσο, περαιτέρω κατανόηση της βιολογίας των όγκων της ουροδόχου κύστης είναι απαραίτητο να αναπτυχθούν πιο αποτελεσματική θεραπεία. Υπάρχει επομένως μία ανάγκη για την ταυτοποίηση και την εφαρμογή νέων θεραπευτικών στόχων στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Τα επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κινάσης τυροσίνης (ETK), επίσης γνωστή ως Μυελού των Οστών Χ κινάσης (ΒΜΧ), είναι ένα μέλος της οικογένειας Tec μη-υποδοχέα τυροσινικής κινάσης. ETK περιέχει ένα ΝΗ2-τερματικό πεδίο πλεκστρίνης ομολογία, ένα Src ομολογίας 3 τομείς, έναν τομέα Src ομολογίας 2, και ένα COOH-τερματικό πεδίο κινάσης τυροσίνης [6]. ETK μπορεί να ενεργοποιηθεί από διάφορους εξωκυτταρικά ερεθίσματα, συμπεριλαμβανομένων των παραγόντων ανάπτυξης, κυτοκινών, εξωκυτταρική μήτρα και ορμόνες [7]. ETK πρωτεΐνη είναι παρούσα σε κυτταρόπλασμα με ισχυρή περιπυρηνική χρώση στα κύτταρα όταν εξετάσθηκε με τη χρήση ανοσοφθορισμού μικροσκοπία [8], [9], [10]. Η ενεργοποίηση της δραστικότητας κινάσης ETK μπορεί να επιτευχθεί με την αλληλεπίδραση του τομέα πλεκστρίνης ομολογίας της, είτε με την φωσφατιδυλινοσιτόλη φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση προϊόν 3,4,5-τριφωσφορική ή τομέα FERM του FAK, η οποία οδηγεί σε μετατόπιση της μεμβράνης του πλάσματος από ETK [6], [8]. ETK έχει δειχθεί ότι παίζουν ρόλο σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τον μετασχηματισμό, τη διαφοροποίηση, τη μετανάστευση και τη μετάσταση. ETK μπορεί να αλληλεπιδράσει με FAK και ρ130

Cas για τη ρύθμιση του κυτταροσκελετού της ακτίνης και την κυτταρική κινητικότητα [8], [11]. Έχει επίσης δειχθεί ότι ETK αλληλεπιδρά άμεσα με την καταστολή όγκου ρ53 και αναστέλλουν πυρηνική μετατόπιση της, προωθώντας έτσι χημειοαντίσταση σε καρκινικά κύτταρα [9]. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι ETK προοδευτικά ρυθμίζεται αυξητικά κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη και την εξέλιξη [12], [13]. Ωστόσο, ο ρόλος της ΕΤΚ σε καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης παραμένει άγνωστη.

Σε αυτήν την έκθεση, αποδείξαμε ότι η έκφραση ETK αυξάνεται προοδευτικά κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. ETK παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της επιβίωσης, τη μετανάστευση και εισβολή με ρύθμιση πολλαπλές οδούς σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα κύστης. Δείξαμε επίσης ότι ETK βρίσκεται επίσης στα μιτοχόνδρια μέσω της άμεσης αλληλεπίδρασης με Bcl-XL και τη ρύθμιση της παραγωγής ROS σε απόκριση σε θεραπεία των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων. Επιπλέον, η έκφραση ETK συσχετίζεται θετικά βαθμό του όγκου και προβλέπει έκβαση των ασθενών. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η ΕΤΚ μπορεί να χρησιμεύσει ως στόχος φαρμάκων και προγνωστικός δείκτης για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Αποτελέσματα

Λειτουργική ÈTK υπερεκφράζεται στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Εξετάσαμε την έκφραση ETK στην ένα πάνελ ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών ουροδόχου κύστης και διαπίστωσε ότι το επίπεδο έκφρασης ETK κυμαινόταν σε αυτά τα κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον, ένα σημαντικά υψηλότερο επίπεδο ETK πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε UM-UC-3 και Τ24 κύτταρα τα οποία προέρχονται από υψηλής ποιότητας και επιθετικοί όγκοι της ουροδόχου κύστης (Σχ. 1Α). Στη συνέχεια εξετάστηκε κατά πόσον ETK είναι λειτουργική σε αυτές τις επεμβατικές κύτταρα. Πρέπει πρώτα ελεγχθεί εάν παράγοντα ανάπτυξης θα μπορούσε να ενεργοποιήσει τη δράση κινάσης ETK χρησιμοποιώντας φωσφορυλίωση της τυροσίνης 40 (Y40), μια ιστοσελίδα αυτοφωσφορυλίωση από ETK με την ενεργοποίηση της [8], όπως ανάγνωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. θεραπεία 1Β, EGF επαγόμενη φωσφορυλίωση Y40, γεγονός που υποδηλώνει ότι ETK είναι ενεργή σε καρκινικά κύτταρα κύστης. Συνεπής με προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η ΕΤΚ είναι ανάντη της STAT3 και μονοπάτια ΑΚΤ [15], [16], βρήκαμε το επίπεδο φωσφορυλίωσης τόσο STAT3 και AKT τέθηκε σε κίνδυνο όταν η έκφραση ETK χτυπήθηκε κάτω από ένα ειδικό shRNA (Εικ. 1Γ, Αριστερά ). Αντιστρόφως, όταν υπερεκφράζεται ETK σε 5637 κύτταρα με ένα σχετικά χαμηλότερο επίπεδο ενδογενούς ETK, ανιχνεύσαμε αυξημένη δράση τόσο STAT3 και ΑΚΤ (Σχ. 1C, δεξιά). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι μαζί ETK εκφράζεται έντονα σε επεμβατικές κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως και εμπλέκονται στη ρύθμιση STAT3 και δραστικότητα ΑΚΤ.

Α, προφίλ έκφρασης του ETK σε καρκινικές κυτταρικές σειρές κύστης. επίπεδο έκφρασης ETK συνολικά κυτταρολύματα από κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως εξετάσθηκε με ανοσοστύπωμα με αντι-ETK. Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β, η ενεργοποίηση του ETK σε καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης σε επεξεργασία με EGF. UM-UC-3 και Τ24 κύτταρα στερήθηκαν τον ορό για 24 ώρες, στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 20 ng /ml EGF επί 15 ή 30 λεπτά. Το επίπεδο των ενεργοποιημένων EGFR και ETK παρακολουθήθηκε με ανοσοκηλίδωση με αντι-pEGFR (Y1175) και αντι-pETK (Y40) αντιστοίχως. Το επίπεδο της συνολικής EGFR και ETK στα προϊόντα λύσης κυττάρων ανιχνεύθηκε επίσης με αντι-EGFR και αντι-ETK αντίστοιχα. C, ο κανονισμός της STAT3 και τη δραστηριότητα της ΑΚΤ από ETK σε καρκινικά κύτταρα κύστης. UM-UC-3 και Τ24 κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊό που κωδικοποιεί το ειδικό shRNA για ETK ή ένα μάρτυρα φορέα. Σε 24 ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα στερήθηκαν ορού όλη τη νύκτα και στη συνέχεια υποβάλλονται σε λύση. Το επίπεδο των ενεργών STAT3 και AKT εξετάστηκε με ανοσοκηλίδωση με αντι-pSTAT3 (Y705) και αντι-ρΑΚΤ (S473) αντίστοιχα (αριστερό πάνελ). Η επίδραση της ΕΤΚ υπερέκφραση σε STAT3 και τη δραστηριότητα ΑΚΤ εξετάστηκε επίσης σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης 5637 κύτταρα (δεξιά πλευρά).

Η

ÈTK είναι παρούσα στα μιτοχόνδρια και συνδέονται με Bcl-XL

Όταν εξετάσαμε την κυτταρική εντόπιση του ETK σε καρκινικά κύτταρα κύστης, παρατηρήσαμε μια puncate διανομή του ETK στο κυτταρόπλασμα. Είναι ενδιαφέρον ότι, η κηλίδωση ETK ήταν μερικώς επικαλυμμένο με επισήμανση Mitotracker σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 2Α). Διαπιστώσαμε επίσης ένα σημαντικό ποσό ETK πρωτεΐνης στο μιτοχονδριακό κλάσμα, μαζί με άλλα γνωστά μιτοχονδριακών πρωτεϊνών Bcl-XL και VDAC (Εικ. 2Β). Όπως ETK στερείται ενός σήματος στόχευσης μιτοχόνδρια, αναρωτηθήκαμε αν θα μπορούσε να εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια μέσω αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C, ενδογενές Bcl-XL συν-καθιζάνει με ETK σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης που εξετάστηκαν. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης σε κύτταρα 293Τ που υπερεκφράζουν τόσο Τ7-tagged ETK και GFP-tagged Bcl-XL. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι ETK μπορεί να σχηματίσει ένα σύμπλοκο με Bcl-XL και εντοπίζονται στα μιτοχόνδρια. Λόγω της αντι-αποπτωτική λειτουργία Bcl-XL, μπορούμε εξέτασαν το ρόλο του στη ρύθμιση ETK απόπτωση σε αυτά τα κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, knock-down της έκφρασης ETK από ένα συγκεκριμένο shRNA αύξησε σημαντικά τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων σε UM-UC-3 και Τ24 κύτταρα. Επιπλέον, η αναστολή της δραστικότητας ETK ενισχυμένη παραγωγή και κυτταροτοξικότητα ROS σε καρκινικά κύτταρα κύστης σε απόκριση σε θεραπεία του Doxorubucin, ενώ η υπερέκφραση του ETK είχε προστατευτικές επιδράσεις (Σχήμα 3Β & amp?. 3C). Η ανάπτυξη του όγκου και μετάσταση ρυθμίζεται εν μέρει από την ικανότητα των κυττάρων του όγκου να αποικοδομείται περιβάλλοντα ιστό μήτρας και μεταναστεύουν. Για να ελέγξετε αν ETK προς τα πάνω ρύθμιση μπορεί να προκαλέσει ένα τέτοιο φαινότυπο, εξετάσαμε περαιτέρω τα αποτελέσματα της ΕΤΚ knock-down για τη μετανάστευση των κυττάρων του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και την εισβολή χρησιμοποιώντας τις δοκιμασίες θάλαμο Boyden. Σύκο. 3D δείχνει ότι η μετανάστευση του ETK-knockdown UM-UC-3 και Τ24 κυττάρων μειώνεται στο 40% και 60% αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον έλεγχο shRNA επεξεργασμένα κύτταρα. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης όταν εξετάσαμε την ικανότητά τους να εισβάλλουν μέσω Matrigel. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η αναστολή της έκφρασης ETK σε καρκινικά κύτταρα κύστης σε κίνδυνο τόσο τη μετανάστευση και την εισβολή.

Α, ETK εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια σε UM-UC-3 και Τ24 κύτταρα. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με Rhodamine Mitotracker, που ακολουθείται από χρώση ανοσοφθορισμού με αντι-ETK. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με χρήση DAPI. Ο εντοπισμός του ETK προσδιορίστηκε με συνεστιακή μικροσκόπηση. Κίτρινο δείχνει συνεντόπισης της ΕΤΚ και Mitotracker. Β, ETK πρωτεΐνη ανιχνεύεται στο μιτοχονδριακό κλάσμα. Μιτοχονδριακή και κυτοσολικά κλάσματα παρασκευάζονται όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα κλασματωμένα εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με αντι-ETK ή υποδεικνυόμενα αντισώματα για δείκτες κλασμάτωση. ERK χρησιμοποιήθηκε ως κυτοσολική δείκτη, ενώ Bcl-XL και VDAC ως μιτοχονδριακό δείκτες. C, ETK συνδέεται με Bcl-XL. Σύνολο κυτταρικά εκχυλίσματα από UM-UC-3 και Τ24 κύτταρα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-ETK ή IgG ελέγχου, που ακολουθείται από ανοσοστύπωμα με αντισώματα όπως υποδεικνύεται (αριστερό πάνελ). Κύτταρα 293Τ συν-επιμολύνθηκαν με Τ7-ETK και GFP-Bcl-XL, ανοσοκαταβύθιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντι-Τ7 (πίνακας Κέντρο) ή αντι-GFP (δεξιός πίνακας), που ακολουθείται από ανοσοστύπωμα με τα αντισώματα όπως υποδεικνύεται.

Α, κάτω-ρύθμιση της έκφρασης ETK απόπτωση που επάγεται σε καρκινικά κύτταρα κύστης. UM-UC-3 και Τ24 κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊό που κωδικοποιεί το ειδικό shRNA για ETK για 96 ώρες και η απόπτωση εκτιμήθηκε με δοκιμασίες TUNEL. Τα αποπτωτικά κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν μετρώντας TUNEL θετικά κύτταρα από πέντε τυχαίες ανεξάρτητες πεδία. Β, ETK ρυθμίζει δραστικότητα ROS και κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα κύστης σε απόκριση σε θεραπεία Doxorubucin (DOX). Τα κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊό κωδικοποιεί το shRNA ειδικό για ETK, ETK Τ7-tagged ETK ή ένας φορέας μάρτυρας. Στις 48 ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DOX (UM-UC-3, 0,5 μg /ml? Κύτταρα Τ24, 2,5 μg /ml) για 20 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με 10 ηΜ 5 (6) -CDCFDA για 30 λεπτά. ROS-θετικά κύτταρα μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο φθορισμού. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ποσοστό του ελέγχου. C, ETK ρυθμίζει κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα κύστης σε απόκριση σε θεραπεία DOX. Τα κύτταρα μολύνθηκαν όπως περιγράφεται στο Β και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DOX (Τ24, 5 μg /ml? UM-UC-3, 0,5 μg /ml) για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με WST-1 ανιχνεύσεις (άνω πάνελ). Το επίπεδο έκφρασης ETK παρακολουθήθηκε με ανοσοκηλίδωση με αντι-ETK (κάτω πίνακας). *, Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο? **, Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο. D, Knockdown του ETK ανέστειλε τη μετανάστευση και την εισβολή in vitro. μετανάστευση των κυττάρων και δοκιμασία εισβολής περιγράφονται ως Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ποσοστό του ελέγχου. *, Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο? **, Ρ & lt?. 0.01 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

ETK υπερεκφράζεται σε ιστό ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης και η προβλεπόμενη επιβίωση του ασθενούς

Για να εξεταστεί η έκφραση ETK σε ιστούς ανθρώπινου όγκου ουροδόχου κύστης, εκτελέσαμε ανάλυση ανοσοϊστοχημείας για μικροσυστοιχίες ιστό κύστεως ανθρώπου που περιέχει 619 δείγματα ιστών από 233 ασθενείς. χρώση ETK φάνηκε να είναι τόσο κυτταροπλασματική και πυρηνική θετικό (Σχ. 4Α), και η έκφραση ETK ήταν σημαντικά αυξημένη σε ιστούς όγκων της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με καλοήθη αντίστοιχά τους (Πίνακας 1). Επιπλέον, το επίπεδο έκφρασης ETK ήταν σημαντικά υψηλότερη στην επεμβατική όγκους Τ1-Τ4 από ότι σε μη επεμβατικές ομολόγους Tis /Ta (ρ & lt? 0.001)? Ωστόσο, η έκφραση ETK δεν διέφερε σημαντικά εντός Τ1 έως Τ4 όγκοι (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, η έκφραση ETK αυξήθηκε με το βαθμό του όγκου (ρ & lt? 0.001). έκφραση ETK στο CIS ήταν μια αξιοσημείωτη εξαίρεση, με μέση 12% στο κυτταρόπλασμα, το οποίο είναι χαμηλότερο από ό, τι βαθμολογίες G1-G3 (Πίνακας 1), γεγονός που υποδηλώνει μια ένωση του ETK overepression με όγκους θηλώδες της ουροδόχου κύστης. Για να εκτιμηθεί εάν ETK θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μια πιθανή προγνωστικός δείκτης, ανάλυση της κλινικής έκβασης διεξήχθη σε 118 ασθενείς υποβλήθηκαν σε κυστεκτομή οποίοι παρακολουθήθηκαν για ένα μέσο διάστημα 92,3 μηνών. Έχουμε εντοπίσει ένα σημείο αποκοπής του 15% για τη βέλτιστη υποστρωματοποίησης από αυτούς τους ασθενείς, σύμφωνα με ETK κυτταροπλασματική έκφραση. Υπήρχαν 75 όγκους (64%) με χαμηλή έκφραση (≤15%) και 43 όγκων (36%) με υψηλή έκφραση (& gt? 15%). Η ανάλυση Kaplan-Meier έδειξε ότι οι ασθενείς που είχαν υψηλότερα κυτταροπλασματική χρώση των ΕΤΚ (βαθμολογία χρώση & gt? 15%) είχαν φτωχότερες συνολική πιθανότητα επιβίωσης (Σχήμα 4Β, δοκιμασία log-rank p = 0,0028).. Επιπλέον, πολυπαραγοντική Cox ανάλυση παλινδρόμησης έδειξε ότι η ΕΤΚ αποτελεί σημαντικό προγνωστικό παράγοντα επιβίωσης μετά την προσαρμογή για άλλες σημαντικές κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές όπως η ηλικία, το βαθμό του όγκου, το στάδιο και την κατάσταση του κόμβου θετική λεμφαδένες (Πίνακας 2). Όπως αναφέρεται στο υπόδειγμα, ETK ήταν ο μόνος ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας πρόβλεψης για τη συνολική επιβίωση με αναλογία κινδύνου 1,7 (95% CI: 01.01 έως 02.07, p = 0,0159). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η έκφραση ETK αυξάνεται σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης και των συναφών με την εξέλιξη του όγκου και κακή πρόγνωση.

Α, ο εκπρόσωπος τομείς της ανθρώπινης καρκίνου της ουροδόχου κύστης TMAs χρώση με αντι-ETK αντίσωμα. Β, ανάλυση Kaplan-Meier για τη σύνδεση των ETK κυτταροπλασματική χρώση με το ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με κυστεκτομή.

Η

Η

Συζήτηση

Η υπερέκφραση του ETK έχει αναφερθεί σε αρκετές μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων προστάτη, του μαστού και του καρκίνου του πνεύμονα [8], [13], [17], [18]. Αυτή είναι η πρώτη έκθεση σχετικά με την απορρύθμιση της έκφρασης ETK στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Συχνά αυξημένη έκφραση ETK σε καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης πρότεινε ότι ETK μπορεί να παίζει ένα αιτιώδη ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη της νόσου. Αυτό υποστηρίζεται από την παρατήρηση μας ότι η δραστηριότητα ETK μπορεί να ενισχυθεί από το ΕΤΠ, η οποία είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι επάγει την ανάπτυξη και την ενίσχυση της εισβολής των καρκινικών κυττάρων κύστης με τη ρύθμιση της δραστηριότητας ΑΚΤ [19], [20]. Ο υποδοχέας EGF έχει αναφερθεί υψηλή έκφραση σε καρκινικά κύτταρα της κύστης και σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου και την κακή πρόγνωση σε ασθενείς [21], [22], [23]. Ως εκ τούτου, μπορεί να ETK πιθανό να λειτουργήσει ως καθοδικός τελεστής του EGF /EGFR για την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου της ουροδόχου κύστης και της μετάστασης. Έχει δειχθεί ότι η υπερέκφραση ETK μπορεί να αυξήσει τον πολλαπλασιασμό σε επιθήλιο προστάτη ποντικού και να οδηγήσει σε ανάπτυξη των προστατικών ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ) εν μέρει από την αύξηση της ΑΚΤ και δραστηριότητα STAT3 [13]. Βρήκαμε ότι η ρύθμιση προς τα κάτω της ΕΤΚ σε καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης εξασθενημένα STAT3 και AKT δραστηριότητα, ενώ εξωγενείς υπερέκφραση του ETK είχε αντίθετα αποτελέσματα. Απορρύθμιση της STAT3 και ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδών έχει δειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκινώματος ουροθηλιακά και συσχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου [24], [25]. Είναι πιθανό ότι ETK μπορεί να ασκήσει το ρόλο της στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης μέσω της ρύθμισης αυτών των οδών. μετάσταση όγκου εξαρτάται από την ικανότητα των κυττάρων του όγκου να εισβάλλουν φυσιολογικούς ιστούς. Δείξαμε ότι ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης κύτταρα θα μπορούσαν να εισβάλουν αποτελεσματικά ένα εμπόδιο μήτρας in vitro, και αυτή η ικανότητα ήταν σημαντικά απορρίφθηκε όταν η έκφραση ETK χτυπήθηκε κάτω από ένα συγκεκριμένο shRNA. Knockdown ETK οδηγεί σε μειωμένη ενεργοποίηση του STAT3, η οποία παίζει ένα ρόλο στην εισβολή του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, εξηγείται εν μέρει ο πιθανός μηχανισμός της αναστολής εισβολής. Η επίδραση της ΕΤΚ για τη μετανάστευση των κυττάρων θα μπορούσε να εξηγηθεί με βάση το καθιερωμένο ρόλο της ΕΤΚ στη μετανάστευση των κυττάρων στον προστάτη και του καρκίνου του μαστού μέσω της FAK με τη μεσολάβηση της ιντεγκρίνης σηματοδότηση [8].

Εκτός από STAT3 και AKT μονοπάτια που είναι γνωστό ότι ενεργοποιείται από ETK, μπορούμε επίσης έδειξαν, για πρώτη φορά, ότι ETK εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια σε καρκινικά κύτταρα κύστης και συνεπώς ρυθμίζει την παραγωγή ROS και την ευαισθησία του φαρμάκου. Άλλες κινάσες τυροσίνης, συμπεριλαμβανομένων Src και EGFR, έχει αποδειχθεί ότι είναι παρόντες στα μιτοχόνδρια. Salvi

κ.ά.

ανέφεραν ότι Src βρίσκεται στα μιτοχόνδρια στον εγκέφαλο αρουραίου [26]. EGFR και Src μπορεί να μετατοπίσει προς τα μιτοχόνδρια με σύνδεση του υπομονάδα της μιτοχονδριακής coxidase κυτοχρώματος (Coxα) σε ένα τρόπο που εξαρτάται από EGF και ρυθμίζουν μιτοχονδριακή λειτουργία μέσω φωσφορυλίωσης Coxα [27]. Ωστόσο, δεν έχει ακόμη καθοριστεί η ακριβής λειτουργία της ΕΤΚ στα μιτοχόνδρια. Βρήκαμε ότι ETK συνδέεται με ένα μέλος της οικογένειας Bcl-2 Bcl-XL σε καρκινικά κύτταρα κύστης. Knockdown έκφρασης ETK οδηγεί σε αύξηση της παραγωγής ROS και ευαισθητοποίηση του κυττάρου Caner ουροδόχου κύστης σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Έχει αποδειχθεί ότι το DNA βλάβη, ακτινοβολία και υποξία μπορεί να προκαλέσει ROS στα καρκινικά κύτταρα [28], [29]. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι ETK μπορεί να προσδώσει αντοχή φαρμάκου σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη με αλληλεπίδραση με την ρ53 και την αναστολή της λειτουργίας των πυρηνικών μεταγωγή του. Είναι πιθανό ότι ETK μπορεί επίσης να προωθήσει αντοχή φαρμάκου μέσω προστατευτική δράση του στη λειτουργία των μιτοχονδρίων. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι ETK αποδίδει μία κακοήθη και επεμβατική φαινότυπο σε καρκινικά κύτταρα κύστης μέσω ρύθμισης πολλαπλές οδούς σηματοδότησης (Εικ. 5).

Η

Έχει δειχθεί ότι η δραστηριότητα STAT3 και έκφραση είναι αυξημένη σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης όγκου και προβλέπει επανεμφάνιση του όγκου και της επιβίωσης των ασθενών [30], [31]. ανάλυση IHC μας για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης TMAs έδειξαν ότι η έκφραση ETK αυξάνεται σε ιστούς του καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με καλοήθη ομολόγους τους. Θεωρώντας ότι στοχευμένη έκφραση του ETK στον προστάτη ποντικού οδηγεί στην ανάπτυξη του ΡΙΝ [13], είναι πιθανό ότι ETK μπορεί επίσης να παίζουν ρόλο στην ογκογόνο μετασχηματισμό σε κύτταρα ουροθηλιακό κύστη. Το πιο σημαντικό, η έκφραση ETK είναι υψηλότερη σε επεμβατική (Τ1-Τ4) από μη επεμβατικές όγκους της ουροδόχου κύστης (Tis /Ta), υποδηλώνοντας ότι ETK μπορεί επίσης να παίζει ένα ρόλο στην εισβολή και μετάσταση όγκων. Η δυνατότητα αυτή υποστηρίζεται από την παρατήρηση μας ότι το νοκ ντάουν της έκφρασης ETK σε καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης αναστέλλουν τη δραστηριότητά τους στο

in vitro

δοκιμασίες εισβολής. Επιπλέον, βρήκαμε ότι το επίπεδο έκφρασης ETK επίσης μπορεί να προβλέψει την επιβίωση των ασθενών με τη θεραπεία κυστεκτομή ανεξάρτητη από άλλες σημαντικές κλινικοπαθολογοανατομικών μεταβλητές όπως η ηλικία, το βαθμό του όγκου, το στάδιο και τη θετική κατάσταση των λεμφαδένων. Ως εκ τούτου, ETK μπορεί δυνητικά να χρησιμεύσει ως ένα νέο στόχο για τη θεραπεία της καρκίνο της ουροδόχου κύστης, καθώς και ένα βιοδείκτη που θα μπορούσαν να χρησιμοποιούνται για τη διαστρωμάτωση των ασθενών με υψηλότερο κίνδυνο θνησιμότητας. Αυτοί οι ασθενείς μπορεί να είναι ευεργετική από θεραπευτική στόχευση δραστηριότητα ETK.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture, επιμόλυνση και λεντοϊού λοίμωξη

Ανθρώπινο κύστης καρκίνο κυτταρική σειρά Τ24, 5637, J82, RT-4 και UM-UC-3, καθώς και 293Τ αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC). UM-UC-3, Τ24 και 293Τ κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco. 5637, J82 και RT-4 κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 με 10% ορό εμβρύου μόσχου και 1% (ν /ν) πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml) και διατηρήθηκε στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με HD FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Λοίμωξη οφειλόμενη σε φακοϊό διεξήχθη όπως προηγουμένως [9].

Ανοσοκαθίζηση και στύπωμα Western

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20 mM Tris /HCl, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton Χ-100, 1 mM Να

3νο

4, 1 mg /ml απροτινίνη, 1 mg /ml λευπεπτίνη και 1 mM φαινυλμεθυλ-σουλφονύλιο). Το αδιάλυτο υλικό απομακρύνθηκε με φυγοκέντρηση και προστέθηκαν αντισώματα σε κυτταρόλυμα για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Αντισώματα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας πρωτεΐνη Α ή πρωτεΐνη G σφαιρίδια-Sepharose, και πρωτεϊνικά σύμπλοκα εκπλύθηκαν τρεις φορές στους 4 ° C με το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Ανοσοκηλίδωση έγινε όπως περιγράφεται προηγουμένως [9]. Εν συντομία, τα ίσες ποσότητες δείγματος διαχωρίστηκαν σε μια γέλη πολυακρυλαμιδίου SDS και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Οι κηλίδες επωάστηκαν με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C και ακολουθήθηκε από ανίχνευση με χρένο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση. Το μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-BMX (BD Transduction Laboratories) χρησιμοποιήθηκε σε 1:2000, ενώ αντι-pSTAT3 (Y705), ΑΚΤ, ρΑΚΤ (S473), EGFR, pEGFR (Y1175) και pETK (Y40) (Cell Signaling Technology, Danvers , ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν σε 1:1,000. Anti-Bcl-XL, αντι-τουμπουλίνης, ERK, VDAC και αντι-σήμα μετατροπείς και ενεργοποιητές της μεταγραφής 3 (STAT3) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) χρησιμοποιήθηκαν σε 1:2,000.

WST -1, σχηματισμός αποικίας και TUNEL δοκιμασίες

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο και μολύνθηκαν με τον φακοϊό κωδικοποιεί την ETK shRNA ή ένα στοιχείο ελέγχου shRNA. Σε κάθε υποδεικνυόμενο χρονικό σημείο, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με WST-1 δοκιμασία (Roche) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, κύτταρα (1 χ 10

4) σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και μολύνθηκαν με τον φακοϊό για τον έλεγχο shRNA ή ETK shRNA. Η κυτταρική καλλιέργεια διατηρήθηκε σε πλήρες μέσο για 14 ημέρες. αποικίες κυττάρων στη συνέχεια κατέστησαν ορατές με βαφή Coomassie blue. UM-UC-3 και Τ24 κύτταρα μολύνθηκαν με τον φακοϊό κωδικοποιεί ETK shRNA ή όργανα ελέγχου για 96 ώρες και αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με προσδιορισμό TUNEL ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (Roche). Τα αποπτωτικά κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν μετρώντας TUNEL θετικά κύτταρα από πέντε τυχαίες ανεξάρτητες πεδία.

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή δοκιμασίες

Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με Transwell δοκιμασία όπως περιγράφεται προηγουμένως [8]. Εν συντομία, τα μολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε μέσο άνευ ορού, και στη συνέχεια μεταφέρθηκε στην κορυφή θαλάμους (5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο), ενώ οι κάτω θάλαμοι που περιέχουν 0,5 ml ρυθμισμένο μέσο από ΝΙΗ 3Τ3 ινοβλάστες. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα στην άνω επιφάνεια αποξέστηκαν και έπλυνε, ενώ τα κύτταρα μετανάστευσαν προς την κατώτερη επιφάνεια μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 4 ‘, 6-diamidino- 2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) για 5 λεπτά και στη συνέχεια μετρήθηκαν υπό ένα μικροσκόπιο φθορισμού, και ο σχετικός αριθμός με τον έλεγχο φορέα υπολογίστηκε. δοκιμασία κυττάρων εισβολή διεξήχθη σε συνθήκες παρομοίως ως ανωτέρω, με εξαίρεση τα φίλτρα transwell προ-επικαλύπτονται με Matrigel (BD Biosciences) και 1 × 10

5 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ανά φρεάτιο.

Ανοσοφθορισμός και συνεστιακή μικροσκοπία ανάλυση

τα κύτταρα σημάνθηκαν σε φρέσκα μέσα καλλιέργειας με 200 ηΜ Mitotracker (Invitrogen) στους 37 ° C για 30 λεπτά, και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 3.75% φορμαλίνη για 15 λεπτά που ακολουθείται από επώαση με διάλυμα αποκλεισμού [10% γάιδαρος 0.5% αλβουμίνη ορού βοός, 0,3% Triton Χ-100 σε PBS] και κατεργάζεται με ETK αντισώματος για μία νύκτα στους 4 ° C. Οι ανοσοαντιδράσεις αποκαλύφθηκαν με επώαση των κυττάρων με γίδινο αντι-ποντικού FITC 488-συζευγμένο IgG (Jackson Immuno Research) και ϋΑΡΙ (1:5000) για 5 λεπτά. Τέλος, η καλυπτρίδα που περιέχει τα ανοσοσημασμένων κύτταρα τοποθετήθηκαν με ένα αντι-ξεθώριασμα μέσο στερέωσης (Biomeda γέλη mount, Electron Microscopy Sciences). Τα κύτταρα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μία βύθιση σε νερό 40Χ αντικειμενικό φακό ενός μικροσκοπίου Zeiss συνεστιακού 510 εξοπλισμένο με 347-, 488-, και 543-nm δέσμες λέιζερ.

μιτοχονδριακού προετοιμασία και αντιδρώντα είδη οξυγόνου (ROS) ανίχνευση

κλάσμα μιτοχόνδρια καθαρίστηκε με μιτοχόνδρια Kit Μόνωση για καλλιεργημένα κύτταρα (Pierce) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ενδοκυτταρική ROS μετρήθηκε με τη χρήση της χρωστικής 5 (6) -CDCFDA (Molecular Probes). Μετά το πέρασμα μέσω της μεμβράνης του πλάσματος, αυτή η λιπόφιλη και όχι-φθορίζουσα ένωση αφεστεροποιείται σε ένα υδρόφιλο αλκοόλη (H2DCF), η οποία μπορεί να οξειδωθεί προς φθορισμού DCF με μία μέθοδο που συνήθως θεωρούνται ότι συνιστούν με ROS. Καλλιεργημένα κύτταρα φορτώθηκαν με 10 μΜ 5 (6) -CDCFDA σε κανονικό μέσο στους 37 ° C για 30 λεπτά. Μετά την επώαση, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με μέσο και άφησε την τελευταία μέσο έκπλυσης για μελέτες απεικόνισης. Απεικόνισης ελήφθη με μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιώντας ένα Nikon TE2000s ανεστραμμένο μικροσκόπιο με 10x στόχο.

μικροσυστοιχιών ιστών, ανοσοϊστοχημεία και στατιστική ανάλυση

μικροσυστοιχίες ιστών (TMAs) παρασκευάστηκαν από το Τμήμα Παθολογίας στο Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, Λος Άντζελες (UCLA) Medical Center, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Οι ερευνητές είχαν μόνο υπό τον όρο με κλινικο-παθολογικών δεδομένων, όπως το στάδιο του όγκου και της ποιότητας. Όλα ταυτοποίηση ασθενών απομακρύνθηκαν έτσι ώστε να μην είναι δυνατός ο εντοπισμός κάθε ιστό σε έναν συγκεκριμένο ασθενή. Ως εκ τούτου, το απόρρητο του ασθενούς είναι προστατευμένη. Σύμφωνα με το πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το IRB επιτροπή στο UCLA, δεν συγκατάθεση του ασθενούς απαιτείται για τη μελέτη αυτή. TMA αποπαραφινοποιήθηκαν με ξυλόλιο και βάφτηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Εν συντομία, τα πλακίδια επανυδατώθηκαν και ανάκτηση αντιγόνου επιτεύχθηκε με μικροκύματα για 15 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού. Τα πλακίδια επωάστηκαν στη συνέχεια σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,3% για τη σβέση της ενδογενούς υπεροξειδάσης horseradish (HRP) για 30 λεπτά. Τα πλακίδια προ-επωάστηκαν με φυσιολογικό ορό κατσίκας σε PBS (1:20) για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πλακίδια στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα ETK (1:2000) στους 4 βαθμό τη διάρκεια της νύχτας. Στη συνέχεια, τα πλακίδια επωάστηκαν με επισημασμένο με βιοτίνη IgG αντι-κουνελιού και επωάστηκαν με προσχηματισμένο σύμπλεγμα υπεροξειδάσης αβιδίνης-βιοτίνης. Τέλος, τα πλακίδια αντίθετα με αιματοξυλίνη, αφυδατώνονται και τοποθετημένα.

Τα πλακίδια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Ariol SL-50 αυτόματο σαρωτή διαφανειών (Applied Imaging, San Jose, Calif) για να ποσοτικοποιηθεί η ποσότητα του θετική χρώση για κάθε τομέα ενδιαφέροντος. Κατώτατα όρια για κάθε εικόνα εφαρμόστηκαν χρησιμοποιώντας το Ariol λογισμικό ανάλυσης που βασίζονται σε πολλαπλές παραμέτρους: RGB αλγορίθμου, το σχήμα και το μέγεθος. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το σενάριο MultiStain. Οριοθετημένων ταξινομητές έχουν προσαρμοστεί για κάθε λεκέ.

Για την αξιολόγηση της πυρηνικής χρώσης, θετική χρώση DAB υπολογίστηκε με την εφαρμογή δύο κατώτατα όρια χρώμα με ένα αναγνωρίζοντας μπλε φόντο (αιματοξυλίνη χρωματισμένο) κύτταρα και άλλες αναγνωρίζουν καφέ θετικά κύτταρα και μπλε, μη θετικών κυττάρων (συνολικός αριθμός κυττάρων). Μεμονωμένα κύτταρα υφίστανται διακρίσεις με την ενσωμάτωση των κατώτατων ορίων σχήμα και το μέγεθος, την παροχή, μαζί με τα κατώτατα όρια χρώμα, πραγματική μετρήσεις κυττάρων. Ποσοστό θετικότητα προσδιορίστηκε με διαίρεση του αριθμού των κυττάρων που ανιχνεύεται από τον καφέ κατώφλι με το συνολικό αριθμό των κυττάρων, που ανιχνεύεται από το άθροισμα των καφέ και μπλε όρια. Συνολική έκταση του ιστού αναλύθηκαν επίσης περιλαμβάνονται στην τελική ανάλυση (μm

2).

Για την εκτίμηση κυτταροπλασματική χρώση, η θετική χρώση περιοχή υπολογίστηκε με την εφαρμογή κατώτατων ορίων χρώμα για τον εντοπισμό θετικών καφέ pixels. Ποσοστό της θετικότητας προσδιορίστηκε διαιρώντας την συνολική έκταση θετική χρώση (μm

2) από τη συνολική έκταση του ιστού που αναλύθηκαν (μm

2).

Το ανοσοδραστικό βαθμολογία για κάθε υπόθεση ποσοτικά από το μέσο όρο από τέσσερις πυρήνες. Συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης ETK και παθολογικών παραμέτρων εκτιμήθηκαν με μη παραμετρικά τεστ Kruskal-Wallis. Διαφορετικά τελικά σημεία επιβίωσης /επανάληψης αξιολογήθηκαν για τους ασθενείς που υποβλήθηκαν σε TUR και οι ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε κυστεκτομή. Καμπύλες Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η επιβίωση καμπύλες χρόνου /χωρίς υποτροπή και η δοκιμή log rank χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί αν οι καμπύλες διέφεραν μεταξύ των ομάδων. COX μοντέλο πολλαπλής αναλογικών κινδύνων χρησιμοποιείται για να εκτιμήσει ποιες συμπαράγοντες επηρεάζουν την επιβίωση /υποτροπή ελεύθερο χρόνο. Για κάθε συμμεταβλητή, το ποσοστό σχετικής επικινδυνότητας και η σχετική

P

αξία έχουν αναφερθεί. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό SAS έκδοση 9.2.

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τον Δρ Allan J. Πάντακ για τις συμβουλές του σχετικά με την ανάλυση των δεδομένων.