Αφηρημένο

Η αλδεΰδη αφυδρογονάση ισομορφή 1 (ΑΙ_ϋΗ1) έχει αποδειχθεί χρήσιμη για τον προσδιορισμό της καρκινικά βλαστικά κύτταρα. Ωστόσο, οι γνώσεις μας για την έκφραση και τη δραστηριότητα των ΑΙ_ϋΗ1 κοινά επιθηλιακών καρκίνων και των αντίστοιχων φυσιολογικών ιστών τους είναι ακόμα σε μεγάλο βαθμό απούσα. Ως εκ τούτου, χαρακτηρίζεται από έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 σε 24 τύπους των φυσιολογικών ιστών και μια μεγάλη συλλογή των επιθηλιακών όγκων δειγμάτων (τύποι έξι καρκίνου, n = 792) με ανοσοϊστοχημική χρώση. Χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ALDEFUOR, δραστικότητα ΑΙ_ϋΗ1 εξετάστηκε επίσης σε 16 πρωτογενή δείγματα όγκου και 43 καθορίζονται επιθηλιακών καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Επιπλέον, ένας καρκίνος των ωοθηκών διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού και 7 ποντικού κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών αναλύθηκαν. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης και τα πρότυπα του ΑΙ_ϋΗ1 σε επιθηλιακούς καρκίνους είναι αξιοσημείωτα διαφορετικές, και να συσχετίζονται με τις αντίστοιχες φυσιολογικούς ιστούς τους. Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης ΑΙ_ϋΗ1 συσχετίζεται θετικά με ΑΙ_ϋΗ1 ενζυματική δραστικότητα μετράται με προσδιορισμό ALDEFLUOR. Μακροχρόνια

in vitro

πολιτισμό δεν επηρεάζει σημαντικά ΑΙ_ϋΗ1 δραστηριότητα στα επιθηλιακά κύτταρα του όγκου. Σύμφωνα με την έρευνα για άλλους καρκίνους, βρήκαμε ότι η έκφραση υψηλού ΑΙ_ϋΗ1 συνδέεται σημαντικά με την κακή κλινική έκβαση σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών ορώδης (n = 439, p = 0,0036). Τέλος, ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα br όγκου παρουσιάζουν ιδιότητες του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων και είναι ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία. Ως δείκτης βλαστικών κυττάρων νέα καρκίνος, ΑΙ_ϋΗ1 μπορούν να χρησιμοποιηθούν για όγκους των οποίων αντίστοιχοι φυσιολογικοί ιστοί εκφράζουν ΑΙ_ϋΗ1 σε σχετικά κλειστές ή περιορισμένα επίπεδα όπως του μαστού, του πνεύμονα, των ωοθηκών ή του κόλου

Παράθεση:. Deng S, Yang X , Lassus Η, Liang S, Kaur S, Ye Q, et al. (2010) διακριτά επίπεδα Έκφραση και κατανομή των Βλαστικών Κυττάρων Marker, αλδεΰδη δεϋδρογενάση Ισόμορφης 1 (ΑΙ_ϋΗ1), σε ανθρώπινα επιθηλιακά καρκίνους. PLoS ONE 5 (4): e10277. doi: 10.1371 /journal.pone.0010277

Επιμέλεια: Yihai Cao, του Ινστιτούτου Καρολίνσκα, στη Σουηδία

Ελήφθη: πρώτης Δεκεμβρίου 2009? Αποδεκτές: 30 Μάρτη 2010? Δημοσιεύθηκε: 21, Απριλίου του 2010

Copyright: © 2010 Deng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τον Καρκίνο του μαστού Συμμαχία (LZ), η ωοθηκών Cancer Research Βρέθηκαν (Liz Tilberis Μελετητής, LZ), το Φιλανθρωπικό Ίδρυμα Mary Kay Ash (LZ), Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (R01CA142776 και καρκίνου των ωοθηκών SPORE P50-CA83638-7951 σχέδιο 3, LZ), και το Υπουργείο άμυνας των ΗΠΑ (W81XWH-10-1-0082, LZ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η έρευνα έχει παράσχει ισχυρή υποστήριξη για την υπόθεση των κυττάρων του καρκίνου του στελέχους, η οποία προτείνει ότι ένα σχετικά σπάνιο υποπληθυσμό καρκινικών κυττάρων έχουν τη μοναδική ικανότητα να κινήσει και να διαιωνίσει την ανάπτυξη του όγκου [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Τα κύτταρα αυτά, που ονομάζονται καρκινικά βλαστικά κύτταρα ή καρκινικά κύτταρα-κίνηση, μοιράζονται διάφορα χαρακτηριστικά με εμβρυϊκά και σωματικά βλαστικά κύτταρα συμπεριλαμβανομένης της αυτο-ανανέωσης και multi-ισχυρή διαφοροποίηση [11], [12], [13], [14], [15] [16], [17]. Καρκίνος βλαστικά κύτταρα μπορεί να είναι ιδιαίτερα ανθεκτικό σε ακτινοβολία ή χημειοθεραπεία [18], [19], [20], επομένως, η ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπειών για τον καρκίνο απαιτεί αποτελεσματική στόχευση αυτού του κυτταρικού πληθυσμού [11], [12], [13 ], [14], [15], [16], [17]. Καρκίνος βλαστικά κύτταρα μπορούν να ταυτοποιηθούν και να απομονώνονται χρησιμοποιώντας δείκτες ειδικούς για κανονική προγονικά ή βλαστικά κύτταρα του ίδιου οργάνου [16], [21]. Αρκετοί δείκτες έχουν αποδειχθεί χρήσιμες για την απομόνωση των υποσυνόλων εμπλουτισμένο για τα επιθηλιακά καρκινικά βλαστικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων CD44 /CD24 (HAS /pGP1) [3], CD133 (PROM1) [4], ΑΤΡ-δέσμευσης Β5 κασέτα (ABCB5) [22], CD90 (Thy1) [23], CD61 (β3 ιντεγκρίνη) [24], 26S πρωτεασώματος δραστηριότητα [25], καθώς και Hoechst33342 αποκλεισμού [6], [26], [27].

Αλδεΰδη αφυδρογονάσης ( ΑΙ_ϋΗ) καταλύει την μη αντιστρεπτή οξείδωση μιας σειράς αλειφατικών και αρωματικών αλδεϋδών προς αντίστοιχα καρβοξυλικά οξέα τους [28]. Υψηλή δραστικότητα ΑΙ_ϋΗ ανιχνεύεται σε βλαστικά και τα προγονικά κύτταρα διαφόρων γραμμώσεων, συμπεριλαμβανομένων αιμοποιητικών [29], [30], [31], τα μεσεγχυματικά [32], νευρωνικό [33], του μαστού [34], [35] και του προστάτη [36] . Η δοκιμασία ALDEFLUOR αναπτύχθηκε αρχικά για να ανιχνεύσει δραστηριότητα ALDH σε αιματοποιητικούς ιστούς? το φθορίζον προϊόν αντίδρασης ALDEFLUOR συσσωρεύεται σε βλαστικά κύτταρα και συσχετίζεται με δραστικότητα ALDH [29]. ΑΙ_ϋΗ μετατρέπει το υπόστρωμα ΑΙ_ϋΗ, ΒΑΑΑ (ΒΟϋΙΡΥ-αμινοακεταλδεΰδης), μέσα στο φθορίζον ΒΑΑ προϊόν (ΒΟϋΙΡΥ-αμινοξικός), η οποία συγκρατείται μέσα βιώσιμων κυττάρων. Τα κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα ALDH γίνονται λαμπρά φθορίζοντα (ALDH

br) και μπορούν να αναγνωριστούν και απαριθμούνται χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο κυτταρόμετρο ροής ή απομονώνονται με διαλογή κυττάρων για περαιτέρω καθαρισμό και χαρακτηρισμό. ALDECOUNT® είναι ένα FDA εγκεκριμένο

in vitro διαγνωστική

προϊόν το οποίο βασίζεται στην ανίχνευση ALDEFLUOR και χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση και την καταμέτρηση των βλαστικών κυττάρων για κλινικές εφαρμογές. Πιο πρόσφατα, η δοκιμασία ALDEFLUOR έχει εφαρμοστεί με επιτυχία για την ανίχνευση των προγονικών και αρχέγονων κυττάρων καρκίνου σε μη αιματοποιητικούς ιστούς όπως καρκίνοι του μαστικού αδένα και του μαστού [34]. Το αντιδραστήριο ALDEFLUOR είναι γνωστό ότι δρα ως υπόστρωμα για ΑΙ_ϋΗ1. Είναι σημαντικό ότι, ένα ειδικό αντίσωμα ΑΙ_ϋΗ1 μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του καρκίνου βλαστικών κυττάρων σε κλινικά δείγματα εμπεδωθεί με παραφίνη [34]. Αρκετές ανεξάρτητες ομάδες έχουν αναφέρει ότι ΑΙ_ϋΗ1 έκφρασης μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστικός δείκτης για επιθηλιακών καρκίνων [34], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43]. Ως εκ τούτου, η δοκιμασία ALDEFLUOR και ΑΙ_ϋΗ1 ανοσοχρώση μπορεί να αποδειχθεί χρήσιμη για την ανίχνευση και την απομόνωση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων σε επιθηλιακούς όγκους, διευκολύνοντας έτσι την εισαγωγή των εννοιών του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων με την κλινική πρακτική [34]. Ωστόσο, οι γνώσεις μας για την έκφραση και τη δραστηριότητα των ΑΙ_ϋΗ1 σε ανθρώπινα επιθηλιακά καρκίνους και τις αντίστοιχες φυσιολογικούς ιστούς τους, καθώς και η κλινική σημασία του, είναι ακόμα στα σπάργανα. Να προάγει τις γνώσεις μας σε αυτόν τον σημαντικό τομέα, που χαρακτηρίζεται έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 σε 24 τύπους των φυσιολογικών ανθρώπινων ιστών, καθώς και μια μεγάλη συλλογή από ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά δείγματα παραφίνη-ενσωματωμένες (τύποι έξι καρκίνου, n = 792) με ανοσοϊστοχημική χρώση. Χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ALDEFUOR, δραστικότητα ΑΙ_ϋΗ1 εξετάστηκε επίσης σε 16 πρωτογενή δείγματα όγκου και 43 καθορίζονται ανθρώπινων επιθηλιακών καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Επιπλέον, ένα καρκίνο των ωοθηκών διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού και 7 ποντικού κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών αναλύθηκαν στη μελέτη μας.

Υλικά και Μέθοδοι

Φρέσκα Tumor Δείγματα

Οι ιστοί ελήφθησαν μετά γραπτή συγκατάθεση των ασθενών στο πλαίσιο ενός γενικού πρωτοκόλλου συλλογής ιστού που εγκρίθηκε από το ίδρυμα Institutional Review Board (IRB) του Πανεπιστημίου της Πενσυλβάνια. Όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης debulking από λάβει προηγούμενη θεραπεία ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών τελικού σταδίου. Τα ερυθροκύτταρα λύθηκαν με διάλυμα χλωριούχου αμμωνίου. Single-κυτταρικά εναιωρήματα παρασκευάσθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σουρωτήρι κύτταρο 40 μm. Τα νεκρά κύτταρα αποκλείστηκαν χρησιμοποιώντας μαγνητικά σφαιρίδια (Dead κιτ αφαίρεσης κυττάρων, Miltenyi Biotec) και ένα διαχωριστικό MidiMACS

μικροσυστοιχίες ιστών

Ιστός ομάδα του δικτύου πίνακα:.

Μια FDA φυσιολογικό ανθρώπινο όργανο microarray ιστός χρησιμοποιείται για να χαρακτηρίσει την έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 σε φυσιολογικά όργανα. Η πλατφόρμα αυτή σειρά ιστού περιλαμβάνονται 24 τύποι φυσιολογικών ανθρώπινων οργάνων με βάση τις κατευθυντήριες γραμμές του FDA, και κάθε όργανο ελήφθη δείγμα από 3 φυσιολογικά άτομα. Έξι τύποι ανθρώπινων μικροσυστοιχίες ιστού επιθηλιακών όγκων χρησιμοποιήθηκαν για να χαρακτηρίσουν την έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 σε επιθηλιακούς όγκους. Κάθε ασθενής που αντιπροσωπεύεται με τουλάχιστον δύο βιοψίες πυρήνα ιστού.

Ελσίνκι κοόρτη:

Μια μικροσυστοιχία καρκινικού ιστού των ωοθηκών χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστεί η προγνωστική σημασία της ΑΙ_ϋΗ1 στον καρκίνο των ωοθηκών. Η σειρά περιελάμβανε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία για την πρωτογενή ορώδες καρκίνωμα των ωοθηκών στο Πανεπιστήμιο του Ελσίνκι Κεντρικό Νοσοκομείο της.

Οι κυτταρικές σειρές και Cell Culture

Ένα σύνολο από 50 κυτταρικές σειρές καρκίνου χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, συμπεριλαμβανομένων 15 ανθρώπινου του μαστού, των ωοθηκών 18 ανθρώπινα, 7 ποντικού ωοθηκών, και 10 ανθρώπινου κόλον. Όλες οι κυτταρικές σειρές καρκίνου καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen). Τρεις ανεξάρτητες αθανατοποιημένα ανθρώπινα κύτταρα ωοθηκών επιφάνεια επιθηλιακών (IOSEs) έχουν γενναιόδωρα από τον Dr. Auersperg, και καλλιεργούνται σε ένα 1:01 συνδυασμό μέσου 199 και μέσου MCDB 105 (Sigma) συμπληρωμένο με 15% FBS. Ποντικού επιφάνεια επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών (Μωυσής) απομονώθηκαν και καλλιεργήθηκαν όπως έχει ήδη αναφερθεί [44].

διαγονιδιακά ποντίκια

Το πρωτόκολλο της μελέτης ζώο εξετάστηκε και εγκρίθηκε από τη φροντίδα των θεσμικών ζώων και τη χρήση της ουσίας ( IACUC) του Πανεπιστημίου της Πενσυλβάνια. Ο καρκίνος των ωοθηκών MISRII-SV40 διαγονιδιακό ποντίκι που δημιουργήθηκε από το εργαστήριο του Δρ Denise Κόνολι [45].

Η ανοσοϊστοχημεία και Ανάλυση Εικόνας

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Vectastain ABC Kit όπως περιγράφεται από ο κατασκευαστής (Vector). Τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη: αντι-ανθρώπινο ΑΙ_ϋΗ1 ποντικού (κλώνος: 44 /ΑΙ_ϋΗ, 1:250, BD Pharmingen) [34], [39], [46]? ποντικού αντι-ανθρώπου Κί67 (1:100, ϋΑΚΟ) και κουνελιού αντι-ανθρώπινης CD45 (1:200, Millipore). Αντισώματα επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Η ανοσοαντίδραση οπτικοποιήθηκε με 3,3′-διαμινοβενζιδίνη. Διπλή χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [47].

ALDEFLUOR Δοκιμασία

δραστικότητα ALDH ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας ALDEFLUOR (StemCell Technologies) όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή. Εν συντομία, διαχωρίστηκαν μονά κύτταρα από κυτταρικές γραμμές ή δείγματα όγκου εναιωρούνται σε ρυθμιστικό δοκιμασίας που περιέχει ένα ALDEFLUOR υπόστρωμα ΑΙ_ϋΗ, ΒΟϋΙΡΥ-αμινοακεταλδεΰδης (ΒΑΑΑ), σε 1,5 μΜ, και επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 ° C. Ένας ειδικός αναστολέας του ΑΙ_ϋΗ, diethylaminobenzaldehyde (ϋΕΑΒ), σε 10-πλάσια γραμμομοριακή περίσσεια, χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Η κυτταρομετρία ροής δεδομένα αναλύθηκαν με BD V6.1.3 λογισμικό FACSDiva (BD Biosciences) ή λογισμικό FlowJo (TreeStar).

Protein Απομόνωση και

κηλίδος Western

Τα καλλιεργημένα κύτταρα λύθηκαν σε 200 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης που περιέχει 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7,4), 150 mM NaCl, και 1% Triton Χ-100. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE υπό μετουσιωτικές συνθήκες και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με ένα πρωτογενές αντίσωμα αντι-ΑΙ_ϋΗ1 (1:300, BD Pharmingen), ακολουθούμενο από επώαση σε δευτεροταγές αντίσωμα αντι-ποντικού συζευγμένο με υπεροξειδάση (1:5,000? Amersham Biosciences). Ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific).

Mammosphere καλλιέργεια

Mammosphere καλλιέργειες διεξήχθησαν όπως περιγράφεται από τους Dontu

κ.ά.

[48]. Εν συντομία, και μόνο τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες εξαιρετικά χαμηλής σύνδεσης 24 φρεατίων (Corning) σε πυκνότητα 20.000 βιώσιμα κύτταρα /ml και 5000 κύτταρα /ml σε επόμενες διαβάσεις. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο mammosphere καλλιέργειας χωρίς ορό (MammoCult, StemCell Technologies) συμπληρωμένο με MammoCult συμπληρώματα διάδοσης. Mammospheres συλλέχθηκαν με ήπια φυγοκέντρηση (800 rpm) μετά από 7-10 ημέρες και διαχωρίστηκαν μηχανικά και ενζυμικά (10 λεπτά σε 0,05% θρυψίνη, 0,53 mM EDTA-4Na).

In vivo

ογκογόνο

δοκιμασία

το πρωτόκολλο της μελέτης ζώο εξετάστηκε και εγκρίθηκε από την θεσμική επιτροπή φροντίδα των ζώων και τη χρήση (IACUC) του Πανεπιστημίου της Πενσυλβάνια. Έξι έως οκτώ παλιά θηλυκά ανοσοποιητικό ανεπαρκή ποντίκια εβδομάδων χρησιμοποιήθηκαν σε αυτές τις μελέτες. ΑΙ_ϋΗ

χαμηλή και ALDH

br (ALDH

φωτεινά) κύτταρα απομονώθηκαν με διαλογή FACS. Τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο αναμεμιγμένο με έναν ίσο όγκο Matrigel (BD Biosciences) στα 10 mg /ml. Ένα συνολικό όγκο 0.3 ml, που περιέχει 500? 5000 ή 50.000 κύτταρα, εγχύθηκε υποδορίως (με ωοθηκεκτομή και οιστρογόνο-σφαιρίδιο συμπληρωμένο ποντίκια).

ΜΤΤ δοκιμασία

προσδιορισμοί ΜΤΤ πραγματοποιήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων με χρήση του Κιτ Πολλαπλασιασμού Κυττάρου (Ι) ( Roche) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

η στατιστική ανάλυση

η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση των στατιστικών πακέτων SPSS και StatView.

Αποτελέσματα

Έκφραση και διανομή του ΑΙ_ϋΗ1 πρωτεΐνης σε κανονικούς ανθρώπινους ιστούς

Ως δείκτη βλαστικών κυττάρων, ΑΙ_ϋΗ1 έχει χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του καρκίνου βλαστικών κυττάρων σε πολλούς τύπους επιθηλιακών όγκων ανθρωπίνων χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημική χρώση? Ωστόσο, τα πρότυπα έκφρασης και διανομή του σε κανονικούς ανθρώπινους ιστούς είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Για να αντιμετωπιστεί αυτό το σημαντικό ζήτημα, χαρακτηρίσαμε την μορφή έκφρασης του ΑΙ_ϋΗ1 σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς με ανοσοϊστοχημική χρώση. Ένα FDA-εγκριθεί φυσιολογικό μικροσυστοιχιών ιστός ανθρώπινο όργανο χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Εδώ, συμπεριλήφθηκαν 24 είδη των φυσιολογικών ανθρώπινων οργάνων με βάση τις κατευθυντήριες γραμμές της FDA, όπου κάθε όργανο λήφθηκε από 3 φυσιολογικό ανθρώπινο άτομα. Mouse αντί-ανθρώπινο αντίσωμα ΑΙ_ϋΗ1 (κλώνος: 44 /ALDH) [34], [39], [46] χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της έκφρασης ΑΙ_ϋΗ1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, ΑΙ_ϋΗ1 θετική χρώση ανιχνεύθηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα, και εκφράζονται ευρέως στο πεπτικό σύστημα (συμπεριλαμβανομένου του επιθηλίου του οισοφάγου, του στομάχου, του εντέρου και του παχέος εντέρου, καθώς και το ήπαρ και το πάγκρεας), το ενδοκρινικό σύστημα (συμπεριλαμβανομένων των επινεφριδίων, υπόφυση, το θυρεοειδή και σιελογόνου αδένα) και το αναπαραγωγικό σύστημα (ωοθήκες και όρχεις). Δεν υπήρχαν ανιχνεύσιμα ΑΙ_ϋΗ1 θετικών κυττάρων στο εγκέφαλο και την παρεγκεφαλίδα (Σχήμα 1Α). Σε άλλα όργανα, ΑΙ_ϋΗ1 διανεμήθηκε σε ορισμένες περιοχές και σε συγκεκριμένους τύπους κυττάρων. Για παράδειγμα, στον σπλήνα, ΑΙ_ϋΗ1 θετικά κύτταρα βρέθηκαν κυρίως σε λευκοκύτταρα των κόκκινες περιοχές πολτό, αλλά όχι στο λευκό πολτό (Σχήμα 1Α). Είναι σημαντικό ότι, σε συμφωνία με άλλες αναφορές [34], [46], [49], ισχυρώς θετικά κύτταρα ΑΙ_ϋΗ1 βρέθηκαν στις περιοχές στις οποίες επιθηλιακά βλαστικά προγονικά κύτταρα /είχαν πιθανώς βρίσκεται στο στήθος, του παχέος εντέρου και του στομάχου (Σχήμα 1Β). Στην κανονική του μαστού, ΑΙ_ϋΗ1 θετικά κύτταρα που βρίσκονται κυρίως στην περιοχή του αυλού (Εικόνα 1Β), και ήταν ένα σχετικά σπάνιο πληθυσμό (1-2% του αυλού των επιθηλιακών κυττάρων). Μικρές θετικά κύτταρα ΑΙ_ϋΗ1 βρέθηκαν επίσης σε φυσιολογικά στρώμα του μαστού (Σχήμα 1Β). Διπλό ανοσοϊστοχημική χρώση έδειξε ότι τα περισσότερα από αυτά τα κύτταρα (& gt? 90%) ήταν θετικοί CD45 λευκοκύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στο φυσιολογικό κόλον, παρόλο ασθενώς ΑΙ_ϋΗ1 θετικά κύτταρα μπορούσαν να βρεθούν σχεδόν σε όλες τις κανονικές κρύπτες, ο αριθμός των ισχυρώς θετικών κυττάρων ΑΙ_ϋΗ1 ήταν αρκετά περιορισμένη (Σχήμα 1Β). Αυτά τα ισχυρά θετικά κύτταρα που βρίσκονται κυρίως στις βάσεις των κρυπτών (Σχήμα 1Β). Παρόμοια πρότυπα χρώσης που παρατηρείται επίσης στο στομάχι (Εικόνα 1Β).

Α. Ένα FDA φυσιολογικό μικροσυστοιχιών ιστός ανθρώπινο όργανο χρησιμοποιήθηκε για να χαρακτηρίσει την έκφραση και τη διανομή των ΑΙ_ϋΗ1 σε 24 ιστούς. Β έντονα θετικά κύτταρα ΑΙ_ϋΗ1 βρέθηκαν στις περιοχές στις οποίες επιθηλιακά βλαστικά προγονικά κύτταρα /ήταν πιθανώς βρίσκεται στο στήθος, του παχέος εντέρου και του στομάχου.

Η

Η έκφραση και τη διανομή των ΑΙ_ϋΗ1 πρωτεΐνης στα επιθηλιακά ανθρώπινων όγκων

στη συνέχεια, μελετήσαμε την έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 σε επιθηλιακά καρκινώματα ανθρώπινη χρήση συστοιχιών ιστού. Όπως φαίνεται από τα παραπάνω, τα μοτίβα και τα επίπεδα έκφρασης του ΑΙ_ϋΗ1 σε κανονικούς ανθρώπινους ιστούς είναι αξιοσημείωτα διαφορετικές και μπορούν να ταξινομηθούν σε τρεις τύπους: 1) ιστού με απούσα ή περιορισμένη έκφραση ΑΙ_ϋΗ1, όπως του μαστού ή του πνεύμονα? 2) ιστού με σχετική ασθενή έκφραση ΑΙ_ϋΗ1, όπως του παχέος εντέρου ή του γαστρικού επιθηλίου? και 3) ιστού με εκτεταμένη και υψηλή έκφραση του ΑΙ_ϋΗ1 όπως, το ήπαρ ή το πάγκρεας (Εικόνα 1Α). Έτσι, επιλέξαμε έξι τύπους (μαστού, η = 69? Πνεύμονα, η = 66? Ωοθηκών, η = 65? Παχέος εντέρου, η = 67? Συκώτι, η = 67? Και τον καρκίνο του παγκρέατος, n = 19) των επιθηλιακών καρκίνων του οποίου οι αντίστοιχες κανονική epitheliums ήταν αντιπροσωπευτικές της κάθε υπότυπο. Σε όλες τις έξι τύπους όγκων, ένας μεγάλος αριθμός των θετικών ΑΙ_ϋΗ1 στρωματικά κύτταρα όγκου-διηθητικά βρέθηκαν (Σχήμα 2Β). Διπλή ανοσοχρώση έδειξε ότι οι περισσότερες από αυτές ήταν CD45 θετικά κύτταρα. Το ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ1 θετικών καρκινικών κυττάρων στα νησίδια του όγκου ανεξάρτητα ποσοτικά από δύο ερευνητές με παθολογικά κατάρτισης. Στρωματικά ΑΙ_ϋΗ1 θετικά κύτταρα εξαιρέθηκαν από την ανάλυση αυτή. Βρήκαμε ότι η έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 ήταν αρνητική σε 79,7% (55/69), στήθους, 18,2% (12/66) των πνευμόνων και 23,1% (15/65) των καρκίνων των ωοθηκών. Αντιθέτως, μόνο το 6,0% (4/67) του παχέος εντέρου και του 5,3% (1/19) των καρκίνων του παγκρέατος ήταν ΑΙ_ϋΗ1 αρνητικά, και όλα τα δείγματα καρκίνου του ήπατος ήταν ΑΙ_ϋΗ1 θετικές. Επιπλέον, για εκείνες τις ΑΙ_ϋΗ θετικών όγκων, το ποσοστό των κυττάρων όγκου που εκφράζουν ΑΙ_ϋΗ1 αναλύθηκε επίσης. Η λεπτομερής ποσοστό των θετικών ΑΙ_ϋΗ1 καρκινικών κυττάρων συνοψίζεται στην Εικόνα 2C. Εκτός από την περίπτωση του καρκίνου του μαστού (4,3%), ένα υψηλό ποσοστό έκφρασης ΑΙ_ϋΗ1 (μεταξύ 75 και 100% των νεοπλασματικών κυττάρων) βρέθηκε σε καθένα από τα άλλα πέντε τύπους καρκίνου (των ωοθηκών: 29,2%, του παχέος εντέρου: 38,8%, του πνεύμονα : 43,9%, του παγκρέατος 78,9% και του ήπατος: 97,0%). Στο σύνολό τους, υπήρχε σαφής συσχέτιση της έκφρασης ΑΙ_ϋΗ1 μεταξύ όγκων και αντίστοιχων φυσιολογικών ιστών. Για παράδειγμα, σε αυτούς τους τύπους καρκίνου όπου ΑΙ_ϋΗ1 ήταν εντόνως εκφρασμένο στους αντίστοιχους φυσιολογικούς epitheliums, όπως το ήπαρ και του παγκρέατος, ΑΙ_ϋΗ1 εκφράστηκε στα περισσότερα δείγματα όγκου σε αξιοσημείωτα υψηλά επίπεδα.

μικροσυστοιχίες ιστού χρησιμοποιήθηκαν για τον χαρακτηρισμό του έκφραση και τη διανομή των ΑΙ_ϋΗ1 σε καρκίνους (n = 353). Α Έκφραση ΑΙ_ϋΗ1 στους αντίστοιχους φυσιολογικούς ιστούς. καρκινικά κύτταρα που διηθούν Β ΑΙ_ϋΗ1 + ανιχνεύθηκαν στο στρώμα. Γ Έκφραση των ΑΙ_ϋΗ1 σε επιθηλιακά καρκινώματα. Ποσοστό ΑΙ_ϋΗ1 + καρκινικών κυττάρων συνοψίστηκε. Δ Υψηλό ποσοστό κυττάρων ΑΙ_ϋΗ1 + συσχετίστηκε με κακή κλινική έκβαση σε ορώδης καρκίνο των ωοθηκών.

Η

Έχει αναφερθεί από ανεξάρτητες ομάδες ότι ένα υψηλό ποσοστό των θετικών καρκινικών κυττάρων ΑΙ_ϋΗ1 σχετίζεται με μικρότερους χρόνους επιβίωσης σε του μαστού [34], [37], [42], του πνεύμονα [38], παγκρεατικό [40], της ουροδόχου κύστης [41] και του προστάτη [43] ασθενείς με καρκίνο. Ελέγξαμε την προγνωστική αξία της ΑΙ_ϋΗ1 χρησιμοποιώντας μία συστοιχία ιστών ορώδους καρκίνων των ωοθηκών, η πιο κοινή histotype του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών του ανθρώπου. Τα δείγματα συλλέχθηκαν από το Τμήμα Γυναικολογίας και Μαιευτικής στο Πανεπιστήμιο του Ελσίνκι Κεντρικό Νοσοκομείο της. Ο διάμεσος χρόνος παρακολούθησης των ασθενών ζωντανοί στο τέλος της περιόδου μελέτης ήταν 101 μήνες, που κυμαίνονται 4-475 μήνες. Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε δύο ομάδες με βάση ΑΙ_ϋΗ1 ανοσοχρώση: ΑΙ_ϋΗ1 χαμηλή (& lt? 10% καρκινικών κυττάρων ήταν θετικό ΑΙ_ϋΗ1) και ΑΙ_ϋΗ1 υψηλό (≥10% καρκινικών κυττάρων ήταν ΑΙ_ϋΗ1 θετικό). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα από το στήθος [34], [37], [42], του πνεύμονα [38], παγκρεατικό [40], της ουροδόχου κύστης [41] και του προστάτη [43] καρκινοπαθείς, βρήκαμε ότι οι ασθενείς με υψηλές ΑΙ_ϋΗ1 είχαν μικρότερη ασθένεια ελεύθερη και συνολική χρόνους επιβίωσης σε σύγκριση με εκείνους με χαμηλή ΑΙ_ϋΗ1 (p = 0,0036 και ρ = 0,023, αντίστοιχα, Σχήμα 2D).

ΑΙ_ϋΗ1 ενζυματική δραστικότητα σε επιθηλιακά κύτταρα του όγκου

Το αντιδραστήριο ALDEFLUOR, αρχικά αναπτυχθεί για την ανίχνευση δραστικότητας ALDH σε αιματοποιητικούς ιστούς [29], είναι γνωστό ότι δρα ως υπόστρωμα για ΑΙ_ϋΗ1. Πρόσφατα, η δοκιμασία ALDEFLUOR έχει εφαρμοστεί με επιτυχία για την ανίχνευση ALDH

br σε βλαστικά κύτταρα του καρκίνου από μη αιματοποιητικούς όγκους [34]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε αυτή την δοκιμασία για να εξετάσει ΑΙ_ϋΗ1 ενζυματική δραστικότητα σε επιθηλιακά κύτταρα του όγκου

in vitro

. Πρώτον, για την επικύρωση των αποτελεσμάτων της συστοιχίας ιστού, επιλέξαμε κυτταρικές σειρές από τρία επιθηλιακά τύπους όγκων συμπεριλαμβανομένου του μαστού (n = 15), των ωοθηκών (n = 18) και του παχέος εντέρου (n = 10). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, το ποσοστό των όγκων με υψηλή συχνότητα ΑΙ_ϋΗ1 θετικών κυττάρων ήταν μεγαλύτερη σε καρκίνο του παχέος εντέρου σε σύγκριση με καρκίνο του μαστού ή των ωοθηκών. Σε συμφωνία με αυτό το εύρημα, βρήκαμε ότι το ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα br σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου (15,5 ± 11,5%) ήταν αξιοσημείωτα υψηλότερο από το στήθος (3.5 ± 4.8%) ή των ωοθηκών (6,2 ± 13,5%) των καρκινικών κυττάρων γραμμές (Σχήμα 3Β και Πίνακας S1). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση του αποτελέσματος αυτού, ανιχνεύσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης ΑΙ_ϋΗ1 από δυτικές κηλίδες σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Όπως αναμενόταν, τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης ΑΙ_ϋΗ1 σχετίστηκαν θετικά με το ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα br στις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3C και το Σχήμα S3). Αν και υπήρχε μια σαφής θετική συσχέτιση μεταξύ

in situ

ανοσοχρώση και τα αποτελέσματα της ανάλυσης ALDEFLUOR σε αυτούς τους τρεις τύπους όγκων, το ποσοστό των κυττάρων που εμφανίζουν ΑΙ_ϋΗ1 ενζυματική δραστικότητα με κυτταρομετρία ροής ήταν μικρότερο από το ποσοστό των θετικών κυττάρων ΑΙ_ϋΗ1 με ανοσοχρώση . Για παράδειγμα, 4,3%, 29,2% και 38,8% των δειγμάτων του μαστού, των ωοθηκών και του καρκίνου του παχέος εντέρου εντόνως εκφρασμένα ΑΙ_ϋΗ1 (μεταξύ 75 και 100% των καρκινικών κυττάρων ήταν ΑΙ_ϋΗ1 θετικά, Εικόνα 2C), ωστόσο, καμία από τις κυτταρικές σειρές όγκων που αποτελείται από μεγαλύτερο από το 75% των ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα br (Πίνακας S1). Στη συνέχεια, επιλέξαμε τον καρκίνο των ωοθηκών ως παράδειγμα για να διερευνηθεί η ενζυματική δραστηριότητα ΑΙ_ϋΗ σε πρωτογενή κύτταρα όγκου. εξετάστηκαν δεκαέξι στάδιο δείγματα ωοθηκικού καρκίνου αργά. Επειδή βρήκαμε ότι τα λευκοκύτταρα που διηθούν όγκο εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του ΑΙ_ϋΗ1 (Σχήμα 2Β), χωρίσαμε πρώτα κύτταρα ασκίτη με CD326 (EpCAM, ένα επιθηλιακό δείκτη στην πύλη ο πληθυσμός των κυττάρων του όγκου) ή CD45 (α maker λεμφοκυττάρων με τον πληθυσμό πύλη λεμφοκυττάρων) μετά την απομάκρυνση των νεκρών κυττάρων, χρησιμοποιώντας μαγνητικά σφαιρίδια. Η δοκιμασία ALDEFLUOR χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει κύτταρα με δραστικότητα ALDH σε κάθε ένα από παραπάνω πληθυσμού (Σχήμα 4Α). Βρήκαμε ότι 2.6 ± 3.1% (0,1 έως 11,3%) του CD45 θετικών κυττάρων ήταν ALDH

br (Σχήμα 4Β). Σύμφωνα με την μελέτη κυτταρική γραμμή, 1,1 ± 1,9% (0,1 – 7,0%) των θετικών καρκινικών κυττάρων CD326 ήταν ΑΙ_ϋΗ

br (Εικόνα 4Β), ένα μικρότερο ποσοστό από ό, τι στα αποτελέσματα ανοσοχρώση.

Α. ΑΙ_ϋΗ1 ενζυματική δραστικότητα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό ALDEFLUOR. ΫΕΑΒ χρησιμοποιήθηκε για να αναστέλλει την αντίδραση του ALDH με το αντιδραστήριο ALDEFLUOR, παρέχοντας ένα αρνητικό έλεγχο. B. Περίληψη της ενζυματικής δραστηριότητας ΑΙ_ϋΗ1 σε καθιερωμένες μαστού (n = 15), των ωοθηκών (n = 18) και του παχέος εντέρου (n = 10) κυτταρικές σειρές καρκίνου. έκφραση της πρωτεΐνης C. ΑΙ_ϋΗ1 ανιχνεύθηκε από δυτικές κηλίδες. Υπήρξε θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της πρωτεΐνης ΑΙ_ϋΗ1 και ενζυμική δραστηριότητα ΑΙ_ϋΗ1. Οι κηλίδες πλήρους μήκους παρουσιάζονται στο Συμπληρωματικό Σχήμα S3.

Η

Α. ΑΙ_ϋΗ1 ενζυματική δραστικότητα σε κύτταρα που απομονώνονται από ένα δείγμα καρκίνου των ωοθηκών. Τα νεκρά κύτταρα αποκλείστηκαν χρησιμοποιώντας μαγνητικά σφαιρίδια και ένα διαχωριστή MidiMACS. Για ανοσοφαινοτυποποίηση της ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα br ασκίτη, APC-CD45 ή APC-CD326 χρησιμοποιήθηκε για αντικηλίδωση. ΫΕΑΒ χρησιμοποιήθηκε για να αναστέλλει την αντίδραση του ALDH με το αντιδραστήριο ALDEFLUOR, παρέχοντας ένα αρνητικό έλεγχο. B. Περίληψη των ποσοστών των ΑΙ_ϋΗ

br σε κάθε κυτταρικό πληθυσμό από 16 προχωρημένου σταδίου ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών.

Η

Για να αντιμετωπίσει το ερώτημα εάν η μακροχρόνια

in vitro

καλλιέργεια θα επηρεάσει σημαντικά ΑΙ_ϋΗ δραστικότητα σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, επιλέξαμε ένα καρκίνο των ωοθηκών διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού, στην οποία ένα ογκογονίδιο (την περιοχή μετασχηματισμού του SV40) ήταν υπερεκφράζεται στην επιφάνεια των ωοθηκών ειδική αναστολή ουσίας τύπου υποδοχέα Müllerian II (MISRII) προαγωγό (Σχήμα S1 Α). Η δοκιμασία ALDEFLUOR διεξήχθη σε δύο πρωτογενή απομονωμένα κύτταρα όγκου και δύο μακροχρόνιες καλλιέργειες κυτταρικών γραμμών όγκου (περισσότερο από 40 διελεύσεις) που απομονώθηκαν από το ίδιο μοντέλο. Βρήκαμε ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα br μεταξύ πρωτοπαθών όγκων (9,5 ± 7,6%, n = 5) και των πολιτισμών μακροπρόθεσμη κυττάρων (6,8 ± 4,9%, n = 2, Ρ & gt? 0,05 Σχήμα S1B). Δεδομένου ότι μόνο περιορισμένος αριθμός κυτταρικών σειρών αναλύθηκαν στην παρούσα μελέτη, το συμπέρασμα αυτό χρειάζεται περαιτέρω επικύρωση σε άλλα μοντέλα.

Τέλος, συγκρίναμε δραστηριότητα ΑΙ_ϋΗ σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και αντίστοιχο φυσιολογικό epitheliums τους, επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών επιφάνεια. Τρεις αθανατοποιημένες ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές επιφάνεια επιθηλιακού ωοθηκικού συγκρίθηκαν με 18 ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, και τα πρωτογενή απομονωμένα κύτταρα ωοθηκών επιφάνεια ποντικού σε σύγκριση με 7 ποντικού κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών (συμπεριλαμβανομένων δύο γραμμές από το MISIIR-SV40 διαγονιδιακό ποντίκι). Βρήκαμε ότι το ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα br ήταν σχετικά υψηλότερη σε φυσιολογικά κύτταρα ωοθηκών επιφάνεια επιθηλιακών (ανθρώπινο: 13,1 ± 6,72%, η = 3? Ποντικού: 7,6%, η = 1) σε σύγκριση με τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (ανθρώπινο: 6,2 ± 13,5%, n = 18? ποντικού: 3,8 ± 2,92%, Εικόνα S2). Ομοίως, το ποσοστό των ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα br ήταν σχετικά υψηλότερη σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα μαστού (8,18 ± 4,31%, η = 14) [34] σε σύγκριση με κύτταρα καρκίνου του μαστού (3,5 ± 4,8%, η = 15, Εικόνα 3) .

ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα br όγκου έχουν καρκίνο ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων και αντιστάθηκε στη χημειοθεραπεία

έχει αποδειχθεί ότι ΑΙ_ϋΗ

br καρκινικά κύτταρα που απομονώνονται από πρωτογενείς ανθρώπινους όγκους ή από σύντομη -Term περάσματα των κυττάρων από NOD /SCID ποντικοί έχουν ιδιότητες καρκινικό κύτταρο βλαστικών [34] και είναι ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία [50], [51]. Να εξετάσει τις ιδιότητες του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων των ΑΙ_ϋΗ

br κύτταρα που απομονώθηκαν από καθιερώσει τη μακροπρόθεσμη καλλιεργημένες κυτταρικές γραμμές, ΑΙ_ϋΗ

χαμηλή και ALDH

καρκινικά κύτταρα br απομονώθηκαν από τις καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών με FACS ανθρώπινο μητρικό και διαλογής. Πρώτον, ικανότητα αυτο-ανανέωσης τους εξετάστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία mammosphere [48] σε τέσσερα κύτταρα καρκίνου του μαστού. Ο αριθμός των mammospheres σχηματίζεται από ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα br όγκου ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι από ΑΙ_ϋΗ

χαμηλή καρκινικά κύτταρα (Εικόνα 5Α). ΑΙ_ϋΗ

χαμηλή κύτταρα από κυτταρικές σειρές ZR-75-1 T47-D και δεν είχαν την ικανότητα να σχηματίζουν mammospheres σε καλλιέργεια εναιωρήματος. Στη συνέχεια, εξετάσαμε τους

in vitro

δυνατότητες ανάπτυξης του όγκου χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό σχηματισμού αποικίας σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές 5 του μαστού. ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα br όγκου σχηματίστηκε εμφανώς μεγαλύτερες αποικίες σε σύγκριση με ALDH

χαμηλή καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 5Β). Επιπλέον, οι αριθμοί των αποικιών από ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα br όγκου ήταν σημαντικά υψηλότερα από ό, τι από ΑΙ_ϋΗ

κύτταρα χαμηλής όγκου (Σχήμα 5Β). Τέλος, η

in vivo

ογκογόνο ικανότητα της ΑΙ_ϋΗ

χαμηλή και ALDH

br καρκινικών κυττάρων εξετάστηκε χρησιμοποιώντας καρκινικά κύτταρα που είχαν μοσχεύματος μεταμοσχευμένου (500? 5000? Ή 50.000) έως το ανοσοποιητικό ποντίκια με έλλειψη . Βρήκαμε ότι 500 ΑΙ_ϋΗ

br αλλά όχι ALDH

χαμηλή καρκινικά κύτταρα ήσαν ικανά να παράγουν ξενομοσχεύματος όγκων

in vivo

(Σχήμα 5C). Ιστολογία των τριών όγκων ξενομοσχεύματος εξετάστηκε με χρώση HE. Σε κυτταρικές σειρές SKBR-3 MCF-7 και, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των ιστολογικών ΑΙ_ϋΗ

br και ALDH

χαμηλή όγκους. Ωστόσο, το BT-474 όγκους, υπάρχουν περιορισμένες στρωματικά κύτταρα ΑΙ_ϋΗ

br όγκους σε σύγκριση με ALDH

χαμηλή όγκους (Σχήμα 5D).

In vivo

πολλαπλασιασμό των κυττάρων εξετάστηκε επίσης χρησιμοποιώντας χρώση Ki-67. Δεν βρήκαμε καμία σημαντική διαφορά στο δείκτη πολλαπλασιασμού (ποσοστό των Ki-67 θετικών κυττάρων) μεταξύ της ΑΙ_ϋΗ

br και ALDH

χαμηλή όγκους και στις τρεις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 5Ε).

ΈΝΑ. ΑΙ_ϋΗ

br κυτταρικών πληθυσμών (μπλε) που παράγονται σημαντικά υψηλότερους αριθμούς mammospheres σε σύγκριση με το χαμηλό πληθυσμό ΑΙ_ϋΗ

(κίτρινο). Β Ογκογονικότητα της ΑΙ_ϋΗ

br και ALDH

χαμηλή κύτταρα εξετάστηκαν

in vitro

χρησιμοποιώντας δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας. Γ Ογκογονικότητα της ΑΙ_ϋΗ

br και ALDH

χαμηλή κύτταρα εξετάστηκαν

in vivo

. Δ Ιστολογία της ΑΙ_ϋΗ

br και ALDH

χαμηλή BT-474 όγκων εξετάστηκε με χρώση HE. Ε διάδοσης της ΑΙ_ϋΗ

br και ALDH

χαμηλή BT-474 όγκων εξετάστηκε από Ki-67 ανοσοχρώση.

Η

Σε σύντομο χρονικό διάστημα συσσωρεύονται τα στοιχεία δείχνουν ότι τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα μπορεί να είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά σε ακτινοβολία ή χημειοθεραπεία [18], [19], [20]. Συνεπής με αυτά τα ευρήματα, βρήκαμε ότι η ΑΙ_ϋΗ

κυτταρικό πληθυσμό br επεκτείνεται σε ένα σύνολο ανθεκτικών πλατίνα κυτταρικών γραμμών καρκίνου ωοθηκών, Α2780 /CP70, Α2780 /C200 και Α2780 /C30, σε σύγκριση με τη γονική πλατίνα ευαίσθητη γραμμή, Α2780 τους /WT (Σχήμα 6Α). Επιπλέον, η θεραπεία των κυττάρων με σισπλατίνη (1XIC

50) εμπλουτίζεται σημαντικά το ALDH

κυτταρικό πληθυσμό br σε κυτταρικές σειρές των ωοθηκών και του καρκίνου του μαστού

in vitro

(Σχήμα 6Β). Η ΑΙ_ϋΗ

πληθυσμού br ήταν σημαντικά πιο ανθεκτικές στη θεραπεία της πλατίνας σε σύγκριση με την ALDH

χαμηλό πληθυσμό (Σχήμα 6C). Τέλος, έχουμε δοκιμάσει την παραπάνω παρατήρηση

in vivo

χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ποντικού των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. Τρεις εβδομάδες μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου, Α2780 (5 × 10

6 ανά ζώο), τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις πειραματικές ομάδες για να λάβουν θεραπεία με ί.ρ. ένεση με 1) θεραπεία ελέγχου (n = 4), 2) κατεργασία 2 mg /kg οίδ-λευκόχρυσος (½ μέγιστη ανεκτή δόση (MTD), η = 3) και 3) επεξεργασία 4 mg /kg οίδ-λευκόχρυσος (πλήρης MTD, n = 3). Η q7d × 4 ε.π. χρονοδιάγραμμα αγωγής (Σχήμα 6D) χρησιμοποιήθηκε για την πειραματική θεραπεία. Ποσοστό του θετικού πληθυσμού ALDH αναλύθηκε με δοκιμασία ALDEFLUOR. Συνεπής με μας

in vitro

δεδομένων, επεξεργασία cis-πλατίνα αυξήθηκε σημαντικά το ΑΙ_ϋΗ

πληθυσμό br κυττάρων σε ξενομόσχευμα όγκου

in vitro

(Σχήμα 6D, ½ MTD: 8,44 φορές κατά μέσο όρο ? πλήρης MTD: 4,67-φορές κατά μέσο όρο, σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα όγκους). Προτείνει ότι ΑΙ_ϋΗ

πληθυσμό br καρκινικών κυττάρων είναι ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία. Παρόμοια αποτελέσματα είχε επίσης αναφερθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου

in vivo

πιο πρόσφατα από μια ανεξάρτητη ομάδα [50].

Α. ΑΙ_ϋΗ

br κύτταρα εντυπωσιακά επεκτάθηκαν σε ανθεκτικούς πλατίνα κυτταρικές σειρές (Α2780 /CP70, Α2780 /C200 και Α2780 /C30) σε σύγκριση με γονική πλατίνα ευαίσθητη γραμμή τους (Α2780 /WT). Β

In vitro

θεραπεία της πλατίνας αυξήθηκε σημαντικά το ΑΙ_ϋΗ

κυτταρικό πληθυσμό br σε κυτταρικές σειρές των ωοθηκών και του καρκίνου του μαστού μετά από τρεις ημέρες. Γ ΑΙ_ϋΗ

br κύτταρα ήταν ανθεκτικά στη θεραπεία της πλατίνας. ΑΙ_ϋΗ

br και ALDH

χαμηλή κύτταρα απομονώθηκαν με διαλογή FACS. Δ ΑΙ_ϋΗ

πληθυσμό κυττάρων br όγκος ήταν ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία

in vivo

. Η q7d × 4 ε.π. πρόγραμμα θεραπείας χρησιμοποιήθηκε για την πειραματική θεραπεία. Οι όγκοι συλλέχθηκαν και διαχωριστεί με πέψη ενζύμου. Ποσοστό της ΑΙ_ϋΗ

πληθυσμός br αναλύθηκε με δοκιμασία ALDEFLUOR.

Η

Συζήτηση

Ως νέα προσέγγιση, η δοκιμασία ALDEFLUOR και ΑΙ_ϋΗ1 ανοσοχρώση μπορεί να αποδειχθεί χρήσιμη για την ανίχνευση και την απομόνωση του καρκίνου του βλαστικών κυττάρων σε επιθηλιακούς όγκους, διευκολύνοντας έτσι την εφαρμογή των εννοιών του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων με την κλινική πρακτική [34]. Βρήκαμε ότι η μορφή και το επίπεδο έκφρασης του ΑΙ_ϋΗ1 σε κανονικούς ανθρώπινους ιστούς είναι αξιοσημείωτα διαφορετικές και θα μπορούσαν να ταξινομηθούν σε τρεις τύπους: 1) ιστού με απούσα ή περιορισμένη έκφραση ΑΙ_ϋΗ1, όπως του μαστού ή του πνεύμονα? 2) ιστού με σχετική ασθενή έκφραση ΑΙ_ϋΗ1, όπως του παχέος εντέρου ή γαστρική epitheliums? και 3) ιστού με εκτεταμένη και υψηλή έκφραση του ΑΙ_ϋΗ1, όπως το ήπαρ ή πάγκρεας (Εικόνα 1Α).