Αφηρημένο

Το εργοστάσιο φλαβονοειδές λουτεολίνη παρουσιάζει διαφορετικές βιολογικές επιδράσεις, συμπεριλαμβανομένων αντικαρκινικές ιδιότητες. Λίγα είναι γνωστά σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς που διέπουν τις δράσεις της στον καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC). Εδώ έχουμε ερεύνησε τις επιπτώσεις της luteolin για τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, με έμφαση στην ισορροπία μεταξύ κεραμιδιού και σφιγγοσίνης-1-φωσφορικής (S1P), δύο σφιγγοειδών μεσολαβητές με αντίθετη ρόλους στην κυτταρική μοίρα. Χρησιμοποιώντας καλλιεργημένα κύτταρα, βρήκαμε ότι φυσιολογικές συγκεντρώσεις λουτεολίνη επάγει την ανύψωση του κεραμιδιού, που ακολουθείται από αποπτωτικό θάνατο των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, αλλά όχι των διαφοροποιημένων εντεροκύτταρα. μελέτες Pulse αποκάλυψε ότι luteolin αναστέλλει κεραμιδιού αναβολισμός σε πολύπλοκες σφιγγολιπίδια. Περαιτέρω πειράματα μας οδήγησε να αποδείξει ότι luteolin επάγει μια μεταβολή του ενδοπλασματικού δικτύου (ER) -Golgi ροή του κεραμιδιού, ζωτικής σημασίας για την μεταβολική επεξεργασία της σε συγκρότημα σφιγγολιπίδια. Αναφέρουμε ότι luteolin ασκεί τη δράση του με αναστολή τόσο ενεργοποίησης Akt, και κινάση σφιγγοσίνης (δρΗΚ) 2, με την επακόλουθη μείωση του S1P, ενός Akt διεγέρτη. χορήγηση S1P προστατεύεται καρκινικά κύτταρα κόλου από λουτεολίνη επαγόμενη απόπτωση, πιθανότατα με ένα ενδοκυτταρικό, μηχανισμός υποδοχέα-ανεξάρτητη. Συνολικά αυτή η μελέτη αποκαλύπτει για πρώτη φορά ότι η διαιτητική φλαβονοειδές λουτεολίνη ασκεί τοξικές επιδράσεις στα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, αναστέλλοντας τόσο S1P βιοσύνθεση και την κυκλοφορία του κεραμιδιού, γεγονός που υποδηλώνει διαιτητική εισαγωγή /συμπλήρωση της ως μια πιθανή στρατηγική για τη βελτίωση των υφιστάμενων θεραπειών στο CRC.

Παράθεση: Abdel Hadi L, Di Vito C, Marfia G, Ferraretto Α, Tringali C, Viani P, et al. (2015) σφιγγοσίνης κινάσης 2 και Ceramide Μεταφορών ως βασικούς στόχους του Φυσικού Φλαβονοειδών Luteolin να επάγει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. PLoS ONE 10 (11): e0143384. doi: 10.1371 /journal.pone.0143384

Επιμέλεια: Ashley Cowart, Ιατρικό Πανεπιστήμιο της Νότιας Καρολίνα, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 15 Ιουλίου, 2015? Αποδεκτές: 4 Νοέμβρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 18 του Νοέμ του 2015

Copyright: © 2015 Abdel Hadi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

CRC είναι ένα από τα πιο κοινά νεοπλασία και μία κύρια αιτία θανάτου παγκοσμίως. Ο καρκίνος αυτός αναγνωρίστηκε ως και παραμένει, μια περιβαλλοντική καρκίνο, τη συχνότητά του αυξάνεται παράλληλα με την οικονομική ανάπτυξη, με την πλειονότητα των περιπτώσεων συμβαίνουν σε βιομηχανικές χώρες, και κυρίως οφείλεται στη διατροφή [1, 2]. Πολυάριθμες μελέτες έχουν συνδέσει άφθονη κατανάλωση τροφίμων από φυτικά προελεύσεων με μειωμένο κίνδυνο εμφάνισης διαφόρων μορφών καρκίνου, ένας χημειο-προληπτικό αποτέλεσμα που σχετίζεται με την υψηλή περιεκτικότητα σε αρκετές φυτοχημικά με ισχυρές αντικαρκινικές ιδιότητες [3], συμπεριλαμβανομένων των ενώσεων της οικογένειας των φλαβονοειδών [4 , 5]. Ένα από τα πιο κοινά συστατικό αυτής της οικογένειας είναι λουτεολίνη (3 ‘, 4’, 5,7-tetrahydroxyflavone), η οποία είναι παρούσα σε υψηλά επίπεδα σε κοινά φρούτα, λαχανικά και βότανα, και παρουσιάζει ένα ευρύ φάσμα επιδράσεων, περιλαμβανομένων των αντικαρκινικών δραστηριότητες [6, 7]. Luteolin αντι-καρκινογόνες ιδιότητες επεκταθεί σε ένα ευρύ φάσμα κακοηθειών και συνδέονται σε πολλαπλές επιδράσεις, όπως η αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της αγγειογένεσης, μετάσταση, επαγωγή της απόπτωσης, και ευαισθητοποίηση σε χημειοθεραπεία [6, 7]. Παρόλα αυτά, οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν τις δράσεις λουτεολίνη, και ιδιαίτερα εκείνες που σχετίζονται με χημειοθεραπευτικούς δυναμικό της, παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ασαφείς.

Σε διαφορετικά κύτταρα όγκου, κεραμίδιο, το ενδιάμεσο-κλειδί του μεταβολισμού σφιγγολιπίδιο, έχει αποδειχθεί ότι δρα ως μεσολαβητής κυτταρικής πολλαπλών αντικαρκινικές ενώσεις, είναι σε θέση να ρυθμίζουν διαφορετικές οδούς σηματοδότησης, και που οδηγεί σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης [8, 9]. Αρκετά ένζυμα σε διαφορετικές υποκυτταρικές θέσεις που εμπλέκονται στον έλεγχο του επιπέδου κεραμιδιού [10]. Τα προ-αποπτωτικά και ογκο-κατασταλτικά αποτελέσματα του κεραμιδιού ανταγωνισμό από S1 Ρ, ενός προ-μιτογόνο και επιβίωση παράγοντας για μια ποικιλία κυτταρικών τύπων [11-13]. μεταβολισμός S1P συνδέεται άμεσα με εκείνη του κεραμιδιού, βιοσύνθεση απαιτώντας σφιγγοσίνης του, που προέρχεται από κεραμίδιο υδρόλυση, και SphKs (ισομορφή SphK1 ή SphK2). S1P εκθέματα τόσο ενδοκυτταρικά και εξωκυτταρικά δράσεις, κυρίως μέσω της ενεργοποίησης του προ-μιτογόνου και σηματοδότηση προ-επιβίωσης [11, 14]. Η σωστή ρύθμιση της σφιγγολιπίδιο ροοστάτη, ότι είναι η ισορροπία μεταξύ S1P και του κεραμιδιού, είναι απαραίτητη για την κυτταρική ομοιόσταση, και διαδραματίζει θεμελιώδη ρόλο στη ρύθμιση ιδιοτήτων των κυττάρων και η μοίρα [11, 13].

επίπεδα Ceramide έχουν αναφερθεί ότι μειώνεται σημαντικά το CRC σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό κόλου [15], και αρκετά χημειοθεραπευτικά βρέθηκαν να έχουν επίδραση στην κεραμίδιο μεταβολισμό και προάγουν τη συσσώρευση της σε κύτταρα καρκίνου κόλου (που επισκοπείται στο [16]). Επιπλέον, S1P διεγείρει την ανάπτυξη, την εισβολή και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου [17, 18], και SphK1 και S1P λυάση είναι πάνω και κάτω-ρυθμίζονται, οδηγώντας σε συσσώρευση S1P στα CRC [19, 20]. Αυτά τα αποδεικτικά στοιχεία δείχνουν ότι η ανισορροπία του ροοστάτη σφιγγολιπίδιο ευνοούν CRC.

Παρά luteolin φαίνεται πολλά υποσχόμενη, όπως χημειοθεραπευτικά σε ορισμένες καρκινικά κύτταρα [7], λίγα είναι γνωστά σχετικά με το ρόλο του ροοστάτη σφιγγολιπίδιο σχετικά με τις δράσεις της, και ιδιαίτερα στην CRC. Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να διερευνήσει τον πιθανό ρόλο των δύο κεραμιδιού και S1 Ρ σε λουτεολίνη κυτταροτοξικότητα σε CRC. Χρησιμοποιώντας ανθρώπινα κύτταρα Caco-2 ως μοντέλο CRC, η μελέτη μας αποκαλύπτει για πρώτη φορά το ροοστάτη σφιγγολιπίδιο ως στόχο της luteolin κυτταροτοξικά αποτελέσματα.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Όλα τα αντιδραστήρια ήταν της υψηλότερης διαθέσιμης αναλυτικού βαθμού. Αετού Minimum Essential Medium (ΕΜΕΜ), brefeldin Α (ΒΡΑ), ελεύθερο λιπαρό οξύ-BSA (FFA-BSA), Ν-ακετυλο-D-ερυθρο-σφιγγοσίνης (C2-Cer), Ν-εξανοϋλ-D-ερυθρο-σφιγγοσίνης ( C6-Cer), Ο-τρικυκλο [5.2.1.02,6] δεκ-9-υλ διθειοανθρακικό κάλιο άλας (D609), Hoechst 33342, λουτεολίνη, τοξίνη κοκκύτη (ΡΤΧ), και τα κοινά χημικά ήταν από την Sigma Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). S1P αγοράστηκε από Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY, USA), και εγκλωβίστηκαν S1P από Alexis Biochemicals (Plymouth Meeting, ΡΑ, USA). Υψηλής απόδοσης TLC (HPTLC) πλάκες silica gel και όλους τους διαλύτες ήταν από Merck (Darmstadt, Γερμανία). Ορός εμβρύου μόσχου (FCS) ήταν από EuroClone (Μιλάνο, Ιταλία). LY294002, SEW2871, και W123 ήταν από την Cayman Chemical (Αηη Arbor, ΜΙ, USA), και Ν- (4,4-διφθορο-5,7-διμεθυλο-4-βορα-3α, 4α-διαζα-

s

ινδακεν-3-πεντανοϋλο) σφιγγοσίνης (ΒΟϋΙΡΥ-C

5-CER) από την Life Technologies (Monza, Ιταλία).

3Η-σερίνη (30 Ci /mmol),

3Η-D-ερυθρο-σφιγγοσίνης (

3Η-Sph) (20,0 Ci /mmol) και D-ερυθρο- [4,5

3Η] διϋδροσφιγγοζίνη (60,0 Ci /mmol) ήταν από την PerkinElmer Επιστημών ζωής (Boston, MA, USA) και η αμερικανική Radiolabeled Chemicals, Inc. (St. Louis, MO, USA).

Κυτταρική καλλιέργεια

Η ανθρώπινη κυτταρική γραμμή καρκινώματος κόλου Caco-2 (BS TCL 87) ελήφθη από το Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna (Brescia, Ιταλία), και διατηρήθηκαν σε ΕΜΕΜ συμπληρωμένο με 15% FCS, 2 mM L- γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, 100 U /mL πενικιλλίνη, και 0.25 μg /mL αμφοτερικίνη-Β στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. κύτταρα Caco-2 απλώθηκαν σε 1,25 × 10

4 /cm

2, και χρησιμοποιούνται είτε ως κόλου μοντέλο καρκινικού κυττάρου (κύτταρα CC) (σε συρροή, 3 ημέρες μετά την επίστρωση), ή διαφοροποιημένη εντεροκύτταρα (DES) ( 21 ημέρες μετά την συρροή) [21]. Εντερική διαφοροποίηση επιβεβαιώθηκε με αξιολόγηση ειδικών μορφολογικών χαρακτηριστικών και βιοχημικών δεικτών, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [21]

κύτταρα θεραπείες

Στοκ διαλύματα των χορηγούμενων μόρια παρασκευάστηκαν με διάλυση τους ως εξής: α. Λουτεολίνη, SEW2871 , W123, και εγκλωβίστηκαν S1P σε DMSO, C2-Cer και BFA σε απόλυτη αιθανόλη, C6-Cer ως σύμπλοκο 1: 1 με FFA-BSA, και S1 Ρ σε FFA-BSA (4 mg /ml σε PBS). Κατά τον χρόνο των πειραμάτων, τα διαλύματα παρακαταθήκης αραιώθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο στην κατάλληλη συγκέντρωση και να χορηγηθούν σε κύτταρα. Σε παράλληλα πειράματα, τα κύτταρα επωάστηκαν με αραιωμένο οχήματα ως μάρτυρες. Όλοι οι διαλύτες, που χρησιμοποιούνται στις τελικές συγκεντρώσεις, βρέθηκαν χωρίς επίδραση ούτε σφιγγολιπίδιο μεταβολισμό ή την επιβίωση των κυττάρων. Όταν χρησιμοποιείται, W123 και ΡΤΧ χορηγήθηκαν 1 ώρα πριν και κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Για ενδοκυτταρική παραγωγή S1P, τα κύτταρα CC φορτώθηκαν με κλουβιά S1 Ρ (σε ΕΜΕΜ που περιέχει 1 mg /ml FFA-BSA) στους 37 ° C για 2 ώρες. Το μέσο στη συνέχεια απομακρύνθηκε, και φωτόλυση πραγματοποιήθηκε με ένα παλμό 30 δευτερολέπτων UV στα 360 nm με τη μέγιστη ένταση.

Προσδιορισμός της βιωσιμότητας των κυττάρων και την απόπτωση

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με την ΜΤΤ χημική δοκιμή. Εν συντομία, μετά τη θεραπεία για ενδεικνυόμενη χρονική περίοδο, το μέσο αντικαταστάθηκε με ΜΤΤ διαλύθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο (0,8 mg /ml) για 4 ώρες. Οι κρύσταλλοι φορμαζάνης μετά διαλυτοποιήθηκαν σε ισοπροπανόλη /μυρμηκικό οξύ (95: 5 ν /ν) για 10 λεπτά και η απορρόφηση (570 nm) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών (Wallack Multilabel Counter, Perkin Elmer, Boston, MA, USA).

Για την αξιολόγηση της απόπτωσης, χρώση Hoechst και η ανάλυση της κασπάσης 3 διάσπασης εκτελέστηκαν. Ειδικότερα, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες σημάνθηκαν με 10 μΜ χρωστική Hoechst 33342 για 15 λεπτά στους 37 ° C, στο σκοτάδι. Μετά την πλύση με PBS, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 0.5% γλουταραλδεϋδη σε PBS (10 λεπτά, 4 ° C). Η πυρηνική μορφολογία εξετάστηκε από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus ΒΧ-50), εξοπλισμένο με μια γρήγορη κάμερα υψηλής ανάλυσης CCD (Colorview 12) και ένα λογισμικό ανάλυσης εικόνας (Ανάλυση από Soft System Imaging GmbH). Κασπάσης-3 διάσπαση εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western (βλέπε παρακάτω).

Ceramide ποσοτικοποίηση και μεταβολικές μελέτες

Για να αξιολογηθεί το περιεχόμενο του κεραμιδιού και το μεταβολισμό σφιγγολιπίδιο, κύτταρο σφιγγολιπίδια επισημάνθηκαν με 25 nM

3Η-Sph (0.5 μCi /ml) ή 200 ηΜ L-

3Η-σερίνη (6.0 μCi /ml) όπως έχει ήδη αναφερθεί [22, 23], για διαφορετικούς χρόνους. Ειδικότερα, για κεραμιδιού ποσοτικοποίηση, πραγματοποιήσαμε έναν παλμό 6 ώρες ακολουθούμενο από 24 ώρες κυνηγητό, μια κατάσταση που δικαιολογεί μια σταθερή κατάσταση μεταβολική σήμανση. Για μελέτες μεταβολισμού, τα πειράματα παλμού πραγματοποιήθηκαν για 1-2 ώρες. Στο τέλος του χρόνου παλμού /εκδίωξης, το μέσο συλλέχθηκε προσεκτικά, τα κύτταρα αποξέστηκαν από την πλάκα και σφιγγολιπίδια και S1 Ρ εκχυλίζονται και μερικώς καθαρίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22, 24]. Μετά την καταμέτρηση για ραδιενέργεια με υγρό σπινθηρισμού, οι τελικές οργανικές και υδατικές φάσεις υποβλήθηκαν σε HPTLC, χρησιμοποιώντας χλωροφόρμιο /μεθανόλη /νερό 55: 20: (. Κατά όγκο) 3 και σε κ-βουτανόλη /οξικό οξύ /ύδωρ 3: 1: 1 (κατ ‘όγκο.) για τον διαχωρισμό του συμπλόκου σφιγγολιπίδια και SLP, αντίστοιχα. πλάκες HPTLC υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε ψηφιακή αυτοραδιογραφία με βήτα-Imager 2000 μέσου (Biospace, Paris, FR). Η ραδιενέργεια που σχετίζεται με την ατομική λιπίδια προσδιορίστηκε με το λογισμικό Μ3-Vision παρέχεται με το όργανο.

3Η-σφιγγολιπίδια ταυτοποιήθηκαν με συν-μετανάστευση με εσωτερικά πρότυπα χρωματογραφήθηκαν στην ίδια πλάκα. περιεχόμενο κεραμίδιο προσδιορίστηκε με τον υπολογισμό της σταθερής κατάστασης

/

αναλογία 3Η-κεραμιδιού 3Η-σφιγγομυελίνη, και πολλαπλασιάζοντας το για ενδογενή περιεχόμενο σφιγγομυελίνη (22, 23). Παρόμοια επίπεδα κεραμιδιού (διαφορετικές για λιγότερο από 12%) ελήφθησαν μετά από σήμανση των κυττάρων σε ισορροπία με

3Η-Sph και

3Η-σερίνη.

3Η-S1P υποβάθμιση αξιολογήθηκε ως τριτιωμένο νερό με κλασματική απόσταξη της υδατικής φάσης από το μέσο καλλιέργειας, και μετρήσεως της ραδιενέργειας με υγρό σπινθηρισμό [22]. Πειράματα ελέγχου με προστιθέμενη

3Η

2O έδειξε ότι δεν υπάρχει απώλεια τριτίου με εξάτμιση συνέβη κάτω από τις πειραματικές συνθήκες.

Η ενδοκυτταρική εντόπιση του φθορισμού κεραμιδιού

Η μεταφορά ER-Golgi του κεραμιδιού ήταν ποιοτικά αξιολογείται με ΒΟϋΙΡΥ-C

5-Cer, όπως έχει ήδη αναφερθεί [25]. Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες φορτώθηκαν με 2,5 μΜ ΒΟϋΙΡΥ-C

5-Cer για 30 λεπτά, στους 4 ° C, και στη συνέχεια επωάστηκαν σε ρυθμισμένο μέσο (30 λεπτά στους 37 ° C), εν τη απουσία ή παρουσία του luteolin. Τα δείγματα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με γλουταραλδεΰδη, και αναλύθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού (βλέπε παραπάνω).

Δραστικότητα δρΗΚ

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό δρΗΚ (20 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4 που περιέχει 40 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 1 mM EDTA, 0.5 mM δεοξυπυριδοξίνης, 15 mM NaF, 1 mM β-μερκαπτοαιθανόλη, 1 mM Na

3νο

4, 0.4 mM PMSF, 10% γλυκερόλη, και πλήρη αναστολείς πρωτεάσης), και συντρίβονται με κατάψυξη-απόψυξη. Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών [26] αποτιμήθηκαν για δραστηριότητα δρΗΚ, χρησιμοποιώντας πειραματικές συνθήκες που είναι γνωστό ότι ευνοούν επιλεκτικά SphK1 ή δραστηριότητα SphK2 [27, 28]. Το μίγμα επωάστηκε στους 37 ° C για 15-30 λεπτά. Η αντίδραση τερματίστηκε με την προσθήκη χλωροφορμίου /μεθανόλης (2: 1., Κατ ‘όγκο), ακολουθούμενη από διπλό στεγανοποίηση, πρώτα σε αλκαλικό και στη συνέχεια σε όξινες συνθήκες. S1P στην τελική οργανική φάση αναλύθηκε με HPTLC, και ποσοτικά με ψηφιακό αυτοραδιογραφία. Οι τιμές υποβάθρου προσδιορίστηκαν σε αρνητικούς ελέγχους στους οποίους ΑΤΡ δεν προστέθηκε στο μίγμα της αντίδρασης.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα λύθηκαν (20 λεπτά στους 4 ° C) σε Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (20 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 150 mM NaCl) που περιέχει, 1% Nonidet Ρ-40, 10 mM NaF, 1 mM Na

3νο

4, 10 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 1 mM PMSF, και αναστολείς πρωτεάσης. Μετά τη φυγοκέντρηση, τα υπερκείμενα προσδιορίστηκαν για πρωτεΐνες [26], και ίση ποσότητα πρωτεϊνών (15-30 μα) υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE σε 10% πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Μετά τη μεταφορά σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, τα δείγματα επωάστηκαν (όλη τη νύκτα, 4 ° C) με τα ακόλουθα αντισώματα: anti-SphK1 και αντι-SphK2 (Abcam, Cambridge, UK), αντι-φωσφο-Ακί, αντι-κασπάση-3 αντίσωμα (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, ΜΑ), και στη συνέχεια με ένα αντι-HRP-συζευγμένο αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Αντι-β-ακτίνης (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ) και αντι-GAPDH αντισώματα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης. Ανοσοδραστικές σήματα κατέστησαν ορατά με SuperSignal West Femto (Thermo Scientific (Rockford, IL), και έκθεση σε φιλμ Kodak Biomax (Rochester, ΝΥ) Ανοσολογικά πυκνότητα ταινίας προσδιορίστηκε με ένα πυκνόμετρο (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA?. Ποσότητα Ένα λογισμικό ).

Στατιστική ανάλυση

τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα εις διπλούν. τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό StatMate, έκδοση 4.0 (GraphPad). η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Μαθητή

t-test

διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε

σ

& lt?.. 0.05

Αποτελέσματα

Luteolin προκαλεί απόπτωση σε CC κύτταρα

Αξιολογήσαμε πρώτα την επίδραση της λουτεολίνη επί ΥΝ και βιωσιμότητα CC κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, μέχρι 100 μΜ λουτεολίνη ασκεί καμία εμφανής τοξική επίδραση στις DES, και ακόμη και στην υψηλότερη συγκέντρωση (200 μΜ), μια μέτρια , αν υπάρχουν, παρατηρήθηκε κυτοτοξικό αποτέλεσμα. εις το αντίθετο, με τον ίδιο του εύρους συγκέντρωσης, λουτεολίνη προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας CC (Εικόνα 1Α). Σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από λουτεολίνη 20 μΜ, οι αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων CC χαρακτηριστική των αποπτωτικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων συρρίκνωση και εκτεταμένη αποκόλληση από το υπόστρωμα της καλλιέργειας, παρατηρήθηκαν (δεν φαίνεται). Μετά από 24 ώρες θεραπείας με κυτταροτοξικά δόσεις luteolin, μικροσκοπική φθορισμού αναλύει με Hoechst 33342 αποκάλυψε ότι CC κύτταρα παρουσιάζονται αποπτωτικών μορφολογικές αλλαγές, με συμπύκνωση και τον κατακερματισμό των πυρήνων, και εκτίθενται λαμπρό μπλε φθορισμού (Σχήμα 1Β, δεξιά). Αντιστρόφως, υπό τις ίδιες συνθήκες, η απο βρέθηκαν με φυσιολογική εμφάνιση, και η φθορίζουσα χρωστική βάφονται μορφολογικώς φυσιολογικά πυρήνες, με ένα αμυδρά μπλε φθορισμού (Σχήμα 1 Β, αριστερά). Επιπλέον, ανοσοχρώση της κασπάσης-3 αποκάλυψε ότι luteolin επάγεται προ-κασπάσης-3 ενεργοποίηση σε CC κύτταρα, αλλά όχι σε δεσ (Σχήμα 1 C).

(Α) CC κύτταρα (CCS) και της δεσ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διαφορετικές συγκεντρώσεις λουτεολίνη, και μετά από 48 ώρες η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ΜΤΤ. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων? *, P & lt? 0,05 και **, p & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου. (Β) Εκπρόσωπος μικροσκοπικές εικόνες ΥΝ και CCS χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 μετά τη θεραπεία με 100 μΜ luteolin για 36 ώρες. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των προ-κασπάσης-3 και κασπάσης-ενεργός 3 ενδοκυτταρικά επίπεδα της δεσ και ΥΧ αγωγή ή όχι με 100 μΜ λουτεολίνη για 36 ώρες.

Η

συσσώρευση κηραμιδίου εμπλέκεται σε luteolin επαγόμενη απόπτωση

στα χρησιμοποιούνται πειραματικές συνθήκες, το βασικό επίπεδο του κεραμιδιού ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε CC κύτταρα από ό, τι στο Des (2,45 ± 0,38 και 4,73 ± 0,59 nmol /mg πρωτεΐνης, αντίστοιχα). Μετά από 24 ώρες αγωγή με κυτταροτοξικά δόσεις λουτεολίνη, βρήκαμε ότι το επίπεδο κεραμίδιο του CC κυττάρων ήταν σημαντικά αυξημένη (περισσότερο από 3 φορές) με λουτεολίνη σε τοξικά, αλλά όχι υπο-τοξικές δόσεις (Σχήμα 2Α). Η λουτεολινο που προκαλείται από την αύξηση του κεραμιδιού ήταν μετρήσιμη σε CC κύτταρα πριν από την εμφανή μορφολογικά και πυρηνικές αλλαγές. Υπό τις ίδιες συνθήκες επεξεργασίας λουτεολίνη, καμία σημαντική μεταβολή στην περιεκτικότητα κεραμίδιο παρατηρήθηκε σε δεσ (Σχήμα 2Α). Αυτά τα αποτελέσματα μας ώθησε να διερευνήσει τους μηχανισμούς που διέπουν λουτεολινο που προκαλείται από την αύξηση του κεραμιδιού, εστιάζοντας σε CC κύτταρα.

(Α) ΥΝ και CC κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με luteolin, και, μετά από 24 ώρες, κυτταρική κεραμίδιο προσδιορίστηκε ποσοτικά. (Β) και (C) CC κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις C2-Cer (Β, τετράγωνο), C6-Cer (Β, τρίγωνο) ή D609 (C), και μετά από 48 ώρες η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με ΜΤΤ. Όλα τα δεδομένα είναι ο μέσος όρος ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *, P & lt? 0,05? **, P & lt? 0.01 vs ελέγχου.

Η

Η έκθεση των κυττάρων σε CC αυξανόμενες δόσεις διαπερατό κυττάρου C2-C6-και Cer οδήγησε σε δοσοεξαρτώμενη κυτταροτοξική δράση (Σχήμα 2Β). Η ισχύς αυτών των αναλόγων κηραμιδίου για να επάγει θάνατο CC κυττάρου αντιστρόφως ανάλογη προς το μήκος τους από τους αλυσίδας ακυλίου, όπως αναμενόταν βάσει της διαπερατότητας των κυττάρων τους. Επιπλέον, η θεραπεία των κυττάρων με D609, ένας αναστολέας της συνθάσης σφιγγομυελίνης [29], που προκαλείται από μια κυτταροτοξική δράση πολύ (Σχήμα 2C). θεραπεία D609 (0.5 mM για 24 ώρες), προκάλεσε μια σημαντική αύξηση (1,94-φορές, ρ & lt? 0,01) του κεραμιδιού (από 2,45 ± 0,38 4,76 ± να 0.59), υποδεικνύοντας ότι αυτή η θεραπεία ήταν αποτελεσματική στην ανύψωση ενδοκυτταρικό κηραμίδιο. CC κύτταρα κατεργασμένα με κεραμίδια ή D609 έδειξε συμπύκνωση χρωματίνης και την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 (δεν φαίνεται), υποδεικνύοντας μία επαγόμενη αύξηση της κυτταρικής κεραμίδιο σε θέση να μιμηθούν λουτεολίνη στην επαγωγή της απόπτωσης.

Luteolin αναστέλλει τον μεταβολισμό κεραμιδιού σε πολύπλοκες σφιγγολιπίδια

Για να διερευνήσουν τον μηχανισμό που διέπουν τη συσσώρευση κηραμιδίου που προκαλείται από luteolin, μπορούμε στη συνέχεια εκτελούνται πειράματα παλμού με επισημασμένη σφιγγοσίνη. Βρήκαμε ότι

3Η-Sph γρήγορα ενσωματωθεί CC κύτταρα, ανεξάρτητα από τη θεραπεία luteolin. Πράγματι, η συνολική ενσωματωμένη ραδιενέργεια αντιπροσώπευαν 373 ± 20 και 385 ± 25 nCi /πιάτο στον έλεγχο και λουτεολινο επεξεργασμένα κύτταρα CC, αντίστοιχα. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, μετά από μία ώρα παλμό, το επίπεδο της ενδοκυτταρικής

3Η-Sph αντιπροσώπευε λιγότερο από το 5% των συνολικών ενσωματωμένης ραδιενέργειας (δεν φαίνεται), υποδεικνύοντας ένα αποτελεσματικό μεταβολισμό σφιγγοσίνης εμφανίστηκαν σε CC κύτταρα και δεν επηρεάστηκε από λουτεολίνη. Το μεγαλύτερο μέρος των ενσωματωμένη ραδιενέργεια που συνδέεται με Ν-ακυλιωμένα παράγωγα σφιγγοσίνης, αντιπροσωπεύονται κυρίως από κηραμιδίου και σφιγγομυελίνης, και, σε πολύ χαμηλότερες ποσότητες, από γλυκοσφιγγολιπίδια. θεραπεία Luteolin αύξησε σημαντικά την ποσότητα της ραδιενέργειας που ενσωματώνεται σε Ν-ακυλιωμένη μεταβολιτών (213,7 ± 17,3 και 282,4 ± 24,9 nCi /τρυβλίο, στον έλεγχο και τα κύτταρα λουτεολίνη-αγωγή) και τροποποιημένη κατανομή της μεταξύ διαφορετικών μεταβολιτών σφιγγοσίνης. Πράγματι, σε κύτταρα λουτεολίνη επεξεργασμένα, ραδιοεπισημασμένο κεραμίδιο βρέθηκε περισσότερο από 2 φορές υψηλότερη από εκείνη των κυττάρων ελέγχου (σχήμα 3Α, άνω πίνακας), και παράλληλα με μια σημαντική μείωση του συμπλόκου σφιγγολιπίδια, συμπεριλαμβανομένων τόσο σφιγγομυελίνη και γλυκοσφιγγολιπίδια (σχήμα 3Α , άνω φωτογραφία). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε πειράματα παλμού με επισημασμένη σερίνη, που χρησιμοποιείται ως πρόδρομος του novo σύνθεση σφιγγολιπιδίου de (Σχήμα 3Α, κάτω πίνακας). Σε γενικές γραμμές, αυτές οι παραλλαγές ως αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση του συμπλόκου αναλογία κεραμιδίου /σφιγγολιπίδιο σε κύτταρα λουτεολινο σε σύγκριση με το ελέγχουν αυτά (πάνω από 10- και 7-φορές μετά

3Η-Sph και

3Η-σερίνη παλμό, αντίστοιχα, p & lt?. 0.001)

(Α) κύτταρα CC σημάνθηκαν με 25 nM

3Η-Sph (άνω τμήμα) ή 200 nM

3Η-σερίνη (κάτω πάνελ) στο η απουσία (λευκή γραμμή) ή παρουσία (γκρι μπάρα) 100 μΜ luteolin για 2 ώρες. Στο τέλος το περιεχόμενο του κυτταρικού ραδιοσημασμένου κεραμιδιού (CER), σφιγγομυελίνη (SM) και γλυκοσφιγγολιπίδια (ΓΣΛ) μετρήθηκε. **, P & lt? 0.01. (Β) κύτταρα CC επωάστηκαν εν απουσία (CT) ή παρουσία λουτεολίνη (LU), στη συνέχεια με ΒΟϋΙΡΥ-C

5-Cer και αναλύθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού (bar, 10 μm). (C) κύτταρα CC επωάστηκαν χωρίς (α) ή με (β) BFA (1 μg /ml) για 30 λεπτά, και στη συνέχεια δονήθηκαν με

3Η-Sph ή

3Η-σερίνη με λουτεολίνη (100 μΜ) για 2 ώρες. Το σύμπλοκο αναλογία κεραμιδίου /σφιγγολιπίδιο έχει αναφερθεί. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± S.D. από δύο ανεξάρτητα πειράματα. **, P & lt? 0.01.

Η

Μετά από 2 ώρες παλμό με L-

3Η-σερίνη, τον έλεγχο και τα κύτταρα λουτεολινο επεξεργασμένο ενσωματωθεί παρόμοιες ποσότητες ραδιενέργειας στο συνολικό σφιγγολιπίδια (22,3 ± 2,7 και 24,9 ± 3,0 nCi /πιάτο). Στις πειραματικές συνθήκες που χρησιμοποιούνται,

3Η-κηραμιδίου αντιπροσώπευε το μείζον επισημασμένο σφιγγολιπίδιο, και βρέθηκε σημαντικά αυξημένη στην λουτεολίνη-κατεργασμένα κύτταρα (σχήμα 3Α, κάτω πίνακας). Όπως και στην περίπτωση του

3Η-Sph παλμό, την ανύψωση του κεραμιδιού συνοδεύτηκε από σημαντική μείωση τόσο της σφιγγομυελίνης και γλυκοσφιγγολιπίδια (Σχήμα 3Α, κάτω πίνακα).

Luteolin παρεμποδίζει την κυκλοφορία ER-Golgi κεραμιδιού

στις βάσεις τα παραπάνω αποτελέσματα, ήταν ενδιαφέρον να διερευνηθεί κατά πόσον η μείωση του μεταβολισμού κηραμιδίου σε πολύπλοκες σφιγγολιπίδια οφείλεται σε αλλοιώσεις της μεταφοράς του από την ER στη συσκευή Golgi. Για το σκοπό αυτό, μελετήσαμε πρώτα την επίδραση της λουτεολίνη στην ενδοκυτταρική μεταφορά του ΒΟϋΙΡΥ-C

5-Cer, μία φθορίζουσα αναλόγου κεραμίδιο είναι σε θέση να μιμηθούν την κίνηση ER-Golgi των φυσικών κεραμιδιού στα ζωντανά κύτταρα [30]. Μετά την επισήμανση κύτταρα ελέγχου με ΒΟϋΙΡΥ-C

5-Cer, ιδιαίτερα φθορισμού ενδοκυτταρικά κυστίδια συσσωρεύονται στο συμπαγές περιπυρηνική δομές, εκπρόσωπος της συσκευής Golgi (Σχήμα 3Β, αριστερά), υποδεικνύοντας την κανονική έξοδο του κεραμιδιού από το ER. Αντίθετα, στα κύτταρα λουτεολινο έλαβαν μια φθορισμού εξαπλώνεται σε όλα τα κύτταρα με ένα διάχυτο δικτυωτό μοτίβο, και συνοδεύεται από μείωση της περιπυρηνικών φθορισμού ήταν εμφανής (Σχήμα 3Β, δεξιά). Αυτές οι παραλλαγές, μαζί με τα αποτελέσματα της μελέτης του παλμού, είναι συνεπείς με την υπόθεση ότι κυτταροτοξική δόσεις luteolin βλάψει την μεταφορά κεραμιδιού από το ER στο Golgi. Για να τεκμηριώσει περαιτέρω αυτό, διερευνήθηκε η επίδραση της BFA, η οποία διαταράσσει την Golgi με την πρόκληση της σύντηξης με το ER [31], για λουτεολινο που προκαλείται από δυσλειτουργία του μεταβολισμού του κεραμιδιού. Βρήκαμε ότι BFA μείωσε σημαντικά τη συσσώρευση κηραμιδίου λουτεολίνη επαγόμενη, και αυτό παράλληλα με την ανύψωση των δύο σφιγγομυελίνη και γλυκοσυλοκεραμιδίου. Κατά συνέπεια, με την παρουσία του BFA, η λουτεολίνη επαγόμενη ανύψωση του λόγου κεραμιδιού /σύμπλοκο σφιγγολιπίδια ήταν σημαντικά μειωμένη (Εικ 3C).

Akt εμπλέκεται σε λουτεολίνη προκαλούμενη βλάβη του κεραμιδιού κυκλοφορίας

Καθώς η ενεργοποίηση της κινάσης σερίνης-θρεονίνης Akt (πρωτεϊνική κινάση Β) κρίσιμα εμπλέκονται σε σηματοδότηση επιβίωσης σε διάφορους τύπους κυττάρων [32], από την επόμενη διερευνήθηκε αν Akt εμπλέκεται στην τοξικότητα λουτεολίνη. Βρήκαμε ότι η θεραπεία luteolin προκάλεσε δοσοεξαρτώμενη μείωση της φωσφορυλιωμένης Akt σε CC κύτταρα (Σχ 4Α). Επιπλέον, LY294002, ένας ειδικός αναστολέας της ΡΙ3Κ /Akt, ήταν σε θέση να μιμηθούν τις επιδράσεις στο μεταβολισμό λουτεολίνη κεραμίδιο, αυξάνοντας και μειώνοντας κεραμίδιο συγκρότημα σφιγγολιπίδια (Σχήμα 4Β).

(Α) ΥΧ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 και 100 μΜ από λουτεολίνη για 2 ώρες και υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με αντι-ρΑΚΤ αντισώματα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε παλμό με

3Η-Sph απουσία (CT) ή παρουσία LY294002 για 2 ώρες. Τα επίπεδα κεραμιδιού (CER), σφιγγομυελίνη (SM) και γλυκοσφιγγολιπίδια (ΓΣΛ) αναφέρονται ως μέση ± δ.ϋ. τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. **, P & lt? 0.01 vs κύτταρα CT.

Η

Luteolin διαταράσσει την ισορροπία του ροοστάτη σφιγγολιπίδιο αναστέλλοντας SphK2

Οι αναλύσεις των μεταβολιτών 1-φωσφορυλίωση

3Η-Sph (συμπεριλαμβανομένων των

3Η- S1P και

3Η-νερό, το προϊόν αποδόμησης του) αποκάλυψε ότι τόσο S1P- και νερό σχετιζόμενη ραδιενέργεια ήταν σημαντικά μειωμένες με λουτεολίνη (Σχήμα 5Α και 5Β). Το εύρημα ότι luteolin προκάλεσε μείωση τόσο S1P και των προϊόντων αποδόμησής της μας ώθησε να αξιολογήσει την πιθανή επίδραση των κυτταροτοξικών συγκεντρώσεων των luteolin στην έκφραση και τη δραστηριότητα δρΗΚ. Western blots απεκάλυψε κανένα αισθητές διαφορές στην έκφραση τόσο SphK1 και πρωτεΐνες SphK2 (Σχήμα 5C). Ενδιαφέροντος, βρήκαμε ότι 50-100 μΜ luteolin ανέστειλε σημαντικά δραστηριότητα SphK2 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, αλλά ήταν αναποτελεσματική στην SphK1 (Σχήμα 5D).

(Α) και (Β) κύτταρα CC σημάνθηκαν με

3Η-Sph για 2 ώρες σε περίπτωση απουσίας (λευκή γραμμή) ή παρουσία 100 μΜ luteolin (γκρίζα γραμμή). Στο τέλος, επισημασμένο S1 Ρ (Α) και νερό (Β) αξιολογήθηκαν σε κύτταρα και μέσον, αντίστοιχα. (C) κύτταρα CC υποβλήθηκαν σε αγωγή με 50-100 μΜ λουτεολίνη για 2 ώρες, και ίσες ποσότητες πρωτεϊνών κατόπιν αναλύθηκαν για πρωτεΐνες SphK1 και SphK2 με ανοσοστύπωση. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (D) SphK1 και SphK2 δραστηριότητες προσδιορίστηκαν με την απουσία ή παρουσία λουτεολίνη, χρησιμοποιώντας κυτταρικό ομογενοποίημα CC ως πηγή ενζύμου. Τα δεδομένα είναι μέσες ± S.D. τριών πειραμάτων εις διπλούν. **, P & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου

Η

Η λουτεολινο που προκαλείται από την αναστολή τόσο της κεραμιδιού αναβολισμό και τη δραστηριότητα SphK2 οδήγησε σε σημαντική αύξηση της αναλογίας του κεραμιδιού /S1P (πάνω από 6 φορές, σ & lt? 0.01)., ότι είναι μια σχετική ανισορροπία του σφιγγολιπίδιο ροοστάτη.

μείωση S1P είναι λειτουργική για την τοξικότητα luteolin

Η λουτεολινο που προκαλείται από τη μείωση της ενδοκυτταρικής S1P μας οδήγησε να αξιολογήσει κατά πόσον διοίκηση S1P επηρεάζει luteolin κυτταροτοξικότητα. Πρέπει πρώτα διαπίστωσε ότι η θεραπεία S1P αυξήθηκε σημαντικά φωσφορυλίωση της Akt σε CC κύτταρα (Σχήμα 6Α, επάνω). Επιπλέον, η συγχορήγηση του S1P και λουτεολίνη οδήγησε σε σημαντική αύξηση των βιώσιμων κυττάρων (Σχήμα 6Α, κάτω), και μείωσε την αναστολή της φωσφορυλίωσης λουτεολίνη Akt (Σχήμα 6Β)

(Α) πάνω πίνακα.: κύτταρα CC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,5-1 μΜ S1P για 2 ώρες. Ίσες ποσότητες των πρωτεϊνών του κυττάρου στη συνέχεια αναλύθηκαν για φωσφορυλιωμένη Akt (pAkt) με ανοσοκηλίδωση. Κάτω πίνακας: κύτταρα CC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του S1P παρουσία 50 μΜ λουτεολίνη, και μετά από 48 ώρες η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. (Β) Ρ-Akt /β-ακτίνης αναλογία (μέσος όρος ± Τ.Α) πριν και μετά την επεξεργασία των κυττάρων CC με 1 μΜ S1P ή /και 50 μΜ λουτεολίνη για 2 ώρες. *, P & lt? 0,05 και **, p & lt? 0,01 έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα? #, P & lt? 0,05 vs. κύτταρα λουτεολινο επεξεργασία. Μια αντιπροσωπευτική κηλίδα Western αναφέρεται στο κάτω μέρος. (C) κύτταρα CC επωάστηκαν με λουτεολίνη μόνο (Lu) ή παρουσία 1 μΜ S1P ή /και 1 μΜ SEW2871? 5 μΜ W123? ή 100 ng /ml ΡΤΧ. (D) κύτταρα CC επωάστηκαν με λουτεολίνη απουσία ή παρουσία 1 μΜ κλουβιά S1P χωρίς ή με 100 ng /ml ΡΤΧ για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χωρίς (σκούρο γκρι) ή με (ανοιχτό γκρι) υν ακτινοβολία για 30 s. Στο (C) και (D), η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ, και η βιωσιμότητα των κυττάρων λουτεολίνη αγωγή θεωρήθηκε ως 100%. Τα δεδομένα είναι μέσες ± S.D. από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα. **, P & lt? 0.01.

Η

Για να προσδιορίσετε αν S1P ασκεί προστατευτική δράση στην luteolin θάνατο που προκαλείται μέσω ενός μονοπατιού που περιλαμβάνει S1PRs, δύο φαρμακολογικών αναστολέων με χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης. Δεδομένου ότι δέσμευση του S1P με τον υποδοχέα S1P1 έχει δειχθεί ότι εμπλέκεται στην κολίτιδα που προκαλείται από τον καρκίνο [33], αξιολογήσαμε πρώτα τον πιθανό ρόλο του υποδοχέα S1P1 σε ισχύ S1P επί CC κύτταρα. Η ειδική SEW2871 αγωνιστής S1P1 δεν ήταν σε θέση να μιμηθούν S1P προστατευτική-επίδραση στην τοξικότητα λουτεολίνη (Σχήμα 6C), και το S1 Ρ ανταγωνιστής W123 ήταν χωρίς σημαντικές επιδράσεις στο S1P μεσολάβηση επιβίωση CC κύτταρα (Σχ 6C, λωρίδες 3 και 4, αντίστοιχα). Για να αντιμετωπιστεί το ζήτημα αν S1P αποτελέσματα που προκαλούνται από προ-επιβίωσης ήταν εξαρτώμενη των συγκεκριμένων G-πρωτεΐνη υποδοχείς της, προσδιορίσαμε την επιβίωση των κυττάρων παρουσία ΡΤΧ, επειδή όλοι οι γνωστοί υποδοχείς S1P είναι, τουλάχιστον εν μέρει, σε συνδυασμό με Gi /πρωτεΐνη o [34]. Όπως φαίνεται στο Σχ 6C, ΡΤΧ δεν ήταν σε θέση να επηρεάσουν την διεγερτική δράση της S1P στην επιβίωση των κυττάρων, γεγονός που υποδηλώνει ότι ΡΤΧ-ευαίσθητη πρωτεϊνών G δεν εμπλέκονται στα μονοπάτια σηματοδότησης του S1P ενίσχυση της κυτταρικής επιβίωσης. Τέλος, για τη διερεύνηση της ικανότητας των S1P να δρουν ως ενδοκυτταρικό μεσολαβητής, φορτώσαμε κύτταρα CC με ένα παράγωγο photolysable (εγκλωβισμένου) του S1P. Όπως φαίνεται στο Σχ 6D, μετά φωτόλυση, κλουβιά S1P παρουσίασαν δηλωτικός, προστατευτική επίδραση έναντι λουτεολίνη-κυτταρικό θάνατο που επάγεται, και αυτό το αποτέλεσμα παρέμεινε unmodified.in παρουσία ΡΤΧ.

Συζήτηση

αυτή η μελέτη, αρχικά αναφέρουν ότι, luteolin εμφανίζει μια δοσοεξαρτώμενη αποπτωτική επίδραση επί CC κύτταρα στην περιοχή των 50-200 μΜ, που είναι γνωστή ως φυσιολογική συγκέντρωση των διατροφικών πολυφαινολών στο γαστρεντερικό σωλήνα [35]. Συνάφειας, στην ίδια περιοχή συγκεντρώσεων, η φλαβόνης δεν έδειξε τοξικότητα στο Des, που χρησιμοποιείται ως μοντέλο των κανονικών εντερικών επιθηλιακών κυττάρων. Έτσι, προκύπτει ότι luteolin επιδεικνύουν κυτταροτοξική δράση προς τα ανθρώπινα CC κύτταρα με ελάχιστη ή καμία επίδραση στα φυσιολογικά κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι θα μπορούσαν να αποτελέσουν ένα ιδανικό υποψήφιο για νέα θεραπευτικά μέσα.

Η μελέτη μας αποκαλύπτει, επίσης, για πρώτη φορά, ότι η αυξημένη περιεκτικότητα σε της κυτταρικής κεραμιδιού είναι στο τιμόνι της διαφορετικής ευαισθησίας των κυττάρων ΥΝ και CC σε τοξικότητα luteolin. Αρχικά διαπιστώθηκε ότι, υπό τις συνθήκες καλλιέργειας που χρησιμοποιούνται, CC κύτταρα έδειξαν περίπου τα μισά από τα επίπεδα κεραμιδιού σε σύγκριση με DES. Ενδιαφέρον, μια παρόμοια μείωση στην κυτταρική περιεκτικότητα κηραμιδίου βρέθηκε σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου σε σύγκριση με την κανονική βλεννογόνο του κόλου (15), γεγονός που υποδηλώνει ότι CC κύτταρα είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στην ανύψωση του κεραμιδιού. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η θεραπεία luteolin ενισχυμένο επίπεδο κεραμιδιού σε CC κύτταρα, αλλά όχι στο Des.