Αφηρημένο

Στον καρκίνο του παχέος εντέρου, μια ιδιαίτερα επιθετική νόσο, η εξέλιξη μέσα από την κακοήθη ακολουθία συνοδεύεται από ολοένα και πιο πολλές χρωμοσωμικές αναδιατάξεις. Να αποικίσουν τα όργανα-στόχους, της εισβολής κύτταρα διασχίζουν διάφορους ιστούς των διαφόρων ελαστικότητας. Είτε μαλακό αυξήσεις ιστού κακοήθεια ή σε όρια αντίθεση εξάπλωση της εισβολής των κυττάρων του παχέος εντέρου παραμένει ένα ανοιχτό ερώτημα. Χρησιμοποιώντας πολυηλεκτρολύτη πολυστρωματικές μεμβράνες μιμούνται μικροπεριβάλλοντα διαφόρων ελαστικότητας, αποκαλύψαμε ότι η ανθρώπινη SW480 κύτταρα καρκίνου κόλου εμφανίζεται αυξανόμενη συχνότητα σε ανωμαλίες διαχωρισμό χρωμοσωμικό όταν καλλιεργούνται σε υποστρώματα με μειούμενη ακαμψία. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι, αν και μειώνεται ακαμψία συσχετίζεται με αυξημένη κυτταρική θνησιμότητα, ένα σημαντικό ποσοστό των καρκινικών κυττάρων SW480 είχε διαφύγει από τα πολύ μαλακά υποστρώματα, ακόμη και όταν φέρουν ανώμαλη διαχωρισμό χρωμοσωμάτων, την επίτευξη της μίτωσης και να υποβάλλονται σε νέο κύκλο αναδιπλασιασμού σε αντίθεση με τα ανθρώπινα κολικά HCoEpiC κύτταρα τα οποία έχασαν τη ζωή τους σε μαλακά υποστρώματα. Η παρατήρηση αυτή ανοίγει τη δυνατότητα ότι η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να ξεπεράσουν ελαττώματα χρωμόσωμα διαχωρισμό σε πολύ μαλακό υποστρώματα θα μπορούσαν να συμβάλουν στην αύξηση της χρωμοσωματικών αναδιατάξεων και των καρκινικών κυττάρων επιθετικότητα

Παράθεση:. Rabineau M, L Kocgozlu, Dujardin D, Senger Β, Haikel Υ, Voegel JC, et al. (2013) Συμβολή των Soft υποστρώματα σε κακοήθεια και όγκου καταστολή κατά τη διάρκεια τμήματος του καρκίνου παχέος εντέρου Cell. PLoS ONE 8 (10): e78468. doi: 10.1371 /journal.pone.0078468

Επιμέλεια: Θωμάς Claudepierre, Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου της Λειψίας, Γερμανία

Ελήφθη: 15η Απριλίου του 2013? Αποδεκτές: 13, Σεπτεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Οκτώβρη του 2013

Copyright: © 2013 Rabineau et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από την Αλσατία Contre Καρκίνο le. Μ.Κ. είναι χρεωμένη στην Faculté de Chirurgie Dentaire του Στρασβούργου για τη χρηματοδοτική στήριξη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κατά τη διάρκεια των τελευταίων 10 ετών, έχει καταστεί προφανές ότι η συμπεριφορά των κυττάρων δεν εξαρτάται μόνο από τη χημική συνθήματα, αλλά ότι οι μηχανικές ιδιότητες του κυτταρικού περιβάλλοντος παίζουν τόσο σημαντικό ρόλο. Αυτό θεαματικά αποδεικνύεται από τα πειράματα ορόσημο της ομάδας Discher ο οποίος έδειξε ότι τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα μπορεί είτε να διαφοροποιηθούν σε οστεοβλάστες, ινοβλάστες ή νευρώνες ανάλογα με την συντελεστής Young του υποστρώματος προσκόλλησης [1]. Είναι επίσης ευρέως αποδεκτό ότι οι διαφορετικοί τύποι κυττάρων χρειάζεται υποστρώματα διαφορετικών Νέοι moduli να κολλήσει καλά και να πολλαπλασιάζονται. Οστεοβλάστες απαιτούν Νέοι συντελεστές στην περιοχή του MPa να τηρούν ενώ ινοβλάστες προσκολλώνται σε πιο ήπια υποστρώματα των οποίων συντελεστές των περίπου 10 kPa [2] και οι νευρώνες αναπτύσσονται σε εξαιρετικά μαλακά υποστρώματα από περίπου 1 kPa [1]. Αυτές οι διακριτές τιμές είναι σύμφωνα με τις Νέοι συντελεστές που χαρακτηρίζουν τους ιστούς που περιβάλλουν αυτούς τους διαφορετικούς τύπους κυττάρων. Τα αποτελέσματα αυτά είναι ύψιστης σημασίας, για παράδειγμα στον τομέα της μηχανικής των ιστών για να σχεδιάσουν τα ικριώματα που επιτρέπει την κατάλληλη ανάπτυξη των κυττάρων ή εμφύτευμα ολοκλήρωσης. Ωστόσο πρόσφυσης δεν είναι η μόνη πτυχή που χαρακτηρίζει τη συμπεριφορά των κυττάρων: κυτταρική διαίρεση είναι επίσης μια κρίσιμη πτυχή για την κυτταρική μοίρα. Η ομάδα μας άρχισε πρόσφατα να εξεταστεί η επίδραση των μηχανικών ιδιοτήτων του υποστρώματος για την κυτταρική διαίρεση [3]. Αυτά τα δεδομένα τονίζεται ότι οι μηχανικές ιδιότητες του υποστρώματος παίζουν ένα κρίσιμο ρόλο στην χρωμόσωμα διαχωρισμό κατά την διάρκεια της μίτωσης των επιθηλιακών κυττάρων. Πράγματι, παρατηρήσαμε μια προοδευτική αύξηση σε ανωμαλίες χρωμοσωμικού διαχωρισμού με μειούμενο ακαμψία υπόστρωμα σε μη καρκινικά κύτταρα αρουραίου καγκουρό νεφρού ρΤΚ2 [3]. Επιπλέον, τα μαλακά υποστρώματα (κάτω από 50 kPa) έχουν περιγραφεί ως ένας φυσικός φραγμός μικροπεριβάλλον αναστολή σχεδόν εντελώς τα κύτταρα ρΤΚ2 [3].

Κατά τα τελευταία χρόνια, έχει διαπιστωθεί ότι εξέλιξης επιρροές ακαμψία του ιστού του όγκου και μπορεί να προωθήσει η κακοήθης συμπεριφορά [4-6]. Με την εισαγωγή καρκινικά κύτταρα σε 3-διαστάσεων μήτρες ινώδους, Liu et al. έδειξε ότι η μαλακή μήτρες Νέων μέτρου περίπου 100 Pa προώθησε την ανάπτυξη του γύρου αποικίες με αυξανόμενη επιθετικότητα όταν ξενομοσχεύτηκε σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια [7]. Πολύ πρόσφατα, Tang et al. αποκάλυψε την εξασθένηση της κυτταρικής mechanosensitivity των καρκινικών κυττάρων όταν καλλιεργείται σε μαλακό υποστρώματα [8]. Στον καρκίνο του παχέος εντέρου, μια ιδιαίτερα επιθετική νόσο, η εξέλιξη μέσα από την κακοήθη ακολουθία συνοδεύεται από αύξηση των χρωμοσωματικών αναδιατάξεων [9-12]. Για να αποικίζουν όργανα στόχους, επεμβατική κύτταρα διασχίζουν διάφορους ιστούς διαφόρων ελαστικότητας (όπως π.χ., 175, 918, 320, 120 και 640 Ρα για βασική μεμβράνη, στρώμα, λέμφο, λεμφαδένα και το ήπαρ, αντιστοίχως) [2,4] και, ενώ τα περισσότερα από αυτά τα κύτταρα πεθαίνουν κατά τη διάρκεια του ταξιδιού τους, λίγες αντιστέκονται και μπορούν να δημιουργήσουν μεταστάσεις [13]. Είτε μαλακό αυξήσεις ιστού κακοήθεια ή σε αντίθεση με τα όρια της εισβολής εξάπλωση των κυττάρων παραμένει ένα ανοιχτό ερώτημα. Χρησιμοποιώντας πολυστρωματικών πολυηλεκτρολύτη ταινίες (ΡΕΜ) [14-18], αποκαλύψαμε ότι η ανθρώπινη SW480 κύτταρα καρκίνου κόλου εμφανίζεται αυξανόμενη συχνότητα σε ανωμαλίες διαχωρισμό χρωμοσωμικό όταν καλλιεργούνται σε υποστρώματα με τη μείωση της ακαμψίας (Σχήμα 1) και [3]. Στην παρούσα εργασία, αναφέρουμε ότι υποστρώματα με δυσκαμψία των 50 kPa και κάτω αιτία μαζικό θάνατο των μιτωτικών κυττάρων αλλά ότι λίγα κύτταρα να αντισταθούν και να επιτύχει τη μίτωση ξεπερνώντας ανώμαλη χρωμοσωμικό διαχωρισμό. Για το σκοπό αυτό, συγχρονισμένα κύτταρα SW480 σπάρθηκαν σε μια σειρά από ταινίες κατασκευάζονται από ένα /υαλουρονικού οξέος πολυ-L-λυσίνη (PLL /ΗΑ)

24 στρώμα καλυμμένο με πολυ (στυρένιο) σουλφονικό /πολυαλλυλαμίνης (PSS /ΡΑΗ)

n

στρωμάτων (

n

= 0, 1 και 2? αυξάνοντας

ν

αυξάνει την ακαμψία του υποστρώματος [19]) και ακολουθείται από την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων.

Fisher Ακριβής Τεστ δείχνει το ποσοστό επί E

50 (18 κύτταρα με ανωμαλίες του χρωμοσώματος σε 121 κύτταρα που αναλύθηκαν) είναι σημαντικά διαφορετική από ότι στο γυαλί (6/153,

σ

μια αυθαίρετη τιμή 1 αποδόθηκε στην μέση τιμή που αντιστοιχεί σε κύτταρα πάνω σε γυαλί). Δ) α-τουμπουλίνης και β1-ιντεγκρίνης διανομή 30 λεπτά μετά το συγχρονισμό σε γυαλί, Ε

50 και Ε

20 από στερεωμένα κύτταρα SW480, υπέρθεση των κυττάρων με αντι-α-τουμπουλίνης (πράσινο) και αντι-β1 ιντεγκρίνη (κόκκινο) (α-τουμπουλίνης /β1-ιντεγκρίνης). Βέλος δείχνει ένα λεπτό σημείο του β1-ιντεγκρίνης επικεντρώθηκε στα μέσα του σώματος. Αντιπροσωπευτικά εικόνες παρουσιάζονται για 2 ανεξάρτητα πειράματα για ένα σύνολο 10 κύτταρα για κάθε κατάσταση? κλίμακα bar: 10 μm. Στο γυαλί, E

50 και Ε

20 από σταθερό κύτταρα SW480, υπέρθεση των κυττάρων με DNA (μπλε) και ακτίνη (κόκκινο) (DNA /ακτίνης). Arrowhead δείχνει συσσώρευση ακτίνης στο κύτταρο μέσα ζώνη. Αντιπροσωπευτικά εικόνες παρουσιάζονται για 2 ανεξάρτητα πειράματα για ένα σύνολο 10 κύτταρα για κάθε κατάσταση? κλίμακα bar: 10 μm

Η

4.. Μιτωτικής ατράκτου οργάνωση των καρκινικών κυττάρων ως απάντηση σε μαλακά υποστρώματα

Είμαστε δίπλα ελεγχθεί μιτωτική συναρμολόγηση ατράκτου σε μαλακές μήτρες με ανοσοφθορισμό με αντι-α-τουμπουλίνης και χρώση του DNA με τη Hoechst. Οι μιτωτικών ατράκτων των κυττάρων SW480, ορατό στο άκαμπτο υποστρώματα (γυαλί), συντηρήθηκαν σε Ε

50 και ακόμα και σε Ε

20 (Σχήμα 6Α και Β). Αυτό το αποτέλεσμα έρχεται σε αντίθεση με αυτό που παρατηρήθηκε για μη καρκινικά κύτταρα μιτωτικά ρΤΚ2 σπάρθηκαν σε μαλακό μήτρα αφού για συντελεστής Young ≤ 50 kPa, δεν μπορούσε να παρατηρηθεί μιτωτικής ατράκτου [3]. Συνεπής με ανάλυση ζωντανό κύτταρο μας (Σχήμα 3Β και Δ), μη φυσιολογική εκδηλώσεις χρωμόσωμα διαχωρισμός θα μπορούσε να παρατηρηθεί (Εικόνα 6Β και D), ωστόσο, χωρίς στοιχεία για πολυπολικός ή μονοπολικές ατράκτους επί των διαφορετικών υποστρωμάτων πιθανότατα λόγω β1-ιντεγκρίνης εμπλοκής διατηρείται στο πολύ μαλακό υπόστρωμα. Πράγματι, πολυπολική άτρακτοι παρατηρήθηκαν για τα κύτταρα που φέρουν μεταλλαγμένα β1-ιντεγκρίνης [23].

SW480 κύτταρα 30 min-2h μετά το συγχρονισμό σε γυαλί, E

50 και Ε

20 από σταθερά κύτταρα. Οι εικόνες επάλληλα με αντι-α-τουμπουλίνης (λευκό) και Hoechst για το DNA (κόκκινο) (α-τουμπουλίνης /DNA). Βέλος δείχνει την μιτωτικής ατράκτου, χωρίς ανωμαλία (Α), με ανωμαλία (Β), αιχμή βέλους υποδεικνύει την ανωμαλία? κλίμακα bar: 10 μm. Γ) Ποσοστό των κυττάρων SW480 με μιτωτικής ατράκτου από το Α, καθορίζεται σε 3 συγκεντρώνονται ανεξάρτητα πειράματα. Fisher Ακριβής Τεστ δείχνει ότι το ποσοστό των κυττάρων με μιτωτικής ατράκτου σε Ε

50 (93/140) είναι σημαντικά διαφορετική από την αναλογία στο γυαλί (139/142,

σ

μια αυθαίρετη τιμή 1 αποδόθηκε με τη μέση τιμή που αντιστοιχεί σε κύτταρα πάνω σε γυαλί).

Η

6. δραστηριότητα αντιγραφή του DNA των καρκινικών κυττάρων σε απόκριση σε μαλακό υποστρώματα

Για να καθοριστεί εάν τα κύτταρα SW480 που ήταν σε θέση να προχωρήσει μέσα από τη μίτωση ήταν ικανά Επανεισήγαγε κυτταρικού κύκλου, ερευνήσαμε την ικανότητα τους να υποβληθούν σε DNA 4h αντιγραφής αφού σπάρθηκαν σε διαφορετικές υποστρώματα. κύτταρα SW480 σπάρθηκαν σε Ε

50 και Ε

20 δείχνουν θέση της αντιγραφής ομοιόμορφα κατανεμημένα στον πυρήνα (Σχήμα 8Α) με αντίστοιχα 60% και 23% των κυττάρων με σήμα πυρηνικής BrdU (Σχήμα 8Β). Είναι αξιοσημείωτο ότι τα ποσοστά των κυττάρων SW480 ενσωματώνουν BrdU συσχετίζεται με το ποσοστό των κυττάρων επίτευξη μίτωση επί E

50 και Ε

20 (Σχήματα 3C και 8Β), υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα SW480 σε θέση να ολοκληρώσει χρωμόσωμα διαχωρισμού μαλακά υποστρώματα αποτελούν περαιτέρω σε θέση να υποβληθεί σε νέο κύκλο αντιγραφής του DNA.

Α) BrdU ορατά με έμμεσο ανοσοφθορισμό των κυττάρων SW480 4 ώρες μετά το συγχρονισμό σε γυαλί, E

50 και Ε

20? κλίμακα bar: 10 μm. Β) ποσοστό των κυττάρων με πυρηνική BrdU προσδιορίζεται στις 3 συνενώθηκαν ανεξάρτητα πειράματα. Fisher Ακριβής Τεστ δείχνει ότι το ποσοστό των κυττάρων με πυρηνική BrdU E

50 (108/170) είναι σημαντικά μικρότερη από ότι στο γυαλί (400/400,

σ

& lt? 0.001) και η αναλογία στην Ε

20 (35/150) είναι σημαντικά μικρότερη από ότι στην Ε

50 (

σ

& lt? 0.001). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το 95% διαστήματα εμπιστοσύνης.

Η

Συμπέρασμα

Εν κατακλείδι, αναφέρουμε ότι παρά τις μαζικές κυτταρικό θάνατο σε εξαιρετικά μαλακά υποστρώματα (Ε

0), τα καρκινικά κύτταρα, όπως οι SW480 καρκινικά κύτταρα κόλου, ακόμη και όταν φέρουν ανώμαλη διαχωρισμό χρωμοσωμάτων, αντιστέκονται στις πολύ μαλακά υποστρώματα (Ε

20 και Ε

50) και να επιτύχει τη μίτωση. Τα ευρήματα αυτά θα μπορούσαν να είναι ιδιαίτερα σημαντικές για την παθοφυσιολογία του καρκίνου και τη διάδοση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. Πράγματι, τα καρκινικά φύση τους τουλάχιστον μερικά από τα κύτταρα του όγκου θα μπορούσε να βοηθήσει να ξεπεράσουν ανωμαλίες χρωμοσωμικού διαχωρισμού συνδέεται με την αλλαγή στην ακαμψία του υποστρώματος και ως εκ τούτου ξεφύγουν από τα μαλακά υποστρώματα να συνεχίσουν το ταξίδι τους έως τη θέση του σχηματισμού μετάστασης. Επιπλέον, αυτή η ικανότητα να ξεπεράσει τις ανωμαλίες του διαχωρισμού θα μπορούσε να οδηγήσει σε περισσότερο χρωμοσωματικών αναδιατάξεων, η οποία μπορεί να συμβάλει στην αύξηση των καρκινικών κυττάρων επιθετικότητα. Περαιτέρω διερεύνηση της απόκρισης των καρκινικών κυττάρων σε φυσικές μεταβολές του περιβάλλοντος μπορεί να βοηθήσει στον εντοπισμό νέων πιθανών στόχων για αντικαρκινική θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

1. Υλικά και κατασκευή των ΡΕΜ

PLL (MW = 5.7 x 10

4 Da, Sigma, St. Quentin Fallavier, Γαλλία) και ΗΑ (MW = 4.0 x 10

5 Da, BioIberica, Βαρκελώνη ) χρησιμοποιήθηκαν για συσσώρευση (PLL /ΗΑ)

24 ταινίες, και PSS (MW = 7.0 x 10

4 Da, Sigma, St. Quentin Fallavier) και πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων (MW = 7.0 x 10

4 Da , Sigma) για το (PSS /ΡΑΗ)

n

κάλυψης φιλμ (

n

αντιστοιχεί στον αριθμό των ζευγών στιβάδων), που κατατέθηκαν στην κορυφή του (PLL /ΗΑ)

24 στρώματα. PLL, ΗΑ, PSS, και ΡΑΗ διαλύθηκαν σε 1 mg /mL σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 150 mM NaCl και 20 mM τρις ​​(υδροξυμεθυλ) -αμινομεθάνιο (TRIS, Merck) σε ρΗ 7,4, και όλα τα στάδια έκπλυσης πραγματοποιήθηκαν με τον ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα. (PLL /ΗΑ)

24 στρώματα και (PSS /PAH)

ν

κάλυψης ταινίες παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας μια μηχανή βύθιση (εμβάπτιση ρομπότ DR3, Riegler & amp? Kirstein GmbH, Βερολίνο, Γερμανία), σε γυάλινες πλάκες (VWR Scientific, Fontenay sous Bois, Γαλλία). Η ακαμψία του (PLL /ΗΑ)

24- (PSS /PAH)

ν

ταινία αυξάνεται με τον αριθμό των κατατεθειμένων ζεύγη PSS /στρώμα ΠΑΥ (Πίνακας 1) [19]. Οι συμβολισμοί σύντομο χέρι E

0, E

20 και Ε

50 είναι για το (PLL /ΗΑ)

24, (PLL /ΗΑ)

24- (PSS /PAH)

ν

ταινίες με το

n

= 0, 1 και 2, αντίστοιχα.

2. PEM χαρακτηρισμό

παρατηρήσεις CLSM έγιναν με Zeiss LSM 510 μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας x40 /1.4 λάδι κατάδυσης Objectif. FITC-φθορισμός ανιχνεύεται μετά από διέγερση στα 488 nm με cutoff διχρωϊκό κάτοπτρο 488 nm και εκπομπή ζωνοπερατό φίλτρο 505-530 nm. Rho-φθορισμός ανιχνεύεται μετά από διέγερση στα 543 nm, διχροϊκό καθρέφτη 543 nm, και εκπομπή μακρινή πάσα φίλτρο 585 nm.

3. Κύτταρα και συγχρονισμός

παχέος SW480 κύτταρα αδενοκαρκινώματος επιθηλιακά (ATCC, CCL-228) αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI-1640 (Invitrogen) συμπληρωμένου με Glutamax, 10% FBS (Invitrogen), 100 μg /mL πενικιλλίνη, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (Invitrogen), 0.025 U /mL ινσουλίνη, 50 mg /mL υδροκορτιζόνη και 1,25 mg /mL G418 διατηρήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2. Τρεις ημέρες πριν από το συγχρονισμό, τα κύτταρα απλώνονται εκ νέου σε 1.2×10

4 ανά cm

2. Τα κύτταρα συγχρονίστηκαν με μηχανικά shakeoff. Μιτωτικές κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν (800

g

, 7 λεπτά), επαναιωρούνται σε μέσο καλλιέργειας, και ανακαλλιεργήθηκαν σε 1.2×10

4 ανά cm

2 επί επικαλυμμένων με λεπτό υμένιο καλυπτρίδες για περαιτέρω αναλύσεις. Ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα του κόλου (HCoEpiC, ScienCell Research Laboratories) αναπτύχθηκαν σε Παχέος Επιθηλιακών Κυττάρων Medium (CoEpiCM, ScienCell Πεδίο έρευνας Laboratories) συμπληρωμένο με κολικά επιθηλιακά συμπλήρωμα ανάπτυξης κυττάρου (CoEpiCGS, ScienCell Research Laboratories) και με πενικιλλίνη /διάλυμα στρεπτομυκίνη (P /S, ScienCell, Research Laboratories) που διατηρείται στους 37 ° C με 5% CO

2. 2 διπλασιασμούς πληθυσμού απλώθηκαν σε 5×10

5 ανά cm

2 σε υποστρώματα για περαιτέρω αναλύσεις.

4. Ανοσοσήμανση

Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν /διαπερατά σε 3.7% (w /v) PFA σε PBS συν 0.1% Triton Χ-100 για 15 λεπτά και αποκλείστηκαν με 10% αποσυμπληρωμένο FBS (Invitrogen). Τα κύτταρα επωάστηκαν με β1-ιντεγκρίνης (αραίωση 1:20, της Santa Cruz ακολουθούμενη από ροδαμίνη-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (αραίωση 1: 250, Santa Cruz), ή με αντι-α-τουμπουλίνης (αραίωση 1: 100, Santa Cruz) που ακολουθείται από συζευγμένο με FITC δεύτερο αντίσωμα. (αραίωση 1: 500, AnaSpec, CA) και το DNA αποκαλύφθηκε με Hoechst 33258 (20 μg /mL, Sigma) Για τις μελέτες αντιγραφή του DNA, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν προηγουμένως με BrdU (37 ° C) (1:50 , RPN 201, GE Healthcare) σταθεροποιήθηκαν /διαπερατά, επωάστηκαν με αντι-BrdU και DNase για 1 ώρα στους 37 ° C (αραίωση 1: 100, RNP 202, GE Healthcare), ακολουθούμενη από TRITC-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (1: 500 , AnaSpec).

5. DNA Replication

1.2 × 10

4 συγχρονισμένα κύτταρα σπάρθηκαν ανά cm

2 και επωάζονται με BrdU (37 ° C) (1:50 ?.. RPN 201, GE Healthcare) τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν /διαπερατά σε 3.7% PFA σε PBS συν 0.5% Triton Χ-100 για 15 λεπτά Μετά την πλύση με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-BrdU και DNase για 1 ώρα στους 37 ° C (αραιωμένο 1: 100? RNP 202, GE Healthcare). Μετά από πλύσεις με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με TRITC-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (1: 500? AnaSpec).

6. μικροσκοπία φθορισμού

Τα δείγματα τοποθετούνται σε vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA). εικόνες φθορισμού συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας Nikon Elipse TE200 με 63 × PL APO (1.4 NA) Objectif εξοπλισμένη με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή Nikon (DS-Q11MC με τα ΝΑΚ-Στοιχεία λογισμικά), και υποβάλλονται σε επεξεργασία με ImageJ (https://rsb.info.nih.gov /θ /).

7. Live-κυττάρων απεικόνισης

Για τη διαίρεση δοκιμασίες, τα κύτταρα επωάστηκαν 20 λεπτά με Hoechst 33242 (0,1 μg /ml, Sigma) πριν από την μηχανική shakeoff, επαναποτέθηκαν σε 1.2×10

4 ανά cm

2 για επικαλυμμένα με λεπτό υμένιο καλυπτρίδες και τοποθετούνται σε ένα Ludin Επιμελητήριο (Life Υπηρεσίες Imaging, Βασιλεία της Ελβετίας) στους 37 ° C, 5% CO

2, σε ένα μικροσκόπιο Leica DMIRE2 εξοπλισμένο με 40 × HCX PL APO PH2 (0,75 NA) στόχος και μια Leica DC350FX CCD (Leica λογισμικού FW4000). Οι εικόνες ελήφθησαν κάθε 5 λεπτά για 2h30, με φθορισμό και τη φάση της αντίθεσης.

8. Western Blot

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε επιφάνειες (Nunc) σε 2 × 10

5 ανά cm

2 και επωάστηκε για 30 λεπτά μετά το συγχρονισμό σε μέσο καλλιέργειας στους 37 ° C. Τα κύτταρα λύθηκαν σε 20 mM Tris-base, ρΗ 8, (0,15 Μ NaCl, 2 mM EDTA, 1% ΝΡ-40, 10% γλυκερόλη, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο που περιέχει 1% του κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης? Sigma). Τα μίγματα Εκχύλιση ανακινείται στους 4 ° C και φυγοκεντρήθηκε (3 λεπτά, 13Κ rpm στους 4 ° C). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία πρωτείνης DC (Bio Rad, USA). Ίσες ποσότητες ολικής πρωτεΐνης εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε SDS PAGE (NuPAGE, Invitrogen, Γαλλία) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Iblot μεταφοράς της στοίβας, Invitrogen, USA) αποκλείστηκε σε Τ- TBS (0.1% Tween 20, 50 mM Tris-base, ρΗ 7,6, 0,15 Μ NaCl) που περιέχει 1% BSA (Euromedex, Γαλλία) και ανιχνεύθηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι κηλίδες επωάστηκαν 2 ώρες με πρωτεύον αντίσωμα: β-ιντεγρίνη ενεργοποιημένη LIBS, (κλώνος Β44) (αραιωμένο 1: 1000, Millipore), αντι-Rac1 (αραιωμένο 1: 1000, Millipore) και ρ44 /Ρ42 ΜΑΡΚ (αραιωμένο σε 1: 1000, Cell Signaling, USA) χρησιμοποιήθηκαν. Τα στυπώματα επωάστηκαν για 2 ώρες με συζευγμένο με HRP αντι-κουνελιού, αντισώματα αντι-ποντικού (αραίωση 1: 2000? GE Healthcare). Ζώνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ECL Western Blotting Ανάλυση Συστήματος (RNP2109, GE Healthcare). Αυτοραδιογραφήματα ποσοτικά με το λογισμικό Kodak Digital Science 10. Αντιπροσωπευτικές μέσες τιμές από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα με τα τυπικά σφάλματα (τέσσερα χρονικά σημεία ανά ζώνη) παρουσιάζονται.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Movie S1.

ταινία που αντιστοιχεί στην Εικόνα 3Α για SW480 κυττάρων σε Ε

0.

doi: 10.1371 /journal.pone.0078468.s001

(AVI)

Movie S2.

ταινία που αντιστοιχεί στην Εικόνα 3Α για SW480 κυττάρων σε Ε

50.

doi: 10.1371 /journal.pone.0078468.s002

(AVI)

Movie S3.

ταινία που αντιστοιχεί στην Εικόνα 3Α για SW480 κυττάρων σε Ε

20.

doi: 10.1371 /journal.pone.0078468.s003

(AVI)

Movie S4.

ταινία που αντιστοιχεί στην Εικόνα 3Α για SW480 κύτταρα σε γυαλί.

doi: 10.1371 /journal.pone.0078468.s004

(AVI)

Movie S5.

ταινία που αντιστοιχεί στο Σχήμα 3Β για SW480 κυττάρων σε Ε

50.

doi: 10.1371 /journal.pone.0078468.s005

(AVI)

Movie S6.

ταινία που αντιστοιχεί στο Σχήμα 3Β για SW480 κυττάρων σε Ε

20.