Αφηρημένο

Ιστορικό και Σκοπός

Για να κατανοήσουμε τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην ισχυρή σκοτώνοντας επίδραση της ακτινοβολίας δέσμης άνθρακα-ιόντων σε καρκινικά κύτταρα με

TP53

ελλείψεις ογκοκατασταλτικό γονίδιο.

Υλικά και Μέθοδοι

απαντήσεις βλάβη του DNA μετά δέσμη άνθρακα-ιόντων ή X- ακτινοβολία ακτίνων σε ισογονικών HCT116 ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές με και χωρίς

ΤΡ53

(ρ53

+ /+ και p53

– /-, αντίστοιχα) αναλύθηκαν ως εξής: η επιβίωση των κυττάρων με κλωνογόνο προσδιορισμό, κύτταρο τρόποι θανάτου από την παρατήρηση των μορφολογικών ϋΑΡΙ-χρωματισμένων πυρήνων, DNA δίκλωνα σπασίματα (DSBs) με ανοσοχρώση φωσφορυλιωμένου Η2ΑΧ (γH2AX), και του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής και ανοσοχρώσης του Ser10-φωσφορυλιωμένων ιστόνης Η3.

Αποτελέσματα

το p53

– /- κύτταρα ήταν πιο ανθεκτικό από το p53

+ /+ κυττάρων σε ακτινοβολία ακτίνων Χ, ενώ οι ευαισθησίες του p53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα σε ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων ήταν συγκρίσιμα. X-ray και προσπίπτουσα ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων που προκαλείται κατά κύριο λόγο την απόπτωση του p53

+ /+ κύτταρα, αλλά όχι το p53

– /- κύτταρα. Στην ρ53

– /-. Κύτταρα, ακτινοβολία άνθρακα δέσμης ιόντων, αλλά όχι ακτινοβόληση με ακτίνες Χ, αισθητά επαγόμενη μιτωτική καταστροφή που συνδέθηκε με την πρόωρη έναρξη μιτωτική με φιλοξενούν μακράς διατήρησε DSBs στις 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση

Συμπεράσματα

η αποτελεσματική επαγωγή της μιτωτικής καταστροφής στην απόπτωση ανθεκτικά p53-ανεπαρκή κύτταρα υποδηλώνει μια ισχυρή καρκινικό κύτταρο-θανάτωση επίδραση της ακτινοβολίας δέσμης άνθρακα-ιόντων που είναι ανεξάρτητη από την κατάσταση της p53, γεγονός που υποδηλώνει βιολογικό πλεονέκτημα της πάνω από X-ray θεραπεία

Παράθεση:. Amornwichet Ν, Oike Τ, Shibata Α, Ogiwara Η, Tsuchiya Ν, Yamauchi M, et al. Καρκίνος (2014) Carbon-Ion Beam Ακτινοβολία σκοτώνει X-Ray-Resistant p53-Null κύτταρα επάγοντας Μιτωτικά Καταστροφή. PLoS ONE 9 (12): e115121. doi: 10.1371 /journal.pone.0115121

Επιμέλεια: Peiwen Φέι, Πανεπιστήμιο της Χαβάης Cancer Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Ιουλ του 2014? Αποδεκτές: 18, Νοεμ 2014? Δημοσιεύθηκε: 22, Δεκεμβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Amornwichet et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις-in-Aid από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας για προγράμματα οδηγώντας Πτυχιούχος σχολεία, καλλιέργεια Global Leaders στην Βαρέων ιόντων Therapeutics Μηχανικών και Μηχανικών, και Στρατηγικών νεαρός ερευνητής Πρόγραμμα Overseas επισκέψεις για την επιτάχυνση του εγκεφάλου Κυκλοφορίας, και Επιστημονικής Έρευνας για καινοτόμους τομείς (22131006). Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από τις επιχορηγήσεις-in-Aid από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης για Νέους Επιστήμονες (Β) KAKENHI [10.643.471]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ακτινοθεραπεία Carbon-ion έχει προκαλώντας το ενδιαφέρον στον τομέα της θεραπείας του καρκίνου. ακτίνες του άνθρακα-ιόντων έχουν πλεονεκτικές ιδιότητες έναντι ακτίνων Χ? μια ανώτερη κατανομή της δόσης που συνδέονται με την απότομη ημίφως και την κορυφή Bragg, και την ισχυρή επίδραση των κυττάρων-θανάτωσή τους [1], [2]. Η κύρια υποσχόμενη κλινική έκβαση της ακτινοθεραπείας άνθρακα-ιόν είναι να ξεπεράσει τη θεραπευτική αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στην ακτινοθεραπεία με ακτίνες Χ. Για παράδειγμα, μια πρόσφατη μελέτη στην οποία ακτινοθεραπεία άνθρακα ιόντων χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία ασθενών με καρκίνο του ορθού ανέφεραν 5ετή τοπικό έλεγχο και τα συνολικά ποσοστά επιβίωσης του 97% και 51% για μετεγχειρητική υποτροπιάζουσες περιπτώσεις [3]. Το ποσοστό αυτό είναι ανώτερο από τα συνολικά ποσοστά επιβίωσης 5 ετών (0-40%), που συνήθως επιτυγχάνεται με συμβατική ακτινοθεραπεία με ακτίνες Χ ή χειρουργική εκτομή [3], [4]. Ωστόσο, η βιολογική βάση για την ισχυρή κυτταρική θανάτωση επίδραση της ακτινοβόλησης με δέσμη ιόντων άνθρακα σε όγκους ακτινογραφία ανθεκτικά δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως.

γενετικών ανωμαλιών συμβάλλουν στην αντοχή ακτίνων Χ των καρκινικών κυττάρων [ ,,,0],5], [6]. Αδρανοποίηση μεταλλάξεις στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο

ΤΡ53

είναι αντιπροσωπευτικά της αντίστασης όγκου, και αυτές οι εκτροπές σχετίζονται με κακή πρόγνωση μετά την ακτινοθεραπεία με ακτίνες Χ [7], [8]. Η πρωτεΐνη p53 παίζει πολλαπλούς ρόλους στην απόκριση βλάβης DNA (DDR) σε ακτινοβολία ακτίνων Χ, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης των οδών κυτταρικού θανάτου και τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου [9]. Η επαγωγή της απόπτωσης από ρ53 είναι ένας βασικός παράγοντας που επηρεάζει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων στην ακτινοβολία ακτίνων-Χ. Αρκετές προ-κλινικές και κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι

Οι TP53

μεταλλάξεις που σχετίζονται με την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στη θεραπεία ακτινοβολίας ακτίνων Χ [7], [10], [11].

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ion σκοτώνει αποτελεσματικά p53-μεταλλαγμένο καρκινικά κύτταρα ακτίνων-Χ-ανθεκτικά [12 έως -15]. Αν και οι μηχανισμοί που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία εξετάστηκαν σε αυτές τις μελέτες, τα αποτελέσματα ήταν ασυνεπής. Οι αντιφάσεις είναι πιθανόν οφείλεται στο γεγονός ότι κάθε μελέτη επικεντρώθηκε σε λίγες μόνο πτυχές της DDR (όπως η απόπτωση ή την απόκριση του κυτταρικού κύκλου) [12] – [15], καθώς και κάθε χρησιμοποιήθηκαν κυτταρικές σειρές καρκίνου με διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο? ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα των εκτροπών σε γονίδια άλλα από

ΤΡ53

μπορεί να έχουν επικαλυφθεί τα αποτελέσματα [12], [13]. Εδώ, για να αποσαφηνιστούν οι μηχανισμοί που διέπουν την ισχυρή δολοφονία επίδραση της ακτινοβολίας δέσμης άνθρακα-ιόντων για ακτίνων Χ ακτινοβολίας ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα με

TP53

εκτροπές, πραγματοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη μελέτη των πολλαπλών πτυχών της DDR χρησιμοποιώντας ένα σύνολο ισογονικών ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων που διέφεραν μόνο στην κατάσταση ρ53 τους.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα HCT116 που φιλοξενούν άγριου τύπου ρ53 (ρ53

+ /+) και ισογονιδιακό ρ53-ηυΙΙ παράγωγο της (ρ53

– /-) δόθηκαν από τον Dr. Β Vogelstein του Πανεπιστημίου Johns Hopkins. HCT116 p53

+ /+ κύτταρα έχουν άθικτα τα σημεία ελέγχου βλάβης του DNA [16]. έκφραση p53, καθώς και τις επιπτώσεις των ακτίνων Χ και του άνθρακα-ιόντων ακτινοβολία δέσμης στην έκφραση p53 σε p53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα, εξετάστηκε με ανοσοστύπωση με αντισώματα έναντι ρ53 (Santa Cruz) και β-ακτίνης (έλεγχος φόρτωσης, Τεχνολογία Σηματοδότησης Κυττάρου) (S1a Εικ.). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο χρόνο πληθυσμιακού διπλασιασμού μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών (S1b Εικ.).

Ανθρώπινο καρκίνου του παχέος εντέρου (RKO, LS123, και WiDr) κύτταρα, τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα (Η1299) και ανθρώπινη (Saos-2) κύτταρα οστεοσαρκώματος αγοράστηκαν από την ATCC. κύτταρα RKO λιμάνι άγριου τύπου ρ53. LS123 και WiDr κύτταρα φέρουν μετάλλαξη παρερμηνεύσιμη στο p53 σε R175H και R273H, αντίστοιχα. Η1299 και Saos-2 κύτταρα είναι p53-null. κύτταρα Η1299 που εκφράζουν σταθερά μια μετάλλαξη ρ53 παρερμηνεύσιμη (R175H, R273H, R249S ή R280K) καθορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό.

hTERT-αθανατοποιημένα φυσιολογικών ανθρώπινων διπλοειδών ινοβλαστών ακροποσθίας (BJ-hTERT) που φιλοξενούν άγριου τύπου ρ53 τα προμηθευτήκαμε από την Clontech. κύτταρα BJ-hTERT εκφράζουν shRNA έναντι EGFP (BJ-hTERT-WT? έλεγχος). ή ρ53 (BJ-hTERT-shp53) καθορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18], και καλλιεργήθηκαν σε Ελάχιστο Απαραίτητο Μέσο του Eagle

Ακτινοβόληση

ακτινοβολία ακτίνων Χ εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας Faxitron RX-650 πηγή ακτινοβολίας (100 kVp, 1.14 Gy /min? Faxitron bioptics). ακτινοβόληση με δέσμη άνθρακα-ιόντων διεξήχθη στο Πανεπιστήμιο της Γκούνμα Βαρέων Ιόντων Ιατρικό Κέντρο με τις ίδιες προδιαγραφές πορείας που χρησιμοποιούνται στην κλινική πράξη (290 MeV /νουκλεόνιο και ένα μέσο γραμμικής μεταφοράς ενέργειας (LET) στο κέντρο του 6 εκατοστών εξάπλωση-out Bragg αιχμή του περίπου 50 keV /μm). δέσμες Carbon-ion παραδόθηκαν σε κατακόρυφη κατεύθυνση, έτσι ώστε τα κύτταρα σε πλάκες καλλιέργειας μπορεί να λάβει τη δόση ομοιόμορφα.

κλωνογονιδιακή επιβίωση δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και εκτίθενται (ή όχι ) με ακτίνες Χ ή ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων. Μετά την επώαση για περαιτέρω 10 ημέρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Αποικίες τουλάχιστον 50 κύτταρα μετρήθηκαν. Το κλάσμα που επιβίωσαν ομαλοποιήθηκε στα αντίστοιχα στοιχεία ελέγχου. Η δόση που είχε ως αποτέλεσμα ένα κλάσμα επιβίωσης του 10% (D

10) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον γραμμικό-τετραγωνική μοντέλο, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19].

αξιολογήσεων κυτταρικός θάνατος

Cells αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες, εκτεθειμένα (ή όχι) να ακτίνων-Χ ή ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων, και στη συνέχεια βάφονται με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης διϋδροχλωρίδιο (ϋΑΡΙ), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Ομοεστιακή εικόνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο BX51 (Olympus) εξοπλισμένο με μια κάμερα CCD (VB-7000? Keyence). Η απόπτωση προσδιορίστηκε με βάση την μορφολογία των πυρήνων, συμπεριλαμβανομένης της παρουσίας αποπτωτικών σωμάτων, πυρηνική συμπύκνωση και τον κατακερματισμό [21]. Τα κύτταρα που περιέχουν πυρήνες με δύο ή περισσότερες διακριτές λοβούς βαθμολογήθηκαν ως θετικά για μιτωτική καταστροφή [20], [22]. Τα κύτταρα που περιέχουν πυρήνες που δείχνει γήρανση που σχετίζεται heterochromatic εστίες βαθμολογήθηκαν ως θετικά για τη γήρανση [23]. Τα ποσοστά των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση, μιτωτική καταστροφή ή γηρασμός ποσοτικοποιήθηκαν μετρώντας τουλάχιστον 300 κύτταρα για κάθε πειραματική συνθήκη.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Cells εκτίθεται (ή όχι) να ακτίνων-Χ ή ακτινοβολία δέσμης άνθρακα ιόντων συλλέχθηκαν στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία, μονιμοποιήθηκαν με αιθανόλη, χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο σε παρουσία ΚΝάσης, και στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19].

ανοσοχρώση

Cells εκτίθεται (ή όχι) να ακτίνων-Χ ή άνθρακα-ion ακτινοβολία δέσμης βάφτηκαν με αντισώματα έναντι Ser139-φωσφορυλιωμένη ιστόνη Η2ΑΧ (γH2AX? Millipore) ή Ser10-φωσφορυλιωμένο Η3 ιστόνης (ρΗ3? Millipore), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. γH2AX εστίες ανά πυρήνα βαθμολογήθηκαν με διαδοχική 2D εικόνες που έχουν ληφθεί από πολλαπλές εστιακά επίπεδα. Τουλάχιστον 500 κύτταρα αξιολογήθηκαν για κάθε πειραματική συνθήκη.

Στατιστική ανάλυση

Τα πειράματα εκτελέστηκαν εις τριπλούν σε τουλάχιστον εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Στατιστικά σημαντικές διαφορές προσδιορίζονται με

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ χρησιμοποιώντας StatMateIII αταίριαστο Φοιτητών ver. 3.17 λογισμικού (ΑΤΜ).

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

δοκάρια Carbon-ιόντων έχουν πιο ισχυρό καρκίνο δραστηριότητα των κυττάρων-θανάτωσης από ό, τι οι ακτίνες Χ, ανεξαρτήτως της κατάστασης ρ53

Οι ευαισθησίες της p53

+ /+ και p53

– /- HCT116 κυττάρων με ακτίνες Χ και ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων αξιολογήθηκαν με δοκιμασίες κλωνογόνο επιβίωση (Εικ. 1). Όπως αναμένεται με βάση τα αποτελέσματα των προηγούμενων μελετών [14], [15], ρ53

– /- κύτταρα ήταν περισσότερο ανθεκτικά σε ακτινοβολία ακτίνων Χ από ρ53

+ /+ κύτταρα? οι D

10 τιμές για τις δύο αυτές κυτταρικές γραμμές ήταν 6,8 Gy και 3,8 Gy, αντίστοιχα. Αντίθετα, οι ευαισθησίες της p53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα σε ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων ήταν συγκρίσιμα? οι D

10 τιμές για αυτές τις κυτταρικές σειρές ήταν 1,7 Gy και 1,9 Gy, αντίστοιχα. Ως εκ τούτου, η σχετική βιολογική αποτελεσματικότητα της ακτινοβόλησης με δέσμη ιόντων άνθρακα σε ακτινοβόληση με ακτίνες Χ σε D

10 ήταν 2,2 σε ρ53

+ + κυττάρων και /3,6 σε ρ53

– /- κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ακτινοβόληση δέσμης άνθρακα-ion σκοτώνει αποτελεσματικά ακτίνες Χ ανθεκτικά

p53

-null καρκινικά κύτταρα.

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων, επωάστηκαν όλη τη νύκτα, και στη συνέχεια εκτίθενται σε X-ray ή ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων. Μετά την επώαση για περαιτέρω 10 ημέρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν. Το κλάσμα που επιβίωσαν κανονικοποιήθηκε με την αξία των αντίστοιχων ελέγχων. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. C-ion, άνθρακα-ιόντων.

Η

εκτροπές σε p53 αλλάξετε τη λειτουργία της ακτινοβολίας που προκαλείται από τον καρκίνο κυτταρικό θάνατο από απόπτωση σε μιτωτικά καταστροφή

Για να διερευνήσει τους μηχανισμούς που διέπουν την κατάσταση- p53 ανεξάρτητη δραστικότητα θανάτωσης κυττάρου του ακτινοβόλησης με δέσμη ιόντων άνθρακα, οι τρόποι κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από ακτίνες Χ ή ακτινοβολία δέσμης άνθρακα ιόντων αξιολογήθηκαν (Σχ. 2, 3). p53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα ακτινοβολούνται με δόσεις ακτίνων Χ ή άνθρακα-ion δοκάρια που ήταν παρόμοιο με το D

10 για p53

+ /+ κύτταρα (X -ray, 4 Gy? δοκάρια άνθρακα-ιόντων, 1.5 Gy). Η απόπτωση, μιτωτική καταστροφή και γήρανση προσδιορίσθηκαν με την εξέταση των χαρακτηριστικών μορφολογίες των πυρήνων κηλιδώθηκαν με DAPI (Σχήμα 2a-c.) [20] – [23]. Σε p53

+ /+ κύτταρα, η απόπτωση ήταν ο κυρίαρχος τρόπος του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από ακτίνες Χ και άνθρακα-ιόντων ακτινοβολία δέσμης (Σχ. 2δ, στ, 3α). Αντίθετα, το ρ53

– /- κύτταρα ήταν λιγότερο ευαίσθητα σε απόπτωση που προκαλείται από τα δύο είδη ακτινοβολίας (Σχ 2e, g, 3β.). Είναι ενδιαφέρον, στην ρ53

– /- (Τα Σχ. 2G, 3b) κύτταρα, άνθρακα-ion ακτινοβολία δέσμης προκαλούμενη μιτωτική καταστροφή περισσότερο προφανώς από ακτινοβολία ακτίνων-Χ. Μια υψηλότερη δόση ισοδύναμη ακτινοβολίας ακτίνων Χ στο D

10 (6.8 Gy) για p53

– /- κύτταρα που προκαλείται από ένα παρόμοιο επίπεδο μιτωτικής καταστροφής με εκείνη που προκαλείται από ακτινοβόληση με δέσμη άνθρακα-ιόντων σε 1,5 Gy (S2 Σύκο.). Η επαγωγή του γηρασμού δεν ήταν εμφανής σε όλες τις πειραματικές συνθήκες (Εικ. 2). Αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε με δοκιμασίες χρώσης β-γαλακτοσιδάσης γήρανση που σχετίζεται, με την οποία το κλάσμα χρώσης-θετικών κυττάρων ήταν μικρότερη από 2% και για τις δύο κυτταρικές γραμμές εκτέθηκαν σε ακτίνες Χ ή ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η απόπτωση και η μιτωτική καταστροφή είναι το μεγαλύτερο λειτουργία του κυτταρικού θανάτου σε p53

+ /+ κύτταρα και p53

– /- κύτταρα, αντίστοιχα, τόσο μετά από έκθεση σε ακτίνες Χ και ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων, και ότι η ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων προκαλεί μιτωτική καταστροφή πιο αποτελεσματικά από ό, τι η ακτινοβόληση με ακτίνες Χ σε απόπτωση ανθεκτικά ρ53

– /- κύτταρα

κύτταρα εμβολιάζονται σε γυάλινες καλυπτρίδες επωάστηκαν όλη τη νύχτα, εκτεθειμένα (ή όχι.? 0 h) για να ακτίνων-Χ (4 Gy) ή δέσμη άνθρακα-ιόντων (1,5 Gy) ακτινοβολία, και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ. Η απόπτωση, μιτωτική καταστροφή, και γήρανση προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τις χαρακτηριστικές μορφολογίες πυρηνικό (βλέπε «Υλικά και μέθοδοι» για τους ορισμούς). (Α-γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες δείχνουν την πυρηνική μορφολογία των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση (α), μιτωτική καταστροφή (β), ή γήρανση (γ). Οι εικόνες της p53

– /- κύτταρα ελήφθησαν 72 ώρες μετά την ακτινοβόληση με δέσμη άνθρακα-ιόντων. (D, e) Λειτουργία του κυτταρικού θανάτου σε ρ53

+ /+ (δ) και p53

– /- (ε) τα κύτταρα σε 0, 12, 24, 48, 72, 96 και 120 ώρες μετά X- ακτινοβολία ακτίνων. (F, g) Κατάσταση του κυτταρικού θανάτου σε ρ53

+ /+ (f) και p53

– /- (ζ) κύτταρα σε 0, 12, 24, 48, 72, 96 και 120 ώρες μετά άνθρακα ακτινοβόληση με δέσμη ιόντων. IR, ακτινοβολία? C-ιόντων, άνθρακα-ιόν.

Η

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες, επωάστηκαν όλη τη νύκτα, που εκτίθενται σε δέσμες άνθρακα-ιόντων (1.5 Gy), και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ 72 ώρες αργότερα. Η απόπτωση, μιτωτική καταστροφή, και γήρανση προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τις χαρακτηριστικές μορφολογίες πυρηνικό (βλέπε «Υλικά και μέθοδοι» για τους ορισμούς). (Α) ρ53

+ /+ κυττάρων: 12,5%, 0% και 0% των κυττάρων έδειξαν απόπτωση, μιτωτική καταστροφή, και γήρανση, αντίστοιχα. (Β) p53

– /- κύτταρα: 0%, 12,8% και 0% των κυττάρων έδειξε απόπτωση, μιτωτική καταστροφή και τη γήρανση, αντίστοιχα. Τα βέλη στο (α) και (β) υποδεικνύουν κύτταρα που υφίστανται απόπτωση και μιτωτική καταστροφή, αντίστοιχα. Κλίμακα μπαρ, 10 μm.

Η

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το θέμα, εξετάσαμε την κατάσταση του κυτταρικού θανάτου σε πολλές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές με διαφορετική ιδιότητα p53 μετά ακτίνων-Χ ή ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων (Εικ. 4 ). RKO κύτταρα που φέρουν άγριου τύπου ρ53 έδειξε απόπτωση-κυρίαρχο φαινότυπο μετά είτε με ακτίνες Χ ή ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων, ενώ ρ53-null Η1299 και Saos-2 κύτταρα έδειξε μια μιτωτική καταστροφή-κυρίαρχο φαινότυπο. Κατά συνέπεια, η καταστολή της έκφρασης p53 σε BJ-hTERT ινοβλάστες προώθησε την επαγωγή της μιτωτικής καταστροφής κατά ακτίνων-Χ ή ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων (S3 Εικ.). Είναι ενδιαφέρον ότι, LS123 και τα κύτταρα WiDr (που εκφράζουν ρ53 που φιλοξενούν ένα παρανοηματική σε R175H και R273H, αντίστοιχα), έδειξε επίσης μια μιτωτική καταστροφή-κυρίαρχο φαινότυπο (Εικ. 4). Αυτές οι θέσεις μετάλλαξης βρίσκονται εντός του τομέα δέσμευσης DNA της πρωτεΐνης p53, το οποίο παίζει καθοριστικό ρόλο στην μεταγραφική ενεργοποίηση αρκετών γονιδίων στόχων, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που εμπλέκονται στην επαγωγή απόπτωσης [25]. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε έπειτα τη λειτουργία της ακτινοβολίας που προκαλείται από κυτταρικό θάνατο χρησιμοποιώντας μια σειρά από ισογονικών κυττάρων Η1299 σταθερώς εκφράζουν πρωτεΐνες ρ53 φέρουν μεταλλάξεις εσφαλμένου νοήματος στον τομέα δέσμευσης DNA που συχνά παρατηρούνται σε ανθρώπινους καρκίνους (π.χ., R175H, R273H, R249S και R280K ) [25]. Όλες αυτές οι κυτταρικές σειρές έδειξε μια μιτωτική καταστροφή-κυρίαρχο φαινότυπο κατά την ακτινοβολία (Εικ. 5). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η δυσλειτουργία του τομέως ρ53 δέσμευσης DNA αλλάζει τη λειτουργία της ακτινοβολίας που προκαλείται από τον καρκίνο κυτταρικό θάνατο από απόπτωση σε μιτωτικά καταστροφή. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν επίσης ότι ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων ήταν καλύτερη από την ακτινοβόληση με ακτίνες Χ στην επαγωγή μιτωτική καταστροφή σε καρκινικά κύτταρα που φιλοξενούν παρεκκλίνουσα ρ53.

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες, επωάστηκαν όλη τη νύκτα, ακτινοβολείται με ακτίνες Χ ( D

10 δόσης) ή δέσμες άνθρακα-ion (D

10 δόσης), και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ 72 ώρες αργότερα. Η απόπτωση, μιτωτική καταστροφή, και γήρανση προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τις χαρακτηριστικές μορφολογίες πυρηνικό (βλέπε «Υλικά και μέθοδοι» για τους ορισμούς). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. Ap, απόπτωση? MC, μιτωτική καταστροφή? SNS, γήρανση? IR, ακτινοβολία? C-ιόντων, άνθρακα-ion

Η

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες, επωάστηκαν όλη τη νύκτα, ακτινοβολείται με ακτίνες Χ (10,9 Gy, D

10 για ακτίνες Χ?. Ή 3,8 Gy, D

10 για τις δοκούς άνθρακα-ion) ή δέσμες άνθρακα-ιόντων (3,8 Gy, D

10 για τις δοκούς άνθρακα-ion), και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ 72 ώρες αργότερα. Η απόπτωση, μιτωτική καταστροφή, και γήρανση προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τις χαρακτηριστικές μορφολογίες πυρηνικό (βλέπε «Υλικά και μέθοδοι» για τους ορισμούς). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. MC, μιτωτική καταστροφή? C-ion, άνθρακα-ion? IR, ακτινοβολία. Σημειώστε ότι ένα μέρος του ρ53-ηυΙΙ πάνελ Η1299 είναι η ίδια με αυτή που φαίνεται στο Σχ. 4 (αλλά το πλαίσιο είναι πλέον διαφορετική).

Η

Τα κύτταρα απελευθερώνονται από την ακτινοβολία που προκαλείται G2 /M σύλληψη 24 ώρες μετά ακτίνων-Χ ή ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων

Η μιτωτική καταστροφή πιστεύεται ότι συμβαίνει όταν τα κύτταρα να προχωρήσει μέσα από παρεκκλίνουσα μίτωσης με επιδιορθώθηκε βλάβες στο DNA [26]. Ως εκ τούτου, για να διερευνήσουν τον μηχανισμό βασίζεται η επαγωγή της μιτωτικής καταστροφής στο p53-null κύτταρα με ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων, τα αποτελέσματα των ακτίνων Χ και του άνθρακα-ιόντων ακτινοβολία δέσμης σχετικά με τις καταστάσεις κυτταρικού κύκλου p53

+ /+ και p53

– /- HCT116 κύτταρα προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής (Εικ. 6a, b). Όπως αναλύει το κυτταρικό θάνατο, τα κύτταρα ακτινοβολούνται με δόσεις ακτίνων-Χ (4 Gy) ή δέσμες άνθρακα-ιόντων (1,5 Gy). Η επαγωγή της G2 /M σύλληψης που κορυφώθηκε 12 ώρες μετά παρατηρήθηκε ακτινοβολία και στις δύο κυτταρικές σειρές μετά από ακτίνες Χ ή άνθρακα-ιόντων ακτινοβολία δέσμης, είναι πιο εμφανής στην p53

– /- κύτταρα από p53

+ /+ κύτταρα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές εκτέθηκαν σε ακτίνες Χ ή ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων, G2 /M σύλληψης αποδεσμευτεί πλήρως 48 ώρες μετά την ακτινοβόληση.

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 35 mm (a, b) ή σε γυάλινες καλυπτρίδες (γ), επωάστηκαν όλη τη νύκτα, και εκτίθενται (ή όχι? 0 h) για να ακτίνων-Χ (4 Gy) ή δέσμη άνθρακα-ιόντων (1,5 Gy) ακτινοβολία. (A, b) κύτταρα ακτινοβολούνται με ακτίνες Χ (α) ή δέσμες άνθρακα-ιόντων (b) επωάστηκαν για 0, 12, 24, 48, 72, 96 ή 120 ώρες, μονιμοποιήθηκαν με αιθανόλη, βάφονται με ιωδιούχο προπίδιο, και κατάσταση του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Γ) Τα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν με ακτίνες Χ ή ακτίνες άνθρακα-ιόντων, επωάστηκαν για 1 ώρα, και στη συνέχεια υποβάλλεται σε ανοσοχρώση για ρΗ3, ένα ειδικό δείκτη για κύτταρα Μ φάση. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. *

P

& lt? 0,05 και †

P

& lt? 0,01 έναντι των αντίστοιχων ελέγχων. IR, ακτινοβολία? C-ion, άνθρακα-ion

Η

Στη συνέχεια, τα ποσοστά της ρ53

+ /+ και p53

-. /- Κυττάρων στη φάση Μ πριν και μετά το X-ray (4 Gy) ή άνθρακα-ion δοκών (1,5 Gy) ακτινοβολία αξιολογήθηκαν από ανοσοχρώση χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον ρΗ3 (Σχ. 6c) [24]. Περίπου το 2% των μη ακτινοβολημένων p53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα στη φάση Μ. Μία ώρα μετά την ακτινοβόληση με δέσμη ιόντων άνθρακα, τα ποσοστά αυτών των κυττάρων στη φάση Μ είχαν μειωθεί σημαντικά, αν και το ρ53

– /- κύτταρα ήταν λιγότερο ευαίσθητα από ρ53

+ /+ κυττάρων σε ακτινοβολία ακτίνων-Χ. Αξιοσημείωτα, 24 ώρες μετά την ακτινογραφία ή ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων, τα ποσοστά της ρ53

+ /+ και p53

– /- κυττάρων στη φάση Μ ανακτάται στη γραμμή βάσης, υποδηλώνοντας ότι και οι δύο κυτταρικές σειρές επανεκκίνηση μίτωση 24 ώρες μετά την αγωγή.

DNA δίκλωνα σπασίματα που παράγεται από ακτινοβόληση με δέσμη ιόντων άνθρακα δείχνουν πιο αργή κινητική επισκευή από εκείνα που δημιουργούνται από την ακτινοβολία ακτίνων Χ

Τέλος, η κινητική επιδιόρθωση του DNA διπλής -strand διαλείμματα (DSBs), το πιο θανατηφόρο είδος της βλάβης του DNA που δημιουργείται από την ιονίζουσα ακτινοβολία, εξετάστηκαν σε p53

+ /+ και p53

– /- HCT116 κύτταρα [27]. Ακτινοβολημένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανοσοχρώση χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον γH2AX, και οι αριθμοί των εστιών γH2AX ανά κύτταρο στα 15 λεπτά και 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση μετρήθηκαν (Εικ. 7, S1 πίνακα) [24], [28]. Τα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν με μία 2 Gy δόση ακτίνων Χ ή 1 Gy δόση δοκών άνθρακα-ion? σε αυτές τις δόσεις, ο αριθμός των εστιών γH2AX ανά κύτταρο στο χρονικό σημείο ελέγχου (15 λεπτά μετά την ακτινοβόληση) ήταν περίπου 20-30, η οποία ήταν κατάλληλη για την αξιολόγηση [24], [28]. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την ακτινοβόληση με ακτίνες Χ, οι αριθμοί των γH2AX εστιών σε ρ53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα ήταν 24 ± 4,3% και 23 ± 5,3% εκείνων των αντίστοιχων ελέγχων (κατά τη 15 λεπτά χρονικό σημείο), αντίστοιχα (Σχ. 7a, b), υποδεικνύοντας ότι ο μεγάλος αριθμός των DSBs που παράγεται από ακτινοβολία ακτίνων-Χ επιδιορθώθηκαν εντός 24 ωρών. Αντίθετα, 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση με δέσμη άνθρακα-ιόντων, οι αριθμοί των γH2AX εστιών σε ρ53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα ήταν 93 ± 11% και 85 ± 7,3% εκείνων των αντίστοιχων ελέγχων , αντίστοιχα (Σχ. 7α, γ), υποδεικνύοντας ότι οι DSBs που δημιουργούνται από ακτινοβόληση με δέσμη ιόντων άνθρακα δεν επισκευάστηκαν αποτελεσματικά, πιθανώς λόγω της δομικής πολυπλοκότητας των DSB άκρα [29]. Πράγματι, p53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα που βάφονται διπλά θετικά για γH2AX και pH 3 εντοπίστηκαν 24 ώρες μετά την ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων, αποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα που φέρουν ϋδΒδ είχε εισέλθει μίτωση (Εικ. 7δ). Η κατάσταση p53 δεν επηρέασε την κινητική της απώλειας γH2AX εστιών μετά ακτίνων-Χ ή ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ρ53-ηυΙΙ κύτταρα που φιλοξενούν επιδιορθώθηκε DSBs αρχίζει μίτωση 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση με δέσμη ιόντων άνθρακα, που οδηγεί σε μιτωτική καταστροφή.

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες, επωάστηκαν όλη τη νύκτα, που εκτίθενται σε X- ακτίνες (2 Gy) ή δέσμες άνθρακα-ιόντων (1 Gy), επωάστηκαν για επιπλέον 15 λεπτά ή 24 ώρες, και στη συνέχεια υποβάλλεται σε ανοσοχρώση για γH2AX και ρΗ3. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ. (Α) Οι αριθμοί των εστιών γH2AX ανά κύτταρο στα 15 λεπτά ή 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση. Τα αποτελέσματα για κάθε κυτταρική σειρά κανονικοποιήθηκαν με τον αριθμό των εστιών γH2AX στο χρονικό σημείο των 15 λεπτών. Τουλάχιστον 500 κύτταρα μετρήθηκαν ανά πειραματική κατάσταση. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. *

P

& lt? 0,05 έναντι των αντίστοιχων δειγμάτων σε 15 λεπτά. (B, c) Αντιπροσωπευτική μικροσκοπικές εικόνες που δείχνουν πυρήνες εκτέθηκαν σε ακτίνες Χ (β) ή δέσμη άνθρακα-ιόντων (γ) ακτινοβολία, και ανοσοχρώση για γH2AX. Σε κάθε πίνακα, το περίγραμμα του πυρήνα ανιχνεύονται με χρώση ϋΑΡΙ υποδεικνύεται με μία διακεκομμένη γραμμή. (D) Αντιπροσωπευτική μικροσκοπικές εικόνες των πυρήνων που εκτίθενται σε ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων και ανοσοχρώση για γH2AX και ρΗ 3 στις 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση. Τα βέλη δείχνουν διπλό θετικών πυρήνων. C-ion, άνθρακα-ιόντων.

Η

Συζήτηση

Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι η ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων προκαλεί διαφορετικούς τρόπους κυτταρικού θανάτου, σύμφωνα με την κατάσταση της μετάλλαξης του

TP53

. Μετά από δύο ακτίνων Χ και ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων, η απόπτωση ήταν ο κυρίαρχος τρόπος του κυτταρικού θανάτου του p53

+ /+ κύτταρα αλλά όχι p53

– /- κύτταρα. Αξίζει να σημειωθεί ότι το ποσοστό της μιτωτικής εισόδου και η κινητική της επισκευής DSB μετά την ακτινοβολία, η οποία μπορεί να είναι βασικοί παράγοντες που επάγουν μιτωτική καταστροφή, ήταν παρόμοιες σε ρ53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα, ανεξάρτητα από τον τύπο του ακτινοβολία που χρησιμοποιείται. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η απόπτωση παίζει πρωταρχικό ρόλο στο θάνατο των καρκινικών κυττάρων που προκαλείται από την ακτινοβολία στην παρουσία του ρ53. Εν απουσία ρ53, τα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν αντίσταση σε επαγωγή απόπτωσης και μιτωτική καταστροφή παρατηρήθηκε μετά από δύο ακτίνων-Χ και του άνθρακα-ion ακτινοβολία δέσμης. Αυτό το εύρημα είναι πιθανή εξηγείται από τον περιορισμό της G2 /M σημείο ελέγχου μετά την ακτινοβόληση. Η ενεργοποίηση αυτού του σημείου ελέγχου επιτρέπει την αποκατάσταση των κατεστραμμένων DNA πριν αυτό μεταβιβάζεται σε θυγατρικά κύτταρα και δρα ως εμπόδιο για την πρόληψη της πρόωρης έναρξης μίτωσης [30]. Ωστόσο, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει τον περιορισμό της G2 /M σημείο ελέγχου μετά IR? G2 /M σημείο ελέγχου απελευθερώνεται όταν ο αριθμός των DSBs καθίσταται χαμηλότερη από ~ 10-20, που ακολουθείται από μιτωτική είσοδο [24], [31]. Μετά την απελευθέρωση G2 /M σημείο ελέγχου, τα κύτταρα που φιλοξενούν 10-20 ϋδΒδ είναι σε θέση να ολοκληρώσει την μιτωτική εκδήλωση και να εισέλθουν στην φάση G1 [32], [33]. επισκευή DSB ρυθμίζεται μειωτικά κατά τη φάση Μ? Ως εκ τούτου, αυτή η βλάβη μπορεί να επισκευαστεί στο επόμενο κυτταρικό κύκλο, αν και η διαδικασία επιδιόρθωσης στα θυγατρικά κύτταρα παραμένει να διευκρινιστεί [34]. Μια άλλη πιθανή αιτία για την αποτελεσματική επαγωγή της μιτωτικής καταστροφής στο p53

– /- κυττάρων είναι η υψηλότερη ροπή αυτών των κυττάρων να σταματήσει στη φάση G2 /M μετά την ακτινοβολία από το p53 + /+ κυττάρων

. Αυτή η συσσώρευση φάση G2 /M είναι το αποτέλεσμα ενός ελαττώματος στην οδό σηματοδότησης ρ53-ρ21 που εξασθενίζει G1 σύλληψης μετά την ακτινοβόληση [16]. Αυτή η ιδιότητα του p53-ανεπαρκή τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να αυξήσει την πιθανότητα ακτινοβολημένων κυττάρων που φιλοξενούν επιδιορθώθηκε ϋδΒδ είσοδο μίτωση, που οδηγούν στην ενίσχυση της μιτωτικής καταστροφής.

Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι τόσο η έλλειψη p53 και εσφαλμένου νοήματος μεταλλάξεις στο p53 συμβάλλει στην μετάβαση από την απόπτωση σε μιτωτική καταστροφή. Συνολικά, το 75% των μεταλλάξεων ρ53 προσδιορίζονται σε ανθρώπινους καρκίνους είναι απλές μεταλλάξεις εσφαλμένου νοήματος. Οι περισσότερες μεταλλάξεις εσφαλμένου νοήματος, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που εξετάστηκαν στην παρούσα μελέτη, που βρίσκεται μέσα στην περιοχή ρ53 δέσμευσης DNA, η οποία διαδραματίζει έναν βασικό ρόλο στην μεταγραφική ενεργοποίηση πολλών γονιδίων στόχων, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που προκαλούν απόπτωση [25]. Οι περισσότερες μεταλλαγμένες πρωτεΐνες ρ53 έχουν ένα κυρίαρχο-αρνητικό αποτέλεσμα, που οδηγεί σε δυσλειτουργία των υπολοίπων φυσιολογικών πρωτεϊνών ρ53. Ως εκ τούτου, είναι λογικό ότι, μαζί με την έλλειψη του ρ53, οι μεταλλάξεις εσφαλμένου νοήματος στον τομέα ρ53 σύνδεσης DNA συμβάλλουν επίσης στην απόπτωση ανθεκτικό φαινότυπο διακόπτοντας την ικανότητα των φυσιολογικών πρωτεϊνών ρ53 να μεταγραφικά ενεργοποιούν γονίδια σχετίζονται με την απόπτωση? Αυτό μπορεί να καταστήσει ακτινοβολημένα κύτταρα που φιλοξενούν επιδιορθώθηκε ϋδΒδ πιο επιρρεπή σε μιτωτική καταστροφή. Παρ ‘όλα αυτά, αξίζει να σημειωθεί περιορισμό μελέτη σε αυτό το σημείο: δεν ήμασταν σε θέση να αποδείξει κύτταρα Η1299 που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53 (είτε παροδικά είτε σταθερά)? Ως εκ τούτου, ήταν αδύνατον η σύγκριση μεταξύ άγριου τύπου ρ53 και ρ53 μεταλλαγμένη. Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να συγκρίνει την κατάσταση της ακτινοβολίας που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο σε ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές που φέρουν άγριου τύπου, μεταλλαγμένα, και null-p53.

Αξίζει να σημειωθεί ότι τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ επιδεικνύουν αποτελεσματική επαγωγή της μιτωτικής καταστροφής από άνθρακα ακτινοβόληση με δέσμη ιόντων σε p53-null και p53-μεταλλαγμένα κύτταρα. Στην πραγματικότητα, σε όλες τις γραμμές, ρ53-ηυΙΙ και p53-μεταλλαγμένα κύτταρα που δοκιμάστηκαν, η δόση που απαιτείται για την επαγωγή ορισμένο επίπεδο μιτωτικής καταστροφής ήταν προφανώς χαμηλότερη σε δέσμες άνθρακα ιόντων σε σχέση με ακτίνες Χ. Αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να εξηγηθεί από τις δυσκολίες που συνδέονται με την επισκευή των DSBs που παράγεται από ακτινοβόληση με δέσμη ιόντων άνθρακα, τα οποία διατηρούν πιο πολύπλοκες δομές του κατεστραμμένου DNA άκρων από αυτά που δημιουργούνται από την ακτινοβολία ακτίνων-Χ [35]. Αναποτελεσματική DNA αποκατάστασης των ζημιών που προκλήθηκαν από την πολυπλοκότητα των άκρων DSB μπορεί να αποτελούν τη βάση της αποτελεσματικής κύτταρο-θανάτωση επίδραση της ακτινοβολίας δέσμης άνθρακα-ιόντων σε καρκινικά κύτταρα που φιλοξενούν εκτροπές p53.

Τα αποτελέσματα που περιγράφονται εδώ είναι εν μέρει αντιφατικές με εκείνα των προηγούμενων μελέτες που εξέτασαν την DDR μετά την ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων του p53-μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα. Αν και μερικές μελέτες παρατηρήθηκε αποτελεσματική απόπτωση (S2 πίνακα) [12] – [15], θα πρέπει να σημειωθεί ότι αυτός ο τρόπος θανάτου κυττάρου διεγέρθηκε αποτελεσματικά μόνο σε LET τιμές μεγαλύτερες από 70 keV /μm. Αντίθετα, η μέση τιμή LET στο κέντρο της κλινικά χρησιμοποιείται απλωμένη αιχμή Bragg, όπως χρησιμοποιείται εδώ, είναι περίπου 50 keV /μm. Επιπλέον, σε αντίθεση με τα αποτελέσματα που περιγράφονται εδώ, η επαγωγή γήρανση και παρατεταμένη (περισσότερο από 3 ημέρες) G2 /M σύλληψη παρατηρήθηκε επίσης σε προηγούμενες μελέτες με τη χρησιμοποίηση ακτινοβόλησης με δέσμη άνθρακα ιόντων με υψηλές τιμές LET [12], [36] . Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η DDR διαφέρει ανάλογα με την αξία LET της ακτινοβόλησης με δέσμη ιόντων άνθρακα που χρησιμοποιείται. Πρόσθετες

in vitro

και

in vivo είναι

μελέτες μίας ποικιλίας κυτταρικών σειρών που απαιτείται για την επικύρωση των θεραπευτικών επιδράσεων της ακτινοβολίας δέσμης ιόντων άνθρακα στο LET χρησιμοποιηθεί σε κλινικές ρυθμίσεις.

Εν ολίγοις, αυτή η περιεκτική ανάλυση της DDR σε ακτινοβολημένα ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές αποδεικνύει ότι ακτίνων Χ ακτινοβολίας ανθεκτικά p53-null καρκινικά κύτταρα είναι ευαίσθητα στην ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων, το οποίο προκαλεί αποτελεσματικά μιτωτική καταστροφή (Εικ. 8). Η επαγωγή της μιτωτικής καταστροφής στην απόπτωση ανθεκτικά όγκοι μπορεί να είναι ένα σημαντικό βιολογικό πλεονέκτημα της ακτινοθεραπείας άνθρακα-ion πάνω ακτινοθεραπεία με ακτίνες Χ. Πρόσθετες μελέτες που χρησιμοποιούν ζωικά μοντέλα ή κλινικά δείγματα που απαιτούνται για την περαιτέρω διαλεύκανση του ζητήματος αυτού.

C-ιόντων, άνθρακα-ιόντων.

Η

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ.

Ιδιότητες του p53

+ /+ και p53

– /- κύτταρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115121.s001

(PDF)

S2 Εικ.

Οι τρόποι του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από την ακτινοβολία ακτίνων Χ για το D

10 HCT116 p53

– /- κύτταρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115121.s002

( PDF)

S3 Εικ.

Οι τρόποι του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από ακτίνες Χ ή ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων στο BJ hTERT-WT ή -shp53 κύτταρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115121.s003

(PDF)

S1 πίνακα. .

Ο αριθμός των γH2AX εστιών ανά κύτταρο μετά την ακτινοβόληση

doi: 10.1371 /journal.pone.0115121.s004

(PDF)

S2 πίνακα.

LET-εξάρτηση της αποτελεσματικότητας της επαγωγής απόπτωσης με ακτινοβολία δέσμης άνθρακα-ιόντων σε p53-μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115121.s005

(PDF)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Tetsushi Sadakata, Δρ Kohta Torikai, και ο Δρ Mayumi Komachi (Πανεπιστημίου Γκούνμα) για την τεχνική βοήθεια. Ευχαριστούμε τον Δρ Volgelstein (Johns Hopkins University) για την παροχή κυτταρικών σειρών.