Αφηρημένο

Κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας, της αντίστασης στα φάρμακα προκαλείται από αυτοφαγία παραμένει μια μεγάλη πρόκληση για την επιτυχή θεραπεία των ασθενών με καρκίνο. Ο σκοπός αυτής της μελέτης είναι να δείξει ότι η ulinastatin (UTI), ένα αναστολέα τρυψίνης, θα μπορούσε να μειώσει την αντίσταση του καρκίνου του ήπατος κυττάρων σε χημειοθεραπευτικούς epirubicin παράγοντα (ΕΡΙ). Πετύχαμε αυτό το συμπέρασμα αναλύοντας την επίδραση της ΕΡΙ μόνη της ή ουρολοίμωξη συν EPI για SMMC-7721 και MHCC-ΠΝ 3 καρκίνο του ήπατος κύτταρα. Δημιουργήσαμε επίσης μια EPI-ανθεκτικό καρκίνο του ήπατος κυτταρική σειρά (κύτταρα MHCC-LM3er), και διαπίστωσε ότι ουρολοίμωξη μπορεί να ευαισθητοποιήσει τα κύτταρα LM3er να EPI. Αυτοφαγία συνήθως λειτουργεί για την προστασία των καρκινικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας. Η μελέτη μας έδειξε ότι UTI ανέστειλε την αυτοφαγία επάγεται από ΕΡΙ σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος, η οποία προώθησε την απόπτωση, και ως εκ τούτου, μείωσε την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων σε ΕΡΙ. Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι η UTI μεσολάβηση αναστολή επί autophagy επιτεύχθηκε με αναστολή μονοπάτι πυρηνικής μεταγραφικός παράγοντας παράγοντας-κΒ (NF-κΒ) σηματοδότησης. Την επαλήθευση των αποτελεσμάτων μας in vivo, εμείς εγχέεται MHCC-LM3 ηπατικά καρκινικά κύτταρα ή ΕΡΙ-ανθεκτικά κύτταρα LM3er σε ποντικούς, και διαπίστωσαν ότι ΕΡΙ θα μπορούσε να αναστείλει αποτελεσματικά μόνο την ανάπτυξη των όγκων σε ποντικούς κύτταρο-εγχυθεί MHCC-LM3, αλλά όχι σε LM3er κύτταρο -εγχυθέντα ποντίκια. Ωστόσο, όταν UTI χορηγήθηκε επίσης, η ανάπτυξη του όγκου ανεστάλη στα ποντίκια των κυττάρων-εγχυθεί MHCC-LM3er επίσης. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ουρολοίμωξη μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με αντικαρκινικά φάρμακα, όπως η EPI, να βελτιώσει τα αποτελέσματα της θεραπείας του καρκίνου

Παράθεση:. Song Β, Bian Q, Shao CH, Li G, Liu AA , Jing W, et al. (2015) Ulinastatin Μειώνει την αντίσταση των κυττάρων του καρκίνου του ήπατος σε Epirubicin από ανασταλτικός Autophagy. PLoS ONE 10 (3): e0120694. doi: 10.1371 /journal.pone.0120694

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Ying-Jan Wang, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Cheng Kung, Ταϊβάν

Ελήφθη: 27 Σεπ 2014? Αποδεκτές: 26 Γενάρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 27 Μαρτίου 2015

Copyright: © 2015 Song et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έλαβαν καμία ειδική χρηματοδότηση για το έργο αυτό

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

η αυτοφαγία αποτελεί βασική κυτταρική διαδικασία που είναι υπεύθυνη για την αποδόμηση των κατεστραμμένων και δυσλειτουργική κυτταρικά οργανίδια και τα συγκεντρωτικά στοιχεία της πρωτεΐνης. Αυτή είναι μια διαδικασία συντηρημένη μεταξύ ζυμομυκήτων, φυτών, και ζωικά κύτταρα και είναι σημαντικό για την παροχή πηγών ενέργειας σε απόκριση σε θρεπτικό στρες και σε κρίσιμες στιγμές στην ανάπτυξη [1]. Σε γενικές γραμμές, αυτοφαγία είναι ένας μηχανισμός καταστολής όγκων στα φυσιολογικά κύτταρα και κατά την πρώιμη ογκογόνο μετασχηματισμό, αλλά μπορεί επίσης να ενεργεί ως ένα κρίσιμο μονοπάτι επιβίωσης για καθιερωμένους όγκους. Αναπτυσσόμενες και αναπτυγμένες όγκοι έχουν υψηλή μεταβολική ζήτηση λόγω της αυξημένης διάδοσης και υψηλής αποπτωτικών όρια. Σε αυτήν την περίπτωση, autophagy χρησιμεύει ως μηχανισμός επιβίωσης σε πολλά κύτταρα όγκου, επιτρέποντας τους να διαφύγουν αποπτωτικό θάνατο σε απόκριση μεταβολικών κρίσεων. Πολλά αντικαρκινικά φάρμακα που αποσκοπούν στην χημικά μιμούνται θρεπτικό στέρηση και την πείνα, αλλά αυτοφαγία είναι συχνά πάνω ρυθμισμένα σε απόκριση προς την αγωγή με την εξάλειψη του κατεστραμμένου οργανίδιο να ξεφύγει το θάνατο, και ως εκ τούτου δημιουργεί θεραπευτική αντίσταση [2-4]. Έχει δειχθεί ότι με την αύξηση της παραγωγής δραστικών ειδών οξυγόνου στα μιτοχόνδρια, χημειοθεραπευτικούς παράγοντες όπως είναι οι αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης [5] και σισπλατίνη [6] επάγουν αυτοφαγία, και σε πολλές περιπτώσεις, η αυτοφαγικά απάντηση σε αυτές τις θεραπείες είναι κυτταροπροστατευτικές [ ,,,0],5]. Πρόσφατα, έχει προταθεί ότι με το συνδυασμό με παράγοντες που διαταράσσουν αυτοφαγία, η αποτελεσματικότητα του αντικαρκινικού φαρμάκου μπορεί να ενισχυθεί [5].

Ulinastatin (UTI) είναι μια γλυκοπρωτεΐνη που περιέχει γλυκοζαμινογλυκάνες και Ν-συνδεδεμένων γλυκανών . Αναστέλλει τις δραστηριότητες ενός ευρέος φάσματος των ενζύμων συμπεριλαμβανομένων θρυψίνη, χυμο-θρυψίνη, καλλικρεΐνη, πλασμίνη, κ.λ.π. [7]. Κλινικά, ουρολοίμωξη χρησιμοποιείται κυρίως για τη θεραπεία της οξείας παγκρεατίτιδας, χρόνια υποτροπιάζουσα παγκρεατίτιδα και οξεία κυκλοφορική ανεπάρκεια [8, 9]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι UTI αναστέλλει την ανάπτυξη πολλών τύπων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων γαστρεντερικού καρκίνου και του καρκίνου του μαστού, και μπορεί να επάγουν κυτταρικό θάνατο αν χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με άλλους θεραπευτικούς παράγοντες [10-12]. Σε προκαταρκτικές μελέτες μας, ουρολοίμωξη βρέθηκε να έχει ανασταλτική επίδραση στην αυτοφαγία. Από autophagy παίζει σημαντικό ρόλο στην αντίσταση του φαρμάκου σε πολλούς τύπους καρκινικών κυττάρων [13, 14], μπορούμε επομένως υποθέσαμε ότι UTI θα μπορούσε να μειώσει την αντίσταση του φαρμάκου σε καρκινικά κύτταρα με αναστολή αυτοφαγία.

Η epirubicin (EPI) είναι μια ανθρακυκλίνη φάρμακο που χρησιμοποιείται ευρέως στη χημειοθεραπεία του καρκίνου [15]. Επιτυγχάνει την αγωγή με επαγωγή απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, τουλάχιστον σε MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού, ΕΡΙ επάγει επίσης autophagy που προστατεύει τα καρκινικά κύτταρα προκαλώντας φαρμακευτικής αντίστασης [15]. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η επίδραση της ουρολοίμωξης στις αυτοφαγία που προκαλούνται από ΕΡΙ σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος. Δημιουργήσαμε ένα ΕΡΙ-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου του ήπατος (κύτταρα MHCC-LM3er) και μελέτησε τη ρύθμιση των αυτοφαγία σε αυτά τα κύτταρα. Επίσης μελετήσαμε την επίδραση της ουρολοίμωξης στις αυτοφαγία και αντοχή στα φάρμακα σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα, και επαλήθευσε τα αποτελέσματα in vivo. Έχει βρεθεί ότι UTI καταστέλλεται autophagy επάγεται από ΕΡΙ, η οποία επιτεύχθηκε μέσω της αναστολής της οδού πυρηνικό μεταγραφικό παράγοντα παράγοντα-κΒ (NF-κΒ) σηματοδότησης. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι UTI μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένας θεραπευτικός παράγοντας για να βοηθήσει τη θεραπεία του καρκίνου με τη μείωση της αντίστασης στα φάρμακα σε καρκινικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Antibody, κυτταρικές γραμμές, πλασμίδια και άλλα υλικά

Ποντίκια αντι ACTB, κουνελιού αντι ρ-ΙΚΚα, ρ-Nemo αντισώματα (Santa Cruz, USA) χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1: 200. αντι LC3 κουνελιού, αντι ΙΚΚα ποντικού, αντι Nemo ποντικού και αντι PARP κουνελιού, ATG5, ATG7, SQSTM1, αντισώματα BECN1 (Cell Signaling, USA) χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1: 1000. Το σύστημα επισήμανσης HRP-σημασμένο κουνελιού αντι EnVision ποντίκι ήταν από τη Σαγκάη Changdao Biotech Inc.

κυτταρικές σειρές καρκίνου του ήπατος SMMC-7721 και MHCC-ΠΝ 3, και τα φυσιολογικά κύτταρα του ήπατος ήταν δώρα από την Δεύτερη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Σαγκάη. PcDNA3.1-GFP-LC3 αποκτήθηκε από την Ανατολική ήπατος και Χειρουργικής Νοσοκομείο, Δεύτερη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Κίνα. Οι καρκινικές κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη είχαν αγοραστεί από την Cell Bank of Type Culture Collection της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών, Σαγκάη Ινστιτούτο Κυτταρικής Βιολογίας, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών, όπου είχαν χαρακτηρίζεται από την ανίχνευση των κυττάρων ζωτικότητα, DNA-δακτυλικών αποτυπωμάτων, την ανίχνευση ισοένζυμο και ανίχνευση του μυκοπλάσματος. Αυτές οι κυτταρικές σειρές αμέσως επεκτάθηκε και καταψύχονται, έτσι ώστε να μπορούν να επανεκκίνηση κάθε 3 έως 4 μήνες από ένα κατεψυγμένο φιαλίδιο από την ίδια παρτίδα των κυττάρων.

EPI (Ανατολική ήπατος και Χειρουργικής Νοσοκομείο, Δεύτερη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 2,5 μΜ. Ουρολοίμωξη (Techpool Bio-Pharma, Guangdong, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 1000 U /mL. Διθειοκαρβαμιδική πυρρολιδίνη (PDTC) (Beyotime Inc., Σαγκάη, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 10 μΜ. Η χλωροκίνη (CQ, 10 μΜ) και 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ, 10 mM) (Sigma-Aldrich, USA) χρησιμοποιήθηκαν για την αναστολή της αυτοφαγία. Τα ποντίκια διατηρήθηκαν και φροντίζονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές πανεπιστήμιο και πρωτόκολλα Χρήση των ζώων εγκρίθηκαν από τα Συμβούλια Δεοντολογίας της Ανατολικής ήπατος και Χειρουργικής Νοσοκομείο.

Cell Culture, επιμόλυνση, Προσδιορισμός ανάπτυξη των κυττάρων και την παραγωγή ανθεκτικών στα φάρμακα MHCC-ΠΝ 3 Κυτταρική Γραμμή

Όλα τα καρκινικά κύτταρα του ήπατος καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με 10% FBS στους 37 ° C σε 7%

2 θερμοκοιτίδα CO, και επιμολύνθηκαν με Lipo2000 (Genechem Inc., Κορέα) στη συμβολή του 60-70%. Η ανάπτυξη των κυττάρων προσδιορίστηκε με ένα κιτ MTS (Promega, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Drug-ανθεκτική κυτταρική γραμμή MHCC-LM3 δημιουργήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Εν συντομία, MHCC-LM3 κύτταρα σπάρθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας και αφέθηκαν να φθάσουν ~ 80% συρροή σε φρέσκο ​​μέσο πριν κατεργαστεί με ΕΡΙ. Η δόση έναρξης του ΕΡΙ ήταν 0,05 μΜ, και κάθε ακόλουθη δόση ήταν 25-50% υψηλότερη σε συγκέντρωση από ό, τι την προηγούμενη δόση μέχρις ότου τα κύτταρα ήταν σταθερά σε πολλαπλασιασμό χωρίς σημαντική κυτταρικού θανάτου.

σε πραγματικό χρόνο PCR

Ολικό RNA εξήχθη με RNeasy Mini κιτ και QIAshredder (Qiagen), και τον πρώτο κλώνο cDNA συντέθηκε με First-Strand cDNA Synthesis Kit (Abigen Biotechnology Co. Ltd.) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με LightCycler 1.5 (Roche), ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθοι εκκινητές: για Beclin1: 5′-GGCTGAGGGATGGAAGGGTCTAAG-3 ‘και 5′-GTTTCGCCTGGGCTGTGGTAAGTA-3′? για Atg5: 5’-ATGACAGATGACAAAGATG-3 ‘και 5′-CTCATAACCTTCTGAAAGTG-3′? επί g7: 5’-ATGGGGGACCCTGGACTGG-3 ‘και 5′-GCAGAGTCACCATTGTAG-3′? για Ρ62: 5’-ACTGATGGCTGTAACGGTCTA-3 ‘και 5′-GGAAGCAGATGGCACAGAGG-3′? και για GAPDH:. 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘και 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’

Προσδιορισμός απόπτωσης

κύτταρα πλένονται με ψυχρό PBS επανα-εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης (Beyotime Inc. , Σαγκάη, Κίνα) και, στη συνέχεια, συμπληρωμένο με 2 μΐ αννεξίνης-ν-ΡΙΤΟ (20 μg /ml) πριν να αναλύονται με κυτταρομετρία ροής.

Autophagy Δοκιμασίες

Τα κύτταρα σε 70-80% συρροή επιμολύνθηκαν με pcDNA3.1-GFP-LC3 με Lipo2000. Τα κύτταρα στη συνέχεια παρατηρήθηκε κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού και τα κύτταρα με τουλάχιστον 3 πράσινες κουκκίδες θεωρήθηκαν κύτταρα αυτοφαγικά. Το ποσοστό των αυτοφαγία = αυτοφαγικά κύτταρα /σύνολο κυττάρων χ 100%. Για παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS σφαιροποιήθηκαν και το κυτταρικό σφαιρίδιο καθορίστηκε σε 2,5% γλουταρική διαλδεΰδη και 1% οσμικό οξύ για 2 ώρες. Μετά την πλύση, το σφαιρίδιο ήταν αφυδατωμένο και ενσωματωμένα σε εποξική ρητίνη. Οι υπερ-λεπτές τομές (45 nm) βάφτηκαν με οξικό μόλυβδο, και οι τομές παρατηρήθηκαν υπό JEM-2000EX ηλεκτρονικό μικροσκόπιο [16]. Για την παρακολούθηση αυτοφαγικά ροή, το δίδυμο mRFP-GFP-LC3 κατασκεύασμα αδενοϊό που λαμβάνεται από Hanbio Inc (Shanghai, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Η εμφάνισε πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) και κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (RRP) επικαλείται διαφορετική ευαισθησία του pH για την παρακολούθηση της εξέλιξης από την αυτοφαγικά ροή. Εν συντομία, το κατασκεύασμα mRFP-GFP-LC3 εκμεταλλεύτηκε την διαφορά ρΗ μεταξύ του όξινου autolysosome και του ουδέτερου autophagosome να παρακολουθεί την πρόοδο από την autophagosome να autolysosome χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία [17].

ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια

Άντρας γυμνά ποντίκια (ηλικίας 4-6 εβδομάδων και 15-20 g σε βάρος, που αγοράζονται από το Ινστιτούτο υλικών Ιατρική της Σαγκάης, κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών) διατηρήθηκαν στους 25 ~ 27 ° C με 45 ~ 50% υγρασία . Γυμνά ποντίκια διατηρήθηκαν και φροντίζονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές πανεπιστήμιο και πρωτόκολλα Χρήση των ζώων εγκρίθηκαν από τα Συμβούλια Δεοντολογίας της Ανατολικής ήπατος και Χειρουργικής Νοσοκομείο. κύτταρα MHCC-LM3 και MHCC-LM3er κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο συλλέχθηκαν και επανα-αιωρήθηκαν σε PBS σε 5 × 10

6 κύτταρα /0,2 ml PBS. Για κάθε ποντικό, 200 μΙ του κυτταρικού εναιωρήματος εγχύθηκε κάτω από το δέρμα στο δεξί ώμο. ΕΡΙ (5mg /kg) και UTI (20000 /ποντικό) εγχύθηκαν εντός του όγκου κάθε 3 days.30 ημέρες αργότερα οι ποντικοί θανατώθηκαν για περαιτέρω έρευνα. Τα μεγέθη των όγκων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο V = ab

2/2 (α: μεγαλύτερη διάμετρος του όγκου, β: μικρότερη διάμετρο)

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

ουρολοίμωξη Αναστέλλει Autophagy Induced. με EPI

EPI έχει αναφερθεί να προκαλεί αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα του μαστού και προκαλεί ανθεκτικότητα στα φάρμακα [15]. Για Verity αν έχει την παρόμοια επίδραση στον καρκίνο του ήπατος κύτταρα, που αντιμετωπίζονται SMMC-7721 κύτταρα με EPI σε διάφορες συγκεντρώσεις για να προσδιοριστεί το εύρος που ΕΡΙ θα μπορούσε να προκαλέσει αποτελεσματικά αυτοφαγία [15, 18]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, αυτοφαγία αυξήθηκε σε ΕΡΙ εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Με βάση αυτό το αποτέλεσμα, επιλέξαμε μια μέτρια συγκέντρωση 2,5 μΜ για τις επόμενες μελέτες. Στη συνέχεια, ελέγξαμε ότι αν ΕΡΙ που προκαλείται από αυτοφαγία σε άλλα καρκινικά κύτταρα του ήπατος. EPI θα μπορούσε να ενισχύσει σημαντικά την αυτοφαγία στο SMMC-7721, Huh-7 και κύτταρα HCC-ΠΝ 3 και ήπια στα κύτταρα 97H (Σχήμα 1Β). Έχει δειχθεί ότι CQ θα μπορούσε να αναστείλει την έγχυση του αυτοφαγοσώματα και λυσοσώματα, με αποτέλεσμα τη συσσώρευση του αυτοφαγοσώματα και έκφραση LC3-ΙΙ. Εν τω μεταξύ, 3-ΜΑ αναστέλλει τάξης Ι καθώς και PtdIns3Ks κατηγορίας III, η οποία είναι απαραίτητη για το σχηματισμό αυτοφαγοσώματα [16]. Με τα δύο αναστολείς αυτοφαγία, που επικυρώνεται ότι η EPI θα μπορούσε να ενισχύσει την όλη διαδικασία αυτοφαγία, συμπεριλαμβανομένων αυτοφαγοσώματα και autolysosomes σχηματισμό (Σχήμα 1C). Στη συνέχεια, θα ήθελα να ξέρω αν ο ΣΕΠ που προκαλείται από αυτοφαγία θα μπορούσε να ανασταλεί από ουρολοίμωξη. Για το σκοπό αυτό, υποβάλλαμε σε αγωγή SMMC-7721 και MHCC-LM3 κυττάρων με ΕΡΙ ή ΕΡΙ + UTI, η αύξηση του LC3-ΙΙ και μείωση του SQSTM1 ήταν σημαντικά αναστέλλεται με κατεργασία ΕΡΙ + UTI, υποδηλώνοντας ότι η ΕΡΙ-επαγόμενη autophagy ανεστάλη από η προσθήκη UTI (Εικ 1D). Το αποτέλεσμα αυτό υποστηρίζεται περαιτέρω από την παρατήρηση ότι η ATG7, ATG5 και BECN1 εκφράσεις μειώθηκε και η έκφραση SQSTM1 αυξήθηκε τόσο σε επίπεδο mRNA (Σχήμα 1 Ε) και το επίπεδο πρωτεΐνης (Εικ 1 F) σε κύτταρα υπό θεραπεία με ΕΡΙ + UTI σύγκριση με τα κύτταρα που είναι αντιμετωπίζονται με EPI μόνο. Στα κύτταρα επιμολυσμένα με pcDNA3.1-GFP-LC3, η έκφραση του GFP-LC3 (πράσινες κουκκίδες) μειώθηκαν επίσης σημαντικά στα κύτταρα που υποβάλλονται σε θεραπεία με ΕΡΙ + UTI συγκρίνοντας με ότι στα κύτταρα που υποβάλλονται σε θεραπεία με ΕΡΙ μόνο (Σχ 1G ). Επιπλέον, σε σύγκριση με τα κύτταρα που υποβάλλονται σε θεραπεία με ΕΡΙ, η ποσότητα του αυτοφαγικά κυστιδίων σε κύτταρα που υποβάλλονται σε θεραπεία με ΕΡΙ + UTI μειώθηκε επίσης σημαντικά, όπως παρατηρείται υπό ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Εικ 1 Η). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η λειτουργία της ουρολοίμωξης στις αυτοφαγικά ροή, ελέγχουμε τον αριθμό των αυτοφαγοσώματα και autolysosomes στα κύτταρα MHCC-ΠΝ 3 θεραπεία είτε με ΕΡΙ ή ΕΡΙ + ουρολοιμώξεις, λοιμώξεις του ουροποιητικού συστήματος θα μπορούσε να μειώσει σημαντικά το autophgic ροής (Εικ 1Ι). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι UTI αναστέλλει ΕΡΙ που προκαλείται από αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα του ήπατος.

(Α) Η έκφραση της LC3-ΙΙ ανιχνεύθηκε σε κυτταρολύματα SMMC 7721-κύτταρα επεξεργασμένα με διαφορετικές δόσεις του ΕΡΙ. (Β) Το επίπεδο LC3 ανιχνεύτηκε σε διάφορα καρκίνο του ήπατος κύτταρα κατεργασμένα με ΕΡΙ (2,5 μΜ) ή όχι για 24 ώρες. (C) κηλίδα Western έδειξε το επίπεδο του LC3-ΙΙ SMMC 7721-κύτταρα κατεργασμένα με ΕΡΙ (2,5 μΜ) με /χωρίς CQ (10 μΜ) /3-ΜΑ (10 mM) σε διαφορετικά χρονικά σημεία. (Δ) Ενδείκνυται μόρια ανιχνεύθηκαν με ανοσοστυπώματα σε SMMC-7721 και τα κύτταρα MHCC-ΠΝ 3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με ΣΕΠ /EPI + ουρολοιμώξεων για ενδεδειγμένους χρόνους. (Ε) σε πραγματικό χρόνο PCR δείχνει τα επίπεδα mRNAs των γονιδίων αυτοφαγία που σχετίζονται με MHCC-ΠΝ 3 και SMMC-7721 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ΕΡΙ ή ΕΡΙ + ουρολοίμωξη. (F) στύπωμα Western δείχνει τα επίπεδα πρωτεΐνης των γονιδίων που σχετίζονται με αυτοφαγία σε MHCC-LM3 και SMMC-7721 κύτταρα κατεργασμένα με ΕΡΙ /ΕΡΙ + UTI για 24 ώρες. (G) EPI /ΕΡΙ + UTI προστέθηκαν σε κύτταρα MHCC-LM3 για 24 ώρες μετά την επιμόλυνση GFP-LC3. Άνω πάνελ, χρώση GFP-LC3? κάτω πίνακα, γράφημα δείχνουν το κλάσμα του αυτοφαγικά κυττάρων. (H) Electron μικρογραφία της αυτοφαγικά κυστιδίων στα κύτταρα MHCC-ΠΝ 3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με EPI + EPI + ουρολοίμωξη. Οι διευρυμένη εικόνες υψηλής ανάλυσης των τετραγωνικών περιοχών έδειξαν. (Ι) κύτταρα MHCC-ΠΝ 3 μολυνθεί με GFP-mRFP-LC3 αδενοϊό για 24 ώρες, στη συνέχεια κατεργάζεται withEPI /ΣΕΠ + ουρολοίμωξη. Εκπρόσωπος εικόνες και γραφήματα έχουν δείξει. Το πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές. (* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01).

Η

ουρολοίμωξη Προωθεί απόπτωση που προκαλείται από EPI

Ως ένα φάρμακο χημειοθεραπείας, ΣΕΠ εξαλείφει τα καρκινικά κύτταρα από επαγωγή της απόπτωσης [19]. Δεδομένου ότι έχουμε δείξει ότι η ουρολοίμωξη αναστέλλει αυτοφαγία που προκαλούνται από ΕΡΙ, υποψιαζόμαστε ότι ουρολοίμωξη μπορεί επίσης να προωθήσει την απόπτωση καρκίνου σε αυτά τα κύτταρα. Για να μάθετε αν ουρολοίμωξη έχει καμία επίδραση στην απόπτωση που προκαλείται από ΣΕΠ, πρέπει πρώτα ελεγχθεί αν ο συνδυασμός των ΣΕΠ και ουρολοίμωξη μπορεί να προκαλέσει τοξική επίδραση στην κανονική ηπατικών κυττάρων. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην επιβίωση μεταξύ ποσοστών ομάδα ΕΡΙ και ομάδα ΕΡΙ + UTI, γεγονός που υποδηλώνει ότι EPI + UTI δεν θα μπορούσε να προκαλέσει περισσότερο κυτταρικό θάνατο σε φυσιολογικά ηπατικά κύτταρα. Στη συνέχεια, εξετάσαμε το ποσό των SMMC-7721 και MHCC-ΠΝ 3 καρκίνο του ήπατος κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ΕΡΙ ή ΕΡΙ + ουρολοιμώξεις, και διαπίστωσε ότι οι αριθμοί κυττάρων μειώθηκε σημαντικά αν τα δύο EPI και ουρολοίμωξη προστέθηκαν (Σχήμα 2Β). Η διάσπαση της PARP, ενός δείκτη της απόπτωσης, ενισχύθηκε επίσης σε κύτταρα κατεργασμένα με ΕΡΙ + UTI συγκρίνοντας με ότι στα κύτταρα κατεργασμένα με ΕΡΙ μόνο (Σχήμα 2C). Επιπλέον, η θεραπεία με ΕΡΙ + UTI οδήγησε σε μειωμένο επίπεδο του αναστολέα της απόπτωσης Bcl-2 και την αυξημένη διάσπαση της κασπάσης-3 (Σχήμα 2D). Σε στηρίζουν αυτό το αποτέλεσμα, η χρώση αννεξίνης V έδειξε ότι το ποσοστό των κυττάρων υπέστησαν απόπτωση ήταν υψηλότερη σε κύτταρα κατεργασμένα με ΕΡΙ + UTI (Σχήμα 2Ε). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι UTI προάγει την απόπτωση όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με ΕΡΙ, και θα μπορούσε δυνητικά να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα της ΕΡΙ στη θεραπεία του καρκίνου.

(Α) Ποσοστό των επιζώντων L02 κύτταρα κατεργασμένα με ΕΡΙ /EPI + ουρολοίμωξη /ουρολοίμωξη. (Β) ποσοστό των επιζώντων SMMC-7721 και MHCC-LM3 καρκίνο του ήπατος κυττάρων υπό τη θεραπεία της ΕΡΙ /ΕΡΙ + UTI /UTI για υποδεικνυόμενους χρόνους. (C, D) στυπώματος Western έδειξε μόρια φαίνεται στο SMMC-7721 και MHCC- ΠΝ 3 καρκίνο του ήπατος κύτταρα κάτω από τη θεραπεία του ΣΕΠ /EPI + ουρολοίμωξη (θεραπεία με D για 24 ώρες). ACTB στυπώθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Ε) χρώση αννεξίνης V δείχνει το ποσοστό των κυττάρων υπέστησαν απόπτωση υπό την θεραπεία του ΕΡΙ /ΕΡΙ + UTI για ενδεικνυόμενους χρόνους. Αριστερό πάνελ ήταν μέτριο αποτέλεσμα των 3 πειραμάτων? δεξί πάνελ ήταν αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα. Τα αποτελέσματα είναι κατά μέσο όρο 3 ανεξάρτητων πειραμάτων, (* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01).

Η

ουρολοίμωξη Προωθεί EPI-επαγόμενη απόπτωση σε ήπατος Cancer Cell από ανασταλτικός Autophagy

Autophagy διαδραματίζει απαραίτητο προστατευτικό ρόλο σε ΕΡΙ που προκαλείται από κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα [15, 20]. Γνωρίζοντας ότι ουρολοίμωξη προάγει την απόπτωση που επάγεται από την ΣΕΠ, θα ήθελα να ξέρω αν αυτό επιτεύχθηκε αναστέλλοντας αυτοφαγία που επίσης προκαλείται από ΕΡΙ. Για το σκοπό αυτό, δημιουργήσαμε ένα ΕΡΙ-ανθεκτική κυτταρική γραμμή LM3er εφαρμόζοντας χαμηλή δόση ΕΡΙ σε κυτταρικό μέσο καλλιέργειας επί ένα χρονικό διάστημα (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Τόσο στο κύτταρα MHCC-LM3er και μη κύτταρα ελέγχου ΕΡΙ-ανθεκτική (MHCC-Ι_Μ3), προσθέσαμε ΕΡΙ και διαπίστωσε ότι ο αριθμός των κυττάρων που επιβιώνουν MHCC-LM3er ήταν μεγαλύτερη από εκείνη των κυττάρων MHCC-LM3, και λιγότερες MHCC- κύτταρα LM3er υπέστησαν απόπτωση από τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 3Α). Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι οι ΕΡΙ-ανθεκτικά κύτταρα (MHCC-LM3er) έχουν καλύτερη προστασία από ΕΡΙ-επαγόμενη απόπτωση. Για να μάθετε αν η αντίσταση στη ΣΕΠ οφείλεται σε αυξημένη δραστηριότητα αυτοφαγικά στα κύτταρα MHCC-LM3er, εξετάσαμε την βασική έκφραση αρκετών δεικτών αυτοφαγία και διαπίστωσαν ότι στα κύτταρα MHCC-LM3er, τα επίπεδα του mRNA της ATG7, ATG5 και BECN1 ήταν υψηλότερες από ό, τι ότι τα κύτταρα στον έλεγχο (Εικόνα 3Β). Εξετάσαμε, επίσης, τα βασικά επίπεδα αρκετών πρωτεϊνών αυτοφαγία που σχετίζονται με, και βρήκε ότι τα επίπεδα της LC3-II, ATG7, ATG5 και BECN1 αυξημένη στα κύτταρα MHCC-LM3er, καθώς, ενώ το επίπεδο των SQSTM1 μειώθηκε (Σχήμα 3C). μικροσκοπία φθορισμού έδειξε επίσης ότι σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, υπήρχαν περισσότερα κύτταρα σε αυτοφαγικά ομάδα MHCC-LM3er (Σχήμα 3D). Επιπλέον, κάτω από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, βρήκαμε πιο κυστίδια αυτοφαγικά στα κύτταρα MHCC-LM3er (Σχήμα 3Ε). Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα ΕΡΙ-ανθεκτικά κύτταρα MHCC-LM3er έχουν υψηλότερη βασική αυτοφαγικά δραστικότητα από ότι στα κύτταρα ελέγχου. Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα κύτταρα MHCC-LM3er θα μπορούσε να αντισταθεί σε EPI-κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε σύγκριση με τα κύτταρα MHCC-ΠΝ 3, και η αναστολή της αυτοφαγία με 3-MA θα μπορούσε να εμποδίσει εντελώς την αντίσταση των κυττάρων MHCC-LM3er να EPI. Τα παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης όταν εχρησιμοποιήθη UTI (Σχ 3F και 3G). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει έντονα ότι UTI προωθεί ΕΡΙ-επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος με αναστολή αυτοφαγία.

(Α) Ποσοστό κυττάρων που επιβιώνουν MHCC-LM3 και LM3er υπό την θεραπεία του ΕΡΙ. Κάτω πάνελ έδειξαν τα ποσοστά της αννεξίνης V-θετικά MHCC-ΠΝ 3 ή κύτταρα MHCC-LM3er. (Β) σε πραγματικό χρόνο PCR έδειξε τα επίπεδα του mRNA της ATG5, ATG7 και BECN1 στα κύτταρα MHCC-ΠΝ 3 και MHCC-LM3er. (Γ) Western στύπωμα της LC3-Ι, LC3-ΙΙ, ATG7, ATG5, BECN1 και SQSTM1 σε κύτταρα LM3 και LM3er. ACTB ήταν ένας έλεγχος φόρτωσης. (D) κουκκίδες GFP-LC3 στα κύτταρα MHCC-ΠΝ 3 και LM3er. Άνω πάνελ, μικροσκοπία ανοσοφθορισμού έδειξε την αντιπροσωπευτική εικόνα των στιγμών GFP-LC3, και κάτω πάνελ ήταν κλάσμα αυτοφαγικά κυττάρων σε κύτταρα MHCC-ΠΝ 3 ή MHCC-LM3er. (Ε) Electron μικρογραφία της αυτοφαγικά κυστιδίων στα κύτταρα MHCC-ΠΝ 3 και LM3er. Οι διευρυμένη εικόνες υψηλής ανάλυσης των τετραγωνικών περιοχών έδειξαν. (F) Ποσοστό επιβίωσης (άνω τμήμα) και αννεξίνης V-θετικά κύτταρα (κάτω πίνακας) σε κύτταρα MHCC-ΠΝ 3 και LM3er υπό την θεραπεία του ΣΕΠ /EPI + 3-ΜΑ ή EPI /EPI + ουρολοίμωξη. Τα αποτελέσματα είναι μέσος όρος 3 ανεξάρτητων πειραμάτων (* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01).

Η

ουρολοίμωξη Ρυθμίζει Autophagy από ανασταλτικός NF-κΒ μονοπάτι σηματοδότησης

μονοπατιού σηματοδότησης

NF-κΒ θετικά ρυθμίζει αυτοφαγία [14, 21, 22]. UTI θα μπορούσε να αναστείλει την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ οδού σηματοδότησης [23, 24]. Ως εκ τούτου, σκεφτεί ότι θα μπορούσε να UTI αναστέλλουν αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα του ήπατος με καταστολή της οδού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, θα αντιμετωπίζονται SMMC-7721 και τα κύτταρα MHCC-ΠΝ 3 με EPI μόνο του ή EPI + ουρολοιμώξεις, και διαπίστωσε ότι η δραστηριότητα του NF-κΒ κατεστάλη σε ουρολοίμωξη συμπληρώνονται κύτταρα (Σχήμα 4Α). Το αποτέλεσμα αυτό υποστηρίζεται από την αναστολή στην φωσφορυλίωση του ΙΚΚ-α και Nemo (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, βρήκαμε ότι η προσθήκη PDTC, ενός αναστολέα του μονοπατιού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ σε κύτταρα MHCC-LM3 ανέστειλε την φωσφορυλίωση του ΙΚΚ-α και την έκφραση της LC3-ΙΙ (Εικόνα 4C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι UTI αναστέλλει autophagy με καταστολή της οδού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ. Για να μάθετε αν η προσθήκη των φαρμάκων, ουρολοίμωξη ή PDTC, προώθησε την επιρουβικίνη απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα του ήπατος, προσθέσαμε EPI, EPI + ουρολοίμωξη, EPI + PDTC, ή EPI + ουρολοίμωξη + PDTC να SMMC-7721 και MHCC -LM3 καρκίνο του ήπατος κύτταρα, και παρατηρείται παρόμοιο ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων στην EPI + ουρολοίμωξη, ΣΕΠ + PDTC ή EPI + ουρολοίμωξη + PDTC συμπληρώνονται κύτταρα. Ιδιαίτερα, δεν υπήρχε προστιθέμενη επίδραση επί του κυτταρικού θανάτου, εάν και οι δύο UTI και PDTC προστίθενται, υποδηλώνοντας ότι και οι δύο UTI και PDTC προώθηση της απόπτωσης σε ένα ίδιο μηχανισμό, ο οποίος είναι να αναστέλλει την ΝΡ-κΒ σηματοδότηση μονοπατιού ρυθμιζόμενες autophagy (Σχ 4D και 4Ε) .

(Α) Η σχετική δραστηριότητα NF-κΒ σε SMMC-7721 και τα κύτταρα MHCC-ΠΝ 3 υπό την θεραπεία του ΣΕΠ /EPI + ουρολοιμώξεων για 24 ώρες. (Β) κηλίδες Western ρ-ΙΚΚ άλφα και π-Nemo σε σύγκριση με επίπεδα ολικής πρωτεΐνης του ΙΚΚ άλφα και Nemo, αντίστοιχα, σε SMMC-7721 και MHCC-LM3 καρκίνο του ήπατος κυττάρων υπό τη θεραπεία της ΕΡΙ /ΕΡΙ + UTI για 24 hr. ACTB είναι ένας έλεγχος φόρτωσης. (C) κηλίδα Western του ρ-ΙΚΚ άλφα, σύνολο ΙΚΚ άλφα, LC3-Ι και LC3-ΙΙ σε κύτταρα MHCC-LM3 υπό την θεραπεία του ΕΡΙ /ΕΡΙ + UTI /ΕΡΙ + PDTC επί 24 ώρες (D, E) Ποσοστό επιβίωσαν (D) και αννεξίνης V-θετικά κύτταρα (Ε) σε SMMC-7721 και τα κύτταρα MHCC-LM3 υπό την θεραπεία του ΕΡΙ /ΕΡΙ + UTI /ΕΡΙ + PDTC /ΕΡΙ + UTI + PDTC επί 24 ώρες. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος των 3 ανεξάρτητων πειραμάτων (* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01)

Η

ουρολοίμωξη προωθεί επίσης την απόπτωση από ανασταλτικός NF-κΒ μονοπάτι σηματοδότησης-Induced Autophagy στη Vivo

Για να αποδείξουμε παραπάνω αποτέλεσμα μας in vivo, εμείς εγχέεται MHCC-LM3 ή ΕΡΙ-ανθεκτικά κύτταρα MHCC-LM3er κάτω από το δέρμα σε ποντικούς (η = 6), και βρέθηκε ότι η χορήγηση του ΕΡΙ μπορεί να αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου σε MHCC-LM3 ποντίκια κύτταρο ένεση, αλλά σε μικρότερο βαθμό σε ποντίκια κύτταρο-εγχυθεί MHCC-LM3er. Ωστόσο, όταν χορηγήθηκε UTI, η ανάπτυξη του όγκου στον MHCC-LM3er κύτταρο ένεση ποντικούς ανεστάλη, και ο ρυθμός ανάπτυξης ήταν παρόμοια με εκείνη στους ποντικούς-MHCC LM3 κύτταρο ένεση (Σχήμα 5Α και 5Β). Για να διαπιστώσετε εάν UTI ανέστειλε την οδό σηματοδότησης ΝΡ-κΒ in vivo, χορηγήσαμε ΕΡΙ μόνες ή ΕΡΙ + UTI στους ποντικούς και ανέλυσαν την δραστηριότητα του μονοπατιού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ στους όγκους. Διαπιστώθηκε ότι σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου, το επίπεδο της LC3-ΙΙ και οι φωσφορυλιώσεις των ΙΚΚα και Nemo ήταν όλοι μειωθεί στους όγκους των ποντικών χορηγείται με δύο ΕΡΙ + UTI, υποδεικνύοντας την αναστολή της NF-κΒ οδού σηματοδότησης (Σχ 5C και 5D). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι UTI προάγει την απόπτωση μέσω αναστολής της ΝΡ-κΒ μονοπάτι σηματοδότησης ρυθμιζόμενες αυτοφαγία in vivo.

(Α, Β) Τα μεγέθη των όγκων (Α) και η καμπύλη ανάπτυξης του όγκου (Β) από ποντικούς ξενο-μεταμόσχευσις MHCC-LM3 ή κύτταρα MHCC-LM3er (n = 6) που έλαβαν θεραπεία με ΣΕΠ /EPI + ουρολοίμωξη. Η καμπύλη ανάπτυξης ελήφθη από πολλαπλές μετρήσεις από διαφορετικά ποντίκια στην ίδια ομάδα. (Γ) Histoimmunochemical ανάλυση δείχνει την έκφραση της ρ-ΙΚΚα και π-Nemo σε ξενομόσχευμα ποντικούς υπό την θεραπεία του ΕΡΙ /ΕΡΙ + UTI. (D) στύπωμα Western του ρ-ΙΚΚα και π-Nemo σε δείγματα από ξενομόσχευμα ποντικούς υπό την θεραπεία του ΕΡΙ /ΕΡΙ + UTI. ACTB είναι ένας έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος των 3 ανεξάρτητων πειραμάτων (* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01).

Η

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Ανεξάρτητα από τον τύπο του καρκίνου, αντίσταση στα φάρμακα παραμένει μια μεγάλη πρόκληση για την επιτυχή χημειοθεραπευτική αγωγή για ασθενείς με καρκίνο [25]. Είναι σαφώς σημαντικό για τον εντοπισμό και την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών για τη βελτίωση της έκβασης της θεραπείας του καρκίνου. Αυτοφαγία είναι ένα δίκοπο μαχαίρι στον καρκίνο, λειτουργεί τόσο ως αντι- και προ-καρκίνου μηχανισμών [26]. Σε καρκίνο του ήπατος, αυτοφαγία μπορεί να προστατεύσει το συκώτι από την καταστολή της φλεγμονής, βλάβη των ιστών και γονιδιώματος αστάθειας για την αναστολή της έναρξης του καρκίνου? Από την άλλη πλευρά, απαιτείται για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και την ανάπτυξη του καρκίνου [26]. Πολλές τρέχουσες θεραπείες καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης χημειοθεραπείας και ακτινοβολίας-θεραπεία, να επιβάλλει μεταβολικό στρες σε καρκινικά κύτταρα και επάγουν αυτοφαγία, η οποία με τη σειρά τους, προστατεύουν τα κύτταρα από την απόπτωση και να προκαλέσει αντοχής φαρμάκου. Επομένως, η χρήση των αναστολέων αυτοφαγικά σε συνδυασμό με θεραπευτικούς παράγοντες μπορεί ειδικότερα να ενισχύσει τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα [25, 27].

UTI είναι ένα σημαντικό αναστολέα σε θρυψίνη, και πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι λειτουργεί με άλλους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες για την προώθηση της απόπτωσης, με αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου, τουλάχιστον εν μέρει λόγω της ανασταλτικής επίδρασης της σε πολλά μονοπάτια σηματοδότησης που εμπλέκονται στην ανάπτυξη [10, 11, 28-30]. Σε προκαταρκτικές μελέτες μας, βρήκαμε ότι UTI ήταν αναστολέα σε αυτοφαγία, και ως εκ τούτου, υπέθεσαν ότι θα μπορούσε επίσης να βελτιώσει τη θεραπεία του καρκίνου με αναστολή αυτοφαγία και να μειώσει την αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα σε καρκινικά κύτταρα. Πράγματι, τα στοιχεία μας έδειξαν ότι σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος, ουρολοίμωξη ανέστειλε την ανύψωση της αυτοφαγία προκαλείται από ΣΕΠ, ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο χημειοθεραπευτικό φάρμακο του καρκίνου. Όταν χρησιμοποιήθηκε σε συνδυασμό με EPI, UTI προωθείται απόπτωση στα κύτταρα. Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι στα καρκινικά κύτταρα του ήπατος, UTI μόνος είχε ελάχιστο αποτέλεσμα επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, αλλά όταν εφαρμόζεται μαζί με EPI, ενίσχυσε το ΕΡΙ-επαγόμενη απόπτωση, πιθανότατα με αναστολή autophagy (Σχήμα 2Β). Το αποτέλεσμα αυτό υποστηρίχθηκε περαιτέρω από την παρατήρηση ότι το ΕΡΙ-ανθεκτικά κύτταρα, ουρολοίμωξη ήταν σε θέση να ευαισθητοποιήσει αποτελεσματικά τα κύτταρα να EPI αναστέλλοντας την αυτοφαγία (Σχήμα 3).

Από το NF-κΒ έχει αναφερθεί να ρυθμίσει θετικά αυτοφαγία, ελέγξαμε εάν ουρολοίμωξη αναστέλλεται αυτοφαγία με την καταστολή NF-κΒ σηματοδοτικό μονοπάτι. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η προσθήκη των δύο ΕΡΙ και UTI σε καρκίνο ηπατικά κύτταρα ανέστειλε σημαντικά την δραστικότητα λουσιφεράσης ΝΡ-κΒ, και μείωσε τη φωσφορυλίωση του ΙΚΚ-α και Nemo, ένα αποτέλεσμα έχει επίσης επαληθευτεί από in vivo μελέτες. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι η οδός σηματοδότησης του NF-κΒ αναστέλλεται όταν εφαρμόζονται τόσο ΣΕΠ και ουρολοιμώξεις. Για να αποδειχθεί ότι η καταστολή του μονοπατιού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ θα οδηγούσε στην αναστολή της αυτοφαγία, εμείς ανέστειλε ο NF-κΒ οδού σηματοδότησης με την προσθήκη PDTC, ένα γνωστό αναστολέα του ΝΡ-κΒ οδό σηματοδότησης, στα κύτταρα μαζί με ΕΡΙ, και παρατηρήθηκαν η αναστολή της αυτοφαγία όπως αναμενόταν. Αυτό το αποτέλεσμα υποστηρίζει σθεναρά την υπόθεση μας ότι σαν PDTC, UTI θα μπορούσε να αναστείλει autophagy με αναστολή της οδού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ. Για να αποδειχθεί περαιτέρω ότι τόσο UTI και PDTC έδρασε στο ίδιο μονοπάτι σηματοδότησης, αντί εργάστηκαν ανεξάρτητα για να ρυθμίζουν την απόπτωση, προσθέσαμε δύο PDTC και UTI μαζί με ΕΡΙ σε καρκινικά κύτταρα, αλλά δεν παρατηρήσαμε οποιαδήποτε περαιτέρω αύξηση της δραστικότητας απόπτωσης. Αυτό το αποτέλεσμα υποστηρίζει σθεναρά συμπέρασμα μας είναι ότι UTI και PDTC δεν λειτούργησε συνεργικά, και UTI μόνη της ήταν εξίσου αποτελεσματικό με PDTC στην αναστολή της οδού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ για την προώθηση της απόπτωσης.

Autophagy επαγόμενης αντίστασης φαρμάκου σε καρκινικά κύτταρα έχει ήταν μια πρόκληση για τη θεραπεία του καρκίνου [31]. Αντι-autophagy στρατηγικές έχουν χρησιμοποιηθεί σε πολλές κλινικές δοκιμές έχουν εγγραφεί στο Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου στις ΗΠΑ σε μια ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων [32]. Ωστόσο, CQ ή HCQ (υδροξυχλωροκίνη) χρησιμοποιήθηκαν για να αναστέλλουν την έγχυση των αυτοφαγοσώματα και λυσοσώματα στις περισσότερες κλινικές δοκιμές, η χρήση άλλων αναστολέων autophagy που θα μπορούσε να περιορίσει το σχηματισμό αυτοφαγοσώματα στις κλινικές μελέτες δεν έχουν αναφερθεί. UTI έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία άλλων ασθενειών όπως η οξεία παγκρεατίτιδα, και τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι θα μπορούσε να αναστείλει UTI ΕΡΙ που προκαλείται από αυτοφαγία και να προωθήσει την απόπτωση κατά τη διάρκεια της θεραπείας του καρκίνου, πιθανότατα μέσω της αναστολής της οδού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ. ΕΡΙ είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο χημειοθεραπευτικό παράγοντα καρκίνου, αλλά μπορεί επίσης να προκαλέσει φαρμακευτικής αντίστασης επάγοντας αυτοφαγία. Το εύρημά μας υποδηλώνει ότι UTI μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με αντικαρκινικά φάρμακα όπως ΕΡΙ να βελτιώσει τα αποτελέσματα της θεραπείας του καρκίνου. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μπορεί επίσης να ρίξει τα φώτα για την εφαρμογή της UTI σε άλλα κλινικά πεδία.