Αφηρημένο

Έχουμε επινοήσει ένα αερόλυμα που βασίζεται θεραπεία απομεθυλίωση για να επιτευχθεί θεραπευτική αποτελεσματικότητα σε προκαρκινικές ή in situ βλάβες του καρκίνου του πνεύμονα, χωρίς συστηματική τοξικότητα. Βέλτιστη σχήματα αερολύματος αζακυτιδίνη (Αζα) σχεδιάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν σε ορθοτοπική ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα μοντέλα ξενομοσχεύματος καρκίνου. Η θεραπευτική αποτελεσματικότητα και τοξικότητα των αεροζόλ Aza συγκρίθηκαν με ενδοφλέβια χορηγούμενο Aza. Παρατηρήσαμε ότι το 80% των σταγονιδίων του αερολύματος Aza μετράται ~0.1-5 microns, που είχε ως αποτέλεσμα την εναπόθεση στους κάτω βρογχικό αεραγωγούς. Ένα ζωικό μοντέλο που phenocopies πεδίο carcinogeneisis σε ανθρώπους αναπτύχθηκε από ενδοτραχειακό εμβολιασμό των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα σε ποντικούς, με αποτέλεσμα την κατανομή τους σε ολόκληρο το χώρο των αεραγωγών. Αερόλυμα Αζα παρέτεινε σημαντικά την επιβίωση των ποντικών που έφεραν ενδο-βρογχική όγκων του πνεύμονα. Η θεραπεία αερολύματος δεν προκάλεσαν καμία ανιχνεύσιμη τοξικότητα του πνεύμονα ή συστημική τοξικότητα. Μια προ-φαρμακοκινητική μελέτη σε ποντίκια έδειξε ότι πνεύμονα εναπόθεση αερολυμένης Aza ήταν σημαντικά υψηλότερη από την ενδοφλέβια οδό. όγκων του πνεύμονα ανατμήθηκαν μετά αναλύθηκαν θεραπεία αεροζόλ και τα επίπεδα μεθυλίωσης του 24 υποκινητών των γονιδίων όγκου κατασταλτικό που σχετίζονται με τον καρκίνο του πνεύμονα. Αεροζόλ Aza μείωσε σημαντικά το επίπεδο μεθυλίωσης σε 9 από αυτούς τους προαγωγούς και reexpressed πολλά γονίδια που εξετάστηκαν. Συμπερασματικά, αεροζόλ Αζα στο μη-κυτταροτοξική δόσεις φαίνεται να είναι αποτελεσματική και οδηγεί σε απομεθυλίωση DNA και ογκοκατασταλτικό γονίδιο επανέκφραση. Ο θεραπευτικός δείκτης του αεροζόλ Aza είναι & gt? 100 φορές υψηλότερη από εκείνη της ενδοφλέβιας Aza. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν μια προκλινικές σκεπτικό για μια κλινική δοκιμή Φάσης Ι των αερολυμάτων Aza που θα αρχίσει στο Ίδρυμα μας

Παράθεση:. Qiu Χ, Liang Υ, πωλητές RS, Perez-Soler R, Ζου Υ (2014) Αεροζόλ αζακυτιδίνη Αναστέλλει καρκίνοι ορθοτοπική του πνεύμονα σε ποντίκια μέσω DNA απομεθυλίωση του και Gene επανενεργοποίηση Effects. PLoS ONE 9 (10): e109874. doi: 10.1371 /journal.pone.0109874

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 Μαρ του 2014? Αποδεκτές: 12 Σεπτεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 27 Οκτώβρη 2014

Copyright: © 2014 Qiu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση ΝΙΗ 5R01CA154755. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα ισχυρίζεται 1,4 εκατομμύρια ζωές κάθε χρόνο (https://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/index.html) [1], [2]. Ο καρκίνος του πνεύμονα εμφανίζεται ως αποτέλεσμα της σωρευτικής βλάβη στο βρογχικό επιθήλιο που προκαλείται από εισπνεόμενα καρκινογόνα. Επειδή η σωρευτική βλάβη επηρεάζει το σύνολο των αεραγωγών, κατεστραμμένου επιθηλίου των αεραγωγών είναι επιρρεπείς στην ανάπτυξη πρόσθετων πρωτογενών όγκων κατά τη διάρκεια της ζωής ενός ατόμου [3]. Όλες οι μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκίνους (NSCLC) προέρχονται από το βρογχικό επιθήλιο που καλύπτει μεγάλες ή μικρές αεραγωγών, η οποία οδήγησε στα κεντρικό ή περιφερικό όγκους. Για παράδειγμα, καρκινώματα πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα συχνότερα προκύπτουν κεντρικά σε μεγάλο βρόγχους, τα αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα συνήθως αναπτύσσουν περιφερειακά στις μικρότερες αναπνευστικές οδούς, και τα μεγάλα καρκινώματα του πνεύμονα μπορεί να προκύψει είτε σε τοποθεσία. Ωστόσο, όλοι οι όγκοι προέρχονται από μετασχηματισμένα επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών. Ως εκ τούτου, επιλεκτική θεραπευτική παρέμβαση για όγκους περιορίζονται στους αεραγωγούς θα πρέπει να αναστέλλει αποτελεσματικά ή να καθυστερούν το σχηματισμό τους χωρίς να προκαλείται συστηματική τοξικότητα [4] – [7]. Δυστυχώς, υπάρχουν θεραπείες που στοχεύουν ειδικά το βρογχικό επιθήλιο είναι σήμερα διαθέσιμα

Αύξηση των γνώσεων στον τομέα της επιγενετική και καρκινογένεσης έχει οδηγήσει στο συμπέρασμα ότι η παρεκκλίνουσα επιγενετικές αλλαγές παίζουν σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια των πνευμόνων καρκινογένεση.? Επιπλέον, οι αλλαγές αυτές διατηρούνται καθ ‘όλη τη διαδικασία της εξέλιξης της νόσου [8], [9]. Για παράδειγμα, αποσιώπηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων (ΟΚΓ) από ανώμαλη υπερμεθυλίωση έχει βρεθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην έναρξη και την ανάπτυξη καρκίνου σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου [10] – [19]. υπερμεθυλίωση προαγωγού TSG έχει επίσης δειχθεί ότι συσχετίζεται με πτωχή πρόγνωση και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία [20] – [26]. Συγκεκριμένα, όλες οι γενετικές βλάβες σε καρκίνους του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένων των ρ53 και Κ-ras μεταλλάξεις, θα μπορούσε να είναι η συνέπεια της παρεκκλίνουσας επιγενετικές μεταβολές [10], [27], [28]. Επιγενετικές αλλαγές είναι αναστρέψιμες καρκινογόνες γεγονότα [10], [29]. Ο καρκίνος-ειδικότητα αυτών επιγενετικές μεταβολές τα καθιστά μοναδικά στόχους για συγκεκριμένες θεραπείες επιγενετικές [30]. Ως εκ τούτου, υποθέτουμε ότι με τη στόχευση του επιθηλίου των αεραγωγών με ένα παράγοντα απομεθυλίωσης με χορήγηση αερολύματος, μπορεί να επηρεάσει ευνοϊκά τη φυσική ιστορία του καρκίνου του πνεύμονα.

Προηγουμένως παρατηρήσαμε ότι υπερμεθυλίωση στην περιοχή προαγωγέα του γονιδίου σε ανθρώπινα Rassf1 NSCLC κυτταρική σειρά H226 μπορεί να αναστραφεί με την αζακυτιδίνη παράγοντα απομεθυλίωσης (Aza). Μπορούμε επίσης καταδειχθεί, χρησιμοποιώντας ένα κλινικά σχετικό ζωικό μοντέλο που αναπτύχθηκε από εργαστήριο μας, ότι η ενδοτραχειακή ένεση (παρόμοια μορφή τοπικής χορήγησης όπως αεροζόλ) του Aza σε υπο-τοξικές δόσεις μπορεί να αυξήσει την επιβίωση των ποντικών ορθοτοπικά εμφυτευμένων Η358 και Η460 καρκίνου του πνεύμονα [31 ], [32]. Αυτό κλινικά σχετική ζωικό μοντέλο ήταν απόδειξη της έννοιας που αεραγωγών στοχευμένη επιγενετικό θεραπεία μπορεί να έχει ένα πλεονέκτημα στην πρόληψη και τη θεραπεία της πρόωρης NSCLC. Εδώ αναφέρουμε για την αποτελεσματικότητα της αερολυμένης Aza στη θεραπεία της ανθρώπινης ορθοτοπική μοντέλα ξενομοσχεύματος NSCLC σε ποντικούς, καθώς και η αποτελεσματικότητα της θεραπείας για την απομεθυλίωση των συγκεκριμένων υποκινητών των ΕΠΠΕ στον ιστό του όγκου. Για τη διαλεύκανση των επιγενετικών θεραπευτικοί μηχανισμοί, εμείς εκτομή ιστούς όγκων από τα ξενομοσχεύτηκε ζώα που έλαβαν θεραπεία με αεροζόλ Aza, ανέλυσε την κατάσταση μεθυλίωσης των υποκινητών της 24ης πνεύμονα ΕΠΠΕ σχετίζονται με τον καρκίνο, και προσδιορίζονται τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης αυτών των γονιδίων που παρουσίασαν σημαντική απομεθυλίωση υποστηρικτής μετά αεροζόλ Αζα θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

οι κυτταρικές σειρές

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου NSCLC Η226, Η358, Η460 και αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen) και διατηρήθηκαν σε 37 ° C επωαστή με 5% CO

2 και 95% αέρα

.

Ζώα

Αρσενικά και θηλυκό ICR και αθυμικά γυμνά ποντίκια, ηλικίας 6-8 εβδομάδων (Harlan) στεγάστηκαν στην εγκατάσταση ζώων στο Albert Einstein College of Medicine. Όλες οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο (Πρωτόκολλο Αριθμός: 20130312) εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) του Albert Einstein College of Medicine. Στη μελέτη επιβίωσης, τα ζώα παρατηρήθηκαν καθημερινά. Humane τελικά σημεία χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια αυτής της μελέτης: ετοιμοθάνατα ήταν ευθανασία. Χρησιμοποιήσαμε δύο κριτήρια για τον προσδιορισμό των ετοιμοθάνατα ζώα με βάση το πρωτόκολλο χρήση ζώων μας: 1) ποντίκι έχει δυσκολία στην αναπνοή, το φαγητό ή το ποτό? 2) ένα ποντίκι χάνει ≥15% του σωματικού βάρους σε 4 ημέρες. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO2 σε ένα θάλαμο εισπνοής που ακολουθείται από αφαίμαξη. Η αναισθησία χρησιμοποιείται για την ελαχιστοποίηση δυσφορία κατά τη διάρκεια της ενδοτραχειακής ενέσεις.

Η ενδοτραχειακή ένεση

Για ενδοτραχειακή ένεση (ΙΤ), ένας βλωμός των κυττάρων σε εναιώρημα ή φάρμακο εγχύθηκε εντός της τραχείας. Η διαδικασία που χρησιμοποιείται για την έγχυση έχει περιγραφεί προηγουμένως από εμάς [33]. Εν συντομία, οι ποντικοί αναισθητοποιούνται με ισοφλουράνιο με ένα ψεκαστήρα κατά 2,5% ισοφλουράνιο παραδίδονται από 2,0 PSI οξυγόνου και ακινητοποιείται χρησιμοποιώντας μια συσκευή συγκράτησης. Το στόμα ανοίγεται με μια λαβίδα και μια μικρή συσκευή σωληνοειδές φως εισάγεται στο στόμα για να εντοπίσει την τραχεία, εάν χρειάζεται. Μια βελόνα τροφοδοσίας 22 G συνδέεται με μία σύριγγα του 1 ml που περιέχει το εναιώρημα των κυττάρων ή το διάλυμα του φαρμάκου εισάγεται εντός της τραχείας. Περίπου 3 μΙ διαλύματος /g σωματικού βάρους στη συνέχεια εγχέεται ενδοτραχειακά. Το ποντίκι απελευθερώνεται από την συσκευή συγκράτησης κατά την ολοκλήρωση της διαδικασίας και παρατηρήθηκαν μέχρι την πλήρη ανάρρωση από την αναισθησία.

ορθοτοπική μοντέλα ενδοβρογχικό καρκίνο του πνεύμονα ξενομόσχευμα

αθυμικά γυμνά ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως και τα ανθρώπινα NSCLC καρκινικά κύτταρα σε εναιώρημα εμβολιάστηκαν προσεκτικά εντός της τραχείας (περίπου 2-4 × 10

6 κύτταρα /ποντικό) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφεται παραπάνω. Σε αυτά τα μοντέλα, πολλαπλούς όγκους να αναπτυχθούν εντός των πνευμονικών αεραγωγών. Η διάρκεια ζωής των ζώων συσχετίζεται με την επιβάρυνση του όγκου, η οποία σχετίζεται με το μέγεθος του εμβολίου.

φόρμουλα αερολύματος

αζακυτιδίνη (Sigma) διαλύθηκε σε στείρο φυσιολογικό ορό σε 10 mg /ml ακριβώς πριν από τη χορήγηση. Το αεροδυναμικό μέγεθος του αερολύματος Aza προσδιορίστηκε με τη μέθοδο της εξώθησης-καταβύθισης χρησιμοποιώντας ένα 7-Stage Cascade Impactor που συνδέονται με το σύστημα εκνεφωτή PARI ανά τις οδηγίες του κατασκευαστή [34]. χορήγηση αερολύματος. Το αερόλυμα δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας την προσωπική του συμπιεστή A PARI και το σύστημα νεφελοποιητή LC Star. Ο ρυθμός δημιουργίας αεροζόλ ήταν περίπου 0,25 ml /min. Ένα σύστημα έκθεσης της μύτης-μόνο (CH Technologies Inc. Westwood, NJ) συνδεδεμένο με σύστημα αερολύματος του PARI σε μία κλειστή χημική κουκούλα χρησιμοποιήθηκε για χορήγηση αερολύματος σε ποντίκια. Ο χρόνος χορήγησης αερολύματος (min) (Τ) ήταν αυστηρά ελεγχόμενες. Η δόση αερολύματος να αποτίθενται στους πνεύμονες (mg /m

2) (D) υπολογίστηκε πολλαπλασιάζοντας τον χρόνο έκθεσης (min) από τον ρυθμό αεροζόλ εισπνοής (ml /min) (R) και η συγκέντρωση του φαρμάκου (mg /ml) (C) όπως περιγράφεται προηγουμένως από εμάς [34], δηλαδή D = TRCi /W, όπου Ι είναι το σώμα επιφάνειας /δείκτη βάρους (mg /m

2: mg /kg) (3 για ποντίκια) και το W είναι ζώο σωματικό βάρος (kg). Σε προηγούμενη μελέτη, μετρήθηκε ρυθμό εισπνοής αεροζόλ σε ποντικούς, που ορίζεται ως ο όγκος του υγρού αεροζόλ εναποτίθεται στους πνεύμονες ποντικού σε 1 λεπτό ήταν περίπου 10

-4 ml /min για 25 g ποντικού [34]. Η επιθυμητή εναποτίθεται δόση επιτυγχάνεται με τον έλεγχο του χρόνου αερολύματος όπως T = DW /RCI. Για παράδειγμα, ο χρόνος χορήγησης αεροζόλ για κατατεθεί δόση των 2,5 mg /m

2 σε 25 gm ποντικού χρησιμοποιώντας ένα /ml συγκέντρωση 10 mg Αζα είναι Τ = 2.5 × 0.025 /10

-4 × 10 × 3 = 20.83 min.

μελέτες τοξικότητας

ICR ποντίκια (6 /ομάδα) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αεροζόλ Aza σε 2,5 ή 75 mg /m

2 καθημερινές × 7 ημέρες. Μία ομάδα ποντικών υποβλήθηκε σε επεξεργασία με IT Αζα στη μέγιστη ανεκτή δόση των 270 mg /m

2 ως θετικός έλεγχος για τοξικότητα των πνευμόνων. Οι πνεύμονες αποκόπηκαν 7 ημέρες μετά την τελευταία χορήγηση αερολύματος. Η τοξικότητα των πνευμόνων προσδιορίσθηκε με παθολογικές αξιολόγησης (3 πνεύμονες /ομάδα) χρησιμοποιώντας μία προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο [34]. Επιπλέον, η βιωσιμότητα των επιθηλιακών κυττάρων των αεραγωγών προσδιορίστηκε επίσης (3 πνεύμονες /ομάδα). Εν συντομία ο ιστός των πνευμόνων υπέστη πέψη με liberase (Roche) και διηθείται για να ληφθεί ένα εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων, η οποία σημάνθηκε με αντι-ποντικού Ερ-ΟΑΜ αντίσωμα και δευτερογενές αντίσωμα αντι-αρουραίου κατσίκας φθορισμού συζευγμένο με (Biolegend, San Diego, CA), και κατατάσσονται σύμφωνα με κυτταρομετρία ροής. Το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε με τον αποκλεισμό των 4 ‘, 6-χρώση διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη. Η συστημική τοξικότητα προσδιορίστηκε με μέτρηση του αριθμού των αιμοσφαιρίων ως δείκτης της μυελοκαταστολής (η κύρια τοξικότητα της IV Aza) [35]. Ελήφθησαν δείγματα αίματος κατά το χρόνο της ευθανασίας με καρδιακή παρακέντηση 7 ημέρες μετά την τελευταία θεραπεία. Ο συνολικός αριθμός των λευκών αιμοσφαιρίων (WBC) προσδιορίστηκε μετά την απομάκρυνση των ερυθρών αιμοσφαιρίων, όπως περιγράφεται προηγουμένως [32].

Pre-φαρμακοκινητική μελέτη

Φυσιολογικά ποντίκια ICR δόθηκαν αερολυμένης Aza σε 2,5 mg /m

2, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφεται παραπάνω. Σε κάθε σχεδιασμένη χρονικό σημείο (5 λεπτά, 20 λεπτά, 2 ώρες, 6 ώρες και 24 ώρες), τρεις ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι πνεύμονες τους ανατμήθηκαν μετά δεξιά κοιλία έγχυση με φυσιολογικό ορό. Αζακυτιδίνη στους πνεύμονες εκχυλίζεται και ποσοτικά μετρήθηκε με μία προηγουμένως αναφερόμενη μέθοδο που χρησιμοποιεί το σύστημα LC-MS [36]. Η ποσοτική ανίχνευση διεξήχθη με Millis Scientific Inc. Η ευαισθησία ήταν 1 ng Αζα /ml δείγματος. Η συγκέντρωση Aza στον ιστό εναντίον χρονικά δεδομένα αναλύθηκαν και προσομοίωση με την καλύτερη τοποθέτηση (η τιμή υψηλότερη R

2) στο πλαίσιο του προγράμματος Microsoft Excel. Η εξίσωση των προσομοιωμένων καμπυλών C = f (t) χρησιμοποιήθηκαν για να υπολογιστεί του AUC από 0 έως 24 ώρες ως AUC = ∫

0-24 f (t) dt. χρόνος Να οξύνει (Τ) και η συγκέντρωση κορυφής που λαμβάνεται απευθείας από την παρατήρηση των καμπυλών.

αντικαρκινική αποτελεσματικότητα

Δέκα ημέρες μετά την ενδοτραχειακή εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων, τα γυμνά ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 3 ομάδες (6 ποντικοί /ομάδα): 1) αερόλυμα Αζα στα 2.5 mg /m

2 την ημέρα για 7 ημέρες, 2) αερόλυμα φυσιολογικού ορού (οχήματος) ημερησίως για 7 ημέρες, 3) ή IV Αζα στα 75 mg /m

2 την ημέρα για 7 ημέρες. Σε αυτή τη μελέτη επιβίωσης, τα ζώα παρατηρήθηκαν ημερησίως. Humane τελικά σημεία ευθανασίας (που περιγράφηκε προηγουμένως) χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια αυτής της μελέτης και ετοιμοθάνατα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία και τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε νεκροψία. Η αυξημένη διάρκεια ζωής (% ILS) [37] χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η αποτελεσματικότητα της κάθε δοκιμή παράγοντα.

Ιστολογία του πνεύμονα καρκίνου του ξενομοσχευμάτων

Ποντίκια από την μελέτη αποτελεσματικότητας κατά του όγκου υπέστησαν νεκροψία μετά το θάνατο και τα δείγματα πνεύμονα και του όγκου για ιστολογία συλλέχθηκαν και τοποθετήθηκαν σε 10% νευρικά ρυθμισμένη φορμαλίνη. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε 70% αιθανόλη και υποβάλλεται στην Ιστολογίας και Συγκριτικής Παθολογίας κοινόχρηστο πόρο σε Αϊνστάιν για τη συνήθη επεξεργασία με παραφίνη. Ιστοί χωρισμένο σε 5 μm, χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η & amp? Ε), και να αξιολογηθεί από ένα συμβούλιο πιστοποιημένο κτηνιατρικό παθολόγο

Ανάλυση της κατάστασης μεθυλίωσης σε όγκους του πνεύμονα

Ποντίκια που φέρουν ορθοτοπική πνεύμονα. όγκοι χωρίστηκαν σε 3 ομάδες και έλαβαν θεραπεία με αεροζόλ Aza, όχημα αεροζόλ, ή IV Aza. Δύο εβδομάδες μετά την τελική θεραπεία, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι όγκοι ορατή πνεύμονα (1~3 mm) αποκόπηκαν, καταψύχθηκαν σε ξηρό πάγο, και κατανέμονται σε μικρότερα (& lt? 0,5 ​​mm) κομμάτια από ένα ομογενοποιητή eppendorf σωλήνα. Κάθε δείγμα όγκου διαιρέθηκε σε δύο κλάσματα: ένα για δοκιμασία μεθυλίωσης και ένα άλλο για στύπωμα western. Η κατάσταση μεθυλίωσης των περιοχών προαγωγού των γονιδίων καταστολέα όγκου 24 που εμπλέκονται στην καρκινογένεση του πνεύμονα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μεθυλίωσης qPCR μέθοδος array από τη Qiagen (SA Bioscieces) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [38].

Ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης σε όγκους του πνεύμονα

το δεύτερο μέρος των δειγμάτων όγκου πνεύμονα χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης έκφρασης του ΕΠΠΕ. επιλέχθηκαν τα ΕΠΙΠ δείχνει σημαντική απομεθυλίωση υποστηρικτής μετά αεροζόλ θεραπείας Aza, όπως αναλύθηκαν από την μεθυλίωση σειρά qPCR για την αξιολόγηση από την κηλίδα western. Οι κατεψυγμένοι ιστοί ομογενοποιήθηκαν σε ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα RIPA με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma) χρησιμοποιώντας ομογενοποιητή χειρός, που ακολουθείται από κατεργασία με υπερήχους. Τα δείγματα πρωτεΐνης προετοιμάστηκαν για στύπωμα Western μετά από μια ρουτίνα πρωτόκολλο από τεχνολογίες Ζωής (Grand Island, ΝΥ). Πρωτογενή αντισώματα κατά της ανθρώπινης H-καντερίνης, OPCML, Rassf1a (Abcam), SFRP1 (Epitomics, Burlingame, CA), και βήτα-ακτίνης (Santa Cruz Biotechnology) χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των στοχευμένων πρωτεΐνες. LI-COR C-ψήφιο Blot σαρωτή χρησιμοποιήθηκε για να σαρώσει τις δυτικές κηλίδες? οι ζώνες αναλύθηκαν από το λογισμικό Studio εικόνας (LI-COR). Η αναλογία της πυκνότητας των στοχευμένων πρωτεΐνη έναντι του ελέγχου φόρτωσης ακτίνης από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε για να παρουσιάσει τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης ημι-ποσοτικά.

Στατιστική ανάλυση

Οι διαφορές μεταξύ των διαφόρων ομάδων αναλύθηκαν με δύο-side log-rank (Mantel-Cox) τεστ. Μια διαφορά θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική όταν ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

μοντέλα ορθοτοπική NSCLC

NSCLC είναι μια ασθένεια του επιθηλίου των αεραγωγών, ως αποτέλεσμα της χρόνιας έκθεσης των αερομεταφερόμενων καρκινογόνες ουσίες . Προκειμένου να μιμηθεί αυτό το συγκεκριμένο ανάπτυξη του όγκου στον αεραγωγό σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος, έχουμε ενδο-τραχειακά εμβολιάστηκαν ανθρώπινα κύτταρα NSCLC απευθείας στις αναπνευστικές οδούς, και στη συνέχεια συγκρίνονται αυτή τη λειτουργία της μεταμόσχευσης για IV ένεση των κυττάρων του όγκου σε γυμνά ποντίκια. Η ιστολογική εξέταση των πνευμόνων αποκάλυψε ότι το πρότυπο κατανομής όγκου και η ανάπτυξη ήταν περισσότερο παρόμοια με ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα στο μοντέλο εμφύτευσης IT: το μεγαλύτερο μέρος του σπόρου καρκινικών κυττάρων στην επιφάνεια του επιθηλίου των αεραγωγών σε περίπου μία εβδομάδα μετά την εμφύτευση. Με 3 εβδομάδες, μικρά βλεννογόνου οζίδια όγκων εντοπίζεται εντός του αεραγωγού ή πνευμονικό ιστό δίπλα στο αεραγωγών, υποδεικνύοντας πρωτογενή ανάπτυξη του όγκου εντός του αεραγωγού και εισβολή στο πνευμονικό παρέγχυμα (Σχήμα 1 άνω σειρά). Η ανάπτυξη και το μέγεθος του όγκου είναι κύτταρο line- και εμβόλιο μεγέθους- εξαρτάται. Σύμφωνα με την εμπειρία μας, Η460 (καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου) όγκοι αναπτύχθηκαν ταχύτερα από Η358 (καρκίνωμα βρογχοκυψελιδικού) και πολύ πιο γρήγορα από ό, τι H226 (καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων), όταν εμβολιάζεται σε ποντικούς IT. Ελλείψει οποιασδήποτε παρέμβασης, ποντίκια υποκύψει στους όγκους του πνεύμονα μεταξύ των ημερών 40 και 102. Δεν υπήρχαν αναγνωρίσιμα απομακρυσμένες μεταστάσεις. Αντιθέτως, σχεδόν όλα τα ορατά /ανιχνεύσιμου IV εμφυτευμένα καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν σε τριχοειδές σύστημα του πνεύμονα και σχετικά μακριά από τον αεραγωγό (Εικόνα 1 κάτω σειρά), πιο στενά μοιάζει μεταστατικά καρκινικά κύτταρα μεταναστεύουν από άλλα όργανα στον πνεύμονα. Οι όγκοι αναπτύσσονται ταχύτερα από ό, επίσης μετά την εμφύτευση, και οι ποντικοί συνήθως πέθανε την ημέρα 35 να 68 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η εμφύτευση είναι μια πιο κατάλληλη ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος για να μιμείται την ανθρώπινη NSCLC από ό, τι το μοντέλο IV ή άλλη έκτοπη μοντέλα.

Το μοντέλο δημιουργήθηκε από ενδοτραχειακά έγχυση κυττάρων NSCLC Η460 σε γυμνά ποντίκια. Top: H & amp? Ε τομές πνεύμονα από IT εμβολιάζονται ποντίκια την ημέρα 35. Οι όγκοι (Τ) προκύπτουν εντός των αεραγωγών και να αναπτυχθούν γειτονικό στο πνευμονικό παρέγχυμα. Κάτω: H & amp? Ε χρωματισμένες τομές πνεύμονα από τα IV εμβολιάσθηκαν ποντικών την ημέρα 35. Οι όγκοι προκύπτουν εντός μικρών σκαφών στο πνευμονικό παρέγχυμα. Ο στόχος μεγέθυνσης ήταν 40Χ. Οι ράβδοι κλίμακας ήταν 50 μm.

Η

αερολυμάτων διαμόρφωση

Έχουμε αναπτύξει ένα σκεύασμα αερολύματος για την πρωτότυπη παράγοντα απομεθυλίωσης, αζακυτιδίνη (Aza). Το σκεύασμα αποτελείται από Aza και βαθμού ένεση αποστειρωμένο φυσιολογικό ορό ή νερό. Η ισχύς Αζα μπορεί να διαλυθεί γρήγορα (& lt? 30 sec) στο υδατικό διάλυμα μόλις πριν από τη χορήγηση αερολύματος. Έχει προταθεί ότι τα σταγονίδια αεροζόλ & lt? 5 μm, ιδιαίτερα & lt? 3 μm, σε κατάθεση διάμετρο συχνότερα στους κάτω αεραγωγούς και, ως εκ τούτου, είναι κατάλληλα για φαρμακευτικές εισπνοή των παρασκευασμάτων αεροζόλ από τον άνθρωπο [39] [40]. Μετρήσαμε την αεροδυναμική μέγεθος του σκευάσματος Aza αεροζόλ, βάσει του συστήματος παραγωγής αερολύματος μας με τη μέθοδο της εξώθησης-καταβύθισης [34], και βρήκαν ότι περίπου το 80% των σταγονιδίων (βάρος%) ήταν μεταξύ 0,25-5 μm σε διάμετρο και περίπου 71% μεταξύ 0.25~3 μm (Σχήμα 2). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι περίπου 71~80% των σταγονιδίων θα πρέπει να καταθέσουν στην περιφερική αεραγωγών σε ανθρώπους [39] [40].

T προσδιορίζεται με τη μέθοδο της εξώθησης-καταβύθισης χρησιμοποιώντας ένα 7-Stage Cascade Impactor συνδέονται με PARI του προσωπική του συμπιεστή και το σύστημα νεφελοποιητή LC αστέρων. διάλυμα Αζα (4 ml) αερόλυμα σε ένα ρυθμό ροής αέρα 5 λίτρα /λεπτό. Τα δείγματα συνοπτικές αεροζόλ συλλέχθηκαν σε 3 διαφορετικά διαστήματα από 1 έως 1,5 λεπτά από 3 σε 3,5 λεπτά, και από 5 έως 5,5 λεπτά. Αεροδυναμικού μεγέθους και το κλάσμα του αερολύματος με ένα συγκεκριμένο εύρος μεγέθους μετρήθηκαν και υπολογίστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα δεδομένα ήταν μέσος όρος ± τυπική απόκλιση της αεροδυναμικής μέγεθος με βάση το βάρος (συμπαγείς ράβδοι) και η αθροιστική βάρος (άδειο μπαρ) από 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Η τοξικότητα και η δόση επιλογής

Από προηγούμενη μελέτη μας έχουμε μάθει ότι η αποτελεσματική συγκέντρωση απομεθυλίωση του Aza για καλλιεργημένα κύτταρα θα μπορούσε να είναι 3 logs μικρότερη από της IC

50. Η αντικαρκινική αποτελεσματική δόση (7,5 mg /m

2 χ 3) με ενδοτραχειακή ένεση του Aza στο μοντέλο ποντικού δεν προκάλεσε τοξικότητα των πνευμόνων ή ανιχνεύσιμη συστηματική οξεία τοξικότητα, και η τοξικότητα των πνευμόνων εμφανίστηκε μόνο στην υψηλότερη δόση των 270 mg /m

2, η οποία ήταν η μέγιστη ανεκτή δόση με ενδοφλέβια ένεση [32]. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, επιλέξαμε μια δόση για αεροζόλ Αζα που έχουμε προβλέψει θα έχουμε λειτουργία απομεθυλίωση και η θεραπευτική αποτελεσματικότητα χωρίς σημαντική τοξικότητα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η επιλεγμένη δόση αερολύματος του 2,5 mg /m

2 (έκθεση αεροζόλ περίπου 21 λεπτά σε ένα 25 g ποντικού) ημερησίως για 7 ημέρες ή μια υψηλότερη ενδοτραχειακή δόση bolus ένεση των 75 mg /m

2 για 5 ημέρες, δεν προκάλεσε καμία ανιχνεύσιμη τοξικότητα πνεύμονα (αξιολογήθηκαν ιστολογικώς) ή συστηματική τοξικότητα (που μετράται με μυελοκαταστολή) την ημέρα 7 μετά την τελική χορήγηση (Σχήμα 3Α, Β). Η πνευμονική τοξικότητα (πνευμονίτιδα) (Σχήμα 3C) και μυελοκαταστολή (Σχήμα 3D) συνέβη μόνο όταν οι ποντικοί έλαβαν την υψηλότερη δόση ενδοφλέβια ή ενδοτραχειακή ένεση Aza στα 270 mg /m

2 (η MTD της ενδοφλέβιας Aza). Ομοίως, το αερόλυμα Αζα στο επιλεγμένο θεραπευτική δόση δεν προκάλεσε καμία θάνατο των αεραγωγών επιθηλιακών κυττάρων προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής, σε σύγκριση με τον θετικό μάρτυρα σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με την υψηλότερη IT δόσεις του Aza στα 270 mg /m

2 ( Σχήμα 3Ε).

τμήματα του πνεύμονα των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με αεροζόλ Aza σε 2,5 mg /m

2 × 7 (Α), IT Aza σε 75 mg /m

2 × 7 (Β), και της πληροφορικής Aza σε 270 mg /m

2 × 5 (C), παρουσιάζουν αντίστοιχα καμία τοξικότητα σε 2,5 και 75 2,5 mg /m

2 αλλά πνευμονίτιδα στα 270 mg /m

2. Ο στόχος μεγέθυνσης ήταν 40Χ. Οι ράβδοι κλίμακας ήταν 50 μm. Λευκό αναλογία αιμοσφαιρίων (μετά vs. θεραπεία πριν από τη θεραπεία, η = 6) (D) και το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων των επιθηλιακών κυττάρων των αεραγωγών ταξινομούνται (n = 6) (Ε), αντίστοιχα.

Η

η θεραπευτική αποτελεσματικότητα

συστηματικής (IV) χορήγηση του Aza έχει οδηγήσει σε περιορισμένη μόνο αποτελεσματικότητα σε ασθενείς με NSCLC [41] [42], η οποία έχει ανακεφαλαιώνονται σε πειραματικά μοντέλα ποντικών μας NSCLC αγωγή με IV Aza, (Σχήμα 4A-C). Υπάρχει πράγματι ελάχιστα πειραματικά στοιχεία υποστηρίζουν τη χρήση ενός παράγοντα απομεθυλίωσης για να αναστέλλει αποτελεσματικά τον καρκίνο του πνεύμονα σε μοντέλα ζώων [43] [32]. Ένας από τους πιθανούς λόγους είναι ότι αυτό το πολύ ασταθές φάρμακο δεν είχε αποτελεσματικά παραδοθεί στους όγκους του πνεύμονα. Ήμασταν η πρώτη ομάδα για να αναφέρετε μια απόδειξη της μελέτης έννοια στην οποία η διοίκηση της Aza απευθείας στις αναπνευστικές οδούς παρατεταμένη αποτελεσματικά την επιβίωση των ποντικών με ορθοτοπική καρκίνων του πνεύμονα [32]. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε την αναφορά των αποτελεσμάτων με τη χρήση αερολυμάτων Aza για τη θεραπεία στον άνθρωπο ορθοτοπική NSCLC ξενομοσχευμάτων σε ποντίκια. Ένας από τους στόχους μας ήταν να αποδείξει ότι η παράδοση αερολύματος Aza στο επιθήλιο αεραγωγού θα μπορούσε να αναστείλει αποτελεσματικά την ανάπτυξη των κλινικά σχετικές μοντέλα NSCLC. Επιπλέον, αυτές οι μελέτες περαιτέρω σχεδιαστεί για να διερευνήσει κατά πόσον διανομής αερολύματος του παράγοντα απομεθυλίωσης θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη των όγκων εντός των αεραγωγών σε δόσεις χαμηλές απομεθυλίωση παρά κυτταροτοξικό δόσεις (Σχήμα 4Α-C).

Ποντίκια εμβολιάστηκαν ενδοτραχειακά με τη κυτταρικές σειρές H226 (Α), Η358 (Β), ή Η460 (C) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αεροζόλ Αζα (κόκκινη παχιά γραμμή) σε 2,5 mg /m

2 ημερησίως για 7 ημέρες ή όχημα αεροζόλ (μπλε λεπτή γραμμή) με τον ίδιο όγκο. Η θεραπεία με IV Αζα (διακεκομμένη γραμμή) στη βέλτιστη δόση των 75 mg /m

2 ημερησίως για 5 ημέρες χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Η στατιστική σύγκριση των καμπυλών επιβίωσης πραγματοποιήθηκε με δοκιμασία log-rank (Mantel-Cox). Οι τιμές ρ για Η266, Η358 και Η460 μοντέλα ήταν 0,0135, 0,0150 και 0,0719, αντίστοιχα. Προ-φαρμακοκινητική του αερολύματος Aza (D). ποντικοί ICR υποβλήθηκαν σε αγωγή με αεροζόλ Αζα στα 2.5 mg /m

2. Τα δεδομένα σε κάθε χρονικό σημείο ήταν ο μέσος όρος ± τυπική απόκλιση της τοις εκατό του δόθηκε /αρχική δόση από πνεύμονες των 3 ποντικών. Η εξίσωση για κάθε καμπύλη προσομοιώθηκε καμπύλη με την καλύτερη τοποθέτηση (το υψηλότερο R

2 τιμή) στο πλαίσιο του προγράμματος Microsoft Excel.

Η

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι μια χαμηλή δόση αερολύματος Aza παρέτεινε σημαντικά τη διάρκεια ζωής των ποντικών που φέρουν ενδοβρογχικούς όγκους. Οι% ILS και η διάμεση επιβίωση επιμηκύνθηκε κατά 5.1- και 1.5-, (p = 0,0135), 6.4- και 1.9- (p = 0,0150), και 8.9- και 1,6 (p = 0.0719) φορές στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία με αεροζόλ Αζα χρησιμοποιώντας δόση περισσότερο από 20 φορές χαμηλότερη από τη δόση που χρησιμοποιήθηκε στην ομάδα ελέγχου συστημική θεραπεία, στο μοντέλο Η226, Η358, Η460 και, αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα σαφώς καταδεικνύουν ότι η χορήγηση αεροζόλης των Aza στο απομεθυλίωσης, μη κυτταροτοξικές δόσεις είναι ανώτερη από συστηματική χορήγηση Aza από την άποψη της αποτελεσματικότητας αναστολής της ανάπτυξης του όγκου.

Pre-φαρμακοκινητική

Για τον προσδιορισμό της εναπόθεσης των Aza στους πνεύμονες που διεξάγονται προκαταρκτικές μελέτες φαρμακοκινητικής in vivo. Ενδοφλεβίως εγχυθεί Αζα με την ίδια δόση χρησιμοποιήθηκε μια σύγκριση. Στο πρώτο χρονικό σημείο (3 λεπτά, το συντομότερο δυνατό χρονικό σημείο), θα μπορούσαμε να ανακτήσει -89% της αρχικής δόσης αεροζόλ από τον πνεύμονα. Ωστόσο, όταν η ίδια δόση δόθηκε από συστημικά ένεση, η μέγιστη συγκέντρωση στους πνεύμονες ήταν μόνο 1,62% της αρχικής δόσης. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη συγκέντρωσης-χρόνου (AUC

0~24 η) του αεροζόλ Aza ήταν 15 φορές μεγαλύτερη από αυτήν του IV Aza (Πίνακας 1). Aza δίνεται μέσω δύο οδών έδειξε ένα παρόμοιο μοτίβο πτώση: μια ταχεία μείωση μέσα στις πρώτες 2 ώρες μετά τη χορήγηση ακολουθούμενη από μια αργή παρακμή. Μορφή αερολύματος Aza έδειξε ένα πιο αργό ρυθμό μείωσης του βραδύτερη φάση, ενώ IV Aza έδειξε μια καθυστερημένη συγκέντρωση κορύφωσης στον πνεύμονα (Σχήμα 4D). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η μορφή αερολύματος Aza έχει υψηλότερη συγκέντρωση ιστού των πνευμόνων με προβλέψιμες χαμηλότερη συστηματική έκθεση από την IV Aza.

Η

αερολυμάτων Aza απομεθυλίωση

Για να αναλυθεί το κατά πόσον Aza έχει μια επίδραση απομεθυλίωσης στα κλινικά σχετικές NSCLC μοντέλα, συλλέξαμε τα καρκινώματα του πνεύμονα από τα μοντέλα ξενομοσχεύματος σε επεξεργασία με αεροζόλ Αζα ή IV Aza και καθόρισαν την κατάσταση μεθυλίωσης των περιοχών προαγωγού των γονιδίων καταστολέα 24 όγκων, του οποίου ο υποκινητής υπερμεθυλίωση έχει αναφερθεί ως χρήσιμες για την καρκίνο του πνεύμονα βιβλιογραφία. Κανονική βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα από ζώα χωρίς θεραπεία Αζα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος μεθυλίωση βασική γραμμή. Τα 24 ΕΠΠ επιλεγεί είναι APBA1, APC, CADM1, Cdh1, CDH13, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CXCL12, CYP1B1, DLC1, FHIT, MLH1, MTHFR, PAX5, PRDM2, RaRb, RASSF1, RASSF2, SEMA3B, SFRP1, SLIT2, TCF21 και TGFB1. Βρήκαμε ότι 11 από τους 24 υποκινητές είχαν υπερμεθυλίωση στα δείγματα όγκου από 3 διαφορετικά μοντέλα ξενομοσχεύματος και ότι αεροζόλ Αζα μπορούσε απομεθυλίωση 5 από αυτά (Σχήμα 5Α). Στη σύμβαση, IV Aza στην ίδια δόση δεν έδειξε καμία επίδραση απομεθυλίωσης (Εικόνα 5Β). Τα δεδομένα που δείχνονται στο Σχήμα επίπεδο μεθυλίωσης 5 απεικονίζουν ανιχνεύεται από μία συστοιχία μεθυλίωση Q-PCR και παρουσιάζονται ως% μεθυλίωση του συνολικού CG κυτοσίνη της συγκεκριμένης περιοχής του υποκινητή.

ποντίκια που έφεραν όγκο από 3 ορθοτοπικό μοντέλα καρκίνου του πνεύμονα (H226-ξενο, Η358-ξενο και Η460-ξενο) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αεροζόλ Aza (Α) ή IV Αζα (Β) σε 2,5 mg /m

2 ημερησίως × 7. Οι πνεύμονες αποκόπηκαν 14 ημέρες μετά την τελική αγωγή και όγκων οζίδια μεγαλύτερο από 1.5 mm απομονώθηκαν για ανίχνευση μεθυλίωσης με τεχνολογία συστοιχίας qPCR εις Qiagen (SA Biosciences). Τα δεδομένα είναι% μεθυλίωση του συνολικού CG κυτοσίνη της συγκεκριμένης περιοχής του υποκινητή.

Η

ΕΠΠΕ επανέκφραση

Για να αναλυθεί εάν η απομεθυλίωση στην περιοχή του υποκινητή της ΕΠΠΕ μπορεί να επανενεργοποιήσει η ΕΠΠ, θα εκτομή των όγκων του πνεύμονα και μέτρησαν την πρωτεΐνη έκφραση της ΕΠΠΕ των οποίων οι υποστηρικτές σημαντικά απομεθυλιωθεί μετά το αερόλυμα θεραπεία Aza. Western κηλίδωση δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνευθεί η έκφραση του γονιδίου στα δείγματα όγκων από τα ίδια ποντίκια που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη απομεθυλίωση. Έχουμε επιλέξει 5 ΕΠΠΕ των οποίων οι υποστηρικτές σημαντικά απομεθυλιωθεί μετά το αερόλυμα θεραπεία Aza. Βρήκαμε ότι η H-Cad και Rassf1 στους όγκους Η266, Η-cad, OPCML, και SFRP1 σε όγκους Η358, και OPCML σε όγκους Η460 επανενεργοποιήθηκαν στο επίπεδο πρωτεΐνης (Σχήμα 6Α και Β) μετά τη θεραπεία αερολύματος Aza. Η έκφραση αυτών των ΟΚΓ έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν ή να καθυστερούν την ανάπτυξη καρκίνου σε διάφορους τύπους καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα. Για παράδειγμα, έχουμε αναφερθεί πριν από την απώλεια της H-καντερίνης σε ανθρώπινο NSCLC συνδέεται με κακοήθεια [44]. Η περιοχή προαγωγού των Rassf1a βρίσκεται επίσης σε μεγάλο βαθμό μεθυλιωμένα στον καρκίνο του πνεύμονα [45]. OPCML, μια ευρεία ογκοκατασταλτικό βρέθηκε αρχικά σε καρκίνους των ωοθηκών, βρίσκεται μεθυλιωμένο σε πολλές καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές [46]. SFRP1 στο μονοπάτι σηματοδότησης Wnt είναι μεταγραφικά σιγήσει υπερμεθυλίωση προαγωγού σε NSCLC [47]. Τα αποτελέσματα αυτής της in vivo μελέτη υποδηλώνουν ότι η θεραπεία απομεθυλίωσης αερολύματος μπορεί να είναι αποτελεσματική στην αναστολή της ενδο-βρογχική όγκους του πνεύμονα και των βρόγχων προκαρκινικές αλλοιώσεις.

Western δοκιμασία στύπωσης χρησιμοποιήθηκε για τον καθορισμό της πρωτεΐνης έκφρασης του ΕΠΠΕ με σημαντική απομεθυλίωση υποκινητή μετά αεροζόλ θεραπεία Αζα προσδιορίζονται από την μεθυλίωση συστοιχία q-PCR. Τα δείγματα όγκου ήταν η ίδια όπως χρησιμοποιήθηκε στο Σχήμα 5? Ιστόγραμμα των κηλίδων Western (Β). Οι δυτικές κηλίδα ταινίες φωτογραφία σαρώθηκαν και ο λόγος της πυκνότητας των στοχευμένων πρωτεΐνης έναντι του ελέγχου φόρτωσης ακτίνης κάθε δείγματος παρουσιάστηκε ως το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης.

Η

Συζήτηση

Ο καρκίνος του πνεύμονα θεωρείται ως «γενετική ασθένεια» [48], [49]. Μετά την απόδειξη ότι TSG απενεργοποίηση και την ενεργοποίηση ογκογονιδίου παίζουν κρίσιμο ρόλο στην καρκινογένεση, οι θεραπευτικές προσπάθειες έχουν προοδευτικά μετατοπιστεί από τη βελτιστοποίηση των μη-ειδικές μορφές ακτινοβολίας και χημειοθεραπείας θεραπείας που σκοτώνουν κυρίως ταχέως διαιρούμενα κύτταρα για την ανάπτυξη παραγόντων που στοχεύουν τις συγκεκριμένες γενετικές αλλαγές . Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν μια άμεση σχέση μεταξύ της ανώμαλης επιγενετικών αλλαγών και την ανάπτυξη του καρκίνου? αυτό δείχνει ότι ο καρκίνος είναι επίσης εν μέρει ένα επιγενετικό ασθένεια. Σε αντίθεση με γενετικές αλλαγές, επιγενετικές αλλαγές συμβαίνουν νωρίτερα στην εξέλιξη του καρκίνου και είναι αναστρέψιμες. Ως εκ τούτου, μια θεραπευτική στρατηγική με στόχο την αναστροφή της ανώμαλης επιγενετικές αλλαγές θα πρέπει να είναι μια πιο αποτελεσματική στρατηγική από εκείνες που επικεντρώνονται στη χρήση των μη-ειδικών κυτταροτοξικών παραγόντων ή στη στόχευση μη αναστρέψιμες γενετικές ανωμαλίες.

Σύμφωνα με το μοντέλο πεδίο σχηματισμός καρκίνου [3 ] [50], όλα τα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα συσσωρεύονται επιγενετικών και γενετικών αλλοιώσεων μέχρι ένα μόνο κύτταρο αποκτά έναν κακοήθη φαινότυπο και οδηγούν σε μια επεμβατική όγκου, ενώ το υπόλοιπο του πεδίου συνεχίζει τη συσσώρευση επιγενετικών και γενετικές βλάβες και είναι σε κίνδυνο ανάπτυξης άλλων πρωτογενών καρκίνων του πνεύμονα (δεύτερη προκριματικές) [51] [52]. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, οι παρεκκλίνουσα επιγενετικές αλλαγές, όπως υπερμεθυλίωση των υποκινητών των ΕΠΠΕ, συμβαίνουν πριν και μπορεί να προκαλέσει τις επόμενες γενετικές αλλαγές, και επιμένουν σε καρκινικά κύτταρα καθ ‘όλη τη διαδικασία της καρκινογένεσης.

Σε αυτό το