Αφηρημένο

Ιστορικό

γαστρικός καρκίνος είναι κοινή μορφή καρκίνου. Ανακάλυψη νέων γενετικών βιοδεικτών μπορεί να βοηθήσει στον εντοπισμό των ατόμων υψηλού κινδύνου. παραλλαγή αριθμό αντιγράφων (CNV) έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι επηρεάζουν τον κίνδυνο για διάφορες μορφές καρκίνου. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ζητήθηκε να ελεγχθεί η συσχέτιση μεταξύ του αριθμού αντιγράφων σε μια περιοχή της παραλλαγής και GC.

Μέθοδοι

Ένα σύνολο από 110 ασθενείς με γαστρικό καρκίνο και 325 υγιείς εθελοντές συμμετείχαν σε αυτή μελέτη. Ψάξαμε για ένα CNV και βρήκε ένα CNV (Παραλλαγή 7468) που περιέχει μέρος του

APC

γονίδιο, το

SRP19

γονίδιο και το

REEP5

γονίδιο. Εμείς επιλέξαμε τέσσερις ανιχνευτές που στοχεύουν στο

APC-intron8

,

APC-exon9

,

SRP19

και

REEP5

να ανακρίνει αυτό το CNV. Ειδικοί ανιχνευτές Taqman επισημασμένου με διαφορετικά φθοροφόρα ρεπόρτερ χρησιμοποιήθηκαν σε μία πλατφόρμα PCR πραγματικού χρόνου για να ληφθεί αριθμό αντιγράφων. Τόσο τα αρχικά δεδομένα μη ακέραιο και μετασχηματισμένων δεδομένων ακέραιο για τον αριθμό αντιγράφων χρησιμοποιήθηκαν για τις αναλύσεις.

Αποτελέσματα

ασθενείς με γαστρικό Caner είχαν χαμηλότερο αριθμό αντιγράφων μη ακέραιο από τους ελέγχους για το

APC-exon9

καθετήρα (Προσαρμοσμένη p = 0,026) και

SRP19

καθετήρα (Προσαρμοσμένη p = 0,002). Η ανάλυση των ακέραιο αριθμό αντιγράφων απέδωσε ένα παρόμοιο μοτίβο αν και λιγότερο σημαντική (Προσαρμοσμένη p = 0,07 για

APC-exon9

καθετήρα και προσαρμοσμένα p = 0,02 για

SRP19

καθετήρα).

Συμπεράσματα

Οι απώλειες του CNV σε 5q22, ιδιαίτερα στην περιοχή του DNA που περιβάλλει

APC-εξόνιο 9

, μπορεί να σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του στομάχου.

Παράθεση : Tsai PC, Huang ΝΔ, Tsai HL, Ma CJ, Χου MF, Yang IP, et al. (2014) Ο Σύνδεσμος μεταξύ αντιγραφής του DNA Αριθμός ανωμαλιών σε χρωμόσωμα 5q22 και γαστρικού καρκίνου. PLoS ONE 9 (9): e106624. doi: 10.1371 /journal.pone.0106624

Επιμέλεια: Qing-Yi Wei, Δούκα Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29 Απρίλη 2014? Αποδεκτές: 30 Ιουλίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 11 Σεπ 2014

Copyright: © 2014 Tsai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Kaohsiung Ιατρικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο (KMUH98-8I04, KMUH98-8G05, KMUH99-9R03), Αριστεία για τον καρκίνο Κέντρο Ερευνών Grant μέσω της χρηματοδότησης από το Υπουργείο Υγείας, Εκτελεστικό Yuan, Ταϊβάν, Δημοκρατία της Κίνας (MOHW103-TD-B-111-05), και το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο της Δημοκρατίας της Κίνας (NSC 99 – 2320-Β- 037-014-my3, NSC 94-2314B037-104). Οι ιδρυτές είχαν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η τρίτη συχνότερη αιτία θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο στους άνδρες? η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η πέμπτη κορυφαία αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες [1]. Σύμφωνα με τη Διεθνή Υπηρεσία Έρευνας για τον Καρκίνο (IARC), η Ιαπωνία, η Κίνα και η Κορέα έχουν υψηλότερα ποσοστά εμφάνισης της GC [2]. Στην Ταϊβάν, GC ήταν η έκτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με το 2010 (https://www.doh.gov.tw/statistic/index.htm? Προσπελαστεί τον Ιούνιο του 2011). Γαστρικό καρκίνο είναι εξαιρετικά περίπλοκη και παρουσιάζει ετερογένεια σε κλινικές, βιολογικές και γενετικές πτυχές. Γνωστή περιβαλλοντικούς παράγοντες που επηρεάζουν GC περιλαμβάνουν

ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού (H. pylori)

μόλυνσης, διατροφικές συνήθειες, το κάπνισμα, το οικογενειακό ιστορικό, και το φύλο (υψηλότερη αρσενικό-to-θηλέων) [3]. Καθώς το οικογενειακό ιστορικό είναι ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για GC, πρόσφατες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στις γενετικών παραγόντων που παίζουν ρόλο στην GC. Διάφοροι ερευνητές έχουν τεκμηριώσει τις γενετικές αλλαγές που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του GC [4].

καρκίνο του στομάχου παρουσιάζει συχνά αργά κλινική εικόνα, και είναι συνήθως διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο και φέρνει μια κακή πρόγνωση. Η έγκαιρη ανίχνευση του GC είναι ζωτικής σημασίας για τη βελτίωση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας και τη μείωση της θνησιμότητας, ως εκ τούτου, τον εντοπισμό σχετικών γενετικών βιοδεικτών μπορεί να βοηθήσει στην έγκαιρη ανίχνευση του GC. Ένας μεγάλος αριθμός των ενώσεων μεταξύ των διαρθρωτικών αλλαγών γονιδιωματικής και της ευαισθησίας ασθένειες έχουν κατέρρευσε [5], [6]. Αρκετές συγκεκριμένες γενετικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένων επικαλύψεις και μετάλλαξη έχουν πιθανολογείται ή είναι αποδεδειγμένο ότι σχετίζεται με την εξέλιξη της GC [7]. DNA αντιγραφή παραλλαγές αριθμού (CNVs) είναι κοινά σε διάφορες καρκίνους και άλλες παραμέτρους της νόσου. Παραλλαγές σε αριθμό αντιγράφων του DNA μπορεί να είναι ένας δείκτης της υψηλού κινδύνου GC σε άτομα. Χρησιμοποιώντας συγκριτική γενωμική υβριδοποίησης (CGH) /array-CGH ανάλυση (aCGH), αρκετές περιοχές του γονιδιώματος έχουν βρεθεί σε κύτταρα GC ή GC ασθενείς να έχουν κέρδη των περιοχών DNA που περιλαμβάνει 3q26-28, 7p12-15, 7q21-22, 8q21-24 , 13q21-23, 17q21-22, 20p12, και 20q11-13 και τις απώλειες των περιοχών του DNA, συμπεριλαμβανομένων 4q26-27, 5q14-22, 9p21-23, 17p12-13 και 18q22 [8] – [13]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα σχέδια της χρωμοσωμικής αστάθειας μπορεί να συσχετίζονται με τις κλινική-παθολογική χαρακτηριστικά του GC.

Προηγούμενες μελέτες έχουν τεκμηριώσει ανωμαλίες στην αδενωματώδη πολυποδίαση coli (

APC

) γονίδιο στο χρωμόσωμα 5q22 να αποτέλεσμα στην οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση (FAP), κληρονομική μη πολυποδίαση καρκίνο του παχέος εντέρου και άλλων μορφών καρκίνου [14] – [16]. Οι πιο συχνές απώλειες του αριθμού αντιγράφων σε 5q22 σε ασθενείς GC διαφορά φυλετικής συνοψίζονται στον Πίνακα S1 στο αρχείο S1 [8] – [10], [12], [13], [17] – [22]. Μελέτες ανέφεραν ότι 15,4% στα Ιαπωνικά [10], το 35% στην κορεατική [21], και το 21% στην Turk [20] της GC ασθενών είχαν μεταλλάξεις γονιδίων σε 5q14-22. Απώλειες αριθμού αντιγράφων στο χρωμόσωμα 5q22 ευρέθηκε ότι συνδέεται σημαντικά με ιστολογικό τύπο [13], [18], [19], την κατάσταση των λεμφαδένων [12] και τη μετάσταση [12] σε ασθενείς GC. Εκτός από τη σχέση με γαστρικό καρκίνο, απώλεια 5q ήταν επίσης συχνά εμπλέκονται σε προ-κακοήθη στάδιο [17], [22]. Αυτές οι μελέτες έχουν δείξει ότι η

APC

γονίδιο μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην GC. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε τη συσχέτιση του αριθμού αντιγράφων σε 5q22 με GC στον πληθυσμό της Ταϊβάν.

Μέθοδοι

πληθυσμός Μελέτη

Ένα σύνολο 110 ασθενών GC και 325 υγιείς μάρτυρες είχαν εγγραφεί από Kaohsiung Ιατρικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Ταϊβάν. Όλοι οι ασθενείς ήταν είτε της Ταϊβάν ή της ηπειρωτικής Κίνας. Η παρουσία του GC επίσης παθολογικά επιβεβαιώθηκε. Η ιστολογική βαθμού ταξινομήθηκε σύμφωνα με τα κριτήρια της Lauren [23]. Η σταδιοποίηση του όγκου ήταν σύμφωνα με τη μεικτή επιτροπή Αμερικής σχετικά με το σύστημα του Καρκίνου (AJCC) στάσης [24]. Υποκείμενα με οποιεσδήποτε άλλες κακοήθειες αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Τα άτομα της ομάδας ελέγχου ήταν υγιείς εθελοντές που συμμετείχαν σε τακτικές εξετάσεις υγείας στο ίδιο νοσοκομείο. Κανένας από τους ελέγχους είχαν ιστορικό καρκίνου ή άλλων διαγνωστεί σημαντικές γαστρικές διαταραχές κατά τη στιγμή της εγγραφής. Τα πρωτόκολλα μελέτης και μέθοδοι έχουν εγκριθεί από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Kaohsiung Ιατρικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο. Όλοι οι συμμετέχοντες παρείχαν έγγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση πριν από την έναρξη της μελέτης.

Επιλέξτε υποψήφιο CNV του GC που σχετίζονται με

Ο υποψήφιος CNVs περιλαμβάνει το

APC

γονίδιο στο χρωμόσωμα 5q22 ανακτήθηκαν από μια δημόσια βάση δεδομένων (βάση δεδομένων γονιδιωματικής παραλλαγές, DGV, https://projects.tcag.ca/variation). Μέχρι το Νοέμβριο του 2010, η βάση δεδομένων που παρατίθενται φυσικές θέσεις για 66.741 CNVs βρίσκεται σε 15.963 κοινές περιοχές CNV. Ανάμεσά τους ήταν ένα CNV (Παραλλαγή 7468) στο 5q22 που εκτείνονται σε 127,5 kb (θέση χρωμοσώματος: 112.138.707 σε 112.266.194, με βάση την NCBI χτίσει 36 /hg18 έκδοση) που καλύπτει ένα μέρος του

APC

γονιδίων και

SRP19

γονίδιο στο μπροστινό σκέλος του DNA και το

REEP5

γονίδιο στην αντίστροφη έλικα του DNA. Με βάση τα στοιχεία array CGH από 50 υγιείς άνδρες Γαλλικά, η συχνότητα του κέρδους και της απώλειας των αντιγράφων σε αυτή την περιοχή ήταν 2% και 2%, αντίστοιχα. [25] Βιβλιογραφία δείχνει έξι μεταλλάξεις στο εναλλακτικώς-ματισμένη περιοχή του εξονίου 9 του

APC

γονίδιο να συνδέεται με FAP [26] και του παχέος εντέρου [27], αλλά καμία δεν έχει αναφερθεί σε σχέση με GC.

Εμείς επιλέξαμε δύο γειτονικών ανιχνευτές ανακρίνει intron8 και exon9 του

APC

γονιδίου, αντίστοιχα, ένας ανιχνευτής για το

SRP19

γονίδιο, και ένα ανιχνευτή για το

REEP5

γονίδιο για την ανίχνευση του αριθμού αντιγράφων του παρόντος CNV ενώ

RPPH1

χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς. Αυτοί οι ανιχνευτές είναι εμπορικώς διαθέσιμα από TaqMan (Applied Biosystems Inc (ΑΒΙ), CA, USA) και λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τους γονιδιώματα (build 36 /hg18) παρουσιάζεται στον Πίνακα S2 σε File S1 και το Σχήμα S1 σε S1 File.

Genomic παρασκευή DNA και PCR πραγματικού χρόνου για αντιγραφή

ανίχνευση αριθμός

απομόνωση DNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας εμπορικώς διαθέσιμα κιτ απομόνωσης DNA (QIAamp DNA mini kit, Qiagen, Αμβούργο, Γερμανία). RNase Α (Qiagen) χρησιμοποιήθηκε για την πέψη μονόκλωνο RNA, για την απομόνωση του RNA χωρίς DNA. Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από λευκοκύτταρα περιφερικού αίματος. DNA ποσοτικοποιήθηκε πρώτα με απορρόφηση υν (Beckman DU 640 φασματοφωτόμετρο? Beckman Coulter, Brea, CA, USA) και στη συνέχεια ενισχύθηκαν με PCR Πραγματικού χρόνου. Οι συγκεντρώσεις DNA ρυθμίστηκαν σε 10 ng /μl πριν γονότυπου. Real-Time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των Taqman ανιχνευτές σε ένα όργανο ΑΒΙ 7900HT Real-Time PCR (ΑΒΙ). Εμπορικά διαθέσιμο FAM βαφής-επισημασμένο ανιχνευτές σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν το

APC

,

SRP19

και

REEP5

. VIC χρωστική σημασμένο

ριβονουκλεάσης P RNA συστατικό H1 (RPPH1)

χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενή έλεγχο γιατί

RPPH1

έχει ακριβώς δύο αντίτυπα ανά διπλοειδή ανθρώπινο γονιδίωμα, το οποίο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 14q11.2 [ ,,,0],28]. Οι εκκινητές και ανιχνευτές σχεδιάστηκαν από γονιδιωματική αλληλουχία (build 36 /hg18) χρησιμοποιώντας το ιδιόκτητο λογισμικό ΑΒΙ. Ο προσδιορισμός του αριθμού αντιγράφων TaqMan περιείχε 1 μl

APC, SRP19 ή REEP5

καθετήρα (20x, FAM σημασμένο), 1 μl

RPPH1

μείγμα ιχνηλατών (20x, VIC επισημασμένο), 10 μl TaqMan Οικουμενική PCR Master Mix (2χ), 1,5 μl γενωμικού DNA και 6.5 μΐ ύδατος. Το πρωτόκολλο ενισχύσεως που χρησιμοποιείται για την αντίδραση είναι 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 1 λεπτό για 40 κύκλους. Ένα όριο κύκλος εγχειρίδιο κατωφλίου (Ct) του 0.2 και ένα αυτόματο βασική γραμμή χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της ποσότητας προτύπου των γονιδίων στόχων και

RPPH1

γονίδιο από ένα λογισμικό σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας (ΑΒΙ, έκδοση 2.4). Για κάθε δείγμα, τέσσερις ανιχνευτές (

APC-intron8, APC-exon9, SRP19,

και

REEP5

) εκτελέστηκαν μαζί με τον εσωτερικό έλεγχο. Οι ανιχνευτές στόχου και του εσωτερικού ελέγχου φορτώθηκαν στο ίδιο καλά και κάθε αντίδραση διεξήχθη εις τετραπλούν. λογισμικό CopyCaller (ΑΒΙ, έκδοση 1.0) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του αριθμού ακέραιο αντίγραφο του κάθε ανιχνευτή με βάση τα δεδομένα PCR πραγματικού χρόνου. Υπολογίσαμε τη μέση τιμή και την τυπική απόκλιση (SD) του τετραπλούν της ΔΟΙ για κάθε θέμα. Για τον έλεγχο της ποιότητας των δεδομένων, τα δεδομένα φιλτράρονται χρησιμοποιώντας τρία βήματα. Μόνο τα άτομα που πέρασαν και τα τρία στάδια του ελέγχου της ποιότητας των δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν στις επόμενες αναλύσεις.

Αντιγραφή ποιότητας αριθμό

ελέγχου

Για τον έλεγχο της ποιότητας των δεδομένων, τον αριθμό αντιγράφων του κάθε ανιχνευτή από την πραγματική -Time PCR διηθήθηκε από τρία βήματα. Στο πρώτο στάδιο, εξετάστηκαν τα δεδομένα από μεμονωμένες PCR πραγματικού χρόνου τρεξίματα. Τα ακόλουθα κριτήρια εφαρμόστηκε για την εξαίρεση για την ανάλυση: 1) VIC Ct & gt? 32, πιθανώς οφείλεται σε αδυναμία να ενισχύσει την εσωτερική

RPPH1

σήμα, 2) κάθε ανιχνευτή με ΔΟΙ & gt? 4,0 ή 3) FAM Ct & gt? 40 . Τα δεδομένα που συναντήθηκε με τα δύο τελευταία κριτήρια πρότεινε την αποτυχία της ενίσχυσης των ανιχνευτών στόχου, και ως εκ τούτου τα στοιχεία θεωρήθηκαν αναξιόπιστες. Μετά το πρώτο βήμα, υπολογίζεται ο μέσος όρος ΔCt για κάθε αντικείμενο μελέτης.

Το δεύτερο βήμα ήταν να αποκλείσει την ακραία της μέσης ΔΟΙ χρησιμοποιώντας ± 3 ΠΒ ως αποκοπές. Μετά από το πρώτο και δεύτερο βήματα, ο αριθμός αντιγράφων του κάθε ανιχνευτή για κάθε άτομο υπολογίστηκε από τον τύπο 2

-ΔΔCt × 2. Κατά συνέπεια, ο αριθμός αντιγράφων μπορεί να μην είναι ένας ακέραιος αριθμός. Δεδομένου ότι ο αριθμός αντιγράφων είναι θεωρητικά ένας ακέραιος, ακολουθήσαμε περαιτέρω τις κατευθυντήριες γραμμές του λογισμικού CopyCaller να εκτιμηθεί το ακέραιο κάθε αριθμού αντιγράφων χρησιμοποιώντας μέθοδο αυτόματης μέγιστη ανάλυση πιθανότητας, με βάση την κατανομή πυκνότητας πιθανότητας σε όλα τα δείγματα.

Τέλος , σύμφωνα με την κατανομή του αριθμού ακέραιο αντίγραφο, ένα τυποποιημένο βαθμολογία ζ και η τιμή εμπιστοσύνης υπολογίσθηκαν. Μια υψηλότερη απόλυτη τιμή για την τυποποιημένη βαθμολογίας z και μια χαμηλότερη τιμή εμπιστοσύνης συνεπάγεται μεγαλύτερη διακύμανση. Όπως προτείνεται από τις κατευθυντήριες γραμμές χρήσης του λογισμικού CopyCaller (ΑΒΙ, έκδοση 1.0), το τρίτο βήμα για τον έλεγχο της ποιότητας των δεδομένων είναι να αποκλείσει δείγματα που συναντήθηκε με δύο από τα ακόλουθα κριτήρια: 1) η απόλυτη τιμή της βαθμολογίας z & gt? 2,65 και 2) η αξία της εμπιστοσύνης & lt? 0,9. Μόνο οι συμμετέχοντες που πέρασαν και τα τρία στάδια του ελέγχου της ποιότητας των δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν στις επόμενες αναλύσεις.

Στατιστική Ανάλυση

Επειδή λίγες μόνο από τους συμμετέχοντες είχαν αριθμό αντιγράφων μεγαλύτερο από 3 ή λιγότερο από το ένα, ο αριθμός αντίγραφο κατηγοριοποιούνται σε τρεις ομάδες (≤1, = 2, ή ≥3). Για να ελέγξετε για τη σύνδεση μεταξύ της κατηγορίας των αριθμό των αντιγράφων για κάθε κατάσταση καθετήρα και την ασθένεια, χρησιμοποιήσαμε λογιστικής παλινδρόμησης με προσαρμογή για την ηλικία και το φύλο. υπολογίστηκαν λόγοι πιθανοτήτων (OR) και 95% διαστήματα εμπιστοσύνης τους (ΠΙ). Υπολογίσαμε επίσης το ποσοστό αντιστοιχίας της κατηγορίας αριθμού αντιγράφων στους τέσσερις ανιχνευτές. Η δοκιμή τάση Cochran-Armitage χρησιμοποιήθηκε για να βρεθεί η γραμμική σχέση μεταξύ του αριθμού αντιγράφων των ανιχνευτών στόχο και τον κίνδυνο GC. t του Student και Mann-Whitney U (αν όχι κανονικά κατανεμημένα) χρησιμοποιήθηκαν για σύγκριση του αριθμού αντιγράφων του κάθε ανιχνευτή μεταξύ των ασθενών GC και υγιείς μάρτυρες. Ένα δίπλευρη τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με JMP έκδοση λογισμικού 9.0 (SAS Institute Inc., NC, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Αποτελέσματα

Τα άτομα της μελέτης

Όλα τα 110 ασθενείς GC και 325 άτομα της ομάδας ελέγχου είχαν αντιγραφή αριθμός πληροφορίες για τουλάχιστον έναν από τους τέσσερις ανιχνευτές στο 5q22. Η κατανομή των τιμών αριθμού αντιγράφων για κάθε ανιχνευτή φαίνεται στο Σχήμα 1. ασθενείς GC ήταν σημαντικά μεγαλύτερα από τους υγιείς μάρτυρες (ηλικίας? Μέση ± SD: ασθενείς GC = 66,5 ± 13,8, Controls = 62,5 ± 9,7? P = 0,001). Οι άνδρες αντιπροσώπευαν ένα μεγαλύτερο ποσοστό (61,8%) των ασθενών GC, αλλά περιελάμβανε μόνο το 46,4% των υγιών μαρτύρων (p = 0,005). Μεταξύ των ασθενών GC, 55 είχαν

H. pylori

λοίμωξη, 28 δεν είχαν μολυνθεί από

H. του πυλωρού,

και 27 δεν είχε τέτοιες πληροφορίες. 37 των ασθενών GC είχε ταξινόμηση ιστολογική της Lauren (19 διάχυτη, 16 εντερική, και 2 μικτά υποτύπους)? 34 είχε βαθμού διαφοροποίησης (3 καλά διαφοροποιημένο, 9 μετρίως διαφοροποιημένες και 22 ανεπαρκώς διαφοροποιημένη)? 45 είχε AJCC το στάδιο του όγκου (12 στάδιο Ι, 7 το στάδιο ΙΙ, 13 σταδίου ΙΙΙ και 13 σταδίου IV).

Α.

APC_intron8

? Β

APC_exon9

? Γ

SRP19

? D:

REEP5

. * Γραμμή αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή του αριθμού αντιγράφων μη ακέραιο στις ομάδες GC και υγιείς ομάδες,

† Adj_p:. Προσαρμογή για την ηλικία και το φύλο

Η

Σύνδεσης μεταξύ CNV και γαστρικό καρκίνο

Όπως ήταν αναμενόμενο, οι περισσότεροι από τους συμμετέχοντες στη μελέτη είχαν 2 αντίγραφα του κοντινού τμήματος CNV: κυμαίνονται 78,2 έως 92,6% μεταξύ των 4 ανιχνευτές στους ελέγχους και 87,3 έως 93,6% στους ασθενείς που GC. Η σύμφωνη ποσοστό για τον αριθμό αντιγράφων σε όλες τις 4 ανιχνευτές κυμαίνονταν 80,5 έως 93,1% (Πίνακας S3 στο αρχείο S1). Αυτός ο αριθμός αντιγράφων ήταν συχνά μεταβλητή σε μια μεγαλύτερη περιοχή των γνωστών λειτουργικών

APC

και

SRP19

. Ως εκ τούτου, οι μεταβολές θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν το μήκος απόστασης και λειτουργικές παραλλαγές (Πίνακας S3 σε File S1). Για τον ανιχνευτή του

APC-exon9

, 9,1% των ασθενών GC ανήκε για να αντιγράψετε τον αριθμό της κατηγορίας 3, ενώ το 17,5% των ελέγχων ήταν στην κατηγορία 3 (OR = 0,48, 95% CI: 0,22 – 0,93? ακάθαρτο ρ = 0,04, η ηλικία /φύλο προσαρμοσμένο ρ = 0,07, Πίνακας 1). Παρομοίως, λιγότεροι ασθενείς GC ήταν στην κατηγορία 3 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου για τις άλλες τρεις ανιχνευτές, αλλά οι διαφορές δεν ήταν σημαντικές (Πίνακας 1). Επιπλέον, παρατηρήθηκε μία δοσο-εξαρτώμενη σχέση ανάμεσα GC και του αριθμού αντιγράφου του ανιχνευτή για

APC-exon9

(Πίνακας 1). Αυτό σημαίνει ότι οι έλεγχοι έτειναν να έχουν υψηλότερο ποσοστό κέρδους του αριθμού αντιγράφων από τις περιπτώσεις με μια τάση p αξίας 0.026 (ηλικία /προσαρμοστεί σεξ p = 0,067 για τη δοκιμή τάσης).

Η

Επειδή η αριθμός αντιγράφων υπολογίσθηκε από τα δεδομένα PCR πραγματικού χρόνου, ο αρχικός αριθμός αντιγράφων δεν ήταν ένας ακέραιος και κανονικά δεν διανέμεται. Ως εκ τούτου, έχουμε δοκιμάσει επίσης την μη παραμετρική συσχέτιση μεταξύ των δεδομένων μη ακέραιο για τον αριθμό αντιγράφων και την κατάσταση της νόσου. Οι διάμεσοι και ενδοτεταρτημοριακό εύρος (IQRs) του αριθμού αντιγράφων του κάθε ανιχνευτή (

APC-intron8, APC-exon9, SRP19,

και

REEP5

) συγκρίθηκαν μεταξύ ασθενών GC και υγιείς μάρτυρες ( Τραπέζι 1). Παρόμοια με τα αποτελέσματα από τον ακέραιο αριθμό αντιγράφων, οι ασθενείς GC είχαν σημαντικά χαμηλότερο αριθμό αντιγράφων σε σύγκριση με τους ελέγχους για το

APC-exon9

(αργού σ για την δοκιμασία t = 0.006, p αργού για Mann-Whitney U test = 0.013, το φύλο /ηλικία προσαρμοσμένο p = 0,026) και

SRP19

(αργό σ για την δοκιμασία t = 0,0004, p αργού για Mann-Whitney U test = 0.017, το φύλο /ηλικία προσαρμοσμένο p = 0,002) ανιχνευτές (Σχήμα 1Β και το Σχήμα 1 C). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά για τις άλλες δύο ανιχνευτές CNV (

APC-intron8

και

REEP5

) (Σχήμα 1Α και το Σχήμα 1 D). Περαιτέρω ανάλυση των συσχετισμών μεταξύ του αριθμού αντιγράφων και GC κλινικών παθολογικών ταξινομήσεων, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά αντίγραφο αριθμό στο εξόνιο 9 του

APC

γονίδιο ανεξάρτητα από ιστολογικές, βαθμούς διαφοροποίησης ή το στάδιο TNM, που μπορεί να οφείλεται σε μικρά μεγέθη δείγματος (Πίνακας 2).

η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε 4 ανιχνευτές για να διερευνήσει τη σχέση μεταξύ αντιγράφου παραλλαγή αριθμό στο χρωμόσωμα 5q22 και GC. Η περιοχή αυτή καλύπτει τρία γονίδια: το 3 ‘άκρο του

APC

γονίδιο, το σύνολο του

SRP19

γονίδιο, και το 3′ του

REEP5

γονίδιο. Για τον ανιχνευτή του

APC-exon9

, ο έλεγχος είχε υψηλότερες τιμές αριθμό αντιγράφων από τους ασθενείς GC και στις τρεις αναλύσεις (δηλαδή, αντίγραφο της κατηγορίας αριθμός, δοκιμή τάσης, καθώς και τον αριθμό αντιγράφων μη-ακέραιος αριθμός). Ο ανιχνευτής του

SRP19

είχαν επίσης σημαντικά υψηλότερο αριθμό αντιγράφων (με βάση αντίγραφο της κατηγορίας αριθμό και μη ακέραιο αναλύσεις) στους ελέγχους από ό, τι σε ασθενείς με GC. Για το

APC-intron8

και

REEP5

ανιχνευτές, οι τιμές του αριθμού αντιγράφων δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των ασθενών GC και την ομάδα ελέγχου σε οποιαδήποτε από τις τρεις αναλύσεις. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δείχνουν ότι ένας μειωμένος αριθμός αντιγράφων στην περιοχή της CNV μπορεί να σχετίζεται με υψηλότερο κίνδυνο καρκίνου του στομάχου.

Ο

APC

γονίδιο περιέχει 15 εξόνια βρίσκεται στο χρωμόσωμα 5q21-22. Οι περισσότερες μεταλλάξεις του

APC

γονίδιο παρατηρήθηκαν στο εξόνιο 15 σε FAP ασθενείς [26] και οι ασθενείς GC [29]. Έξι μεταλλάξεις στο εναλλακτικώς-ματισμένη περιοχή του εξονίου 9 τεκμηριωθεί ότι σχετίζονται με FAP [26] και του παχέος εντέρου [27], αλλά αυτές οι μεταλλάξεις δεν έχουν αναφερθεί ότι συνδέονται με GC. Αυτή η μελέτη είναι η πρώτη που αναφέρει τη συσχέτιση μεταξύ του αριθμού αντιγράφων σε

APC-exon9

και GC. Μια πιθανή Wnt /β κατενίνης /Tcf σηματοδότηση μεταγωγής μονοπάτι συνδέεται με APC έχει αναφερθεί για GC [30]. Μία κύρια λειτουργία του APC θεωρείται ότι ρυθμίζει τα δωρεάν κατενίνης β και έτσι απώλεια της λειτουργίας APC μπορεί να οδηγήσει σε αστάθεια του β συμπλόκου κατενίνης και την κυτταρική συσσώρευση του β κατενίνης. Κατά τη μετατόπιση προς τον πυρήνα, β κατενίνης χρησιμεύει ως ενεργοποιητής της μεταγραφής κυττάρων Τ που εξαρτώνται από παράγοντα, οδηγώντας σε αυξημένη έκφραση διαφόρων ειδικών γονιδίων στόχο που μπορεί να εμπλέκονται στην εμφάνιση των γαστρικών αλλοιώσεων που κυμαίνονται από χρόνια γαστρίτιδα, γαστρικό ατροφία, η μετάπλαση του εντέρου , δυσπλασία να τελικά αδενοκαρκίνωμα στομάχου [31].

Η πλατφόρμα CGH έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για μελέτες του καρκίνου, και οι ανιχνευτές αυτής της πλατφόρμας συχνά καλύπτουν μια περιοχή DNA της περιοχής DNA περισσότερο από 1 kb. Ως εκ τούτου, η προσέγγιση CGH είναι περιορισμένη σε εντοπίζοντας CNV τμήματα όταν οι αλλαγές είναι μικρότερη από 1 kb. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ειδικούς ανιχνευτές TaqMan επισημαίνονται με διαφορετικά φθοροφόρα ανταποκριτή (VIC και FAM) σε μία αντίδραση. Αυτή η προσέγγιση μας επέτρεψε να ανιχνεύσουν μια πιο λεπτή αλλαγή DNA. PCR ενίσχυση για κάθε ελεγχόμενο καθετήρα με βάση την ΑΒΙ TaqMan έχουν αξιολογηθεί ότι είναι σχεδόν 100% αποτελεσματική [32]. Πρόσφατα, αυτή η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για άλλες ασθένειες, όπως η ηλικία εκφύλιση της ωχράς κηλίδας και του αλλεργικού άσθματος [33], [34]. Πριν αριθμού αντιγράφων του γονότυπου, γονιδιωματική συγκεντρώσεις DNA μας ήταν αυστηρά ποσοτικά και ελέγχονται με τη χρήση δύο ανεξάρτητων μεθόδων: απορρόφηση UV (ορθολογική φάσμα αναλογία OD 260/280: 1,8 ± 0,2) και PCR ενίσχυση του

RPPH1

(ορθολογική σειρά Ct του VIC: 25-27). Ενίσχυση του

RPPH1

πραγματοποιήθηκε την ίδια και τον ανιχνευτή για την προστασία από τεχνητή παραλλαγές (όπως οι διαφορές σε φόρτωση DNA ή λανθασμένη ανίχνευση του null γονότυπου). Ως εκ τούτου, η μέθοδος μας μπορεί να θεωρηθεί ότι είναι αξιόπιστα για ποσοτικό χαρακτηρισμό του αποσπασματική CNV. Με βάση τα προηγούμενα πειράματα CGH, μελέτες έχουν αναφέρει ότι το 2% των αντιγράφων απώλειας και 2% των αντιγράφων κέρδος στο 5q22 σε υγιείς άνδρες Γαλλικά [25]. Χρησιμοποιήσαμε ανιχνευτές TaqMan, τα οποία έχουν μια υψηλότερη ανάλυση για την ανίχνευση ενός μικρότερου περιοχή διακύμανσης αριθμό αντιγράφων, και βρήκε ότι το ποσοστό των αντιγράφων απώλεια στις 4 ανιχνευτές κυμαίνονταν από 0 έως 2,7% κατά τους υγιείς Ταϊβάν. Ωστόσο, ένα μεγαλύτερο ποσοστό των αντιγράφων κέρδος που κυμαίνεται από 2,7% (

REEP5

) σε 14,1% (

APC-exon9

), παρατηρήθηκαν στις υγιείς άνδρες. Παρόμοια με τα στοιχεία για τους άνδρες συμμετέχοντες, η συχνότητα του κέρδους αντίγραφα του

APC-exon9

ήταν επίσης υψηλό για τις γυναίκες συμμετέχοντες (20,2% των αντιγράφων κέρδος). Ωστόσο, μια άλλη μελέτη που διερεύνησε την ιαπωνική πληθυσμού ανέφερε επίσης ένα υψηλότερο ποσοστό (20,6%) του αριθμού αντιγράφων κέρδος σε 5q, όπου βρίσκεται η CNV μας ερευνήθηκε [9].

Όπως ήταν αναμενόμενο, οι περισσότεροι συμμετέχοντες είχαν 2 αντίγραφα του CNV τμήμα μεταξύ των τεσσάρων ανιχνευτές σε όλα τα υποκείμενα. Μόνο μια σύμφωνη ποσοστό 80% παρατηρήθηκε μεταξύ των αριθμών αντίγραφο μετράται από το

APC-exon9

καθετήρα και το

SRP19

καθετήρα (Πίνακας S3 στο S1 αρχείου). Αυτό είναι στην πραγματικότητα το χαμηλότερο ποσοστό αντιστοιχία όλων των κατά ζεύγη ποσοστά μεταξύ των ανιχνευτών, παρ ‘όλα αυτά, οι δύο ανιχνευτές ήταν σημαντικά σχετίζονται με GC. Είναι πιθανό ότι παραλλαγή 7468 δεν είναι μια συνεχής CNV, αλλά θεωρείται έτσι επειδή αναγνωρίστηκε χρησιμοποιώντας array CGH, μια τεχνική με χαμηλότερη ανάλυση από τις διαθέσιμες σήμερα (δηλαδή, θα μπορούσε να αποτελείται από αρκετές μικρότερες περιοχές με μεταβλητούς αριθμούς αντιγράφων) . Ως εκ τούτου, η μεταβλητή όριο του γονιδίου θα μπορούσε να περιοριστεί από το

APC-exon9 να SRP19

. Όσον αφορά το μέτωπο του

APC-exon9

ανησυχεί, εάν υπάρχουν και άλλες μεταβλητές περιοχές που σχετίζονται με GC απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Σε αυτή τη μελέτη, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στον αριθμό αντιγράφων μεταξύ των ασθενών GC και τους ελέγχους σε

APC-intron8

ακόμα και

APC-intron7

(τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Όπως συμβαίνει με τις περισσότερες ερευνητικές προσπάθειες, η μελέτη μας είχε περιορισμούς. Το μέγεθος του δείγματος που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη μπορεί να μην ήταν επαρκής για την ανίχνευση ενός CNV με μια μικρή επίδραση. Επιπλέον, έχουμε περιορισμένες πληροφορίες για κλινική παθολογικά χαρακτηριστικά (όπως

H. Pylori

μόλυνση, ιστολογική βαθμολογία, βαθμός διαφοροποίησης και το στάδιο του όγκου που καθιστά δύσκολο για τις δοκιμές αλληλεπίδρασης CNV και αυτών των παραμέτρων. Περισσότερα υποκείμενα που χρειάζεται για να επιβεβαιωθεί Αυτό το αποτέλεσμα στο μέλλον. Συμπερασματικά, οι απώλειες ενός CNV στο 5q22 (Παραλλαγή 7468), ιδιαίτερα στην περιοχή του DNA που περιβάλλει APC-εξόνιο 9, μπορεί να σχετίζεται με υψηλότερο κίνδυνο καρκίνου του στομάχου. η απώλεια αυτής της CNV μπορούν να χρησιμεύσουν ως ένα μυθιστόρημα βιοδείκτη για τον εντοπισμό των ατόμων υψηλού κινδύνου. Παρ ‘όλα αυτά, μια μεγάλη ένωση-μελέτη είναι αναγκαία για να επιβεβαιώσει τη χρησιμότητα αυτού του βιοδείκτη και λεπτομερής μηχανισμός μένει να διευκρινιστεί.

Υποστήριξη Πληροφορίες

αρχείου S1.

σε συνδυασμό Στήριξη αρχείο πληροφοριών. πίνακα S1 στο S1 αρχείου. γενετική ανωμαλία στο χρωμόσωμα 5q22 σε μελέτες GC. Πίνακας S2 σε S1 αρχείου. Οι πληροφορίες από τέσσερις ανιχνευτές στο χρωμόσωμα 5q22 και εσωτερικό ανιχνευτή στο χρωμόσωμα 14q11. πίνακα S3 στο S1 αρχείου. Η συμφωνία του αριθμού αντιγράφων μεταξύ κάθε γειτονικού καθετήρα (110 ασθενείς GC και 325 υγιείς μάρτυρες). Εικόνα S1 στο S1 αρχείου. Οι θέσεις των τεσσάρων ανιχνευτών στο CNV που περιέχει

APC /SRP19 /REEP5

γονίδια

doi:. 10.1371 /journal.pone.0106624.s001

(DOCX)