Αφηρημένο

Η υποξία έχει συσχετισθεί με κακοήθη εξέλιξη, μετάσταση και η αντίσταση στη θεραπεία. Ως εκ τούτου, μελετήσαμε την έκφραση των γονιδίων υποξία ρυθμίζεται σε 100 καρκίνο του προστάτη (ΚΓΠ) χύμα ιστούς και τα 71 γειτονικά καλοήθεις ιστούς. Βρήκαμε 24 μεταγραφές σημαντικά υπερεκφράζεται (p≤0.02). Είναι σημαντικό, τα υψηλότερα επίπεδα μεταγραφής του δίσκου μεγάλο (Drosophila) ομόλογο-πρωτεΐνη που συνδέεται με 5 (DLGAP5) /δίσκους μεγάλο ομόλογο 7 (DLG7) /ηπάτωμα up-ρυθμιζόμενη πρωτεΐνη (hurp), υαλουρονικό μεσολάβηση υποδοχέα κινητικότητα (HMMR) και κυκλίνης Β1 (CCNB1 ) συνδέθηκαν με υψηλότερα σκορ Gleason και πιο προηγμένες συστηματική εξέλιξη. Δεδομένου ότι τα προϊόντα της HMMR και CCNB1 έχουν αναγνωριστεί πρόσφατα ως μοριακοί δείκτες της εξέλιξης καπάκι, έχουμε δεδομένο ότι DLG7 έχει προγνωστική αξία πάρα πολύ. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, μετρήσαμε τα επίπεδα μεταγραφής για DLG7 σε 150 ζεύγη ομάδα-μαρτύρων. Οι περιπτώσεις (εξέλιξης σε συστηματική νόσο εντός έξι ετών από την επέμβαση) και τους ελέγχους (χωρίς εξέλιξη εντός οκτώ ετών) ήταν συμφωνημένα για την κλινική και παθολογική προγνωστικές μεταβλητές, συμπεριλαμβανομένων βαθμό, το στάδιο, και προεγχειρητική τα επίπεδα του PSA στον ορό. Η συνολική προγνωστική ικανότητα του DLG7, όπως δοκιμάστηκε στην λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη ανάλυση ήταν 0,74 (95% CI, 0,68 έως 0,8). Συνολικά, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η έκφραση του DLG7, ένα γονίδιο υποξία-ελεγχόμενη, κατέχει προγνωστικό δυναμικό σε Cap υψηλού κινδύνου? Αυτό αποδεικνύει επίσης ότι η μεταβολή της τάσης του οξυγόνου μπορεί να αποτελέσει ένα εργαλείο για την ταυτοποίηση νέων βιοδεικτών για κάλυμμα

Παράθεση:. Gomez CR, Kosari F, Munz J-M, Schreiber CA, Knutson GJ, Ida CM, et al. (2013) προγνωστική αξία της Δίσκοι Μεγάλο ομόλογο 7 Απομαγνητοφώνηση Επίπεδα στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 8 (12): e82833. doi: 10.1371 /journal.pone.0082833

Επιμέλεια: Sharon Α Glynn, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ιρλανδίας Galway, Ιρλανδία

Ελήφθη: May 20, 2013? Αποδεκτές: 29 Οκτωβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 9 Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Gomez et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από DOD PC094680 (CRG), Βραβείο PCF δημιουργικότητα (CRG), Μινεσότα εταιρικής σχέσης για τη βιοτεχνολογία και την ιατρική Genomics (GV), και Mayo Clinic προστάτη SPORE 5P50CA091956 (FK). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο ρόλος της τάσης οξυγόνου (

δυνα oxygenii

,

σ

O

2) στη βιολογία του όγκου υπήρξε παραγνωρισμένος για μεγάλο χρονικό διάστημα? ένας λόγος για αυτό ήταν η σχετική οξυγόνο ανεξαρτησία των όγκων ( «το αποτέλεσμα Warburg»?. διαιτητή [1]), που οδήγησε στην υπόθεση της ευαισθησίας του όγκου στις μεταβολές της τάσης οξυγόνου. Πιο πρόσφατα, που σχετίζονται με όγκους υποξία έχει συσχετιστεί με κακοήθη εξέλιξη, μετάσταση, την αντίσταση στη θεραπεία, και η κακή κλινική έκβαση [2,3]. Από κοινού με άλλους συμπαγείς όγκους,

σ

O

2 στον καρκίνο του προστάτη (ΚΓΠ) αυξομειώνεται, προκαλώντας οξείες και χρόνιες υποξία [4]. Ορισμένοι ισχυρίζονται ότι η χαμηλή

σ

O

2 είναι ένας ανεξάρτητος δείκτης κακής κλινική έκβαση για ασθενείς CaP [5], αλλά

σ

O

2 τιμές που μετρώνται στα nidus CaP δεν συσχετίζονται πάντα με την κλινική έκβαση [4] που υποδηλώνει την ανάγκη για πιο σχετική υποξία σχετίζεται βιοδείκτες των επιθετικών Κεφ.

Σήμερα χρησιμοποιούνται δείκτες που προβλέπουν το αποτέλεσμα σε άνδρες με καπάκι περιλαμβάνει το σκορ Gleason, το στάδιο TNM, χειρουργική περιθώριο κατάσταση, και προεγχειρητική επίπεδα του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) [6-8] του ορού. Ενώ διαστρωμάτωση από αυτές τις μεταβλητές συχνά προβλέπει αποτελεσματικά την πορεία της νόσου, οι όγκοι με παρόμοιες βιοχημικές, ιστοπαθολογικές και κλινικές συνθήκες μπορεί ακόμα συμπεριφέρονται πολύ διαφορετικά. Πρόσφατα, μελέτες μεταγραφικό της ΚΓΠ, εντοπίστηκε αρκετά γονίδια που συνδέονται με την έκβαση της νόσου. Μεταξύ αυτών, η έκφραση των μορίων υποξία ρυθμίζεται [δηλ, του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), υποξία παράγοντα (HIF) -1, οστεοποντίνη, λυσυλο οξειδάση (LOX) και γλυκόζη μεταφορέα-1 (GLUT-1)] συσχετίζεται με παθολογική κατάσταση και ο ασθενής χαρακτηριστικά (αναθεωρηθούν διαιτητή [4].). Αυτές οι μελέτες δείχνουν τη σκοπιμότητα της αναγνώρισης βιοδεικτών που συνδέει καπάκι, υποξία και την πρόγνωση και τον καθορισμό της συμβολής των γονιδίων υποξίας που σχετίζονται με Cap εξέλιξη. Ταυτοποίηση βιοδεικτών υποξία που σχετίζονται μπορεί να βοηθήσει στον εντοπισμό των ασθενών που θα μπορούσαν να επωφεληθούν από θεραπείες υποξία στοχευμένες [4]. Εδώ αναφέρουμε τη μελέτη της μεταγραφής των γονιδίων, προηγουμένως βρεθεί υπό τον έλεγχο υποξία, σε ασθενείς καπάκι. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η υποξία-ευαίσθητα γονίδια έχουν προγνωστική αξία σε Cap υψηλού κινδύνου και ότι η μεταβολή της τάσης του οξυγόνου μπορεί να αποτελέσει ένα χρήσιμο εργαλείο για την περαιτέρω ταυτοποίηση βιοδεικτών για την ΚΓΠ.

Υλικά και Μέθοδοι

καρκίνο του προστάτη μεταγραφικό

Όλες οι μελέτες σε αυτήν την έκθεση, εγκρίθηκαν από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review Mayo Clinic. Σε γενικές γραμμές, ακολουθήσαμε προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο μας [9]. Εν συντομία, χρησιμοποιήσαμε κατεψυγμένου ιστού για να μελετηθεί η μεταγραφικό σε καρκινικά κύτταρα απομονώθηκαν με λέιζερ-σύλληψη μικροδιατομής (LCM) ή χωρίς απομόνωση ( «χύμα ιστός»). Τα δείγματα ελήφθησαν από μη νεοπλασματικό ιστό προστάτη, πρωτογενή καρκίνο του προστάτη, και μεταστάσεων καρκίνου του προστάτη. Οι λεπτομέρειες των κατεψυγμένων συλλογής δείγματος, τη συντήρηση, την τομή, χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης, παθολογικές εκτίμηση, LCM, ανάλυση της ακεραιότητας του RNA, και γραμμική ενίσχυση ήδη δημοσιευθεί [10]. Έχουμε λάβει και ανέλυσε το μεταγραφικό των 102 δειγμάτων καρκίνου του προστάτη κυττάρων LCM-απομονωθεί? 19 δείγματα μη-νεοπλαστικών επιθήλιο του προστάτη πλησίον του όγκου? 10 δείγματα της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη (ΒΡΗ)? και πέντε δείγματα από την υψηλού βαθμού προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (HGPIN). δείγματα όγκων που περιλαμβάνονται Gleason μοτίβο (GP) 3 κύτταρα από 28 αποτέλεσμα Gleason (GS) (3 + 3) ασθενείς και τρεις GS (3 + 4) ασθενείς? κύτταρα GP4 από 10 GS (4 + 4) ασθενείς, 4 GS (4 + 3) ασθενείς, και 6 GS (4 + 5) ασθενείς? και GP5 κύτταρα από 5 GS (5 + 5) ασθενείς και 5 GS (5 + 4) ασθενείς. δείγματα όγκων περιλαμβάνονται επίσης επτά μεταστάσεις καπάκι από λεμφαδένες. προφίλ Έκφραση δείγματα χύμα (n = 37) ελήφθησαν από ασθενείς υψηλού κινδύνου με GS7 και υψηλότερο? Αυτοί οι όγκοι ήταν ανεξάρτητες από αυτές που υποβλήθηκε σε απομόνωση κυττάρων με LCM. Τα δείγματα που περιλαμβάνονται όγκων από 18 ασθενείς των οποίων η νόσος προχωρήσει συστηματικά και οι οποίοι έχασαν τη ζωή τους σε λιγότερο από έξι χρόνια μετά την επέμβαση (επιθετική νόσο) και 19 ασθενείς που επέζησαν πάνω από οκτώ χρόνια μετά τη χειρουργική επέμβαση (μη-επιθετική νόσο). έκβαση της νόσου δεν αποκαλύφθηκε στους ερευνητές σε αυτή τη μελέτη πριν από την ολοκλήρωση των πειραμάτων και τη σύναψη όλων των ανάλυσης.

Probe ορίσετε τιμές έκφρασης ελήφθησαν από τα στοιχεία των πρώτων μικροσυστοιχιών (.cel αρχεία) χρησιμοποιώντας το πακέτο gcrma στο Έργο R για στατιστικούς υπολογισμούς (https://www.r-project.org/). Για περαιτέρω ανάλυση επιλέξαμε οι ιχνηλάτες υπερεκφράζονται διπλάσια ή μεγαλύτερη σε Cap πάνω από τα μέσα επίπεδα έκφρασης σε μη νεοπλασματικά ιστούς του προστάτη και των ιστών ΒΡΗ, τόσο χύμα και σε κύτταρα LCM-απομονώνεται.

Case-έλεγχος ταίριασμα των ανδρών με υψηλού κινδύνου καρκίνο του προστάτη

εκατόν πενήντα άνδρες των οποίων CaP συστηματικά προχωρήσει (SP, τεκμηριωμένη με βιοψία ή ακτινολογική απόδειξη μεταστάσεων) ή οι οποίοι έχασαν τη ζωή τους με μεταστατικό CaP εντός έξι ετών από προστατεκτομή εντοπίστηκαν στη Mayo Clinic Ριζοσπαστικής βάση δεδομένων προστατεκτομή για τα έτη 1994 έως 2004. Τα δείγματα ιστού για εκείνους τους ασθενείς που είχαν αρχειοθετηθεί? αποδείξεις για ανακάλυψη βιοδεικτών και τα σχέδια επικύρωσης για αυτή την ομάδα μελέτης έχουν δημοσιευθεί προηγουμένως από εμάς [9,11,12]. Ένα μηχανογραφημένο σύστημα [7] ταιριάζουν αυτούς τους ασθενείς με 150 άνδρες τον έλεγχο των οποίων η νόσος δεν εμφάνισε εξέλιξη και ποιος δεν πέθανε για τουλάχιστον οκτώ χρόνια παρακολούθησης? κριτήρια ταύτισης που περιλαμβάνονται σκορ Gleason, το στάδιο TNM, το καθεστώς του περιθωρίου κέρδους, προεγχειρητική PSA, και η βαθμολογία GPSM (Πίνακας 1). Πολυπαραγοντική ανάλυση που περιλάμβανε DLG7 και οποιαδήποτε από τις κλινικές παραμέτρους δεν προσθέτουν στην ακρίβεια του μοντέλου σε σχέση με ένα μοντέλο που περιλαμβάνεται DLG7 μόνο. Δείγματα τυφλώθηκαν για την κλινική κατάσταση και επανεξετάζονται από J.C.C., έναν παθολόγο πίνακας-επικυρωμένο. Από το σύνολο των 300 δειγμάτων, 141 δείγματα SP και 117 δείγματα ελέγχου επιλέχθηκαν με κριτήρια παθολογίας και από το γεγονός ότι παρέχεται επαρκής ιστός του υψηλότερου προτύπου Gleason για πειραματική ανάλυση. Για τους ασθενείς SP η διάμεση παρακολούθηση από ριζική προστατεκτομή με την εξέλιξη ή την τελευταία παρακολούθησης ήταν 2,4 χρόνια? για ασθενείς της ομάδας ελέγχου η διάμεση παρακολούθηση ήταν 13,2 έτη.

Η ελέγχει

υποθέσεις

τιμή p

†

Παθολογική Gleason σκορ (GS) 0.77GS542GS654GS76182GS82317GS93738GS1012TNM stage0.46T2aN0129T2bN02721T3aN02033T3b4N03454TxN + 2928Margin status0.540455518690Preoperative PSA0.67mean ορού (εύρος) ng /ML19 0.0 (0,9-119) 20,1 (1,3-143) GPSM0.56mean (εύρος) 11,5 (6,0 έως 16,0) 11,7 (6,0 έως 16,0). Πίνακας 1. Κλινικά τιμές παραμέτρων σε περιπτώσεις και τους ελέγχους

† p τιμαί αναφέρονται στη σύγκριση των περιπτώσεων και ελέγχων. CSV Λήψη CSV

εκχύλιση RNA και PCR πραγματικού χρόνου για τη μελέτη

περίπτωση ελέγχου

αιματοξυλίνη και τμήματα όγκου ηωσίνη-βάφονται λαμβάνονται από μπλοκ παραφίνης-ενσωματωμένο φορμόλη σταθερό τυφλώθηκαν σε σχέση με το αν ανήκαν δείγματα SP ή δείγματα ελέγχου? οι τομές εξετάστηκαν από παθολόγους C.M.I. και J.C.C. που έχουν ανατεθεί τα πρωτοβάθμια και δευτεροβάθμια, αλλά όχι τριτοβάθμια πρότυπα Gleason. Το μπλοκ αποδίδεται την υψηλότερη βαθμολογία για την πρωτογενή ή δευτερογενή μοτίβο Gleason και περιέχει την πιο ιστός του όγκου του εν λόγω προτύπου επιλέχθηκε για περαιτέρω ανάλυση. Κάθε μπλοκ ήταν χωρισμένο σε 10 μm πάχους τομές. Όγκου ιστός αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και ξύνεται από το κλείστρο υπό RNase-free συνθήκες σε 1.5 κ.εκ. σωληνάριο που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα πέψης (kit RecoverAll, Ambion, Carlsbad, CA). Οι λεπτομέρειες σχετικά με την εξαγωγή RNA από μπλοκ παραφίνης και τον έλεγχο της ποιότητας έχουν δημοσιευθεί νωρίτερα [9]. Ολικό RNA απομονώθηκε σύμφωνα με τη διαδικασία που RecoverAll και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ϋΝάση χρησιμοποιώντας Ambion Turbo ελεύθερο DNA Kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. RNA ποσοτικοποιήθηκε με το κιτ Quant-iT RiboGreen (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ποσοτική PCR χρησιμοποιήθηκε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [11] για την αξιολόγηση των επιπέδων μεταγραφής για τους δίσκους μεγάλο ομόλογο 7 (DLG7) [γνωστός και ως δίσκος μεγάλο (Drosophila) ομόλογο πρωτεΐνης που συνδυάζεται 5 ή ηπάτωμα επάνω ρυθμισμένη πρωτεΐνη], υαλουρονάνη μεσολάβηση υποδοχέα κινητικότητα (HMMR) και κυκλίνης Β1 (CCNB1). Εμείς αντίστροφα μεταγραμμένο 500 ng RNA σε 40 μΙ όγκου αντιδράσεως με χρήση Superscript III First Strand Synthesis System (Invitrogen). Εκκινητές για ποσοτική PCR σχεδιάστηκαν με τη χρήση του λογισμικού Primer Express (Applied Biosciences, Carlsbad, CA) για να ενισχυθεί ένα 70-bp έως 85-bp όμοια με την αλληλουχία στόχο στη μικροσυστοιχία Affymetrix. Οι διαφορές στο όριο του κύκλου, Δ (

Ct

), ελήφθησαν αφαιρώντας το

Ct

αξία του γονιδίου ομαλοποίηση από το

Ct

αξία του γονιδίου δοκιμή του ίδιου αντίδραση μεταγραφής αντιστραφεί. Το γονίδιο ομαλοποίηση, 40S ριβοσωμική πρωτεΐνη S28 (RPS28), επιλέχθηκε προηγουμένως ως η πιο σταθερά εκφρασμένη σε όλες τις κανονικές και cap δειγμάτων [12]. Επίπεδα DLG7 και RSP28 μεταγραφές σε 22 επιθετικά και 32 μη επιθετικούς όγκους δεν καθορίστηκαν λόγω της ανεπαρκούς ποιότητας του RNA.

Στατιστικές μέθοδοι

Αναλύσαμε τα δεδομένα με το πακέτο R (https://www.r-project.org/). Κατανομές των κλινικών και παθολογικών παραμέτρων συγκρίθηκαν με τις χ

2 και

t

δοκιμές. Λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη (ROC) καμπύλη περιοχές εκτιμήθηκαν για κλινικές και παθολογικές παραμέτρους για όλους τους ασθενείς. Τυπικά σφάλματα της μέσης τιμής για τις περιοχές κάτω από τις καμπύλες υπολογίστηκαν από τη συσχέτιση κατάταξη για (rcorr.cens) δοκιμή λογοκρίνονται δεδομένων.

Αποτελέσματα

υποξία-ελεγχόμενη οι μεταγραφές που σχετίζονται με το στάδιο της νόσου και την πρόγνωση

Επειδή CaP φαίνεται να χαρακτηρίζεται από μια υποξική μεταγραφικό [13-15], υποθέσαμε ότι η υποξία ρυθμιζόμενων γονιδίων θα παρέχει επιπλέον πληροφορίες σχετικά με τους μηχανισμούς της εξέλιξης της ΚΓΠ. Ελέγξαμε την υπόθεση αυτή με συμπληρωματικά εξόρυξη δεδομένων [16]. Αναλύσαμε τα 88 μέχρι τώρα γνωστές μεταγραφές που ρυθμίζονται από υποξία παράγοντα 1 (HIF-1) [17]? 500 γονίδια υποξία σχετίζεται προσδιορίζονται σε κυτταρικές γραμμές [17]? 23 γονίδια της συντηρημένες πυρήνα υποξία υπογραφή [18]? δώδεκα HIF-1 στόχων δοκιμαστεί στην Cap [13]? και 708 γονίδια στο μονοπάτι σηματοδότησης υποξία Ingenuity [19]. Μεταξύ όλων των γονιδίων υποξία ρυθμίζεται, σε δείγματα μας εντοπίσαμε 24 γονίδια σημαντικά υπερεκφράζεται σε Cap κατά τουλάχιστον διπλάσιο

τόσο

χύμα ιστών και κυττάρων LCM-απομονώθηκαν (

σ

≤0.02? Πίνακας 2 ). Είναι σημαντικό, τα επίπεδα μεταγραφής για DLG7, CCNB1 και HMMR ήταν υψηλότερες σε δείγματα που χαρακτηρίζεται από την υψηλότερη βαθμολογία Gleason και σε ασθενείς με χειρότερη πρόγνωση (Σχήμα 1). Εμείς περιγράφεται η πρόγνωση για τους ασθενείς σε αυτή τη μελέτη νωρίτερα [9].

Η Μαζική ιστού

LCM

Σύμβολο

Όνομα

CaP Ν log

2 αναλογία /

τιμή p

CAP /N log

2 αναλογία

τιμή p

ACACAacetyl-συνένζυμο Α καρβοξυλάση alpha1.501.20.002123CDCA3cell διαίρεση του κύκλου-πρωτεΐνης που συνδέεται με 31.701.50CEP55centrosomal πρωτεΐνη 55kDa1.801.40CCNB1cyclin Β11. 801.30CKS2cyclin-εξαρτώμενες κινάσες ρυθμιστική υπομονάδα 21.10.0000431.20.000001DLGAP5discs μεγάλο μεταφορέα ομόλογο 7 (DLG7) 1.801.50SLC7A1high συγγένεια κατιονικές αμινοξύ 11.601.20.000023HMMRhyaluronan μεσολάβηση κινητικότητα receptor2.101.70HIG2hypoxia επαγόμενο πρωτεΐνη 21.501.20.000001LOXlysyl oxidase1.10.0000441.50MMP10matrix μεταλλο -10 1.20.0215211.40.000066MCOLN2mucolipin 2 (πρωτεΐνη κανάλι κατιόντων) 1.10.0003321.40NLNneurolysin (μεταλλοπεπτιδάση οικογένεια Μ3) 1.201.20.000012PDLIM5PDZ και LIM τομέα 5 (πρωτεΐνη ικριωμάτων) 1.101.20.000121PSD3pleckstrin και ΕΚ7 τομέα που περιέχουν 31.10.0000011.20C20orf74Ral ΘΤΡάσης-ενεργοποίησης της πρωτεΐνης υπομονάδα άλφα-21.301.20.000092FAM80Aribosomal πρωτεΐνη τροποποίηση rimK-σαν μέλος της οικογένειας A1.701.20.000013SDK1sidekick ομόλογο 1, κυτταρική προσκόλληση molecule1.501.50STC2stanniocalcin-2 (εκκρίνεται) 1.20.0090531.30.000059SOX4transcription παράγοντας SOX-41.201.20.000001TMEM200Atransmembrane πρωτεΐνη 200A1.301.30. 000886TFF3trefoil συντελεστής 3 (εντερική, σταθερή εκκριτική πρωτεΐνη) 1.20.0018891.20.001276UBE2Cubiquitin-ένζυμο σύζευξης Ε2 C1.401.20UBE2E3ubiquitin-ένζυμο σύζευξης Ε2 Ε3 1.801.30.000079Table 2. γονίδια υποξία σχετίζεται με σημαντικά υπερεκφράζεται στο Cap χύμα ιστό και δείγματα απομονώθηκαν με LCM.

Συντομογραφίες: Cap, τον καρκίνο του προστάτη? Ν, φυσιολογικό? LCM, σύλληψη λέιζερ μικροανατομή CSV Λήψη CSV

Μεταξύ των γονιδίων υποξίας-ρυθμίζονται σημαντικά υπερεκφράζεται στο καπάκι, κυκλίνη Β1 (CCNB1), DLGAP5 και υαλουρονικό μεσολάβηση υποδοχέα κινητικότητα (HMMR) συνδέθηκαν με Gleason σκορ και την έκβαση της νόσου.

το Σχήμα 2 δείχνει τα επίπεδα μεταγραφής γονιδίων για CCNB1, DLGAP5, και HMMR σε διαφορετικά στάδια της νόσου. Τόσο στον ιστό του όγκου και των κυττάρων LCM-απομονώνονται, τα επίπεδα μεταγραφής ήταν υψηλότερα σε CaP σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό. Επίσης, αυτές οι μεταγραφές εκφράζονται σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα σε κύτταρα που απομονώνονται από τους ιστούς CaP στα στάδια GP4 και GP5 ό, τι στο στάδιο GP3, υποδηλώνοντας μια ένωση με την εξέλιξη του όγκου. Επιπλέον, τα επίπεδα μεταγράφων ήταν υψηλότερα σε μεταστάσεις από ασθενείς που προχώρησαν σε θάνατο, γεγονός που υποδηλώνει μια ένωση με αποτέλεσμα τη νόσο (βλέπε Μέθοδοι) (Σχήμα 2).

Πίνακες στην αριστερή συγκρίνουν τα επίπεδα μεταγραφής σε CaP χύδην ιστού (πλήρης σύμβολα ) με τα επίπεδα μετρώνται σε καλοήθη ιστό του προστάτη (ανοικτά σύμβολα) από τους άνδρες χωρίς τάπα (BP) και σε καλοήθη ιστό του προστάτη (BPC) δίπλα της ΚΓΠ σε συνδυασμό Gleason σκοράρει 6 (gs6). Πάνελ για τα σωστά επίπεδα εμφάνισης μεταγραφής μετρούμενη σε μη νεοπλασματικά προστάτη επιθηλιακά κύτταρα απομονώθηκαν με τη σύλληψη λέιζερ μικροδιατομής (LCM) σε καλοήθεις ιστούς (ανοικτά σύμβολα): BP, καλοήθης υπερπλασία του προστάτη (ΚΥΠ) και BPC δίπλα στο καπάκι του υποδεικνύεται σκορ Gleason ( GS). Πλήρης σύμβολα στο πάνελ στη δεξιά δηλώνουν τα επίπεδα μεταγραφής μετρήθηκε στα κύτταρα CaP LCM-απομονωθούν: υψηλού βαθμού προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (HGPIN), τα κύτταρα που απομονώθηκαν από περιοχές των συνδυασμένων Gleason βαθμολογίες 6 έως 8 και τα κύτταρα που απομονώνονται από μεταστάσεις λεμφαδένα (συναντήθηκαν) . CCNB1, κυκλίνη Β1? DLG7, δίσκοι μεγάλο ομόλογο 7? HMMR, υποδοχέα κινητικότητα υαλουρονάνη μεσολάβηση.

Η

Τα προϊόντα της CCNB1 [20] και τα γονίδια HMMR [16] έχουν πρόσφατα αναγνωριστεί ως μοριακοί δείκτες της εξέλιξης της ΚΓΠ. Ως εκ τούτου, εμείς Πρότεινε την πιθανή χρησιμότητα της υποξίας που σχετίζονται με τα γονίδια ως CaP βιοδείκτες με προγνωστική αξία. Για να ελέγξει την ιδέα αυτή, θα συσχετίζονται τα επίπεδα DLG7 απομαγνητοφώνηση με εκείνα της τοποϊσομεράσης DNA 2α (TOP2A), ένα γονίδιο του οποίου οι μεταγραφές έχουν προγνωστική σημασία σε Cap [21], ιδίως υπό τη μορφή υψηλού κινδύνου [11]. Βρήκαμε μια υψηλή συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων των δύο μεταγραφές (συντελεστής Pearson = 0,816). Η αποκαλυπτική αυτής της ένωσης μας ώθησε να υποθέσει ότι οι μεταγραφές DLG7 μπορούσαν ανεξάρτητα να προβλέψει την πορεία της νόσου σε άνδρες με υψηλό ανώτατο όριο κινδύνου.

μεταγραφές DLG7 ως δυνητικά ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη του Cap αποτέλεσμα

Εξετάσαμε τη συσχέτιση της DLG7 μεταγραφή με συστηματική εξέλιξη και το θάνατο από το πώμα σε 150 ζεύγη ομάδα περίπτωση ελέγχου [11]. Οι περιπτώσεις και οι έλεγχοι ήταν πολύ παρόμοιες σε κλινικές και παθολογικές λειτουργίες με εξαίρεση την πλοειδίας του DNA [11]. Με ανάλυση ROC βρήκαμε την περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) για DLG7 0,74 (95% CI, 0,68 να 0,8)? για HMMR 0,67 (95% CI, 0,60 έως 0,74)? και για CCNB1of 0,64 (95% CI, 0,57 έως 0,71). ROC βαθμολογίες για DLG7 αποδεικνύουν την συνολική διαχωρισμό των περιπτώσεων και ελέγχων (Σχήμα 3). Έτσι, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι τα επίπεδα DLG7 μεταγραφή προβλέψει την πορεία της νόσου σε άνδρες που διατρέχουν υψηλό κίνδυνο από την ΚΓΠ. Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα επίπεδα μεταγραφής του υποξία ελεγχόμενη γονίδια CCNB1 και HMMR-προηγουμένως ταυτοποιήθηκε ως μοριακοί δείκτες του Cap εξέλιξη συνδέθηκαν με Gleason στείλει και την πρόγνωση της νόσου, καθώς και.

Η περιοχή κάτω από την καμπύλη ήταν 0,74 (95% CI, 068-0.80). Ένθετο: Διάγραμμα διασποράς των κανονικοποιημένων τιμών έκφρασης για τις περιπτώσεις (κόκκινο) και τους ελέγχους (πράσινο)

Η

Συζήτηση

έχουν τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης έχουν χρησιμοποιηθεί ως εργαλείο για τον εντοπισμό προγνωστικούς δείκτες για. CaP [22-26]. Νωρίτερα, εμείς και οι άλλοι έχουν αποδείξει την προγνωστική αξία των επιλεγμένων μεταγραφές για τους άνδρες που υποβάλλονται σε ριζική προστατεκτομή [9,11,12,27]. Στην ανακοίνωση αυτή δείχνουμε ότι οι μεταγραφές του DLGAP5, ένα γονίδιο υποξία σχετίζεται [17], έχουν προγνωστική αξία σε Cap υψηλού κινδύνου.

Αν και ποσοτικοποίηση

σ

O

2 σε Cap ιστού

in situ

είναι σε προκαταρκτικό στάδιο [4,28], υποξία υπήρξε ένας ανεξάρτητος δείκτης κακή έκβαση [5] που σχετίζονται με τις κλινικές και παθολογικές μεταβλητές [28]. Σημαντικά, τα επίπεδα μεταγραφής της υποξίας που ανταποκρίνεται μόρια [δηλαδή, VEGF, HIF-1α, οστεοποντίνη, LOX και GLUT-1] συσχετίζονται θετικά με την παθολογία και επιθετικότητα (ανασκόπηση από τους Stewart et al., Αναφ [4].). Οι μελέτες αυτές αποδεικνύουν τη σκοπιμότητα της αναγνώρισης βιοδεικτών που συνδέει υποξία και πρόγνωση στην ΚΓΠ και τον καθορισμό της συμβολής των γονιδίων υποξίας που σχετίζονται με Cap εξέλιξη.

Λόγω της εμφανούς σύνδεσης της υποξικής μεταγραφικό και το καπάκι [13-15], υποθέτουμε ότι τα γονίδια υποξία σχετίζεται μπορούσε να παράσχει πρόσθετες γνώσεις σχετικά με τους μηχανισμούς της εξέλιξης της ΚΓΠ. Με την εξόρυξη δεδομένων εντοπίσαμε υποξία που σχετίζονται με γονίδια με έκφραση σημαντικές τροποποιήσεις το καπάκι, τόσο χύμα ιστό και το καπάκι ιστών που έχουν απομονωθεί από το LCM. Αυτών των γονιδίων, βρήκαμε ότι τα επίπεδα μεταγραφής του DLGAP5, CCNB1 και HMMR συνδέθηκαν με σκορ Gleason και συστηματική πρόοδο. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η συσχέτιση μεταξύ της μεταγραφής και την έκβαση της νόσου δεν παρατηρήθηκε για άλλα γονίδια υποξία ελέγχεται προηγουμένως αναφερθεί ως πιθανοί προγνωστικοί βιοδείκτες (Lox, ref [13] .; Πίνακας 1) υποδεικνύοντας έτσι τη δυνατότητα της μεταγραφές για DLG7, CCNB1 και HMMR όπως υποξία -regulated βιοδείκτες ειδικά για ΚΓΠ.

Δεδομένου ότι τα προϊόντα της CCNB1 και γονίδια HMMR έχουν προηγουμένως σχετίζονται με τα μετασχηματισμένα κύτταρα και πρότεινε ως δείκτες της κακής πρόγνωσης για πολλές κακοήθειες [29-33] περιλαμβανομένου του πώματος [16,20 ], εστιάσαμε στην DLGAP5. Το γονίδιο κωδικοποιεί μια DLGAP5 κυτταρικού κύκλου ρυθμίζονται, σχετίζεται με τους μικροσωληνίσκους πρωτεΐνη γνωστή ως DLG7, DAP-5 ή hurp [34] που δρα ως τελεστής Ran ΟΤΡάσης εμπλέκονται στη σταθεροποίηση της μιτωτικής ίνας κινητοχώρου [35]. Σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [36], μηνιγγίωμα [37] και του φλοιού των επινεφριδίων όγκων [38], τα επίπεδα των μεταγραφών που κωδικοποιούν DLG7 αυξάνεται με την επιθετικότητα της νόσου. Αυτές οι μεταγραφές ανιχνεύθηκαν σε ήπαρ και του παχέος εντέρου όγκοι, αλλά όχι σε φυσιολογικά γειτονικούς ιστούς υποδηλώνοντας μια ένωση DLG7 και καρκινογένεσης [39,40]. Ωστόσο, πληροφορίες σχετικά με DLG7 στην ουρολογικών παθήσεων και ιδιαίτερα στο καπάκι είναι περιορισμένη [34]. Σε μια μελέτη, οι μεταγραφές για DLG7 ανιχνεύθηκαν σε σχεδόν 90 τοις εκατό του μεταβατικού κυτταρικού καρκινώματος (TCC) της ουροδόχου κύστης, αλλά όχι σε καλοήθη ουρολογικών παθήσεων? ένα υψηλό επίπεδο μεταγραφημάτων για DLG7 βρέθηκε σε υποτροπιάζουσες TCC [41].

Υπό το φως των πληροφοριών που υποδηλώνει DLG7 ως προγνωστικός δείκτης, διερευνήσαμε τις δυνατότητές της ως αποτέλεσμα προγνωστικό σε Cap υψηλού κινδύνου. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε την συσχέτιση των επιπέδων μεταγραφής για DLG7 και TOP2A επειδή η προγνωστική αξία των TOP2A στην ΚΓΠ έχει τεκμηριωθεί [21,26,42]. Συγκεκριμένα, ανέφεραν ότι οι μεταγραφές TOP2A [11] και το πρωτεϊνικό προϊόν [12] ήταν προγνωστικοί του Cap υψηλού κινδύνου. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα μεταγραφής για DLG7 και TOP2A συσχετίζονταν ισχυρά και δείχνουν ότι η μεταγραφή του γονιδίου DLGAP5 θα πρέπει να μελετηθεί περαιτέρω για το δυναμικό του ως προγνωστικός παράγοντας της έκβασης σε Cap υψηλού κινδύνου. Αξίζει να σημειωθεί ότι η υπερέκφραση της μεταγραφές για TOP2A και DLG7 έχει πρόσφατα εντοπιστεί σε βαθμό ΙΙΙ μηνιγγίωμα σε σύγκριση με το βαθμό που μηνιγγίωμα [37]. Η πληροφορία αυτή προσθέτει αξία στην έννοια που συν-έκφραση TOP2A και DLG7 είναι σχετικό με ογκογένεση και θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω στην αναζήτηση των βιοδεικτών για προχωρημένη νόσο.

Να παρέχει τη δυνατότητα ελέγχου της προγνωστικής αξίας των DLG7 σε Cap υψηλού κινδύνου στο πλαίσιο άλλων προγνωστικών μεταγραφές, ερευνήσαμε τους ασθενείς που μελετήσαμε νωρίτερα [9,11,12]. Οι άνδρες που έκαναν και δεν έκαναν συστηματικά την πρόοδο ή πεθαίνουν από την ΚΓΠ συμφωνημένα στην σκορ Gleason, το στάδιο TNM, το καθεστώς του περιθωρίου κέρδους, και προεγχειρητική PSA στον ορό. Η AUC για DLG7 ήταν 0,74 (95% CI, 0,68 έως 0,8). Είναι ενδιαφέρον ότι η AUC για DLG7 ήταν παρόμοια με την τιμή που αναφέρεται για TOP2A μόνη (0,71? Ref [11].). ROC για HMMR [0,67 (95% CI, 0,60 έως 0,74)] και CCNB1 [0,64 (95% CI, 0,57 έως 0,71)] αποκάλυψε χαμηλότερες τιμές AUC για αυτά τα γονίδια από ό, τι για DLG7. Για το λόγο αυτό δεν περιλαμβάνει HMMR και CCNB1 σε ένα προγνωστικό μοντέλο καρκίνου. Παρ ‘όλα αυτά, σε σύγκριση με HMMR και CCNB1, DLG7 εμφάνισαν υψηλότερη AUC προτείνοντας μια ανώτερη προγνωστική αξία της ΚΓΠ υψηλού κινδύνου.

Βιολογίας του γονιδίου DLGAP5 είναι συμβατές με τη συμμετοχή στη διαμόρφωση και την εξέλιξη του καρκίνου και υποδηλώνει ότι η γονιδίου και των προϊόντων του μπορεί να είναι δυνητικοί θεραπευτικοί στόχοι. DLGAP5 μεταγραφή αυξάνεται κατά τη διάρκεια της φάσης S και διατηρείται σε τόσο G2-φάση και Μ φάση του κυτταρικού κύκλου [43]. DLG7 εντοπίζεται στην άτρακτο πόλους κατά τη διάρκεια της μίτωσης [34], hyperstabilizes της μιτωτικής ατράκτου και ενεργοποιεί το σημείο ελέγχου ατράκτου, ασκώντας έτσι έλεγχο πάνω στην άτρακτο σταθερότητα σε ολόκληρη την κυτταρικού κύκλου [44]. Πρόσφατα δεδομένα στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών δείχνουν ότι DLG7 είναι μια άμεση προς τα κάτω στόχος του Notch 3 [45]. Η πληροφορία αυτή προσθέτει το Notch μονοπατιού στα δίκτυα μοριακής σηματοδότησης που ελέγχουν την έκφραση DLG7 και παρέχει μια νέα λεωφόρο αξίζει να επιδιωχθεί όταν διερεύνηση των δυνατοτήτων για τη θεραπευτική στόχευση των DLG7. Όταν υπερεκφράζεται σε κύτταρα 293Τ, DLG7 ενισχυμένη κυτταρική ανάπτυξη σε χαμηλά επίπεδα στον ορό και αυξημένη σχηματισμό αποικιών [34]. Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν σε ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες που υπερεκφράζουν εμβρυϊκά DLG7 [46]. Πιο πρόσφατα, έχει προταθεί ότι DLG7 είναι ογκογόνο με αποτέλεσμα της μείωσης των επιπέδων της πρωτεΐνης ρ53 καταστολέα όγκου [47]. Η υπερέκφραση του DLG7 σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 ενίσχυσε την ευαισθησία στην δεοξυκυτοσίνης αναλόγων [46]? Ως εκ τούτου, η διερεύνηση της στόχευσης των DLG7 (για παράδειγμα, παρεμβαίνοντας με τις οδούς που ελέγχει DLG7, όπως αυτές που επηρεάζονται από aurora-κινάσης ή Notch) θα μπορούσε να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα χημειοθεραπευτικών σε ευνουχισμό-πώμα. Αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν το ρόλο του DLG7 στην εξέλιξη του καρκίνου και το προτείνει ως πιθανό θεραπευτικό στόχο άξιο περαιτέρω έρευνα.

Αν και ο ρόλος της υποξίας στην έκφραση DLG7 δεν έχει αποδειχθεί άμεσα, έχει συναχθεί από τη διαπίστωση ότι DLG7 είναι ένας στόχος Notch 3 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [45]. Έχει αποδειχθεί ότι οι έλεγχοι υποξία μεταγραφή των στόχων Notch σε νευροενδοκρινή διαφοροποίηση των ανθρώπινων κυττάρων CaP [48]? Αυτό συνεπάγεται τη δυνατότητα του Notch σηματοδότηση σε υποξία μεσολάβηση έλεγχος της έκφρασης DLG7 στο Cap και ο ρόλος της στην εκδήλωση της επιθετικότητας του όγκου. Να αναζητήσει την πιθανή μηχανιστική βάση της ευαισθησίας DLG7 στην υποξία, ψάξαμε την περιοχή του υποκινητή των DLG7 για τις θέσεις δέσμευσης του HIF μεταγραφικού παράγοντα. Χρησιμοποιώντας το δημοσιευμένες πληροφορίες σχετικά με το ελάχιστο

cis-ρυθμιστικών

στοιχεία που απαιτούνται για την HIF-εξαρτώμενη διενεργοποίηση [49,50] βρήκαμε πέντε πιθανές θέσεις δέσμευσης του HIF βρίσκεται 1134, 2498, 2616, 3815, και 8310 nt πριν από το έναρξη DLG7 μεταγραφής, αντίστοιχα (CRG και ΑΕΚ, αδημοσίευτα στοιχεία). Οι περισσότερες από αυτές τις περιοχές βρίσκονται σε μια εξαιρετικά μεθυλιωμένο περιοχή? δεδομένου ότι η μεθυλίωση υποκινητής ρυθμίζει την έκφραση της υποξίας που ελέγχονται γονίδια σε ένα πλαίσιο-εξαρτώμενο τρόπο [50], τα αποτελέσματα της έντασης οξυγόνου για την έκφραση της DLG7 αξίζουν περισσότερη έρευνα.

Τα αποτελέσματά μας επικυρώνει τις μεταγραφές των DLGAP5, ένα

σ

O

2-ρυθμιζόμενο γονίδιο [17], ως ανεξάρτητο προγνωστικό βιοδείκτη στο καπάκι. πιθανές εφαρμογές της περιλαμβάνουν τη βελτίωση των σημερινών προγνωστικά εργαλεία για την ΚΓΠ και την καλύτερη πρόβλεψης της θεραπευτικής έκβασης. Η απόδειξη της ουσιαστικής ευαισθησία των κυττάρων καπάκι για να υποξία μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη αποτελεσματικότητα της θεραπείας, όχι μόνο για την ΚΑΠ, αλλά μπορεί επίσης να χρησιμεύσει ως παράδειγμα για άλλες μορφές καρκίνου.

Ευχαριστίες

ευχαριστώ Δρ. Lucio Miele και Mohamed Hassan για κριτική ανάγνωση του χειρογράφου.